Summary
Vi har utviklet en metode som beriker og isolerer menneskelige astrocyttpopulasjoner fra ferskfrosset vev til bruk i nedstrøms molekylære analyser.
Abstract
Kompleksiteten til menneskelige astrocytter forblir dårlig definert i primært menneskelig vev, og krever bedre verktøy for isolasjon og molekylær karakterisering. Fluorescensaktivert nuklei sortering (FANS) kan brukes til å isolere og studere menneskelige nevronale kjerner (NeuN +) populasjoner fra frossent arkivvev, og dermed unngå problemer forbundet med håndtering av friskt vev. Imidlertid mangler innsats for å isolere astroglia fra det ikke-nevronale (NeuN-) elementet på samme måte. En nylig utviklet og validert immunotagging strategi bruker tre transkripsjon faktor antistoffer for samtidig å isolere beriket neuronal (NeuN +), astrocytt (parret boks protein 6 (PAX6)+NeuN-), og oligodendrocytt forfedre (OLIG2 +NeuN-) nuclei populasjoner fra ikke-syke, friske (unfixed) snap-frossen postmortem human temporal neocort vev.
Denne teknikken ble vist å være nyttig for karakterisering av celletypespesifikke transkripsjonsendringer i primær patologisk epilepsi neocortex. Transkripsjonsanalyser bekreftet at PAX6+NeuN-sorterte populasjoner er robust beriket for pan-astrocyttmarkører og fanger astrocytter under både hvilende og reaktive forhold. Dette dokumentet beskriver FANS-metodikken for isolering av astrocyttberikede kjerner fra ferskfrosset human cortex, inkludert vevsdissosiasjon til enkeltkjerne (sn) suspensjon; immunnagging av kjerner med anti-NeuN og anti-PAX6 fluorescerende konjugede antistoffer; FANS gating strategier og kvalitetskontroll beregninger for optimalisering følsomhet og spesifisitet under sortering og for å bekrefte astrocytt berikelse; anbefalte anskaffelser for nedstrøms transkripsjon og chromatin tilgjengelighet sekvensering ved bulk- eller sn-oppløsning. Denne protokollen gjelder for ikke-nekrotiske, ferskfryste, menneskelige kortikale prøver med ulike patologier og anbefalt postmortem vevsinnsamling innen 24 timer.
Introduction
Den molekylære kompleksiteten til menneskelige astrocytter forblir dårlig definert i primærvev, og krever bedre verktøy for isolasjon og karakterisering ved høy oppløsning, både i helse og sykdom. Separasjon av intakte menneskelige nevroner og glia fra deres nisje har vist seg vanskelig på grunn av begrenset tilgang til ferske hjernevevsprøver, den sterkt sammenkoblede naturen til glial- og nevronale prosesser, og uunngåelig cellulær aktivering under behandling, som alle begrenser molekylær karakterisering av disse celletypene ex vivo1 . Fluorescensaktivert nuklei sortering (FANS) har dukket opp som et alternativ til levende celle sortering, slik at dissosiasjon og immunotagging av kjerner populasjoner fra frossent vev. I løpet av det siste tiåret har FANS blitt mye brukt til å isolere og molekylært karakterisere menneskelige nevronale (NeuN +) kjernepopulasjoner i en rekke hjerneprøver og anatomiske regioner 1,2,3,4.
Imidlertid har lignende metoder for å isolere spesifikke glial nuklei subpopulations fra human cortex vært begrenset, noe som fører til en relativ mangel på raffinement i forståelsen av astrocyttkompleksitet i både normalt og sykt vev. For dette formål ble en tidligere publisert protokoll tilpasset for å isolere menneskelige nevronale populasjoner ved hjelp av FANS4, og en metode ble validert for å berike astrocytter (og for oligodendrogliale forfedre) ved hjelp av en trippel-antistoffkombinasjon, og fanget astrocytter i både hvilende og reaktive forhold5. For å spesifikt berike astrocytter i NeuN-fraksjonen ble antistoffer brukt mot en av to transkripsjonsfaktorer som er kjent for å være differensialt uttrykt på tvers av astrocyttpopulasjoner, PAX6 eller SRY-boks transkripsjonsfaktor 9 (SOX9)6,7. PAX6 er sterkt uttrykt under tidlig fosterutvikling innen radial glia-lignende forfedre i germinal soner og bidrar til både nevrogenese og gliogenese 8,9,10,11 samt til retinal neuronal spesifikasjon 12. Hos voksne er PAX6 differensialt overekspressert i hvilende menneskelige astrocytter6 og viser proteinkouttrykk med glial fibrillært surt protein (GFAP) i humant epilepsivev astrocytter13.
Denne protokollen beskriver samtidig isolasjon av neokortiske nevronale og astrocyttberikede nukleipopulasjoner av FANS. Fersk (uløst) snapfrossen (dvs. ferskfryst) postmortemvev samlet fra voksen cortex blir først mekanisk og kjemisk dissosiert. Etter lysis og ultracentrifugation i en sukrose gradient, blir de cytoplasmatiske og ekstracellulære komponentene kassert mens kjernene beholdes. Nuclei blir deretter merket med fluorescerende konjugerte kjernefysiske antistoffer som tilsvarer de ønskede mållinjeformene og sorteres ved hjelp av FANS. Etter denne tilnærmingen er berikelse av astrocytter demonstrert i de innsamlede PAX6 + NeuN-populasjonene, validert både av et målrettet qPCR-panel så vel som ved nedstrøms kjernefysisk RNA-sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Programmet for beskyttelse av mennesker ved Icahn School of Medicine ved Mount Sinai (ISMMS) og dets Institutional Review Board (IRB) sikrer etisk gjennomføring av forskning og overholdelse av føderale, statlige og institusjonelle forskrifter. I denne studien ble alle postmortemprøver som ble brukt av identifisert, innhentet under passende samtykke gjennom biorepositorien, og ble unntatt fra "menneskelig forskning" betegnelse av ISMMS's IRB (HS # 14-01007).
1. Klargjøring av buffer
MERK: Hvis du utfører nedstrøms RNA-sekvensering, må du behandle alle arbeidsområder og verktøy grundig med RNase Decontamination Solution for å forhindre mRNA-nedbrytning.
- Klargjør lysisbufferen.
- Løs opp følgende i destillert H2O opp til 50 ml: 5,47 g sukrose (0,32 M endelig), 250 μL av 1 M CaCl2 (5 mM endelig), 150 μL 1 M Mg(CH3COO))2 (3 mM finale), 10 μL av 500 mM etylendiamintetraketisk syre (EDTA) (0,1 mM finale), 500 μL av 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM finale), 500 μL av 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM finale), 50 μL Triton X-100 (0,1 % endelig) og 17 μL 3 M dithiothreitol (DTT, 1 mM endelig, tilsett fersk) (se materialtabellen).
- Klargjøre sukrosebuffer
- Løs opp følgende i destillert H2O opp til 50 ml: 30,78 g sukrose (1,8 M endelig), 150 μL 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM finale), 500 μL av 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM finale), 17 μL av 3 M DTT (1 mM finale, tilsett fersk).
2. Frossen vevsdissosiasjon i enkeltkjernefjæring
- Tilsett 4 ml iskald lysisbuffer til en 7 ml glassvevsduncer (grinder), og hold på is. Disseker ca 200-400 mg ferskfrossen human voksen cortex, dounce ca 50x, og overfør vevet homogenat til et 12 ml ultracentrifuge polypropylenrør.
- Bruk en 5 ml pipette, tilsett 6,5 ml iskald sukrosebuffer til bunnen av ultracentrifugerøret, pass på at du ikke forstyrrer laget mellom sukrose og vevshomogenat.
MERK: Hvis du behandler flere prøver, må du forsiktig balansere rørene etter vekt ved å legge til ekstra lysisbuffer i den lettere prøven. Nøyaktig balansering av ultracentrifuge rør er viktig for å forhindre skade på rotoren og sikre rotasjon med riktig hastighet.
3. Ultracentrifugation
- Ultracentrifuge lysate ved 24,400 RPM (101,814 × g) for 1 time ved 4 °C. Aspirer forsiktig supernatanten og rusk uten å forstyrre pelletsen.
MERK: En pellets er kanskje ikke synlig hvis den starter med mindre enn 200 mg vev. - Tilsett 600 μL fosfatbufret saltvann (PBS) (Ca. 2+, Mg2+ gratis) til nukleipellet og inkuber på is i 10 minutter før du bruker den på nytt.
- Pipette opp og ned 50 ganger for å gjenopplive nuklei pellets på is.
- Bruk et hemocytometer for å visualisere de intakte kjernene under et mikroskop og for å sikre at konsentrasjonen av resuspension er over 105 nuklei / ml før du går videre til neste trinn (kombiner 10 μL av den resuspenderte kjernen med 10 μL trypan blå).
4. Antistoff inkubasjon
- For å immunokode prøven for FANS, tilsett 500 μL av den resuspenderte prøvepelleten, 490 μL 1x PBS (Ca. 2+, Mg2+ gratis), 10 μL 10% BSA (0,1% endelig), 1 μL mus anti-NeuN antistoff konjugert til AF555 (NeuN-AF5, 1:1000 endelig konsentrasjon), og 1 μL mus anti-PAX6 antistoff konjugert til allophycocyanin (PAX6-APC, 1:1000 endelig konsentrasjon).
MERK: Alternative antistoffer som er konjugert til andre fluoroforer kan tilsettes (se diskusjon). Her ble musen anti-OLIG2 konjugert til AF488 (1:1000 konsentrasjon) brukt med gunstige resultater. - Utfør bare kontroller med 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) og enkeltfargekontroller for å sette opp gatingparametere, ved hjelp av en liten mengde av prøven etter behov.
- For å utføre AF555 enkeltfargekontroll, tilsett 20 μL av den resuspenderte prøvepelletsen, 970 μL 1x PBS (Ca. 2+, Mg2+ gratis), 10 μL 10% BSA (0,1% endelig) og 1 μL NeuN-AF555 antistoff (1:1000 konsentrasjon).
- For å utføre APC enkeltfargekontroll, legg til 20 μL av den resuspenderte prøvepelletsen, 970 μL 1X PBS (Ca2+, Mg2+ gratis), 10 μL 10% BSA (0,1% endelig) og 1 μL PAX6-APC antistoff (1:1000 konsentrasjon).
- For å utføre kun DAPI-kontroll, tilsett 20 μL av den resuspenderte prøvepelletsen, 970 μL 1X PBS (Ca. 2+, Mg2+ gratis) og 10 μL 10% BSA (0,1% endelig) (DAPI vil bli lagt til senere, se 4.4).
MERK: Hvis mer enn to antistoffer brukes, anbefales det å utføre fluorescens-minus-en (FMO)-kontroll i tillegg til enkeltfargekontrollene.
- Inkuber prøvene og kontrollene med rotasjon i mørket i 1 time ved 4 °C.
- Legg til DAPI klokken 1:1000 i alle eksemplene og kontrollene, og fortsett med sorteringen.
5. Fluorescensaktivert nuklei sortering (FANS)
MERK: Det anbefales å bruke et institusjonelt strømningscytometrianlegg med hjelp fra opplært personell med mindre det allerede er dyktig i strømningscytometri / sorteringsteknikker.
- Porten som vist nedenfor.
- Først og for hvert utvalg, gate by forward scatter (FSC-A) vs. sidespredning (SSC-A) for å inkludere partikler i riktig størrelsesområde for kjerner, og dermed unntatt røde blodlegemer og rusk (figur 1A).
MERK: Et veldig rent nukleipreparat kan skille mellom en mindre ruskklynge og en kjerneklynge. - Deretter, og for hvert utvalg, gate av FSC-A vs. FSC-W (eller FSC-A vs. FSC-H) og SSC-A vs. SSC-W (eller SSC-A vs. SSC-H) for å inkludere bare singlet nuclei (figur 1B).
- Deretter, og for hvert utvalg, gate by DAPI å inkludere intakte nuclei singlets (DAPI-høy inngjerdet populasjon), unntatt rusk (DAPI-lav, til venstre for inngjerdet populasjon) og dobler (til høyre for inngjerdet befolkning) (Figur 1C).
- Sett ytterligere gating basert på fluorescenskontroller, bestemt visuelt som distinkte klynger på FACS-tomter.
- Kjør kun DAPI-kontroll for å bestemme bakgrunnsfarging av populasjoner, i fravær av antistoff (figur 1D og figur 2A).
- Kjør kun NeuN-AF555-kontroll for å fastslå avskjæringen for NeuN+-flekker i kanalen for AF555 (figur 2B).
- Kjør pax6-Apc-bare kontroll for å bestemme avskjæringen for PAX6+ farging i APC-kanalen (figur 2C).
- Kjør flere enkeltfargekontroller hvis du bruker flere antistoffer (figur 2D, E).
MERK: Hvis du bruker mer enn to antistoffer, anbefales en FMO-kontroll å visualisere eventuelle endringer i populasjonene.
- Når alle kontrollene er kjørt, tegner du portene for NeuN+ og PAX6+ samlinger over de etablerte tersklene.
- Gate NeuN + befolkningen for å samle nevroner (figur 1E og figur 2F).
- Gate PAX6 + befolkningen fra NeuN-befolkningen for å samle astrocytter (Figur 1E, F og Figur 2F).
- Gate og samle ytterligere glial populasjoner (som oligodendrocytt stamceller, som vist her av OLIG2 +) fra NeuN-PAX6-befolkningen (Figur 1F).
MERK: I tilfelle det er vanskelig å bestemme passende gating cutoffs med flow cytometri programvare på grunn av utydelige populasjoner, kan det være nyttig å endre antall hendelser som visualiseres (enten øke eller redusere antall hendelser på FANS plottet).
- Først og for hvert utvalg, gate by forward scatter (FSC-A) vs. sidespredning (SSC-A) for å inkludere partikler i riktig størrelsesområde for kjerner, og dermed unntatt røde blodlegemer og rusk (figur 1A).
- Samle inn prøver på riktig måte basert på den tiltenkte nedstrømsanalysen.
6. Innsamling av FANS-populasjoner for nedstrøms molekylære analyser
- For bulk RNA-sekvensering samler du inn 50 000-500 000 kjerner i PBS (se også pkt. 7.1).
- Tilsett 2 ml sukroseoppløsning, 50 μL 1 M CaCl2 og 30 μL 1 M Mg(CH3COO)2, og fyll med PBS opptil 10 ml.
- Inverter og inkuber på is i 15 min, deretter sentrifuger ved 900 × g i 10-15 min ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten, resuspend i 1 ml RNA-ekstraherende reagens, virvel, frys på tørris og oppbevar ved -80 °C.
- Alternativt kan du samle prøvene direkte inn i 200 μL av RNA-ekstraherende reagens. Tilsett RNA-ekstraherende reagens opp til 1 ml etter sortering, og oppretthold et 1:1-forhold mellom reagenset og sortert prøve. Virvel, frys på tørris, og oppbevar ved -80 °C.
- For bulkanalyse for transposase-tilgjengelig kromatin ved hjelp av sekvensering (ATAC-seq), samle 50,000-75,000 kjerner i PBS i et mikrocentrifuge rør belagt med 5% bovint serum albumin (BSA). Frys kjerner på tørris/-80 °C eller bruk dem umiddelbart til ATAC-tilberedning.
- For sn RNA-seq eller ATAC-seq, samle kjerner i 0,04% BSA i PBS (se også pkt. 7.2).
7. Forberedelsestips før biblioteket
- Bulk kjernefysisk RNA sekvensering bibliotek forberedelse
- Etter oppsamling i RNA ekstraksjon reagens, utføre standard fenol / kloroform RNA ekstraksjon ved å legge fenol / kloroform og utfelling RNA fra det øvre vandige laget med etanol, etterfulgt av DNase fordøyelse på røret (15 min).
- Utfør RNA-opprydding og konsentrer deg i et sluttvolum på 15 μL vann.
MERK: Bruk denne metoden, representativ utvinning fra 300 mg voksen cortex prøve er ~ 300,000 NeuN + kjerner (15-20 ng / μL total RNA etter opprydding og konsentrasjon) og ~ 250,000 PAX6 + nuclei (10-12 ng / μL total RNA etter opprydding og konsentrasjon). Dette representative utbyttet kan variere sterkt basert på prøvekvalitet, gating stringency og RNA-gjenoppretting. - Utfør kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) før sekvensering for å bekrefte berikelse av astrocytter basert på høyt differensialuttrykk av kanoniske astrocyttmarkører (GFAP, SOX9), 10-formyltetrahydrofolat dehydrogenase (ALDH1L1)) og uttømming av nevronale og andre celleavstamningsmarkører (figur 1G).
MERK: Innsamling av den dobbeltnegative populasjonen (NeuN-PAX6-) gir mulighet for en mer nøyaktig, multitiered qPCR kvalitetskontrollanalyse for relativ berikelse av astrocytter (figur 2H). - Generer RNA-seq-biblioteker ved hjelp av et sett som anbefales for lave verdier for RNA-integritetsnummer, som forventet fra postmortem-prøver.
- Klargjøring av enkeltkjernesekvenseringsbibliotek
- Utfør sn-sekvensering gjennom en institusjonell sekvenseringskjerne.
- For nanofluidics-basert behandling og sekvensering, bruk den anbefalte konsentrasjonen på 1 × 106 celler/ml i minst 60 μL 1x PBS + 0,04 % BSA for enkeltkjernen RNA-sekvensering (snRNA-seq) og 3 × 106 celler/ml i minst 20 μL 1x PBS + 0,04 % BSA for enkeltkjerneanalyse for transposase-tilgjengelig kromatin ved hjelp av sekvensering (snATAC-seq).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nuclei ble samlet inn fra ferskt (uløst) snap-frossent temporalt neocortex vev med en postmortem samlingstid på 12 timer. Etter vevsdissosiasjon i nuklei suspensjon, ble prøver inkubert med antistoffer mot NeuN, PAX6 og OLIG2, og sortert i henhold til gating vist i figur 1 og figur 2. Nuklei ble samlet inn fra NeuN+, PAX6+NeuN- og OLIG2+NeuN-sorterte populasjoner (figur 1E,F og figur 2F). Et målrettet qPCR-panel avslørte berikelse for pan-astrocyttmarkørene, GFAP og ALDH1L1, i PAX6 +(NeuN-) populasjonen (figur 1G og figur 2H). I tillegg ble OLIG2+-populasjonen beriket for oligodendrocytt stamcellemarkøren (OPC) PDGFRA (figur 1G). Bulk RNA-sekvensering av de innsamlede populasjonene viste komparativ berikelse av astrocyttmarkører og uttømming av nevronmarkører i PAX6+(NeuN-) populasjonen (figur 1H). Immunfluorescens bekreftet colokaliseringen av PAX6 med GFAP hos voksne humane kortikale astrocytter (figur 1I).
Når du undersøker enkeltfargekontroller, vises distinkte positive og negative populasjoner for hver markør, noe som gjorde det mulig å angi nøyaktige avskjæringer for samlingen (figur 2A-G). Videre ble astrocyttberiket FANS-isolasjon sammenlignet med to forskjellige antistoffer mot astrocytt kjernefysiske markører, SOX9 og PAX6. En høyere prosentandel av kjerner ble fanget opp av FANS ved hjelp av PAX6 (~13,8 %) enn av FANS som brukte SOX9 (~6 %) i den astrocyttberikede porten (figur 2F, G). Et målrettet qPCR-panel avslørte berikelse for GFAP-, PAX6- og SOX9 i både SOX9+(NeuN-) og PAX6+(NeuN-) populasjoner (figur 2H). Tilbakevirkende kraft sammenlignet dissosiasjon og farging av flere prøver med varierende postmortem intervall (PMI) av vevsinnsamling viste at en kortere PMI var forbundet med større intakt kjernegjenoppretting (figur 3A). Frossent vev med en PMI på opptil 24 timer ga en høy grad av intakte kjerner, opptil 90%; ved 30 timers PMI kunne imidlertid svært få intakte kjerner gjenvinnes (figur 3A). Inkludert et antistoffvasktrinn i standardprotokollen (som vanligvis utelater dette trinnet for å optimalisere utvinningen) avslørte ikke betydelige endringer i separasjonen av distinkte NeuN +/- eller PAX6+/- populasjoner (figur 3B).
Av og til kunne man se dårlig separasjon av PAX6+NeuN-populasjoner, selv i prøver med en høy prosentandel levedyktige kjerner (figur 3C), noe som nødvendiggjør gjentakelsen av vevsdissosiasjonen og FANS-protokollen. Single-nucleus RNA-seq studier ytterligere prioritert PAX6 som en topp differensialt uttrykt kjernefysisk transkripsjon faktor på tvers av både protoplasmatisk og fibrøst voksen astrocytt subpopulations, ikke bare i neocortex, men også i subventricular sone (SVZ) og tilstøtende striatum (Figur 3D). Sammenligning av NEUN/PAX6/OLIG2 trippelVIFTER mellom neocortex og striatum avledet fra samme hjerneprøve viste regionspesifikke forskjeller i separasjon av PAX6+-kjerner (figur 3E). Denne protokollen er for øyeblikket bare validert for neocortex.
Figur 1: Validering av nevron- og astrocyttberiket isolasjon av FANS. (A-F) Representative eksempler på sekvensielle FANS gating for å utelukke rusk og doublets (A-C) og definere bakgrunnsfarging ved hjelp av (D) en DAPI-bare kontroll for innsamling av (E-F) beriket nevronal (NeuN +), astrocytt (PAX6 + NeuN-), og OPC (OLIG2 + + NeuN-) nukleipopulasjoner. (G) Minimalt qPCR-panel ved hjelp av pan-astrocytt (GFAP, ALDH1L1), nevronale (RBFOX3) og OPC (PDGFRA) markører for kvalitetskontroll av de innsamlede populasjonene (A-G: temporal neocortex obduksjonsprøve uten patologi, 12 h PMI, 100 000 hendelser vist; stiplede linjer representerer positivt inngjerdede sekvensielle populasjoner; faste linjer representerer endelig samling av celle-type berikede populasjoner). (H) Varmekart generert fra rad-normaliserte bulk RNA sekvenseringsdata som viser uttrykk for kanonisk astrocytt og nevronale markører i PAX6 + og NeuN + sorterte populasjoner (n = 3 obduksjonssaker, temporal neocortex uten patologi, PMI 12-21 h). (I) Representativt immunfluorescensbilde av PAX6, GFAP og NeuN i human neocortex. Piler indikerer astrocytter som samtidig uttrykker PAX6 og GFAP. Forkortelser: FANS = fluorescens-aktivere nuklei sortering; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; NeuN = nevronale kjerner; PAX6 = parret boksprotein 6; OLIG2 = oligodendrocytt transkripsjonsfaktor 2; OPC = oligodendrocytt stamcelle; qPCR = kvantitativ polymerasekjedereaksjon; GFAP = glial fibrillært surt protein ; ALDH1L1 = 10-formyltetrahydrofolat dehydrogenase; RBFOX3 = RNA-bindende protein FOX-1 homolog 3; PDGFRA = blodplate-avledet vekstfaktor alfa; PMI = postmortem intervall; SSC-A = sidespredningsområde; FSC-A = fremover punktområde; SSC-W = sidespredningsbredde; FSC-W = fremover punktbredde; NeuN-555 = mus anti-NeuN konjugert til AF555; PAX6-APC = mus anti-PAX6 konjugert til allophycocyanin; OLIG2-488 = mus anti-OLIG2 konjugert til grønn fluorescerende fargestoff for 488 nm laser linje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Komparativ isolering av astrocyttberikede populasjoner som bruker PAX6- eller SOX9-antistoffer. (A-E) Enkeltfargekontroller for DAPI, NeuN, PAX6, SOX9 og OLIG2 definerer positive/negative avskjæringer i de respektive fluorescenskanalene. (F-G) Komparativ FANS-metode for astrocyttberiket isolasjon ved hjelp av (F) NeuN/PAX6 eller (G) NeuN/SOX9 antistoffer. En større prosentandel av hendelsene fanges opp av PAX6 enn av SOX9 innenfor den astrocyttberikede porten. (A-G: identisk postmortem ikke-patologisk temporal neocortex prøve som brukes til alle eksperimenter; 12 h PMI; 10,000 hendelser vist). (H) Kvalitetskontroll qPCR-analyse bekrefter berikelse av astrocyttmarkører og uttømming av ikke-astrocyttmarkører i PAX6 + (NeuN-) og SOX9 + (NeuN-) sorterte populasjoner fra F-G (data normalisert til ACTB og kvantifisert som foldendring av NeuN + befolkningen). Forkortelser: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; NeuN = nevronale kjerner; PAX6 = parret boksprotein 6; OLIG2 = oligodendrocytt transkripsjonsfaktor 2; SOX9 = SRY-boks transkripsjonsfaktor 9; qPCR = kvantitativ polymerasekjedereaksjon; GFAP = glial fibrillært surt protein ; RBFOX3 = RNA-bindende protein FOX-1 homolog 3; PDGFRA = blodplate-avledet vekstfaktor alfa; PMI = postmortem intervall; NeuN-555 = mus anti-NeuN konjugert til AF555; PAX6-APC = mus anti-PAX6 konjugert til allophycocyanin; OLIG2-488 = mus anti-OLIG2 konjugert til grønn fluorescerende fargestoff for 488 nm laser linje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Avhengige og uavhengige beregninger for vellykkede FANS-eksperimenter. (A) Effekt av utvalgsinnsamling PMI på kvaliteten på kjernen: lavere PMI muliggjør gjenoppretting av et større antall intakte kjerner med tilstrekkelige resultater opp til 24 h. (B) Inkluderingen av et vasketrinn etter antistoffinkubasjon ser ikke visuelt ut til å skifte FANS-populasjoner. (C) Eksempel på et mislykket FANS-eksperiment med mangel på distinkt PAX6 +(NeuN-) populasjon (til høyre) til tross for tilstedeværelsen av intakte kjerner og lav bakgrunn (til venstre) (postmortem temporal neocortex, ikke-patologisk, 7 h PMI). (D) Varmekartrepresentasjon av voksne menneskelige sn RNA-seq-data som viser differensialuttrykk av PAX6 og to andre astrocytt kjernefysiske faktorer, SOX9 og LHX2, på tvers av protoplasmatiske og fibrøse astrocytt subpopulasjoner i både cortex og SVZ, sammenlignet med andre celletyper (rød fargegradient representerer spekter av log-normaliserte gjennomsnittlige genuttrykksverdier; n = 3 forskjellige obduksjonstilfeller, 43 619 totale kjerner. (E) Distinkte hjerneregioner (temporal neocortex vs. SVZ og subjacent striatum) viser forskjellige mønstre av NeuN / PAX6 / OLIG2 separasjon. Forkortelser: FANS = fluorescens-aktivere nuklei sortering; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; NeuN = nevronale kjerner; PAX6 = parret boksprotein 6; OLIG2 = oligodendrocytt transkripsjonsfaktor 2; GFAP = glial fibrillært surt protein ; ALDH1L1 = 10-formyltetrahydrofolat dehydrogenase; LXH2 = LIM homeobox 2; PMI = postmortem intervall; SSC-A = sidespredningsområde; FSC-A = fremover punktområde; NeuN-555 = mus anti-NeuN konjugert til AF555; PAX6-APC = mus anti-PAX6 konjugert til allophycocyanin; OLIG2-488 = mus anti-OLIG2 konjugert til grønt fluorescerende fargestoff for 488 nm laserlinje; SVZ = subventrikulær sone; A(p) = protoplasmatisk (grå materie) astrocytter; A(f) = fibrøst (hvitt materiale) astrocytter; OL = oligodendrocytter; OPC = oligodendrocytt stamceller; EN = eksitatoriske nevroner; MSN = middels spiny nevroner; MG = mikroglia; BVC = blodkarceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksperimentell design etter den skisserte protokollen bør sluttføres etter å ha vurdert flere biologiske og tekniske faktorer. Startvevsprøver er ferskfryst, uten å ha blitt fikset, og har helst et kort postmortem samlingsintervall for å maksimere kjerner. Basert på erfaring gir en PMI på opptil 24 timer tilstrekkelig kjernegjenoppretting; En PMI på 12 timer eller mindre er imidlertid å foretrekke for å optimalisere intakt kjernegjenoppretting. Ytterligere faktorer bortsett fra PMI, inkludert temperatur på kroppslagring og pH-nivåer av vevet, kan også påvirke kjerneutbyttet, men ble ikke gjort rede for i disse studiene14. Fra anekdotisk erfaring har FANS utvinning vist seg å være sammenlignbar med det samme vevet som lagres opptil fem år ved -80 °C, selv om kontrollerte eksperimenter ikke ble utført for å vurdere variasjonen av lagring på celletype spesifikt uttrykk. Vasking av prøven etter antistoffinkubasjon er en annen variabel som kan trenge vurdering. Generelt reduserer et vasketrinn det totale utbyttet, men kan forbedre separasjonen av distinkte immunmerkede populasjoner. I disse studiene ble det ikke observert noen forskjell ved separasjon av NEUN/PAX6-populasjoner når de inkluderte eller ekskluderte et post-antistoffvasktrinn, men dette trinnet kan være gunstig ved bruk av andre primære og sekundære antistoffer, spesielt hvis de ikke er forutbestemt.
På grunn av variasjonen i følsomheten til sorteringsutstyret, er det nødvendig å utføre passende kontroller ved hver sorteringshendelse. Hvis det ses for mye ekstracellulært rusk i den resuspenderte prøven når du visualiserer på et hemocytometer, kan prøven føres gjennom et 40 μm filter for å beholde bare kjernene. Hvis prøven er begrenset, kan perler merket med riktig fluorofor også brukes til enkeltfargede og FMO-kontroller. Hvis prøvene ikke ser ut til å være beriket for de ønskede astrocyttpopulasjonene, som bestemt enten av qPCR eller sekvenseringsresultater, kan det være nyttig å gate alle NeuN- så vel som PAX6 + (NeuN-) populasjoner strengere, slik at mer plass mellom portkuttene for positive og negative populasjoner.
De fleste valideringsstudiene som er beskrevet her, ble utført ved hjelp av OLIG2 i tillegg til NeuN og PAX6, for samtidig å berike for nevronale, astrocytt og oligodendrocytt stamcellepopulasjoner (OPCs). Det anbefales å inkludere OLIG2 som en tredje avstamningsmarkør for å berike kortikale astrocytter mer effektivt innenfor NeuN-fraksjonen. Tilstedeværelsen eller fraværet av FITC-konjugert OLIG2 ser ikke ut til å forskyve PAX6+ befolkningen; Antagelsen er derfor at eksperimenter unntatt OLIG2 vil resultere i lignende astrocyttberikelse. Vær oppmerksom på at det er viktig at PAX6 + befolkningen blir inngjerdet fra NeuN-befolkningen, da noen nevronpopulasjoner uttrykker både NeuN og PAX615. Astrocytter kan også sorteres i henhold til SOX9-uttrykk. Farging og sortering med SOX9 fører imidlertid til mindre robust berikelse av astrocytter sammenlignet med PAX6. Selv om det ble observert klar separasjon mellom nevronale, astrocytiske og OPC-avstamninger i voksenbarken, ble det ikke observert en lignende separasjon mellom PAX6+ og OLIG2+ populasjoner i den voksne SVZ og tilstøtende striatum.
Selv om det er mulig at noen astrocytter fra SVZ uttrykker lave nivåer av OLIG2, ble de innsamlede populasjonene bare validert av qPCR (data ikke vist); Nedstrøms RNA-sekvensering kan derfor være nyttig for å definere renheten til disse populasjonene ytterligere. I tillegg kan denne protokollen tilpasses for å isolere kjerner fra frossent fosterhjernevev og hjernesvulstvev ved hjelp av populasjonsspesifikke kjernefysiske markører. Fordi disse vevene er betydelig mer cellulære, kan det være nyttig å starte med mindre vev for å minimere aggregering av kjerner. Ved sortering av aneuploidkjerner fra neoplastisk vev justeres DAPI-gating for å ta høyde for potensielt høyere fluorescens. Det anbefales på det sterkeste at brukere utfører en nøye validering før de utfører FANS på neoplastisk vev, da den nåværende protokollen bare valideres for ikke-neoplastiske prøver. Samlet sett legger den ovenfor beskrevne protokollen frem en validert strategi for å isolere berikede astrocyttpopulasjoner, tilpasset fra tidligere etablerte protokoller for å berike for nevroner. Denne metodikken kan brukes til effektivt å isolere astrocyttkjerner fra både normale og syke kortikale hjernevev til bruk i ytterligere molekylære analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi liker å takke medlemmer i patologi og nevrokirurgi ved Icahn School of Medicine på Mount Sinai for hjelp med anskaffelsen av avidentifisert hjernevev og ISMMS's Flow Cytometry CORE for ekspertråd. Studien ble delvis finansiert av NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (til N.M.T.) og R61DA048207 (til S.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
- Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. The future of neuroepigenetics in the human brain. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S.
- Akbarian, S., et al.
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).
- Tome-Garcia, J., et al. Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy. BioRxiv. , (2020).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Sun, W., et al. SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions. Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).
- Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).
- Sakurai, K., Osumi, N. The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes. Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).
- Zhong, S., et al.
- Pollen, A., et al. Molecular identity of human outer radial glia during cortical development. Cell. 163 (1), 55-67 (2015).
- Cvekl, A., Callaerts, P. PAX6: 25th anniversary and more to learn. Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).
- Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy. European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).
- Monoranu, C. M., et al. pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).
- Ninkovic, J., et al. The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA. Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).
