Summary
Vi har utvecklat en metod som berikar för och isolerar humana astrocytpopulationer från färskfryst vävnad för användning i nedströms molekylära analyser.
Abstract
Komplexiteten hos humana astrocyter förblir dåligt definierad i primär mänsklig vävnad, vilket kräver bättre verktyg för deras isolering och molekylära karakterisering. Fluorescensaktiverad kärnsortering (FANS) kan användas för att framgångsrikt isolera och studera humana neuronala kärnor (NeuN+) populationer från frusen arkivvävnad och därigenom undvika problem i samband med hantering av färsk vävnad. Emellertid saknas ansträngningar för att på liknande sätt isolera astroglia från det icke-neuronala (NeuN-) elementet. En nyligen utvecklad och validerad immuntaggningsstrategi använder tre transkriptionsfaktorantikroppar för att samtidigt isolera berikade neuronala (NeuN+), astrocyt (parat lådprotein 6 (PAX6)+NeuN-) och oligodendrocytförfäder (OLIG2+NeuN-) kärnor från icke-sjuka, färska (ofixerade) snapfrysta human temporal neocortexvävnader.
Denna teknik visade sig vara användbar för karakterisering av celltypspecifika transkriptomförändringar vid primär patologisk epilepsi neocortex. Transkriptomiska analyser bekräftade att PAX6+NeuN-sorterade populationer är robust berikade för pan-astrocytmarkörer och fångar astrocyter under både vilande och reaktiva förhållanden. Detta dokument beskriver FANS-metoden för isolering av astrocytberikade kärnpopulationer från nyfryst mänsklig cortex, inklusive vävnadsdissociation till enkärnig (sn) suspension; immunotagging av kärnor med anti-NeuN och anti-PAX6 fluorescerande konjugerade antikroppar; FANS gating strategier och kvalitetskontroll mätvärden för att optimera känslighet och specificitet under sortering och för att bekräfta astrocytberikning; och rekommenderad upphandling för nedströms transkriptom- och kromatintillgänglighetssekvensering vid bulk- eller sn-upplösning. Detta protokoll är tillämpligt för icke-nekrotiska, färskfrysta, humana kortikala prover med olika patologier och rekommenderad vävnadsuppsamling efter döden inom 24 timmar.
Introduction
Den molekylära komplexiteten hos humana astrocyter förblir dåligt definierad i primär vävnad, vilket kräver bättre verktyg för deras isolering och karakterisering vid hög upplösning, både i hälsa och sjukdom. Separation av intakta mänskliga neuroner och glia från deras nisch har visat sig vara svårt på grund av begränsad tillgång till färska hjärnvävnadsprover, den starkt sammankopplade naturen hos glial- och neuronala processer och oundviklig cellulär aktivering under bearbetningen, som alla begränsar den molekylära karakteriseringen av dessa celltyper ex vivo1 . Fluorescensaktiverad kärnsortering (FANS) har dykt upp som ett alternativ till levande cellsortering, vilket möjliggör dissociation och immunotagging av kärnor från frusen vävnad. Under det senaste decenniet har FANS blivit allmänt använt för att isolera och molekylärt karakterisera mänskliga neuronala (NeuN+) kärnorpopulationer i en mängd olika hjärnprover och anatomiska regioner 1,2,3,4.
Liknande metoder för att isolera specifika glialkärnor subpopulationer från human cortex har dock begränsats, vilket leder till en relativ brist på sofistikering i förståelsen av astrocytkomplexitet i både normala och sjuka vävnader. För detta ändamål anpassades ett tidigare publicerat protokoll för att isolera humana neuronala populationer med hjälp av FANS4, och en metod validerades för att berika för astrocyter (och för oligodendrogliala förfäder) med hjälp av en trippel-antikroppskombination, som fångar astrocyter i både vilande och reaktiva förhållanden5. För att specifikt berika för astrocyter i NeuN-fraktionen användes antikroppar mot en av två transkriptionsfaktorer som är kända för att uttryckas differentiellt över astrocytpopulationer, PAX6 eller SRY-box transkriptionsfaktor 9 (SOX9)6,7. PAX6 uttrycks starkt under tidig fosterutveckling inom radiella glialiknande förfäder i germinalzoner och bidrar till både neurogenes och gliogenes 8,9,10,11 samt till retinal neuronal specifikation 12. Hos vuxna är PAX6 differentiellt överuttryckt i vilande humana astrocyter6 och visar proteinsamuttryck med glialfibrillärt surt protein (GFAP) i humana epilepsivävnadsastrocyter13.
Detta protokoll beskriver samtidig isolering av neokortikala neuronala och astrocytberikade kärnorpopulationer av FANS. Färsk (ofixerad) snapfryst (dvs. färskfryst) postmortemvävnad som samlats in från vuxen cortex dissocieras först mekaniskt och kemiskt. Efter lys och ultracentrifugering i en sackarosgradient kasseras de cytoplasmatiska och extracellulära komponenterna medan kärnorna behålls. Kärnor märks sedan med fluorescerande konjugerade kärnantikroppar som motsvarar de önskade mållinjerna och sorteras med hjälp av FANS. Efter detta tillvägagångssätt demonstreras anrikning av astrocyter i de insamlade PAX6 + NeuN-populationerna, validerade både av en riktad qPCR-panel och genom nedströms kärn-RNA-sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Programmet för skydd av mänskliga ämnen vid Icahn School of Medicine vid Mount Sinai (ISMMS) och dess Institutionella granskningsnämnd (IRB) säkerställer det etiska genomförandet av forskning och efterlevnad av federala, statliga och institutionella bestämmelser. I denna studie avidentifierades alla använda postmortemprover, erhölls under lämpligt samtycke genom biorepositoriet och var undantagna från "mänsklig forskning" -beteckning av ISMMS: s IRB (HS # 14-01007).
1. Förberedelse av buffert
Om du utför nedströms RNA-sekvensering, behandla alla arbetsytor och verktyg noggrant med RNase Decontamination Solution för att förhindra mRNA-nedbrytning.
- Förbered lysbuffert.
- Lös upp följande i destilleratH2Oupp till 50 ml: 5,47 g sackaros (0,32 M slutlig), 250 μl 1 M CaCl2 (5 mM slutlig), 150 μL 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM slutlig), 10 μl 500 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) (0,1 mM slutlig), 500 μL 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM slutlig), 50 μl Triton X-100 (0,1% slutlig) och 17 μl 3 M ditiotreitol (DTT, 1 mM final, tillsätt färskt) (se materialtabellen).
- Förbered sackarosbuffert
- Lös upp följande i destilleratH2Oupp till 50 ml: 30,78 g sackaros (1,8 M slutlig), 150 μl 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM slutlig), 500 μl 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM final), 17 μL 3 M DTT (1 mM final, tillsätt färskt).
2. Fryst vävnadsdissociation i enkärnig suspension
- Tillsätt 4 ml iskall lysbuffert till en 7 ml glasvävnadsdouncer (kvarn) och håll på is. Dissekera cirka 200-400 mg färskfryst human vuxen cortex, dounce cirka 50x och överför vävnadshomogenatet till ett 12 ml ultracentrifug polypropenrör.
- Använd en 5 ml pipett och tillsätt 6,5 ml iskall sackarosbuffert till botten av ultracentrifugröret, var noga med att inte störa skiktet mellan sackaros och vävnadshomogenatet.
OBS: Vid bearbetning av ytterligare prover, balansera rören noggrant efter vikt genom att tillsätta ytterligare lysbuffert till det lättare provet. Exakt balansering av ultracentrifugrören är avgörande för att förhindra skador på rotorn och säkerställa rotation med rätt hastighet.
3. Ultracentrifugering
- Ultracentrifugera lysaten vid 24 400 rpm (101 814 × g) i 1 timme vid 4 °C. Aspirera försiktigt supernatanten och skräpet utan att störa pelleten.
OBS: En pellet kanske inte är synlig om den börjar med mindre än 200 mg vävnad. - Tillsätt 600 μl fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (Ca2+, Mg2+ fri) till kärnpelleten och inkubera på is i 10 minuter innan du återsusparerar.
- Pipettera upp och ner 50 gånger för att återsuspendera kärnpelleten på is.
- Använd en hemocytometer för att visualisera de intakta kärnorna under ett mikroskop och för att säkerställa att koncentrationen av resuspensionen är över 105 kärnor / ml innan du fortsätter till nästa steg (kombinera 10 μL av de återsuspenderade kärnorna med 10 μL trypanblå).
4. Inkubation av antikroppar
- För att immunotagga provet för FANS, tillsätt 500 μL av den återsuspenderade provpelleten, 490 μL 1x PBS (Ca2+, Mg2+ fri), 10 μL 10% BSA (0,1% slutlig), 1 μL mus-anti-NeuN-antikropp konjugerad till AF555 (NeuN-AF555, 1:1000 slutlig koncentration) och 1 μL mus-anti-PAX6-antikropp konjugerad till allokockocyanin (PAX6-APC, 1:1000 slutlig koncentration).
OBS: Alternativa antikroppar konjugerade till andra fluoroforer kan tillsättas (se diskussion). Här användes mus-anti-OLIG2 konjugerad till AF488 (1:1000 koncentration) med gynnsamma resultat. - Utför endast 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) och enfärgade kontroller för att ställa in grindparametrar, med en liten mängd av provet vid behov.
- För att utföra AF555 enfärgskontroll, tillsätt 20 μL av den återsuspenderade provpelleten, 970 μL 1x PBS (Ca2+, Mg2+ fri), 10 μL 10% BSA (0,1% slutlig) och 1 μL NeuN-AF555-antikropp (1:1000-koncentration).
- För att utföra APC-enfärgskontroll, tillsätt 20 μL av den återsuspenderade provpelleten, 970 μL 1X PBS (Ca2+, Mg2+ fri), 10 μL 10% BSA (0,1% slutlig) och 1 μL PAX6-APC-antikropp (1: 1000 koncentration).
- För att utföra endast DAPI-kontroll, tillsätt 20 μL av den återsuspenderade provpelleten, 970 μL 1X PBS (Ca2+, Mg2+ fri) och 10 μL 10% BSA (0,1% slutlig) (DAPI kommer att läggas till senare, se 4.4).
OBS: Om mer än två antikroppar används rekommenderas att utföra fluorescens-minus-en (FMO) -kontroll utöver enfärgskontrollerna.
- Inkubera proverna och kontrollerna med rotation i mörker i 1 timme vid 4 °C.
- Lägg till DAPI vid 1: 1000 till alla prover och kontroller och fortsätt med sortering.
5. Fluorescensaktiverad kärnsortering (FANS)
OBS: Det rekommenderas att använda en institutionell flödescytometrianläggning med hjälp av utbildad personal om du inte redan är skicklig i flödescytometri / sorteringstekniker.
- Grind som visas nedan.
- Först, och för varje prov, gate by forward scatter (FSC-A) vs. sidospridning (SSC-A) för att inkludera partiklar i lämpligt storleksintervall för kärnor, vilket utesluter röda blodkroppar och skräp (figur 1A).
OBS: Ett mycket rent kärnpreparat kan skilja mellan ett mindre skräpkluster och ett kärnkluster. - Därefter, och för varje prov, grind av FSC-A vs FSC-W (eller FSC-A vs FSC-H ) och SSC-A vs. SSC-W (eller SSC-A vs. SSC-H) för att endast inkludera singlet kärnor (Figur 1B).
- Därefter, och för varje prov, grind av DAPI för att inkludera intakta kärnor singlets (DAPI-hög gated population), exklusive skräp (DAPI-låg, till vänster om gated population) och doublets (till höger om gated population) (Figur 1C).
- Ställ in ytterligare grind baserat på fluorescenskontroller, bestämda visuellt som distinkta kluster på FACS-tomter.
- Kör endast DAPI-kontroll för att bestämma bakgrundsfärgning av populationer, i frånvaro av antikroppar (figur 1D och figur 2A).
- Kör endast NeuN-AF555-kontroll för att bestämma gränsen för NeuN+-färgning i kanalen för AF555 (bild 2B).
- Kör endast PAX6-APC-kontrollen för att bestämma gränsen för PAX6+-färgning i APC-kanalen (bild 2C).
- Kör ytterligare enfärgskontroller om du använder fler antikroppar (figur 2D,E).
OBS: Om du använder mer än två antikroppar rekommenderas en FMO-kontroll för att visualisera eventuella förändringar i populationer.
- När alla kontroller har körts ritar du grindarna för NeuN+- och PAX6+-samlingar över de fastställda tröskelvärdena.
- Grinda NeuN + -populationen för att samla neuroner (figur 1E och figur 2F).
- Grinda PAX6+ populationen från NeuN-populationen för att samla in astrocyter (figur 1E,F och figur 2F).
- Grinda och samla in ytterligare glialpopulationer (såsom oligodendrocyt-stamceller, som visas här av OLIG2+) från NeuN-PAX6-populationen (figur 1F).
OBS: Om det är svårt att bestämma lämpliga grindavgränsningar med flödescytometriprogramvaran på grund av otydliga populationer, kan det vara till hjälp att ändra antalet händelser som visualiseras (antingen öka eller minska antalet händelser på FANS-diagrammet).
- Först, och för varje prov, gate by forward scatter (FSC-A) vs. sidospridning (SSC-A) för att inkludera partiklar i lämpligt storleksintervall för kärnor, vilket utesluter röda blodkroppar och skräp (figur 1A).
- Samla in prover på lämpligt sätt baserat på den avsedda nedströmsanalysen.
6. Insamling av FANS-populationer för molekylära analyser nedströms
- För bulk-RNA-sekvensering, samla 50 000-500 000 kärnor i PBS (se även avsnitt 7.1).
- Tillsätt 2 ml sackaroslösning, 50 μl 1 M CaCl2 och 30 μl 1 M Mg(CH3COO)2 och fyll med PBS upp till 10 ml.
- Invertera och inkubera på is i 15 min, centrifugera sedan vid 900 × g i 10-15 min vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten, resuspendera i 1 ml RNA-extraherande reagens, virvel, frys på torris och förvara vid -80 °C.
- Alternativt kan du samla proverna direkt i 200 μl av det RNA-extraherande reagenset. Tillsätt det RNA-extraherande reagenset upp till 1 ml efter sortering, med bibehålla ett förhållande 1: 1 mellan reagenset och det sorterade provet. Virvel, frys på torris och förvara vid -80 °C.
- För bulkanalys för transposastillgängligt kromatin med sekvensering (ATAC-seq), samla 50 000-75 000 kärnor i PBS i ett mikrocentrifugrör belagt med 5% bovint serumalbumin (BSA). Frys kärnor på torris/-80 °C eller använd dem omedelbart för ATAC-beredning.
- För sn RNA-seq eller ATAC-seq, samla kärnor i 0,04% BSA i PBS (se även avsnitt 7.2).
7. Förberedelsetips för förbibliotek
- Förberedelse av bulknukleärt RNA-sekvenseringsbibliotek
- Efter uppsamling i RNA-extraktionsreagens, utför standard fenol / kloroform RNA-extraktion genom att tillsätta fenol / kloroform och fälla ut RNA från det övre vattenhaltiga skiktet med etanol, följt av DNase-matsmältning på röret (15 min).
- Utför RNA-rengöring och koncentrera i en slutlig volym av 15 μL vatten.
OBS: Med hjälp av denna metod är representativ återhämtning från 300 mg vuxen cortexprov ~ 300 000 NeuN + -kärnor (15-20 ng / μL totalt RNA efter rengöring och koncentration) och ~ 250 000 PAX6 + kärnor (10-12 ng / μL totalt RNA efter rengöring och koncentration). Detta representativa utbyte kan variera kraftigt baserat på provkvalitet, gating stringency och RNA-återhämtning. - Utföra kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) före sekvensering för att bekräfta anrikning av astrocyter baserat på högt differentiellt uttryck av kanoniska astrocytmarkörer (GFAP, SOX9), 10-formyltetrahydrofolatdehydrogenas (ALDH1L1)) och utarmning av neuronala och andra cellinjemarkörer (figur 1G).
OBS: Insamling av den dubbelnegativa populationen (NeuN-PAX6-) möjliggör en mer exakt, flerskiktad qPCR-kvalitetskontrollanalys för relativ anrikning av astrocyter (figur 2H). - Generera RNA-seq-bibliotek med hjälp av ett kit som rekommenderas för värden för lågt RNA-integritetsnummer, som förväntat från postmortem-prover.
- Förberedelse av sekvenseringsbibliotek med en kärna
- Utför sn-sekvensering genom en institutionell sekvenseringskärna.
- För nanofluidikbaserad bearbetning och sekvensering, använd den rekommenderade koncentrationen på 1 × 106 celler/ml i minst 60 μl 1x PBS + 0,04 % BSA för enkärnig RNA-sekvensering (snRNA-seq) och 3 × 106 celler/ml i minst 20 μl 1x PBS + 0,04 % BSA för enkärnsanalys för transposastillgängligt kromatin med sekvensering (snATAC-seq).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kärnor samlades in från färsk (ofixerad) snapfryst temporal neocortexvävnad med en uppsamlingstid efter döden på 12 timmar. Efter vävnadsdissociation till kärnorsuspension inkuberades prover med antikroppar mot NeuN, PAX6 och OLIG2 och sorterades enligt gating som visas i figur 1 och figur 2. Kärnor samlades in från NeuN+, PAX6+NeuN-, och OLIG2+NeuN-sorterade populationer (Figur 1E,F och Figur 2F). En riktad qPCR-panel avslöjade anrikning för pan-astrocytmarkörerna, GFAP och ALDH1L1, i PAX6+(NeuN-)populationen (figur 1G och figur 2H). Dessutom berikades OLIG2+-populationen för oligodendrocytprogenitorcellen (OPC) markör PDGFRA (figur 1G). Bulk-RNA-sekvensering av de insamlade populationerna visade jämförande anrikning av astrocytmarkörer och utarmning av neuronala markörer i PAX6+(NeuN-)populationen (figur 1H). Immunofluorescens bekräftade samlokaliseringen av PAX6 med GFAP i vuxna humana kortikala astrocyter (figur 1I).
Genom att undersöka enfärgade kontroller visas distinkta positiva och negativa populationer för varje markör, vilket möjliggjorde inställningen av exakta avgränsningar för insamling (figur 2A-G). Vidare jämfördes astrocytberikad FANS-isolering med två olika antikroppar mot astrocytkärnmarkörer, SOX9 och PAX6. En högre andel av kärnhändelserna fångades av FANS med PAX6 (~ 13,8%) än av FANS med SOX9 (~ 6%) inom den astrocytberikade porten (figur 2F, G). En riktad qPCR-panel avslöjade anrikning för GFAP-, PAX6- och SOX9 i både SOX9+(NeuN-) och PAX6+(NeuN-) populationer (Figur 2H). Att retroaktivt jämföra dissociation och färgning av flera prover med varierande postmortemintervall (PMI) för vävnadsinsamling avslöjade att ett kortare PMI var associerat med större intakt kärnåtervinning (figur 3A). Fryst vävnad med ett PMI på upp till 24 timmar gav en hög hastighet av intakta kärnor, upp till 90%; vid 30 h PMI kunde dock mycket få intakta kärnor återvinnas (figur 3A). Att inkludera ett antikroppstvättsteg i standardprotokollet (som vanligtvis utelämnar detta steg för att optimera återhämtningen) avslöjade inte signifikanta förändringar i separationen av distinkta NeuN +/- eller PAX6 +/- populationer (figur 3B).
Ibland kunde dålig separation av PAX6 + NeuN-populationer ses, även i prover med en hög andel livskraftiga kärnor (figur 3C), vilket krävde upprepning av vävnadsdissociationen och FANS-protokollet. Enkärniga RNA-seq-studier prioriterade vidare PAX6 som en toppdifferentierat uttryckt kärntranskriptionsfaktor över både protoplasmiska och fibrösa vuxna astrocytunderpopulationer, inte bara i neocortexen utan också i subventrikulära zonen (SVZ) och intilliggande striatum (figur 3D). Jämförelse av NEUN/PAX6/OLIG2 trippelFLÄKTar mellan neocortex och striatum härledda från samma hjärnprov visade regionspecifika skillnader i separationen av PAX6+-kärnor (figur 3E). Detta protokoll är för närvarande validerat endast för neocortex.
Figur 1: Validering av neuron- och astrocytberikad isolering av FANS(A-F) Representativa exempel på sekventiell FANS-gating för att utesluta skräp och dubbletter (A-C) och definiera bakgrundsfärgning med (D) en DAPI-endast kontroll för insamling av (E-F) berikade neuronala (NeuN+), astrocyt (PAX6+NeuN-) och OPC (OLIG2++NeuN-) kärnor. (G) Minimal qPCR-panel med pan-astrocyt (GFAP, ALDH1L1), neuronala (RBFOX3) och OPC (PDGFRA) markörer för kvalitetskontroll av de insamlade populationerna (A-G: temporal neocortex obduktionsprov utan patologi, 12 h PMI, 100 000 händelser visade; prickade linjer representerar positivt gated sekventiell populationer; fasta linjer representerar slutlig samling av berikade populationer av celltyp). (H) Värmekarta genererad från radnormaliserade bulk-RNA-sekvenseringsdata som visar uttryck av kanoniska astrocyt- och neuronala markörer i PAX6+ och NeuN+ sorterade populationer (n = 3 obduktionsfall, temporal neocortex utan patologi, PMI 12-21 h). (I) Representativ immunofluorescensbild av PAX6, GFAP och NeuN i human neocortex. Pilar indikerar astrocyter som samuttrycker PAX6 och GFAP. Förkortningar: FANS = fluorescensaktivera kärnämnessortering; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; NeuN = neuronala kärnor; PAX6 = parat lådprotein 6; OLIG2 = oligodendrocyttranskriptionsfaktor 2; OPC = oligodendrocyt stamcell; qPCR = kvantitativ polymeraskedjereaktion; GFAP = glialfibrillärt surt protein ; ALDH1L1 = 10-formyltetrahydrofolatdehydrogenas; RBFOX3 = RNA-bindande protein FOX-1 homolog 3; PDGFRA = trombocyt-härledd tillväxtfaktor alfa; PMI = intervall efter döden; SSC-A = sidospridningsarea; FSC-A = spridningsområde framåt; SSC-W = sidospridningsbredd; FSC-W = spridningsbredd framåt; NeuN-555 = mus anti-NeuN konjugerad till AF555; PAX6-APC = mus anti-PAX6 konjugerad till allophycocyanin; OLIG2-488 = mus anti-OLIG2 konjugerad till grönt fluorescerande färgämne för 488 nm laserlinjen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Jämförande isolering av astrocytberikade populationer med PAX6- eller SOX9-antikroppar. (F-G) Jämförande FANS-metod för astrocytberikad isolering med användning av (F) NeuN/PAX6- eller (G) NeuN/SOX9-antikroppar. En större andel händelser fångas av PAX6 än av SOX9 inom den astrocytberikade porten. (A-G: identiskt icke-patologiskt temporalt neocortexprov efter döden som används för alla experiment; 12 timmar PMI; 10 000 visade händelser). (H) Kvalitetskontroll qPCR-analys bekräftar anrikning av astrocytmarkörer och utarmning av icke-astrocytmarkörer i PAX6+(NeuN-) och SOX9+(NeuN-) sorterade populationer från F-G (data normaliserade till ACTB och kvantifierade som vikförändring av NeuN+-populationen). Förkortningar: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; NeuN = neuronala kärnor; PAX6 = parat lådprotein 6; OLIG2 = oligodendrocyttranskriptionsfaktor 2; SOX9 = transkriptionsfaktor 9 för SRY-box; qPCR = kvantitativ polymeraskedjereaktion; GFAP = glialfibrillärt surt protein ; RBFOX3 = RNA-bindande protein FOX-1 homolog 3; PDGFRA = trombocyt-härledd tillväxtfaktor alfa; PMI = intervall efter döden; NeuN-555 = mus anti-NeuN konjugerad till AF555; PAX6-APC = mus anti-PAX6 konjugerad till allophycocyanin; OLIG2-488 = mus anti-OLIG2 konjugerad till grönt fluorescerande färgämne för 488 nm laserlinjen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Beroende och oberoende mätvärden för framgångsrika FANS-experiment. (C) Exempel på ett misslyckat FANS-experiment med brist på distinkt PAX6+(NeuN-) population (till höger) trots närvaron av intakta kärnor och låg bakgrund (till vänster) (postmortem temporal neocortex, icke-patologisk, 7 h PMI). (D) Värmekartrepresentation av vuxna humana sn-seq-data som visar differentiellt uttryck av PAX6 och två andra astrocytkärnfaktorer, SOX9 och LHX2, över protoplasmiska och fibrösa astrocytunderpopulationer i både cortex och SVZ, jämfört med andra celltyper (röd färggradient representerar spektrum av lognormaliserade genomsnittliga genuttrycksvärden; n = 3 distinkta obduktionsfall, 43 619 totala kärnor. (E) Distinkta hjärnregioner (temporal neocortex vs. SVZ och subjacent striatum) visar olika mönster av NeuN/PAX6/OLIG2 separation. Förkortningar: FANS = fluorescensaktivera kärnämnessortering; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; NeuN = neuronala kärnor; PAX6 = parat lådprotein 6; OLIG2 = oligodendrocyttranskriptionsfaktor 2; GFAP = glialfibrillärt surt protein ; ALDH1L1 = 10-formyltetrahydrofolatdehydrogenas; LXH2 = LIM homeobox 2; PMI = intervall efter döden; SSC-A = sidospridningsarea; FSC-A = spridningsområde framåt; NeuN-555 = mus anti-NeuN konjugerad till AF555; PAX6-APC = mus anti-PAX6 konjugerad till allophycocyanin; OLIG2-488 = mus anti-OLIG2 konjugerad till grönt fluorescerande färgämne för 488 nm laserlinjen; SVZ = subventrikulär zon; A(p) = protoplasmiska (grå substans) astrocyter; A(f) = fibrösa (vita ämnen) astrocyter; OL = oligodendrocyter; OPC = oligodendrocyt stamceller; EN = excitatoriska neuroner; MSN = medelstora taggiga neuroner; MG = mikroglia; BVC = blodkärlsceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Experimentell design enligt det skisserade protokollet bör slutföras efter att ha beaktat flera biologiska och tekniska faktorer. Startvävnadsprover är färskfrysta, utan att ha fixats, och har helst ett kort insamlingsintervall efter döden för att maximera kärnåtervinningen. Baserat på erfarenhet möjliggör ett PMI på upp till 24 timmar tillräcklig kärnåtervinning; emellertid är ett PMI på 12 h eller mindre att föredra för att optimera intakt kärnåtervinning. Ytterligare faktorer förutom PMI, inklusive temperaturen på kroppsförvaringen och pH-nivåerna i vävnaden, kan också påverka kärnornas utbyte, men redovisades inte i dessa studier14. Av anekdotisk erfarenhet har fansåterhämtning visat sig vara jämförbar med samma vävnad som lagras upp till fem år vid -80 °C, även om kontrollerade experiment inte utfördes för att bedöma variationen i lagring på celltypsspecifikt uttryck. Att tvätta provet efter antikroppsinkuering är en annan variabel som kan behöva övervägas. I allmänhet minskar ett tvättsteg det totala utbytet, men kan förbättra separationen av distinkta immunmärkta populationer. I dessa studier observerades ingen skillnad i separationen av NEUN/PAX6-populationer när man inkluderade eller exkluderade ett tvättsteg efter antikroppar, men detta steg kan vara fördelaktigt vid användning av andra primära och sekundära antikroppar, särskilt om de inte är förkonjugerade.
På grund av variationen i sorteringsutrustningens känslighet är det nödvändigt att utföra lämpliga kontroller vid varje sorteringshändelse. Om överdrivet extracellulärt skräp ses i det återsuspenderade provet vid visualisering på en hemocytometer, kan provet ledas genom ett 40 μm filter för att endast behålla kärnorna. Om provet är begränsat kan pärlor märkta med lämplig fluorofor också användas för enfärgs- och FMO-kontroller. Om proverna inte verkar vara berikade för de önskade astrocytpopulationerna, som bestäms antingen av qPCR eller sekvenseringsresultat, kan det vara till hjälp att grinda alla NeuN- såväl som PAX6 +(NeuN-) populationer striktare, vilket ger mer utrymme mellan grindavskärningarna för positiva och negativa populationer.
De flesta av de valideringsstudier som beskrivs här utfördes med OLIG2 förutom NeuN och PAX6, för att samtidigt berika för neuronala, astrocyt- och oligodendrocytprogenitor (OPCs) kärnor. Det rekommenderas att inkludera OLIG2 som en tredje härstamningsmarkör för att berika för kortikala astrocyter mer effektivt inom NeuN-fraktionen. Närvaron eller frånvaron av FITC-konjugerad OLIG2 verkar inte förändra PAX6+-populationen; Därför är antagandet att experiment exklusive OLIG2 kommer att resultera i liknande astrocytanrikning. Observera att det är viktigt att PAX6+ populationen gateras från NeuN-populationen, eftersom vissa neuronala populationer uttrycker både NeuN och PAX615. Astrocyter kan också sorteras enligt SOX9-uttryck; färgning och sortering med SOX9 leder dock till mindre robust anrikning av astrocyter jämfört med PAX6. Även om tydlig separation observerades mellan neuronala, astrocytiska och OPC-linjer i vuxenbarken, observerades inte en liknande separation mellan PAX6+ och OLIG2+-populationer i den vuxna SVZ och intilliggande striatum.
Även om det är möjligt att vissa astrocyter från SVZ uttrycker låga nivåer av OLIG2, validerades de insamlade populationerna endast med qPCR (data visas inte); därför kan nedströms RNA-sekvensering vara till hjälp för att ytterligare definiera renheten hos dessa populationer. Dessutom kan detta protokoll anpassas för att isolera kärnor från frusen fosterhjärnvävnad och hjärntumörvävnad med hjälp av populationsspecifika kärnmarkörer. Eftersom dessa vävnader är betydligt mer cellulära kan det vara bra att börja med mindre vävnad för att minimera aggregeringen av kärnor. Vid sortering av aneuploida kärnor från neoplastisk vävnad justeras DAPI-gating för att ta hänsyn till potentiellt högre fluorescens. Det rekommenderas starkt att användare utför en noggrann validering innan de utför FANS på neoplastisk vävnad, eftersom det nuvarande protokollet endast valideras för icke-neoplastiska prover. Sammantaget lägger det ovan beskrivna protokollet fram en validerad strategi för att isolera berikade astrocytpopulationer, anpassade från tidigare etablerade protokoll för att berika för nervceller. Denna metod kan användas för att effektivt isolera astrocytkärnor från både normala och sjuka kortikala hjärnvävnader för användning i ytterligare molekylära analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka medlemmar i patologi och neurokirurgi vid Icahn School of Medicine vid Mount Sinai för hjälp med upphandling av avidentifierad hjärnvävnad och ISMMS: s Flow Cytometry CORE för expertråd. Studien finansierades delvis av NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (till N.M.T.) och R61DA048207 (till S.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
- Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. The future of neuroepigenetics in the human brain. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S.
- Akbarian, S., et al.
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).
- Tome-Garcia, J., et al. Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy. BioRxiv. , (2020).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Sun, W., et al. SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions. Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).
- Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).
- Sakurai, K., Osumi, N. The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes. Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).
- Zhong, S., et al.
- Pollen, A., et al. Molecular identity of human outer radial glia during cortical development. Cell. 163 (1), 55-67 (2015).
- Cvekl, A., Callaerts, P. PAX6: 25th anniversary and more to learn. Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).
- Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy. European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).
- Monoranu, C. M., et al. pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).
- Ninkovic, J., et al. The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA. Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).
