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Biology

आंतों के तंग जंक्शन बाधा और आयन पारगम्यता के कार्यात्मक मूल्यांकन मूल ऊतक में Ussing चैंबर तकनीक द्वारा

Published: May 26, 2021 doi: 10.3791/62468
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Physiology, Graduate School of Nutritional and Environmental Sciences, University of Shizuoka

Summary

आंत्र उपकला न केवल पोषक तत्व अवशोषण बल्कि हानिकारक पदार्थों के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करती है। एपिकल-सबसे उपकला अंतरकोशिकीय जंक्शन, यानी, तंग जंक्शन, पैरासेलुलर विलेय और आयन पारगम्यता को नियंत्रित करता है। यहां, म्यूकोसल शीट की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल और यूएसिंग चैंबर तकनीक का उपयोग करके तंग जंक्शनों की आयन चयनात्मकता के मूल्यांकन का वर्णन किया गया है।

Abstract

उस्सिंग चैंबर तकनीक का आविष्कार पहली बार डेनिश वैज्ञानिक हंस उस्सिंग द्वारा 1951 में मेंढक की त्वचा पर सोडियम के ट्रांससेलुलर परिवहन का अध्ययन करने के लिए किया गया था। तब से, इस तकनीक को झिल्ली में परिवहन के शारीरिक मापदंडों का अध्ययन करने के लिए कई अलग-अलग ऊतकों पर लागू किया गया है। Ussing कक्ष विधि अन्य तरीकों के लिए बेहतर है क्योंकि देशी ऊतक का उपयोग किया जा सकता है, जिससे यह विवो में क्या हो रहा है, इसके लिए अधिक लागू होता है। हालांकि, क्योंकि देशी ऊतक का उपयोग किया जाता है, थ्रूपुट कम होता है, समय सीमित होता है, और ऊतक की तैयारी के लिए कौशल और प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। इन कक्षों का उपयोग विभिन्न ऊतकों में विशिष्ट ट्रांसपोर्टर प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए किया गया है, सिस्टिक फाइब्रोसिस जैसे रोग पैथोफिजियोलॉजी को समझने, दवा परिवहन और अपटेक का अध्ययन करने के लिए, और विशेष रूप से आंत में पोषक तत्व परिवहन की समझ में योगदान दिया। एक ऊतक की पूरी उपकला परिवहन प्रक्रिया को देखते हुए, न केवल ट्रांसएपिथेलियल मार्ग, बल्कि पैरासेलुलर मार्ग भी महत्वपूर्ण हैं। तंग जंक्शन आंत भर में ऊतक विशिष्ट परकोशिकीय पारगम्यता का एक प्रमुख निर्धारक हैं। इस लेख में, यूएसिंग चैंबर तकनीक का उपयोग ट्रांसेपिथेलियल चालकता और कमजोर पड़ने की क्षमता को मापकर आयनों की परकोशिकीय पर्मसेलेक्टिविटी का आकलन करने के लिए किया जाएगा।

Introduction

Ussing चैंबर विधि पहली बार डेनिश वैज्ञानिक हंस उस्सिंग द्वारा विकसित किया गया था। Ussing ने पहली बार इसे मेंढक की त्वचा पर सोडियम परिवहन के शॉर्ट-सर्किट वर्तमान को मापने के लिए इस्तेमाल किया था, जब यह देखा गया था कि NaCl को एक खड़ी एकाग्रता ग्रेडिएंट 1 के खिलाफ त्वचा पर ले जाया जा सकता है। उनकी प्रणाली में मेंढक की त्वचा शामिल थी जो त्वचा के दोनों तरफ तक पहुंच के साथ दो कक्षों के बीच घुड़सवार थी। प्रत्येक कक्ष में रिंगर का समाधान होता था जिसे परिचालित और वातित किया जाता था। त्वचा के पास स्थित दो संकीर्ण आगर रिंगर पुलों और संतृप्त KCl-calomel इलेक्ट्रोड से जुड़े संभावित अंतर को मापा जाता है जैसा कि एक potentiator द्वारा पढ़ा जाता है। आगर रिंगर पुलों की एक दूसरी जोड़ी प्रत्येक कक्ष के विपरीत छोर पर स्थित थी जो बैटरी द्वारा प्रदान किए गए इलेक्ट्रोमोटिव बल को लागू करने के लिए एजीसीएल के साथ संतृप्त केसीएल के साथ संतृप्त केसीएल के साथ बीकरसे जुड़ी हुई थी। वोल्टेज को समायोजित करने के लिए एक संभावित विभाजक का उपयोग किया गया था ताकि त्वचा में संभावित अंतर शून्य रहे, इस प्रकार शॉर्ट-सर्किट की स्थिति पैदा हो। एक माइक्रोएम्पियर मीटर भी त्वचा के माध्यम से गुजरने वाले वर्तमान को पढ़ने के लिए जुड़ा हुआ था (मूल कक्ष डिजाइन के लिए ref.1 में आंकड़ा देखें)।

पिछले 70 वर्षों में, इस तकनीक को पोषक तत्वों और आयन परिवहन का अध्ययन करने के लिए कई अलग-अलग ऊतकों, विशेष रूप से आंतों के ऊतकों पर लागू किया गया है। उदाहरण के लिए, इन कक्षों में खरगोश इलियम को बढ़ाकर हैजा-प्रेरित दस्त के तंत्र का अध्ययन किया गया था, और यह पाया गया कि हैजा टॉक्सिन-प्रेरित दस्त सीएएमपी 2 द्वारा मध्यस्थता की जाती है। इसके अलावा, इन कक्षों का उपयोग ना + ग्लूकोज कोट्रांसपोर्टर 1 (एसजीएलटी 1) 3 के माध्यम से अंतर्निहित ग्लूकोज परिवहन तंत्र का अध्ययन करने के लिए भी किया गया था। हमारी प्रयोगशाला आंतों के उपकला कोशिकाओं में ट्रांससेलुलर और पैरासेलुलर परिवहन पर केंद्रित है। यूएसिंग चैंबर विधि का उपयोग करते हुए, पेप्टाइड परिवहन का मूल्यांकन क्लाउडिन 15 नॉकआउट चूहों में किया गया था, जिसमें पैरासेलुलर सोडियम परिवहन बिगड़ा हुआ है, जो गैर-हाइड्रोलाइज़ेबल डाइपेप्टाइड ग्लाइसिलसरकोसिन के अवशोषण को मापने के लिए यूएसिंग कक्षों का उपयोग करता है। यह पाया गया कि प्रोटॉन-युग्मित पेप्टाइड परिवहन 4 के लिए ल्यूमिनल ना + होमोस्टैसिस महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, इन कक्षों का उपयोग सेरीन प्रोटीज ट्रिप्सिन 5 द्वारा प्रोटीनेज सक्रिय रिसेप्टर 1 के सबम्यूकोसल सक्रियण के जवाब में मुरीन सीकम में अनियन स्राव की जांच करने के लिए भी किया गया था।

हाल ही में उपकला ऊतक में परकोशिकीय मार्गों का आकलन करने के लिए उस्सिंग कक्षों का भी उपयोग किया गया है। पराकोशिकीय मार्गों को तंग जंक्शनों द्वारा विनियमित किया जाता है, जो प्रोटीन के परिसर होते हैं जो उस बिंदु पर बनते हैं जहां दो या दो से अधिक कोशिकाएं मिलती हैं6। बाधा समारोह और आयन चयनात्मकता (चाहे ऋणायन या धनायन चुनिंदा रूप से तंग जंक्शन के माध्यम से पारित करने में सक्षम हैं) क्लाउडिन परिवार प्रोटीन की उपस्थिति से निर्धारित होता है; जिनमें से कुछ बाधाओं (क्लाउडिन 3 और 7), अनियन छिद्रों (क्लाउडिन 10 ए), या धनायन छिद्रों (क्लाउडिन 2, 10 बी, और 15)7 के रूप में कार्य करते हैं। अन्य तरीकों का उपयोग परकोशिकीय मार्ग का आकलन करने के लिए किया गया है, जैसे कि रक्त प्लाज्मा FITC एकाग्रता 8, या EDTA-Cr9 के साथ FITC के मौखिक गैवेज; हालांकि, ये तकनीकें कम रिज़ॉल्यूशन की हैं और आयन चयनात्मकता या आंतों के पथ के वर्गों के एक विशिष्ट खंड का आकलन नहीं कर सकती हैं। हालांकि, उस्सिंग कक्षों का उपयोग लक्ष्य आयनों की कमजोर पड़ने की क्षमता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, और इसलिए, तंग जंक्शनों की आयन चयनात्मकता निर्धारित करता है। उदाहरण के लिए, NaCl के साथ, Na + और Cl के लिए तंग जंक्शनों की चयनात्मकता की गणना झिल्ली के एक तरफ (आमतौर पर म्यूकोसल पक्ष) को पतला करके और ट्रांसएपिथेलियल संभावित अंतर में परिवर्तन को मापने से की जा सकती है। Na + और Cl की सापेक्ष पारगम्यता का अनुमान गोल्डमैन-हॉजकिन-काट्ज़ समीकरण 10 द्वारा लगाया जा सकता है और तंग जंक्शन की चयनात्मकता का अनुमान किमिज़ुका-कोकेत्सु समीकरण 11 का उपयोग करके लगाया जा सकता है। इसलिए, इन कक्षों में ऊतक के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मापदंडों को मापने का लाभ होता है और परिणामस्वरूप अन्य कम रिज़ॉल्यूशन विधियों की तुलना में तंग जंक्शनों के माध्यम से आयनों के पारित होने के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करते हैं।

उस्सिंग चैंबर विधि न केवल आंतों के मार्ग तक सीमित है, हालांकि यह आंत से संबंधित अध्ययनों में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, इसके कई अन्य अनुप्रयोग भी हैं। उदाहरण के लिए, इन कक्षों का उपयोग सिस्टिक फाइब्रोसिस का अध्ययन करने के लिए किया गया है, और विशेष रूप से क्लोराइड चैनल सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांसमेम्ब्रेन चालकता नियामक (सीएफटीआर) 12। सिस्टिक फाइब्रोसिस CFTR13 में एक उत्परिवर्तन के कारण होता है, जिसके परिणामस्वरूप श्वसन उपकला कोशिकाओं द्वारा बिगड़ा हुआ क्लोराइड स्राव और द्रव परिवहन होता है, और परिणामस्वरूप मोटी, शुष्क श्लेष्मा परत 14 होती है। वायुमार्ग उपकला सीएफटीआर का अध्ययन न केवल बीमारी को समझने के लिए, बल्कि बीमारी के इलाज के तरीकों की खोज करने के लिए इन कक्षों के साथ किया गया है। उदाहरण के लिए, सिस्टिक फाइब्रोसिस के कारण दुर्लभ उत्परिवर्तन वाले रोगियों में, रोगी श्वसन उपकला कोशिकाओं के विश्लेषण का उपयोग ऑर्काम्बी और एम्पलीफायर सह-चिकित्सा जैसे उपचारों का परीक्षण करने के लिए किया गया है।

यूएसिंग कक्षों का उपयोग दवा वितरण के मार्गों का अध्ययन करने के लिए भी किया गया है, जैसे कि मानव बायोप्सी ऊतक के साथ दवा के उत्थान और फार्माकोकाइनेटिक्स का अध्ययन करने के लिए 16। आंत्र अपटेक दवा वितरण का एकमात्र मार्ग नहीं है। इन कक्षों का उपयोग नाक की दवा वितरण प्रणालियों का अध्ययन करने के लिए भी किया गया है17। उस्सिंग कक्षों के साथ दवा वितरण अध्ययन भी आंखों के लिए किया गया है। खरगोश कॉर्निया में, पारगम्यता और अपटेक अध्ययन लैब्रासोल के साथ आयोजित किए गए थे, एक दवा जिसे ऊतकों में दवाओं के अवशोषण को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। एक अन्य अध्ययन ने खरगोश स्क्लेरा 19 में ट्रांसक्लेरल दवा वितरण पर बेंजीलालकोनियम क्लोराइड के प्रभाव की जांच की।

Ussing कक्ष विधि उपयोगी है क्योंकि देशी ऊतक का उपयोग किया जा सकता है। इस प्रकार, यह इन विट्रो मॉडल जैसे कि कैको -2 सेल लाइनों पर बेहतर है। हालांकि, तकनीक को नमूनों को तैयार करने के लिए कौशल और समय की आवश्यकता होती है, इसलिए यह उच्च थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं है। सेल मोनोलेयर्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों का अध्ययन इन कक्षों में सेल संस्कृति आवेषण का उपयोग करके किया जा सकता है। हाल की खोजों ने ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति के लिए अनुमति दी है जो उपकला या एंडोथेलियल स्टेम कोशिकाओं की फसल से संस्कृति में उगाए गए मिनी-अंग हैं20। ऑर्गेनोइड संस्कृति को एक मोनोलेयर में उगाने के लिए हेरफेर किया जा सकता है, जिससे एक यूएसिंग चैंबर 21 में ऑर्गेनोइड्स माउंट करना संभव हो जाता है। विभिन्न उपकला और एंडोथेलियल ऊतकों के ऑर्गेनोइड्स का अध्ययन किया जा सकता है, जिससे आवश्यक जानवरों की संख्या कम हो जाती है, क्योंकि ऑर्गेनोइड संस्कृति को लंबे समय तक बनाए रखा जा सकता है। यह थ्रूपुट को भी बढ़ाएगा क्योंकि समय लेने वाला और श्रमसाध्य ऊतक विच्छेदन और तैयारी के चरणों की आवश्यकता नहीं होगी। भविष्य में, उस्सिंग चैंबर अध्ययन ऊतक परिवहन का अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी रहेगा और वे व्यक्तिगत चिकित्सा के क्षेत्र में विशेष रूप से महत्वपूर्ण होंगे।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल क्लाउडिन 15 नॉकआउट (Cldn15-/-) चूहों और जंगली प्रकार (WT) नियंत्रणों की छोटी आंत में तंग जंक्शनों के permselectivity और बाधा समारोह का आकलन करने के लिए Ussing कक्ष विधि के आवेदन को दर्शाता है NaCl की कमजोर पड़ने की क्षमता को मापने के द्वारा। तंग जंक्शन (टीजे) उस बिंदु पर बनते हैं जहां उपकला और एंडोथेलियल ऊतक में दो या दो से अधिक कोशिकाएं मिलती हैं। द्विकोशिकीय तंग जंक्शनों (bTJ), विशेष रूप से bTJ के भीतर पाए जाने वाले क्लाउडिन परिवार के प्रोटीन, को TJ7 के बाधा समारोह और permselectivity को निर्धारित करने के लिए सोचा जाता है। Cldn15-/- चूहों में एक मेगा छोटी आंत 22 होती है और आंतों के ना + रीसाइक्लिंग के नुकसान के कारण पोषक तत्वों की वृद्धि क्षमता कम हो जाती है जो क्लाउडिन 154,23,24 के माध्यम से होती है। Cldn15-/- चूहों ने ना + होमियोस्टैसिस को खराब कर दिया है, जो उन्हें टीजे की पर्मसेलेक्टिविटी का अध्ययन करने के लिए एक दिलचस्प मॉडल बनाता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल मध्य छोटी आंत में NaCl (PNa / PCl) की कमजोर पड़ने की क्षमता को मापकर NaCl के लिए TJ की पारगम्यता का आकलन करता है। संक्षेप में, झिल्ली के एक तरफ को पतला करके होने वाले झिल्ली संभावित अंतर में परिवर्तन (एम साइड या एस साइड, दोनों को नीचे दिए गए प्रोटोकॉल में मापा जाता है) का उपयोग Na + (PNa) और Cl- (PCl) की पारगम्यता की गणना करने के लिए किया जा सकता है, और कमजोर पड़ने की क्षमता (PNa / PCl) दिखाएगी कि तंग जंक्शन में एक कैटिओनिक या एनिओनिक चयनात्मकता है या नहीं।

इस प्रोटोकॉल में प्रयोगएक अनुकूलित Ussing कक्ष (चित्रा 1A) का उपयोग करके आयोजित किए गए थे, जिसमें दो हिस्से होते हैं, जिसके बीच आंतों की तैयारी लंबवत रूप से घुड़सवार होती है, वोल्टेज क्लैंप एम्पलीफायर, इलेक्ट्रिकल रिकॉर्डर, इलेक्ट्रोड, नमक पुल, रिंगर का समाधान, HEPES बफर (150 mM NaCl), पतला HEPES बफर (75 mM NaCl), आंतों की तैयारी (उपकरणों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)।

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Protocol

इन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले सभी जानवरों को शिज़ुओका विश्वविद्यालय में पशु देखभाल सुविधा में बनाए रखा गया था और प्रयोगों को शिज़ुओका विश्वविद्यालय द्वारा निर्धारित पशु अनुसंधान के दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था। सभी प्रयोगों को शिज़ुओका विश्वविद्यालय में पशु देखभाल और उपयोग समिति से अनुमोदन के साथ किया गया था (परमिट # 205272 और # 656-2303)।

1. NaCl इलेक्ट्रोड की तैयारी

नोट: इन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले इलेक्ट्रोड में केंद्रित NaCl या KCl शामिल हैं। KCl/calomel इलेक्ट्रोड व्यावसायिक रूप से खरीदे जाते हैं। प्रयोग शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि सभी इलेक्ट्रोड केंद्रित NaCl या KCl समाधान के साथ शीर्ष पर भरे हुए हैं।

  1. प्लास्टिक के ढक्कन (वॉल्यूम 20 एमएल) के साथ छोटे ग्लास जार तैयार करें।
  2. प्लास्टिक के ढक्कन में दो छेद ड्रिल करें, एक NaCl नमक पुल (2.5 मिमी व्यास) के लिए, और दूसरा चांदी के तार (1 मिमी व्यास) के लिए; चित्रा 1C, NaCl इलेक्ट्रोड)।
  3. संतृप्त NaCl समाधान के साथ ग्लास जार भरें (लगभग 15 मिलीलीटर, पूर्ण होने तक)।
  4. जार में चांदी के तार (0.8 मिमी व्यास, 7 सेमी लंबा) डालें, लेकिन सुनिश्चित करें कि जार के बाहर तार के हिस्से को एम्पलीफायर सिस्टम के लिए मगरमच्छ क्लिप (छोटे आकार) के माध्यम से जोड़ा जा सकता है।
  5. जब उपयोग में नहीं है, तो इलेक्ट्रोड लपेटें और सुनिश्चित करें कि सूखने से रोकने के लिए पैराफिल्म के साथ छेद कवर किए गए हैं।

2. नमक पुलों की तैयारी

नोट: ठोस करने के लिए पर्याप्त समय प्रदान करने के लिए प्रयोग से कम से कम एक दिन पहले नमक पुल तैयार करें। नमक पुलों का बार-बार उपयोग किया जा सकता है लेकिन 2 महीने के बाद उपयोग की सिफारिश नहीं की जाती है।

  1. NaCl नमक पुलों
    1. # 7 पॉलीइथाइल टयूबिंग (बाहरी व्यास 2.3 मिमी, आंतरिक व्यास 1.3 मिमी), 19 जी सुई और लॉक-प्रकार की सिरिंज, 1 एम NaCl समाधान के 200 मिलीलीटर, 2 जी आगर, नमक पुल भंडारण के लिए सील करने योग्य प्लास्टिक कंटेनर तैयार करें।
    2. उसिंग चैंबर सेट अप के लिए आवश्यक आकार में टयूबिंग को काटकर नमक पुलों की उचित संख्या तैयार करें (प्रत्येक कक्ष को दो नमक पुलों की आवश्यकता होती है)।
    3. आगर के इंजेक्शन से पहले, ट्यूबों के साथ एक यू आकार बनाएं और उन्हें गर्म पानी के बीकर में रखें (नमक पुलों की स्थापना के लिए एक आसान आकार बनाने के लिए)।
    4. विआयनीकृत पानी में 200 मिलीलीटर में NaCl के 11.688 ग्राम को भंग करके 1 M NaCl का 200 mL बनाएं।
    5. 1 M NaCl को 100 mL भागों में विभाजित करें: 1 M NaCl में 2% अगर के 100 mL बनाएं (NaCl में 2 g agar मिलाएं, भंग करने के लिए माइक्रोवेव में गर्मी)।
    6. एक 19 जी सुई का उपयोग करना और सिरिंज को लॉक करना, सिरिंज को 1 एम NaCl / आगर समाधान के साथ भरें। धीरे से बूंद-बूंद घोल को बाहर निकालना शुरू करें और ऐसा करते समय सुई को ट्यूब के एक छोर में डालें और तब तक भरें जब तक कि मिश्रण दूसरी तरफ से बाहर न आ जाए।
    7. धीरे-धीरे सुई को वापस ले लें, जबकि अभी भी समाधान को व्यक्त करते हैं और तब तक दोहराएं जब तक कि सभी आवश्यक नमक पुल नहीं बन जाते हैं। (यदि समाधान सिरिंज या सुई में ठोस हो जाता है, तो इसे गर्म पानी में संक्षेप में गर्म करें जब तक कि समाधान को फिर से व्यक्त नहीं किया जा सकता।
    8. यह सुनिश्चित करने के लिए नमक पुलों की जांच करें कि कोई बुलबुले नहीं हैं और शेष 1 M NaCl समाधान में एक सील योग्य कंटेनर में स्टोर करें।
  2. KCl नमक पुलों
    नोट: पतले टयूबिंग का उपयोग केसीएल आगर पुलों के लिए बफर में K + एकाग्रता की वृद्धि से बचने के लिए किया जाता है, क्योंकि नमक पुल युक्तियाँ भंग हो सकती हैं और K + बफर में रिसाव कर सकती हैं।
    1. # 3 पॉलीइथाइल टयूबिंग (बाहरी व्यास 1.0 मिमी, आंतरिक व्यास 0.5 मिमी), 23 जी सुई और लॉक प्रकार सिरिंज, 1 एम केसीएल समाधान के 200 मिलीलीटर, 2 जी आगर, नमक पुल भंडारण के लिए सील करने योग्य प्लास्टिक कंटेनर तैयार करें।
    2. उसिंग चैंबर के लिए आवश्यक आकार में टयूबिंग को काटकर नमक पुलों की उचित संख्या तैयार करें (प्रत्येक कक्ष को दो नमक पुलों की आवश्यकता होती है)।
    3. विआयनीकृत पानी के 200 मिलीलीटर में KCl के 14.91 ग्राम को भंग करके 1 M KCl का 200 mL बनाएं।
    4. दो 100 मिलीलीटर भागों में विभाजित करें: 1 एम केसीएल में 2% आगर का 100 मिलीलीटर बनाएं (केसीएल में 2 ग्राम आगर मिलाएं, भंग करने के लिए माइक्रोवेव में गर्मी)।
    5. एक 23 जी सुई का उपयोग करना और सिरिंज को लॉक करना, 2% आगर 1 एम केसीएल मिश्रण के साथ टयूबिंग इंजेक्ट करें (सुनिश्चित करें कि ट्यूब पूरी तरह से भरे हुए हैं और कोई बुलबुले नहीं हैं) उसी तरह से जैसे NaCl नमक पुलों के साथ।
    6. यह सुनिश्चित करने के लिए नमक पुलों की जांच करें कि कोई बुलबुले नहीं हैं और एक सील योग्य कंटेनर में शेष 1 एम केसीएल समाधान में स्टोर करें।

3. है रिंगर समाधान और HEPES बफर की तैयारी

नोट: Ussing कक्ष में घुड़सवार ऊतक के आधार पर, रिंगर के समाधान के घटक अलग हो सकते हैं। यहां प्रस्तुत व्यंजनों छोटी और बड़ी आंत के लिए विशिष्ट हैं।

  1. प्रयोगों के दिन रिंगर के समाधान को ताजा बनाएं जैसा कि तालिका 1 में वर्णित है।
  2. ऊतक और एक बफरिंग क्षमता के लिए O2 प्रदान करने के लिए 95% O2 /5% CO2 के साथ समाधान बुलबुला।
रिंगर का समाधान (छोटी आंत) रिंगर का घोल (बड़ी आंत)
NaHCO3 – 21.0 mM NaHCO3 – 21.0 mM
K2HPO4 – 2.4 mM K2HPO4 – 2.4 mM
KH2PO4 – 0.6 mM KH2PO4 – 0.6 mM
NaCl – 119.0 mM NaCl – 119.0 mM
MgCl2 – 1.2 mM MgCl2 – 1.2 mM
CaCl2 – 1.2 mM CaCl2 – 1.2 mM
Indomethacin - 10 μM (21 mM NaHCO3 में 1 mM स्टॉक बनाएं, रिंगर के समाधान के 1 L के लिए स्टॉक का 10 mL जोड़ें) Indomethacin - 10 μM (21 mM NaHCO3 में 1 mM स्टॉक बनाएं, रिंगर के समाधान के 1 L के लिए स्टॉक का 10 mL जोड़ें)
1 mM Glutamine (0.146 g/L) 10 mM ग्लूकोज

तालिका 1: रिंगर समाधान नुस्खा. रिंगर का समाधान बनाने के लिए, सभी घटकों को डी-आयनीकृत पानी के साथ मिलाएं। रिंगर का समाधान प्रयोगों से पहले सबसे अच्छा ताजा किया जाता है। उपयोग करने तक रेफ्रिजरेटर में या बर्फ पर रखें। उपयोग करने से पहले, 95% O2/5% CO2 के साथ गैस।

  1. प्रयोग के दिन HEPES बफर ताजा के रूप में तालिका 2 में वर्णित de-ionized पानी में सामग्री मिश्रण द्वारा बनाएँ.
  2. पीएच समायोजन के बाद तक बफर की अंतिम मात्रा में समायोजित न करें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म HEPES बफर और धीरे-धीरे 1 M Tris समाधान की बूँदें जोड़कर pH को 7.4 करने के लिए समायोजित करते हैं, जबकि सरगर्मी.
  4. विआयनीकृत पानी की उचित मात्रा को जोड़कर अंतिम मात्रा में समायोजित करें।
हेप्स बफर तनुकरण HEPES बफ़र
HEPES - 10 mM HEPES - 10 mM
ग्लूकोज - 10 mM (बड़ी आंत) ग्लूकोज - 10 mM (बड़ी आंत)
1 mM Glutamine (0.146 g/L) (छोटी आंत) 1 mM Glutamine (0.146 g/L) (छोटी आंत)
NaCl – 150 mM NaCl - 75 mM + 150 mM mannitol (osmolality मतभेदों के लिए समायोजित करने के लिए)
MgCl2 – 1 mM MgCl2 – 1 mM
CaCl2 – 2 mM CaCl2 – 2 mM
Indomethacin - 10 μM (21 mM NaHCO3 में 1 mM स्टॉक करें, रिंगर के समाधान के 1 L के लिए स्टॉक का 10 mL जोड़ें) Indomethacin - 10 μM (21 mM NaHCO3 में 1 mM स्टॉक करें, रिंगर के समाधान के 1 L के लिए स्टॉक का 10 mL जोड़ें)
1 M Tris का उपयोग करके pH 7.40 (37°C) को समायोजित करें

तालिका 2: HEPES बफर नुस्खा. HEPES बफर और कमजोर पड़ने HEPES बफर बनाने के लिए, de-ionized पानी में सभी अवयवों को भंग. समाधान को पीएच को 1 एम ट्रिस समाधान के साथ समायोजित किया जाना चाहिए, इसलिए पानी की पूरी मात्रा न जोड़ें (उदाहरण के लिए, 1 एल बनाते समय, लगभग 800 मिलीलीटर पानी में सभी सामग्रियों को भंग करें)। फिर समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें, पीएच को 7.4 पर समायोजित करें और फिर अंतिम मात्रा को समायोजित करें।

4. Ussing कक्ष सेटअप

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले Ussing कक्ष कस्टम-निर्मित निरंतर परफ्यूजन कक्ष हैं। माउस आंतों की बाधा समारोह या पोषक तत्वों के उत्थान का आकलन करने के लिए, 4 या 5 मिमी व्यास के उद्घाटन के साथ कक्षों की सिफारिश की जाती है25 (चित्रा 1 ए-सी)।

  1. एज इफेक्ट 26 को कम करने और कक्षों को सील करने में मदद करने के लिए, स्थापित करने से पहले 4 या 5 मिमी छेद छिद्रित पैराफिन फिल्म (लगभग 4 सेमी 2) संलग्न करें (चित्रा 1 बी)।
  2. तनुकरण संभावित माप के लिए खुले परिपथ स्थितियों में स्थापित करें. वर्तमान क्लैंप मोड में सेट करें. आउटपुट को वर्तमान के रूप में सेट करें और वर्तमान पल्स को ±20 μA पर सेट करें।
  3. शॉर्ट सर्किट वर्तमान और ट्रांसम्यूकोसल प्रतिरोध के माप के लिए शॉर्ट सर्किट की स्थिति में स्थापित करते समय, वोल्टेज क्लैंप मोड में सेट करें। आउटपुट को वोल्टेज के रूप में सेट करें और वोल्टेज पल्स को ±5 mV पर सेट करें।
  4. सुनिश्चित करें कि 37 डिग्री सेल्सियस पानी जैकेट में घूम रहा है।
  5. रिंगर के समाधान या HEPES बफर के साथ प्रत्येक कक्ष को भरें (राशि उपयोग की जाने वाली प्रणाली पर निर्भर करती है, यहां उपयोग किए जाने वाले कक्षों को प्रत्येक पक्ष के लिए 5 एमएल की आवश्यकता होती है) और सुनिश्चित करें कि कोई रिसाव नहीं है।
  6. नमक पुलों और इलेक्ट्रोड को कनेक्ट करें।
  7. सुनिश्चित करें कि वोल्टेज 0 और स्थिर है, पल्स करंट यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमक पुल और इलेक्ट्रोड ठीक से स्थापित किए गए हैं।
  8. सिस्टम और रिंगर के समाधान के तापमान को कम से कम 20 मिनट के लिए संतुलित करने की अनुमति दें।
  9. संतुलन के बाद, KCl इलेक्ट्रोड के बीच विषम वोल्टेज अंतर को सही करें और इसे शून्य में बदलकर द्रव प्रतिरोध के लिए क्षतिपूर्ति करें (सही तरीके से निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले यूएसिंग चैंबर सिस्टम के लिए मैनुअल की जांच करें)।

5. आंतों के ऊतकों का विच्छेदन

नोट: सभी पशु प्रयोग देश और विश्वविद्यालय द्वारा निर्धारित नियमों के भीतर किए जाने चाहिए।

  1. आंतों के ऊतक लेने से पहले, 15 मिनट (चरण 3) के लिए 95% O2 और 5% CO2 के साथ ताजा, बर्फ-ठंडा रिंगर का समाधान और बुलबुला तैयार करें।
  2. अनुसंधान में जानवरों के उपयोग को नियंत्रित करने वाले दिशानिर्देशों के अनुसार चूहों को एनेस्थेटिक करें। इस प्रयोग के लिए, चूहों को एक एनेस्थेटाइज़र द्वारा प्रशासित 2% -3% आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटिक किया गया था। पैर की उंगलियों को चुटकी देकर उचित संज्ञाहरण की जांच करें और यह सुनिश्चित करें कि कोई दर्द प्रतिक्रिया नहीं है।
  3. श्रोणि से डायाफ्राम तक कैंची के साथ पेट में एक चीरा बनाएं; पेट का पता लगाने और पेट के पाइलोरिक अंत में कटौती।
  4. संदंश के साथ छोटी आंत से जुड़े पेट के हिस्से को पकड़ें और मेसेन्टेरिक अनुलग्नकों को काटते हुए धीरे-धीरे छोटी आंत को खींचें। सावधान रहें कि आंतों के ऊतकों को किसी भी तरह से न काटें या नुकसान न पहुंचाएं।
  5. गुदा के लिए सभी तरह से आंत विच्छेदन जारी रखें। बड़ी आंत को पूरी तरह से हटाने के लिए, बड़ी आंत के दूरस्थ हिस्से को प्रकट करने के लिए श्रोणि की हड्डियों को काट लें और अनुलग्नकों को काटकर आंत के बाकी हिस्सों को सावधानीपूर्वक हटा दें।
  6. आंत की लंबाई को मापें और वांछित खंडों में विभाजित करें। इस प्रयोग के लिए, छोटी आंत को तीन खंडों में विभाजित करें और मध्य खंड का उपयोग करें।
  7. वांछित खंडों को बर्फ के ठंडे, बबल्ड रिंगर के समाधान में रखें; फिर, प्रत्येक खंड अनुदैर्ध्य रूप से mesenteric अनुलग्नकों के साथ काटने के द्वारा खोलें। वसा और संयोजी ऊतक को दूर ट्रिम करें।
  8. खंडों को बर्फ-ठंडे रिंगर के समाधान पर वापस लाएं और अच्छी तरह से धो लें (यहां तक कि बर्फ-ठंडे समाधान में भी, उपकला समारोह को बनाए रखने के लिए ल्यूमिनल एपिथेलियम का ऑक्सीकरण महत्वपूर्ण है)।

6. मांसपेशियों की परत को अलग करना और आंतों की चादर की तैयारी

नोट: आंत का उपयोग करके परिवहन अध्ययन के लिए सेरोसा (मांसपेशी परत) को हटाना महत्वपूर्ण है। यदि सेरोसा रहता है, तो आंतों के ऊतक यादृच्छिक मांसपेशियों के संकुचन के अधीन हो सकते हैं जो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल डेटा को विकृत कर देंगे, और परिवहन को बाधित किया जा सकता है। Unstripped ऊतक तेजी से बिगड़जाता है जब Ussing कक्षों में घुड़सवार, के बाद सेरोसा सब्सट्रेट और ऑक्सीजन के लिए एक महत्वपूर्ण प्रसार बाधा है. कुछ विशेष मामलों में, मांसपेशियों की परत को बनाए रखना आवश्यक हो सकता है, इसलिए निर्णय शोधकर्ता और प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर है। आंतों की चादरों को दो तरीकों से तैयार किया जा सकता है जो इस बात पर निर्भर करता है कि किस परत को हटा दिया गया है (चित्र2)। इस प्रयोग के लिए, म्यूकोसा और सबम्यूकोसल तैयारी की आवश्यकता होती है (चित्रा 2, दूसरा पैनल)।

  1. सिलिकॉन रबर, पिन (छोटे एक्यूपंक्चर सुइयों), 5 मिमी छिद्रित फिल्टर पेपर और पैराफिल्म वर्गों (2 सेमी x 2 सेमी; अन्य प्रणालियों के लिए आवश्यक नहीं हो सकता है) के साथ कवर विच्छेदन प्लेटों (10 सेमी व्यास) तैयार करें।
  2. विच्छेदन प्लेट में ताजा, बर्फ-ठंडा, बुलबुला रिंगर के समाधान को डालें (ऊतक को कवर करने के लिए पर्याप्त, लगभग 2-3 मिलीलीटर)।
  3. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, आंतों के ऊतकों के सिरों को पिन करें (म्यूकोसल साइड नीचे)।
  4. ठीक संदंश का उपयोग करते हुए, अंतर्निहित म्यूकोसा से मांसपेशियों की परत को स्पष्ट रूप से विच्छेदन करें।
  5. ऊतक में किसी भी छेद को फाड़ने या पेश करने के लिए सावधान रहें।
  6. एक बार मांसपेशियों की परत को हटा दिए जाने के बाद, 5 मिमी व्यास के उद्घाटन के लिए पर्याप्त बड़ा टुकड़ा काट लें। छोटी आंत को तैयार करते समय, सेरोसा-मांसपेशियों की परत को हटाने के लिए 10 मिनट के भीतर किया जाना चाहिए, क्योंकि इन परिस्थितियों में ल्यूमिनल ऑक्सीजनेशन मुश्किल है।
  7. रिंगर के समाधान में गीला 5 मिमी छिद्रित फ़िल्टर पेपर स्क्वायर और आंतों के ऊतकों को म्यूकोसल साइड के साथ नीचे रखें, क्योंकि सबम्यूकोसल तैयारी अनायास बाहर म्यूकोसल पक्ष के साथ लपेटती है।
  8. सुनिश्चित करें कि उद्घाटन पूरी तरह से आंतों के ऊतकों द्वारा कवर किया गया है और कोई झुर्रियां मौजूद नहीं हैं। तैयारी के नीचे एक काले बोर्ड का उपयोग करें यह जांचने के लिए कि उद्घाटन पूरी तरह से कवर किया गया है या नहीं।
  9. म्यूकोसल तैयारियों की आवश्यक संख्या के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं (इस प्रयोग में दो तैयारी की आवश्यकता होती है: एक तैयारी का उपयोग कमजोर पड़ने की क्षमता को मापने के लिए किया जाएगा, और दूसरे का उपयोग बेसलाइन विद्युत मापदंडों को मापने के लिए किया जाएगा)।

7. Ussing कक्षों में बढ़ते आंतों की तैयारी

नोट:: सेट अप Ussing कक्ष प्रणाली और रिकॉर्डिंग सिस्टम का उपयोग किया के प्रकार पर निर्भर करेगा।

  1. Ussing कक्ष से रिंगर के समाधान / HEPES बफर बाहर सक्शन.
  2. Ussing कक्ष disassemble और आंत्र तैयारी mucosal पक्ष के साथ फिल्टर पेपर रखना mucosal पक्ष कक्ष पर नीचे और समायोजित इतना है कि कक्ष की खिड़की फिल्टर कागज के छेद के साथ संरेखित (चित्रा 1A, कक्ष खिड़की के चारों ओर काले अंकन तैयारी के संरेखण के लिए उपयोगी है).
  3. ध्यान से म्यूकोसल साइड चैंबर पर सेरोसल साइड चैंबर रखें और कसकर बंद करें लेकिन सुनिश्चित करें कि कनेक्शन के दौरान आंतों की शीट स्थानांतरित नहीं हुई है।
  4. रिंगर के समाधान या HEPES बफर के साथ दोनों कक्षों को जल्दी से फिर से भरें, और बुदबुदाते हुए छड़ी (रिंगर का समाधान: 95% O2/ HEPES बफर: 100% O2) कक्षों के विपरीत छोर पर, झिल्ली से दूर (तैयारी के बहुत करीब bubbling माप पर प्रभाव पड़ सकता है)।
  5. नमक पुलों को फिर से कनेक्ट करें और जांचें कि क्या वोल्टेज स्थिर है और यह सुनिश्चित करने के लिए पल्स करंट है कि कनेक्शन ठीक हैं (चित्रा 1 सी)।
  6. प्रत्येक आंतों की तैयारी के लिए दोहराएं।
  7. सिस्टम को लगभग 15 मिनट के लिए संतुलित होने दें। यदि रिकॉर्डिंग सिस्टम का उपयोग कर रहे हैं, तो प्रयोगों को शुरू करने से पहले चालकता और आईएससी / झिल्ली संभावित अंतर को स्थिर होने दें।

8. तनुकरण संभावित प्रयोग (खुला सर्किट शर्तों)

  1. HEPES बफर को सक्शन करके कक्ष के दोनों किनारों को धोएं और प्रत्येक पक्ष में ताजा पूर्व-गर्म HEPES बफर के 5 मिलीलीटर जोड़कर।
  2. रिकॉर्डिंग सिस्टम को चालू करें. 250 mV के लिए सीमा सेट करें, (यहां उपयोग की जाने वाली प्रणाली आउटपुट वोल्टेज 10x को बढ़ाती है), मार्कर पदों को सेट करती है, और मापने के लिए रिकॉर्डिंग सिस्टम सेट करती है।
  3. दबाना मोड और मापने शुरू करने के लिए Ussing कक्ष प्रणालियों बारी. एक बार झिल्ली क्षमता स्थिर हो जाने के बाद (~ 15-20 मिनट), मूल्यांकन शुरू हो सकता है।
  4. Mucosal पक्ष से HEPES बफर सक्शन और जल्दी से गर्म कमजोर पड़ने HEPES बफर के 75 mM NaCl युक्त के 5 mL के साथ प्रतिस्थापित करें।
  5. एक बार जब झिल्ली क्षमता चरम पर पहुंच जाती है (5-10 मिनट), तो "म्यूकोसल" पक्ष से कमजोर पड़ने वाले बफर को हटा दें और HEPES बफर के साथ बदलें।
  6. यदि आवश्यक हो, तो Serosal पक्ष के लिए चरण 3 दोहराएँ, Serosal पक्ष के लिए कमजोर पड़ने HEPES बफ़र जोड़ना।
  7. यह सुनिश्चित करने के लिए कि ऊतक व्यवहार्य है, सेरोसल पक्ष में एडेनिलेट साइक्लेज़ एक्टिवेटर फॉर्सकोलिन (अंतिम एकाग्रता 10 μM) जोड़ें।
  8. एक बार जब झिल्ली संभावित अंतर एक शिखर पर पहुंच गया है और गिरावट शुरू हो गई है, तो प्रयोग खत्म हो गया है।

9. transepithelial विद्युत चालकता और आधार रेखा Isc (शॉर्ट सर्किट की स्थिति) का मापन

  1. रिंगर के समाधान को सक्शन करके कक्ष के दोनों किनारों को धोएं और प्रत्येक पक्ष में ताजा बुलबुले वाले रिंगर के समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़कर।
  2. रिकॉर्डिंग सिस्टम को चालू करें. 2.5 V पर सीमा सेट करें (यहां उपयोग की जाने वाली प्रणाली आउटपुट वोल्टेज 10x को बढ़ाती है), मार्कर पदों को सेट करती है, और मापने के लिए रिकॉर्डिंग सिस्टम सेट करती है।
  3. क्लैंप मोड और मापना शुरू करने के लिए कक्ष प्रणालियों को Ussing बारी; एक बार जब आईएससी और चालकता स्थिर हो जाती है (~ 15-20 मिनट), बेसलाइन माप प्राप्त किया जा सकता है।
  4. यह सुनिश्चित करने के लिए कि ऊतक व्यवहार्य है, सेरोसल पक्ष में एडेनिलेट साइक्लेज़ एक्टिवेटर फोर्सकोलिन (अंतिम एकाग्रता 10 μM) जोड़ें।
  5. एक बार झिल्ली संभावित अंतर एक शिखर पर पहुंच गया है और गिरावट शुरू हो गई है, प्रयोग किया जाता है।

10. परिणामों का विश्लेषण

  1. ओपन-सर्किट स्थितियों के तहत, ओम के नियम के अनुसार वर्तमान दालों के जवाब में वोल्टेज के परिवर्तन से ट्रांसम्यूकोसल चालकता की गणना करें। ओम के नियम को लागू करते हुए ट्रांसम्यूकोसल वोल्टेज और चालकता से समतुल्य शॉर्ट सर्किट करंट (आईएससी) निर्धारित करें।
  2. गोल्डमैन-हॉजकिन-काट्ज समीकरण 10 के साथ सापेक्ष आयनिक चयनात्मकता (PNa / PCl) की गणना करने के लिए NaCl की कमजोर पड़ने की क्षमता का उपयोग करें।
  3. Kimizuka-Koketsu equation11 का उपयोग करके प्रत्येक आयन के लिए तंग जंक्शन की पूर्ण चयनात्मकता का अनुमान लगाएं।
  4. कमजोर पड़ने की क्षमता से गोल्डमैन-हॉजकिन-काट्ज़ समीकरण का उपयोग करके PNa / PCl की गणना करें, और किमिजुका-कोकेत्सु समीकरण से पूर्ण पारगम्यता PNa और PCl निर्धारित करें जैसा कि यू एट अल.10 द्वारा वर्णित है:
    Equation 1
    Equation 2
    Equation 3
    Equation 4
    जहां, वी: कमजोर पड़ने की क्षमता (एमवी); α: गतिविधि अनुपात. HEPES बफ़र में NaCl की परिकलित गतिविधि को कमजोर पड़ने वाले HEPES बफर में NaCl की परिकलित गतिविधि से विभाजित किया गया था (इस प्रयोग के लिए इसकी गणना 1.8966 के रूप में की गई थी); e: गणितीय स्थिरांक, 2.71828; जीएम: ट्रांसम्यूकोसल चालकता (एमएस / सेमी 2); एफ: फैराडे स्थिरांक (96,485.3329 सी / मोल); आर: गैस स्थिरांक (8.314 जे / मोल के); टी: तापमान (310.15 K)

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Representative Results

इस पेपर में दिखाए गए परिणाम ऐसे परिणाम हैं जो बड़ी परियोजना का हिस्सा थे जो पूरा हो गया है (देखें ref.4,23,24)।

Cldn15-/- चूहों में छोटी आंत की ट्रांसेपिथेलियल विद्युत चालकता कम हो जाती है ।
Cldn15-/- चूहों में मध्य छोटे आंतों के खंड की बेसलाइन ट्रांसम्यूकोसल चालकता (शॉर्ट सर्किट परिस्थितियों के तहत) जंगली प्रकार के चूहों में मापी गई तुलना में कम थी (चित्रा 3A; 22.3 mS / cm2 और Cldn15- / - और जंगली प्रकार के चूहों में क्रमशः 48.7 mS / cm2)। बेसलाइन शॉर्ट सर्किट करंट (आईएससी) को Cldn15-/- चूहों (चित्रा 3B) में भी मापा गया था। बेसलाइन आईएससी में वृद्धि हुई थी (चूंकि Na-निर्भर ग्लूटामाइन परिवहन अपरेगुलेटेड है, संदर्भ 23 देखें) Cldn15-/- चूहों में नियंत्रण की तुलना में (चित्रा 3B; 36.0 μA / cm2 एक 26.9 μA / cm2 cldn15- / - और जंगली प्रकार के चूहों में क्रमशः)।

Cldn15-/- चूहों में तनुकरण क्षमता कम हो जाती है
Cldn15-/- चूहों में NaCl के लिए छोटे आंतों के म्यूकोसा की चयनात्मकता का आकलन करने के लिए, कमजोर पड़ने की क्षमता को एक एकाग्रता ढाल के साथ मापा गया था (म्यूकोसल पक्ष पर 60 mmol / L NaCl और serosal पक्ष पर 119 mmol / L NaCl)। Luminal NaCl कमजोर पड़ने पर, एक सकारात्मक संभावित अंतर (9.2 mV) सेरोसल पक्ष के संबंध में WT चूहों (चित्रा 3 C) में देखा गया था। हालांकि, इस सकारात्मक कमजोर पड़ने की क्षमता Cldn15-/- चूहों (चित्रा 3C; 0.8 mV) में कम हो गई थी। NaCl (PNa / PCl) की सापेक्ष पारगम्यता की गणना ऊपर के रूप में की गई थी और यह पाया गया था कि यह Cldn15-/- चूहों में कम हो गया था, जो क्रमशः कम संभावित अंतर (चित्रा 3 D; 1.1 और 3.5, Cldn15-/- और WT चूहों, क्रमशः) के समान था। PNa / PCl > 0.7 का मतलब है कि Na + और Cl- एक कैटिओनिक चयनात्मक रंध्र के माध्यम से फैलाते हैं (संदर्भ 27 में चित्र 4 देखें)। इस डेटा से, यह कहा जा सकता है कि Cldn15-/- चूहों में मध्य छोटी आंत की कैटिओनिक चयनात्मकता कम हो जाती है। यह चालकता डेटा (चित्रा 3 ए) से सहमत है, जो Cldn15-/- चूहों के लिए एक कमी दिखाता है, जिसका अर्थ है कि पैरासेलुलर मार्गों में कमी आई है।

इसके बाद, Na + (PNa) और Cl- (PCl) की पूर्ण पारगम्यता की गणना की गई थी। PNa को Cldn15-/- चूहों में कम पाया गया था (चित्रा 3E; 3.28 x 10-4 सेमी /s और 10.92 x 10-4 सेमी /s, Cldn15-/- और WT चूहों, क्रमशः); हालांकि, PCl को बदलने के लिए प्रतीत नहीं होता था (चित्रा 3F), यह दर्शाता है कि सापेक्ष पारगम्यता में कमी Na + की पारगम्यता में कमी के कारण है। यह परिणाम समझ में आता है क्योंकि Cldn15-/- चूहों ने क्लाउडिन 15 में ना + छिद्र खो दिया है, जिसका अर्थ है कि ना + के लिए उपलब्ध मार्गों को कम कर दिया गया है।

आंतों की तैयारी में व्यवहार्यता का आकलन
अंत में, आंतों की तैयारी की व्यवहार्यता की जांच करने के लिए, एडेनिलेट साइक्लेस एक्टिवेटर, फॉर्सकोलिन, को सेरोसल पक्ष में जोड़ा गया था, जो सीएफटीआर क्लोराइड चैनल को सक्रिय करता है, जिसके परिणामस्वरूप शॉर्ट सर्किट करंट (आईएससी) की वृद्धि होती है। Cldn15-/- और WT चूहों के बीच कोई बड़ा अंतर नहीं है (चित्रा 3G; 341.5 μA/cm2 और 320.1 μA/cm2, Cldn15-/- और WT चूहों, क्रमशः)। चूंकि आंतों के खंडों ने फोर्सकोलिन के सेरोसल आवेदन का जवाब दिया, इसलिए झिल्ली की तैयारी को व्यवहार्य माना जाता है।

Figure 1
चित्र1: उस्सिंग कक्ष की स्थापना की गई है। (ए) उस्सिंग कक्ष में दो हिस्से होते हैं और आंतों की तैयारी को लंबवत रूप से माउंट किया जाता है। (बी) कक्ष के उद्घाटन (5 मिमी) का क्लोज-अप दृश्य, जिसमें पैराफिल्म को 5 मिमी छेद के साथ छिद्रित किया गया है। (c) इकट्ठा उपकरण। कैलोमेल इलेक्ट्रोड का उपयोग संभावित अंतर माप के लिए किया जाता है, जो केसीएल नमक पुलों के माध्यम से कक्ष से जुड़े होते हैं। एजी-एजीसीएल इलेक्ट्रोड का उपयोग आईएससी माप के लिए किया जाता है, जो म्यूकोसल तैयारी के पार से गुजरता है और NaCl नमक पुलों के माध्यम से कक्षों से जुड़ा होता है। पानी की जैकेट लगातार पानी पंप द्वारा संचालित 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी परिचालित कर रही है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: माउस बृहदान्त्र से एक Ussing कक्ष तैयारी के एच एंड ई दाग प्रतिनिधि छवि. पहला पैनल एक पूरी मोटाई (unstripped) तैयारी से पता चलता है. दूसरा पैनल एक म्यूकोसा और सबम्यूकोसल तैयारी दिखाता है (सेरोसा-मांसपेशी परत को छीन लिया गया है)। तीसरा पैनल एक म्यूकोसल तैयारी दिखाता है। स्केल बार 100 μm, आवर्धन 20x को दर्शाता है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल पैरामीटर पर क्लाउडिन 15 के विलोपन का प्रभाव। (A) Cldn15-/- और WT चूहों (n = 2 और 11, क्रमशः) में बेसलाइन ट्रांसम्यूकोसल चालकता। (बी) Cldn15-/- और WT चूहों (n = 2 और 11, क्रमशः) में बेसलाइन शॉर्ट सर्किट करंट (Isc)। (C) Cldn15-/- और WT चूहों (n = 2 और 4, क्रमशः) में NaCl की तनुकरण क्षमता। (D) Cldn15-/- और WT चूहों (n = 2 और 4, क्रमशः) में NaCl की सापेक्ष पारगम्यता। Cldn15-/- और WT चूहों (n = 2 और 4, क्रमशः) में Na+ (E) और Cl- (F) की पूर्ण पारगम्यता। (जी) Cldn15-/- और WT चूहों (n = 2 और 7, क्रमशः) में ऊतक व्यवहार्यता को मापने के लिए Forskolin-प्रेरित Isc वृद्धि। मान SEM (जहां लागू हो) ± माध्य का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रयोग में, Ussing कक्षों का उपयोग बेसलाइन विद्युत मापदंडों और Cldn15-/- और WT चूहों की छोटी आंत में NaCl की कमजोर पड़ने की क्षमता को मापने के लिए किया गया था। यह सत्यापित करने के लिए कक्ष प्रयोगों को उस्सिंग करते समय बहुत महत्वपूर्ण है कि प्रयोगों में उपयोग की जाने वाली झिल्ली की तैयारी व्यवहार्य है। यह आमतौर पर ग्लूकोज या एडेनिलेट साइक्लेज़ एक्टिवेटर फॉर्सकोलिन को जोड़कर किया जाता है और यह देखते हुए कि क्या आईएससी (चूहों में 100-300 μA / cm2 ) में उचित वृद्धि हुई है। यह आकलन करने का एक और तरीका है कि आंतों की तैयारी उपयोग के लिए स्वीकार्य थी या नहीं, ऊतक की चालकता को देखकर है। क्षतिग्रस्त ऊतक में अक्सर सामान्य चालकता (सामान्य चालकता: माउस में ~ 20-60 एमएस / सेमी 2 ) की तुलना में अधिक होता है, जबकि ऊतक जिसमें मांसपेशियों की परत को पर्याप्त रूप से छीन नहीं लिया गया है, में कम-से-सामान्य चालकता होगी (चित्रा 2)। सभी Ussing चैंबर प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम, ऊतक की तैयारी है, और यह सुनिश्चित करना है कि इसे कोई नुकसान न हो। इसके अलावा, छोटी आंत के साथ, आदर्श रूप से झिल्ली की तैयारी को ऊतक के टूटने से बचने के लिए विच्छेदन के 10 मिनट के भीतर कक्षों में रखा जाना चाहिए। ऊतक को माउंट करने के बाद, तैयारी को ठीक करने की कोशिश करना और समायोजित करना एक अच्छा विचार नहीं है, क्योंकि नुकसान हो सकता है। प्रयोगों के दौरान, कक्षों से बफर को हटाते समय या नमक पुलों या बुदबुदाती छड़ी को समायोजित करते समय, हर कीमत पर आंतों की तैयारी को छूने से बचें। कक्ष प्रयोगों के लिए एक और महत्वपूर्ण बिंदु कक्षों का उचित हीटिंग और बफर समाधानों का पर्याप्त बुदबुदाना है। रिंगर समाधान का उपयोग करते समय, बफरिंग सिस्टम के लिए 95% O2/5% CO2 के साथ बुदबुदाना बहुत महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, बुदबुदाते हुए जो बहुत कमजोर है, वह पर्याप्त रूप से पर्याप्त मिश्रण नहीं करेगा और यदि बुदबुदाने बहुत मजबूत है, तो झिल्ली और विद्युत माप प्रभावित हो सकते हैं। यदि आंतों की तैयारी में एक छेद है, तो कमजोर पड़ने वाले संभावित प्रयोगों में कमजोर पड़ने के बाद एक बड़ा झिल्ली संभावित अंतर (पीडी) नहीं होगा। यदि पीडी कमजोर पड़ने के बाद छोटा है, तो यह आंतों की तैयारी में छेद के कारण हो सकता है या यह संकेत दे सकता है कि ऊतक को कक्ष में ठीक से माउंट नहीं किया गया था।

Ussing चैंबर प्रयोगों का प्रदर्शन करते समय, कई चीजें गलत हो सकती हैं। सबसे आम तौर पर, एक नमक पुल की नोक पर एक बुलबुला विकसित होता है। जब ऐसा होता है, यदि यह पतली केसीएल नमक पुल है जो प्रभावित होता है, तो आईएससी या झिल्ली पीडी संभवतः बहुत अनियमित हो जाएगा और एम्पलीफायर लोड हो सकता है। इस स्थिति में, पहले क्लैंप मोड बंद करें। फिर, संदंश का उपयोग करके, धीरे से नमक पुल की नोक को चुटकी लें जब तक कि बुलबुला हटा न जाए। ऐसा करते समय झिल्ली को न छूने के लिए बहुत सावधान रहें। यदि बुलबुला मोटे NaCl नमक पुल की नोक पर विकसित होता है, तो चालकता माप प्रभावित होगा। बुलबुला निकालने की प्रक्रिया समान है। डेटा की रिकॉर्डिंग की निगरानी करना बहुत महत्वपूर्ण है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि डेटा में कोई असामान्यताएं नहीं हैं। इसके अलावा, यह महसूस करना महत्वपूर्ण है कि पैरामीटर अचानक उत्तेजना के बिना नहीं बदलेंगे, इसलिए यदि डेटा रिकॉर्डिंग में अचानक भारी परिवर्तन होते हैं, तो नमक पुलों और इलेक्ट्रोड के कनेक्शन की जांच करें।

तंग जंक्शनों की बाधा समारोह और आयन चयनात्मकता को मापना परकोशिकीय पारगम्यता का आकलन करने के लिए अन्य आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले तरीकों से संभव नहीं है। पराकोशिकीय पारगम्यता का अनुमान लगाने के लिए एक आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला प्रोटोकॉल FITC का मौखिक गैवेज और बाद के समय में प्लाज्मा FITC का माप है। यह विधि FITC के लिए पूरे आंत्र पथ की समग्र पारगम्यता को मापता है। इसके अलावा, FITC संभवतः रिसाव मार्गों के माध्यम से ले जाया जाता है। माना जाता है कि परकोशिकीय परिवहन में रिसाव मार्ग और छिद्र मार्ग 28 शामिल हैं। रिसाव मार्ग तंग जंक्शनों से गुजरने के लिए बड़े चार्ज या अनचार्ज्ड अणुओं के लिए एक गैर-चयनात्मक कम क्षमता वाला मार्ग है, जबकि रंध्र मार्ग एक चयनात्मक, उच्च क्षमता वाला मार्ग है जो अणुओं को उनके आकार और चार्ज 28 के आधार पर पारित करने की अनुमति देता है। FITC और अन्य macromolecule अनुरेखक रिसाव मार्ग का आकलन कर सकते हैं, लेकिन वे आयन या एक ऊतक के चार्ज चयनात्मकता के बारे में कोई जानकारी प्रकट नहीं करते हैं। FITC या अन्य macromolecular tracers के मौखिक गैवेज भी इस बारे में जानकारी नहीं देता है कि आंत में रिसाव कहां हो रहा है। इसके विपरीत, यहां प्रस्तुत विधि का उपयोग ऊतक के एक विशिष्ट खंड की आयनिक चयनात्मकता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, और विशेष रूप से, यह विशिष्ट आयनों की सापेक्ष पारगम्यता का अनुमान लगा सकता है। एक ऊतक की रिसाव का आकलन आधारभूत चालकता को मापकर किया जा सकता है, और छोटी आंत जैसे लीक ऊतकों में, >90% चालकता को परकोशिकीय मार्ग 29 के योगदान के कारण माना जाता है। इस प्रकार, ट्रांसेपिथेलियल चालकता माप परकोशिकीय आयन आंदोलन की मात्रा के बारे में जानकारी देता है, लेकिन यह विशिष्ट नहीं है और यह प्रकट नहीं करता है कि एक ऊतक में कैटिओनिक या एनिओनिक चयनात्मकता है या नहीं। तंग जंक्शनों की permselectivity को समझने के लिए, कमजोर पड़ने की क्षमता का मापन आवश्यक है। यहां, Cldn15-/- चूहों का उपयोग किया गया था, जिसमें पैरासेलुलर Na + पोर-फॉर्मिंग क्लाउडिन 15 की कमी थी। NaCl के कमजोर पड़ने के जवाब में झिल्ली संभावित अंतर को मापने से, आयनिक चयनात्मकता के साथ-साथ Na + और Cl की पारगम्यता की गणना की जा सकती है। जैसा कि अपेक्षित था, Cldn15-/- चूहों में संभावित अंतर कम हो गया था, और डब्ल्यूटी चूहों की तुलना में PNa / PCl (चित्रा 3 D) में कमी आई थी। क्लाउडिन 15 के नॉकआउट के परिणामस्वरूप कम कैटिओनिक चयनात्मकता (PNa / PCl) होती है और Na + (PNa) (चित्रा 3E) की सापेक्ष पारगम्यता में कमी आती है। इसके अलावा, Cldn15-/- चूहों (चित्रा 3A) में बेसलाइन विद्युत चालकता कम हो गई थी, जिससे पता चलता है कि टीजे तंग हो गया है, और बाधा समारोह में वृद्धि हुई है।

जबकि कमजोर पड़ने की क्षमता तंग जंक्शनों की permselectivity का आकलन करने के साथ-साथ क्लाउडिन प्रोटीन की भूमिका को परिभाषित करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है, इसकी सीमाएं हैं। इस तकनीक की एक प्रमुख सीमा यह है कि यह ऊतक का औसत है। छोटे आंतों के एपिथेलिया के भीतर, विली और क्रिप्ट्स होते हैं, और उस्सिंग कक्षों के साथ मापे गए पैरामीटर विली और क्रिप्ट एपिथेलिया के योगदान का अलग से आकलन नहीं करते हैं। कुछ चुनिंदा रूप से व्यक्त किए गए क्लाउडिन की भूमिका का आकलन करते समय यह एक कारक हो सकता है, उदाहरण के लिए, क्लाउडिन 2 को एक धनायन छिद्र भी माना जाता है, लेकिन यह केवल क्रिप्ट्स 24 में व्यक्त किया जाता है। एक और सीमा यह है कि तंग जंक्शनों में कई अलग-अलग क्लाउडिन प्रोटीन की उपस्थिति के कारण, माप को विशेष रूप से एक निश्चित प्रोटीन के लिए जिम्मेदार नहीं ठहराया जा सकता है। हालांकि, कमजोर पड़ने की क्षमता कोशिका मॉडल 10,30 को व्यक्त करने वाले बहिर्जात क्लाउडिन में क्लाउडिन परिवार के प्रोटीन की भूमिकाओं की खोज करने में बहुत उपयोगी रही है। अंत में, यूएसिंग चैंबर तकनीक पूर्व-विवो ऊतक का उपयोग करती है, और यह प्रोटोकॉल मांसपेशियों की परत के बिना आंतों की तैयारी का उपयोग करता है, जिसका अर्थ है कि स्थितियां विवो स्थितियों के समान नहीं हैं। उस्सिंग कक्षों के लिए आंत तैयार करने के लिए कौशल और समय की आवश्यकता होती है, इसलिए देशी ऊतक में प्रयोगों को अक्सर सफलतापूर्वक पूरा करना मुश्किल होता है, कम थ्रूपुट होता है, और बहुत समय लगता है।

Ussing कक्ष एक बहुत ही महत्वपूर्ण उपकरण है जिसे कई अलग-अलग उपकला और एंडोथेलियल ऊतकों पर लागू किया जा सकता है। एक प्रमुख लाभ यह है कि यह देशी ऊतक का उपयोग करता है, जो सेल लाइन मॉडल की तुलना में बहुत अधिक विश्वसनीय है, हालांकि सेल मोनोलेयर्स और ऑर्गेनोइड मोनोलेयर्स का भी मूल्यांकन उसिंग कक्षों में किया जा सकता है। Ussing कक्षों ने झिल्ली शरीर विज्ञान में कई महान निष्कर्षों में योगदान दिया है, और वे भविष्य में एक महत्वपूर्ण उपकरण बने रहेंगे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संभावित संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

यह काम 17K00860 (HH के लिए) और 19K20152 (NI के लिए) द्वारा समर्थित है। डब्ल्यूएच 2018-2021 से अपनी वित्तीय सहायता के लिए ओत्सुका तोशिमी छात्रवृत्ति फाउंडेशन को स्वीकार करना चाहता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#3 polyethyl tubing Hibiki outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm
#7 polyethyl tubing Hibiki outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm
10 mL locking syringe Terumo SS-10LZ Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling
19 g needle Terumo NN-1938R Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container
23 g needle Terumo NN-2332R Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container
5 mm punch NA NA Use to punch holes in filter paper and parafilm
acupuncture needles Seirin NS Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate
Agar Fujifilm Wako 010-15815
Alligator clips NA NA Connects the electrode to the amplifier
CaCl2 Fujifilm Wako 038-00445
D(-)-Mannitol Fujifilm Wako 133-00845 This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer
D(+)-Glucose Fujifilm Wako 049-31165
Dissection kit You will need, scissors and curved forceps
Dissection plates We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber
DMSO Sigma 472301-500ML For making forskolin stock
Electrical recorder TOA Electronics PRR-5041 Other equivalent electrical recorders are available commercially
Epithelial voltage clamp amplifier Nihon Kohden CEZ9100 Other equivalent amplifiers are available commerically
filter paper, cut into squares NA NA Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation
fine forceps Fast Gene FG-B50476 For blunt dissection of the muscle layer
Forskolin Alomone Labs F-500 Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM
HEPES Sigma H4034-1KG
Indomethacin Sigma I7338-5G Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM
K2HPO4 Fujifilm Wako 164-04295
KCl Fujifilm Wako 163-03545
KCl/calomel electrode Asch Japan Co. SCE-100
KH2PO4 Kanto chemical 32379-00
L(+)-Glutamine Fujifilm Wako 074-00522
MgCl2 Fujifilm Wako 135-00165
Mixed Gas (95% O2/5% CO2) Shizuoka Oxygen Company Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution
NaCl Fujifilm Wako 191-01665
NaCl electrode NA NA Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire
NaHCO3 Fujifilm Wako 191-01305
O2 Gas Shizuoka Oxygen Company Used for bubbling chambers when using HEPES buffer
parafilm Bemis PM-996 Used to help seal Ussing chambers
pH meter DKK-TOA Corp HM-305 HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C
pH meter electrode DKK-TOA Corp GST-5311C
silicone rubber Shinetsu Chemical KE-12 Used to fill dissection plates
silver wire Used for making NaCl electrodes
Small jars w/ plastic lids NA NA Use for NaCl electrodes
stereomicroscope Zeiss Stemi 305 A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily
Tris (Trizma base) Sigma T1503-1KG Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers
Ussing chambers Sanki Kagaku Kougei These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm
Water pump and heating system Tokyo Rikakikai Co. Ltd. NTT-110

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References

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जीव विज्ञान अंक 171
आंतों के तंग जंक्शन बाधा और आयन पारगम्यता के कार्यात्मक मूल्यांकन मूल ऊतक में Ussing चैंबर तकनीक द्वारा
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Hempstock, W., Ishizuka, N.,… More

Hempstock, W., Ishizuka, N., Hayashi, H. Functional Assessment of Intestinal Tight Junction Barrier and Ion Permeability in Native Tissue by Ussing Chamber Technique. J. Vis. Exp. (171), e62468, doi:10.3791/62468 (2021).

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