Summary
Intestinal epitel gir ikke bare næringsabsorpsjon, men beskyttelse mot skadelige stoffer. Det apikale mest epitelielle intercellulære krysset, det vil si det tette krysset, regulerer paracellulær løsning og ionpermeabilitet. Her beskrives en protokoll for fremstilling av mucosal ark og vurdering av ion-selektiviteten til tette veikryss ved hjelp av Ussing kammerteknikk.
Abstract
Ussing kammerteknikken ble først oppfunnet av den danske forskeren Hans Ussing i 1951 for å studere den transcellulære transporten av natrium over froskehuden. Siden da har denne teknikken blitt brukt på mange forskjellige vev for å studere de fysiologiske parametrene for transport på tvers av membraner. Ussing kammermetoden er å foretrekke fremfor andre metoder fordi innfødt vev kan brukes, noe som gjør det mer anvendelig for hva som skjer in vivo. Men fordi innfødt vev brukes, er gjennomstrømningen lav, tiden er begrenset, og vevsforberedelse krever dyktighet og trening. Disse kamrene har blitt brukt til å studere spesifikke transportproteiner i ulike vev, forstå sykdomspatofysiologi som i cystisk fibrose, studere narkotikatransport og opptak, og spesielt bidratt til forståelsen av næringstransport i tarmen. Gitt hele epiteltransportprosessen av et vev, er ikke bare transepitheliale veier, men også paracellulære veier viktige. Tette veikryss er en nøkkeldeterminant for vevsspesifikk paracellulær permeabilitet over tarmen. I denne artikkelen vil Ussing-kammerteknikken bli brukt til å vurdere paracellulær permselectivity av ioner ved å måle transepithelial ledningsevne og fortynningspotensialer.
Introduction
Ussing kammermetode ble først utviklet av den danske forskeren Hans Ussing. Ussing brukte den først til å måle kortslutningsstrømmen for natriumtransport over froskehuden etter at det ble observert at NaCl kunne transporteres over huden mot en bratt konsentrasjonsgradient1. Hans system besto av froskehuden montert mellom to kamre med tilgang til hver side av huden. Hvert kammer inneholdt Ringers løsning som ble sirkulert og luftet. To smale agar ringer broer som ligger nær huden og koblet til mettede KCl-calomel elektroder målte den potensielle forskjellen som lest av en potensierer. Et annet par agar ringebroer lå i motsatt ende av hvert kammer koblet til beger med mettet KCl mettet med AgCl for å bruke en elektromotivkraft levert av et batteri. En potensiell skillevegg ble brukt til å justere spenningen slik at den potensielle forskjellen over huden forble null, og dermed skapte kortslutningsforhold. En mikroamperemåler ble også koblet til for å lese strømmen som passerer gjennom huden (se figuren i ref.1 for original kammerdesign).
I løpet av de siste 70 årene har denne teknikken blitt brukt på mange forskjellige vev, spesielt tarmvev, for å studere nærings- og iontransport. For eksempel ble mekanismen for koleraindusert diaré studert ved å montere kanin ileum i disse kamrene, og det ble funnet at koleratoksinindusert diaré formidles av cAMP2. I tillegg ble disse kamrene også brukt til å studere mekanismen som ligger til grunn for glukosetransport via Na+-Glucose cotransporter 1 (SGLT1)3. Laboratoriet vårt fokuserer på transcellulær og paracellulær transport i tarmepitelceller. Ved hjelp av Ussing-kammermetoden ble peptidtransport vurdert i Claudin 15 knockout-mus, som har svekket paracellulær natriumtransport, ved hjelp av Ussing-kamre for å måle absorpsjonen av det ikke-hydroolysebare dieptidet glycylsarcosin. Det ble funnet at luminal Na + homeostase er viktig for proton-koblet peptid transport4. I tillegg ble disse kamrene også brukt til å undersøke anionsekresjon i murin cecum som svar på submukosal aktivering av proteinaseaktivert reseptor 1 av serinprotease trypsin5.
Ussing kamre har også nylig blitt brukt til å vurdere paracellulære veier i epitelvev. Paracellulære veier reguleres av tette veikryss, som er komplekser av proteiner som dannes på det punktet hvor to eller flere celler møtes6. Barrierefunksjonen og ionvalgsevnen (om anioner eller kasjoner er selektivt i stand til å passere gjennom det tette krysset) bestemmes av tilstedeværelsen av claudin familieproteiner; noen av dem fungerer som barrierer (claudin 3 og 7), anionporer (claudin 10a) eller kationporer (claudin 2, 10b og 15)7. Andre metoder har blitt brukt til å vurdere paracellulær vei, for eksempel oral gavage av FITC ledsaget av blodplasma FITC konsentrasjon8, eller EDTA-Cr9; Imidlertid er disse teknikkene av lavere oppløsning og kan ikke vurdere ionvalgivitet eller en bestemt del av delene av tarmkanalen. Ussing kamre kan imidlertid brukes til å vurdere fortynningspotensialet til målioner, og derfor bestemme ionvalgsevnen til de tette kryssene. For eksempel, med NaCl, kan selektiviteten til de tette kryssene for Na + og Cl - beregnes ved å fortynne den ene siden av membranen (vanligvis mucosalsiden) og måle endringen i transepithelial potensiell forskjell. De relative permeabilities av Na + og Cl- kan estimeres av Goldman-Hodgkin-Katz ligningen10 og selektiviteten til det tette krysset kan estimeres ved hjelp av Kimizuka-Koketsu-ligningen11. Disse kamrene har derfor fordelen av å måle vevets elektrofysiologiske parametere og som et resultat gi mer informasjon om passasjen av ioner gjennom de tette kryssene enn andre metoder med lavere oppløsning.
Ussing kammermetoden er ikke bare begrenset til tarmkanalen, selv om den er mye brukt i studier om tarmen, har den mange andre applikasjoner også. For eksempel har disse kamrene blitt brukt til å studere cystisk fibrose, og spesielt kloridkanalen cystisk fibrosetransmembrane ledningsregulator (CFTR)12. Cystisk fibrose er forårsaket av en mutasjon i CFTR13, noe som resulterer i nedsatt kloridsekresjon og væsketransport av respiratoriske epitelceller, og et resulterende tykkere, tørrere slimete lag14. Studie av luftveis epitel CFTR har blitt utført med disse kamrene for ikke bare å forstå sykdommen, men for å oppdage måter å behandle sykdommen på. For eksempel, hos pasienter med sjeldne mutasjoner som forårsaker cystisk fibrose, har analyse av pasientens respiratoriske epitelceller blitt brukt til å teste terapier som Orkambi og en forsterkerkoterapi15.
Ussingkamre har også blitt brukt til å studere ruter for legemiddellevering, for eksempel med humant biopsivev for å studere legemiddelopptak og farmakokinetikk16. Tarmopptak er ikke den eneste ruten for legemiddellevering. Disse kamrene har også blitt brukt til å studere nasal narkotika levering systemer17. Det er også utført legemiddelleveringsstudier med Ussing-kamre for øyet. I kanin hornhinnen ble permeabilitet og opptaksstudier utført med Labrasol, et stoff som er designet for å øke absorpsjonen av legemidler over vev18. En annen studie undersøkte effekten av benzylalkoniumklorid på transscleral legemiddellevering i kaninen sclera19.
Ussing-kammermetoden er nyttig fordi innfødt vev kan brukes. Som sådan er det å foretrekke fremfor in vitro-modeller som Caco-2-cellelinjer. Teknikken krever imidlertid dyktighet og tid til å forberede prøver, så den er ikke egnet for applikasjoner med høy gjennomstrømning. De elektrofysiologiske egenskapene til cellemonolayers kan studeres ved hjelp av cellekulturinnlegg i disse kamrene. Nyere funn har tillatt for kulturen av organoider som er miniorganer dyrket i kultur fra høsting av epitel- eller endotel stamceller20. Organoid kultur kan manipuleres til å bli dyrket i en monolayer, og dermed gjøre det mulig å montere organoider i et Ussing kammer21. Organoider av ulike epitel- og endotelvev kan studeres, senke antall dyr som kreves, da organoidkultur kan opprettholdes på lang sikt. Dette vil også øke gjennomstrømningen siden tidkrevende og arbeidskrevende vevs disseksjon og forberedelsestrinn ikke vil være nødvendig. I fremtiden vil Ussing kammerstudier fortsette å være svært nyttige for å studere vevstransport, og de vil være spesielt viktige innen personlig medisin.
Følgende protokoll demonstrerer anvendelsen av Ussing-kammermetoden for å vurdere permselectivity og barrierefunksjonen til de tette kryssene i tynntarmen til Claudin 15 knockout (Cldn15-/-) mus og wild type (WT) kontroller ved å måle fortynningspotensialet til NaCl. Tette veikryss (TJ) dannes på det punktet hvor to eller flere celler møtes i epitel- og endotelvev. Bicellulære tette veikryss (bTJ), spesielt de claudinske familieproteinene som finnes i bTJ, antas å bestemme barrierefunksjonen og permselectivity av TJ7. Cldn15-/- mus har en mega tynntarmen22 og redusert næringsopptak evne på grunn av tap av intestinal Na + resirkulering som oppstår via claudin 154,23,24. Cldn15-/- mus har svekket Na+ homeostase, noe som gjør dem til en interessant modell for å studere permselectivity av TJ. Følgende protokoll vurderer permeabiliteten til TJ til NaCl ved å måle fortynningspotensialet til NaCl (PNa / PCl) i den midterste tynntarmen. Kort sagt kan endringen i membranpotensialforskjell som oppstår ved å fortynne den ene siden av membranen (M-siden eller S-siden, begge måles i protokollen nedenfor) brukes til å beregne permeabiliteten til Na + (PNa) og Cl- (PCl), og fortynningspotensialet (PNa / PCl) vil vise om det tette krysset har en kationisk eller anionisk selektivitet.
Forsøkene i denne protokollen ble utført ved hjelp av et tilpasset Ussing-kammer (figur 1A), som består av to halvdeler, mellom hvilke tarmpreparatet er montert vertikalt, spenningsklemmeforsterker, elektrisk opptaker, elektroder, saltbroer, Ringers løsning, HEPES-buffer (150 mM NaCl), fortynnet HEPES-buffer (75 mM NaCl), tarmpreparat (for detaljer om utstyr se materialtabellen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrene som ble brukt i disse forsøkene ble opprettholdt i dyrepleieanlegget ved Universitetet i Shizuoka, og forsøkene ble utført i henhold til retningslinjene for dyreforskning fastsatt av Universitetet i Shizuoka. Alle eksperimenter ble utført med godkjenning fra Dyrepleie- og brukskomiteen ved Universitetet i Shizuoka (Tillatelser #205272 og #656-2303).
1. Forberedelse av NaCl-elektroder
MERK: Elektrodene som brukes i disse eksperimentene består av konsentrert NaCl eller KCl. KCl/calomel-elektrodene kjøpes kommersielt. Før du starter eksperimentet, må du sørge for at alle elektroder er fylt til toppen med konsentrert NaCl- eller KCl-løsning.
- Forbered små glassburker med plastlokk (volum 20 ml).
- Bor to hull i plastlokkene, ett for NaCl saltbro (2,5 mm diameter), og det andre for sølvtråd (1 mm diameter; Figur 1C, NaCl elektrode).
- Fyll glassburken med mettet NaCl-løsning (ca. 15 ml, til den er full).
- Sett sølvtråd (0,8 mm diameter, 7 cm lang) inn i kannen, men sørg for at tråddelen utenfor kannen kan kobles via alligatorklemmer (liten størrelse) til forsterkersystemet.
- Når de ikke er i bruk, pakk elektrodene og sørg for at hullene er dekket, med parafilm for å forhindre tørking.
2. Tilberedning av saltbroer
MERK: Forbered saltbroer minst en dag før eksperimentet for å gi tilstrekkelig tid til å størkne. Saltbroer kan brukes gjentatte ganger, men bruk etter 2 måneder anbefales ikke.
- NaCl saltbroer
- Forbered #7 polyetylrør (ytre diameter 2,3 mm, indre diameter 1,3 mm), 19 G nål og sprøyte av låsetype, 200 ml 1 M NaCl-oppløsning, 2 g agar, forseglet plastbeholder for lagring av saltbroer.
- Forbered riktig antall saltbroer ved å kutte slangen til den størrelsen som er nødvendig for Ussing-kammeret satt opp (hvert kammer krever to saltbroer).
- Før injeksjon av agar, lag en U-form med rørene og legg dem i et beger med varmt vann (for å skape en enkel form for å sette opp saltbroer).
- Lag 200 ml 1 M NaCl ved å oppløse 11.688 g NaCl i 200 ml i deionisert vann.
- Del 1 M NaCl i 100 ml porsjoner: Lag 100 ml 2% agar i 1 M NaCl (bland 2 g agar i NaCl, varm i mikrobølgeovn for å oppløse).
- Bruk en 19 G kanyle og låsesprøyte og fyll sprøyten med 1 M NaCl/agaroppløsning. Begynn forsiktig å utvise løsning dråpe for dråpe, og mens du gjør det, sett nålen inn i den ene enden av røret og fyll til blandingen kommer ut fra den andre siden.
- Trekk kanylen langsomt ut mens du fortsatt uttrykker løsningen, og gjenta til alle nødvendige saltbroer er laget. (Hvis oppløsningen størkner i sprøyten eller kanylen, må den kort varmes opp i varmt vann til oppløsningen kan uttrykkes igjen.)
- Kontroller saltbroer for å sikre at det ikke er bobler og oppbevares i gjenværende 1 M NaCl-løsning i en forseglet beholder.
- KCl saltbroer
MERK: Tynnere slange brukes til KCl agarbroer for å unngå økningen av K + konsentrasjon i bufferen, da saltbrospissene kan oppløses og K + kan lekke inn i bufferen.- Forbered #3 polyetylrør (ytre diameter 1,0 mm, indre diameter 0,5 mm), 23 G nål og sprøyte av låsetype, 200 ml 1 M KCl-oppløsning, 2 g agar, forseglet plastbeholder for lagring av saltbroer.
- Forbered riktig antall saltbroer ved å kutte slangen til den størrelsen som er nødvendig for Ussing-kammeret satt opp (hvert kammer krever to saltbroer).
- Lag 200 ml 1 M KCl ved å oppløse 14,91 g KCl i 200 ml deionisert vann.
- Del i to 100 ml porsjoner: Lag 100 ml 2% agar i 1 M KCl (bland 2 g agar i KCl, varm i en mikrobølgeovn for å oppløse).
- Bruk en 23 G nål og låsesprøyte, injiser slangen med 2% agar 1 M KCl-blanding (sørg for at rørene er helt fylt og det ikke er bobler) på samme måte som med NaCl saltbroer.
- Kontroller saltbroer for å sikre at det ikke er bobler og oppbevares i den gjenværende 1 M KCl-løsningen i en forseglet beholder.
3. Utarbeidelse av Ringers løsning og HEPES-buffer
MERK: Avhengig av vevet som er montert i Ussing-kammeret, kan komponentene i Ringers løsning variere. Oppskriftene som presenteres her er spesifikke for tynn og tykktarmen.
- Gjør Ringers løsning frisk på eksperimentdagen som beskrevet i tabell 1.
- Boble løsningen med 95% O2/5% CO2 for å gi O2 til vevet og en bufferkapasitet.
| Ringers løsning (tynntarmen) | Ringers løsning (tykktarmen) |
| NaHCO3 – 21,0 mM | NaHCO3 – 21,0 mM |
| K2HPO4 – 2,4 mM | K2HPO4 – 2,4 mM |
| KH2PO4 – 0,6 mM | KH2PO4 – 0,6 mM |
| NaCl – 119,0 mM | NaCl – 119,0 mM |
| MgCl2 – 1,2 mM | MgCl2 – 1,2 mM |
| CaCl2 – 1,2 mM | CaCl2 – 1,2 mM |
| Indomethacin – 10 μM (Lag 1 mM lager i 21 mM NaHCO3, tilsett 10 ml lager for 1 L ringers løsning) | Indomethacin – 10 μM (Lag 1 mM lager i 21 mM NaHCO3, tilsett 10 ml lager for 1 L ringers løsning) |
| 1 mM glutamin (0,146 g/l) | 10 mM glukose |
Tabell 1: Ringers løsningsoppskrift. For å lage Ringers løsning, bland alle komponenter sammen med avionisert vann. Ringers løsning er best laget frisk før eksperimenter. Oppbevar i kjøleskapet eller på is til bruk. Før bruk gass med 95% O2/5% CO2.
- Gjør HEPES-bufferen frisk på eksperimentdagen som beskrevet i tabell 2 ved å blande ingredienser i avionisert vann.
- Ikke juster til det endelige buffervolumet før etter pH-justering.
- Varm HEPES buffer til 37 °C og juster pH til 7,4 ved å sakte tilsette dråper med 1 M Tris-oppløsning under omrøring.
- Juster til det endelige volumet ved å legge til riktig mengde deionisert vann.
| HEPES-buffer | Fortynnings-HEPES-buffer |
| HEPES – 10 mM | HEPES – 10 mM |
| Glukose – 10 mM (tykktarmen) | Glukose – 10 mM (tykktarmen) |
| 1 mM glutamin (0,146 g/l) (tynntarmen) | 1 mM glutamin (0,146 g/l) (tynntarmen) |
| NaCl – 150 mM | NaCl – 75 mM + 150 mM mannitol (for å justere for osmolalitetsforskjeller) |
| MgCl2 – 1 mM | MgCl2 – 1 mM |
| CaCl2 – 2 mM | CaCl2 – 2 mM |
| Indomethacin – 10 μM (Lag 1 mM lager i 21 mM NaHCO3, tilsett 10 ml lager for 1 L ringers løsning) | Indomethacin – 10 μM (Lag 1 mM lager i 21 mM NaHCO3, tilsett 10 ml lager for 1 L ringers løsning) |
| Juster til pH 7,40 (37 °C) ved hjelp av 1 M Tris | |
Tabell 2: Hepes bufferoppskrift. For å lage HEPES buffer og fortynning HEPES buffer, oppløs alle ingrediensene i avionisert vann. Løsninger må justeres pH med 1 M Tris-oppløsning, så ikke tilsett fullt vannvolum (f.eks. når du lager 1 L, oppløs alle ingrediensene i ca. 800 ml vann). Varm deretter oppløsningen til 37 °C, juster pH til 7,4 og juster deretter det endelige volumet.
4. Oppsett av Ussing-kammer
MERK: Ussing-kamrene som brukes i denne protokollen er skreddersydde kontinuerlige perfusjonskamre. For å vurdere musens tarmbarrierefunksjon eller næringsopptak, anbefales kamre med en åpning med en diameter på 4 eller 5 mm25 (figur 1A-C).
- For å redusere kanteffekten26 og bidra til å forsegle kamrene, fest 4 eller 5 mm hullstanset parafinfilm (ca. 4 cm2) før du setter opp (figur 1B).
- Sett opp i åpne kretsforhold for fortynning av potensiell måling. Sett i gjeldende klemmemodus. Still inn utgangen som strøm og sett gjeldende puls til ±20 μA.
- Når du setter opp kortslutningsforhold for måling av kortslutningsstrøm og transmukosal motstand, sett i spenningsklemmemodus. Still inn utgangen som spenning og sett spenningspulsen til ±5 mV.
- Sørg for at 37 °C vann sirkulerer i vannjakken.
- Fyll hvert kammer med Ringers løsning eller HEPES-buffer (mengden avhenger av systemet som brukes, kamrene som brukes her krever 5 ml for hver side) og sørg for at det ikke er noen lekkasjer.
- Koble til saltbroer og elektroder.
- Kontroller at spenningen er 0 og stabil, pulsstrøm for å sikre at saltbroer og elektroder er riktig satt opp.
- La system- og Ringers løsningstemperatur likevekte i minst 20 minutter.
- Etter likevekt korrigerer du asymmetrisk spenningsforskjell mellom KCl-elektroder og kompenserer for væskemotstand ved å endre den til null (se manualen for Ussing-kammersystemet som brukes til å bestemme riktig måte).
5. Disseksjon av tarmvev
MERK: All dyreforsøk må utføres innenfor regelverket fastsatt av landet og universitetet.
- Før du tar tarmvevet, lag fersk, iskald Ringers løsning og boble med 95% O2 og 5% CO2 i 15 min (trinn 3).
- Bedøv mus i henhold til retningslinjer for bruk av dyr i forskning. For dette eksperimentet ble mus bedøvet med 2% -3% isofluran administrert av en bedøvelsesmiddel. Se etter riktig anestesi ved å klemme tærne og sikre at det ikke er noen smerterespons.
- Lag et snitt i magen med saks fra bekkenet til membranen; finne magen og kutte den pyloriske enden av magen.
- Ta tak i magedelen festet til tynntarmen med tang og trekk tynntarmen forsiktig mens du kutter bort de mesenteriske vedleggene. Vær forsiktig så du ikke kutter eller skader tarmvevet på noen måte.
- Fortsett å dissekere tarmen helt til anus. For fullstendig fjerning av tykktarmen, kutt bekkenbenene for å avsløre den distale delen av tykktarmen og fjern forsiktig resten av tarmen ved å kutte bort vedleggene.
- Mål tarmens lengde og del inn i ønskede segmenter. For dette eksperimentet, del tynntarmen i tre segmenter og bruk det midterste segmentet.
- Plasser de ønskede segmentene i iskald, boblet Ringers løsning; Deretter åpner du hvert segment langsgående ved å kutte langs de mesenteriske vedleggene. Trim bort fett og bindevev.
- Returner segmentene til den iskalde Ringers løsning og vask grundig (selv i den iskalde løsningen er oksygenering av luminal epitel viktig for å opprettholde epitelfunksjonen).
6. Stripping av muskellaget og forberedelsen av tarmarket
MERK: Fjerning av serosa (muskellag) er viktig for transportstudier ved bruk av tarmen. Hvis serosaen forblir, kan tarmvevet bli utsatt for tilfeldige muskelsammentrekninger som vil forvrenge de elektrofysiologiske dataene, og transport kan hemmes. Unstripped vev forverres raskt når det er montert i Ussing-kamre, siden serosa er en betydelig diffusjonsbarriere for substrat og oksygen. I noen spesielle tilfeller kan det være nødvendig å holde muskellaget, så beslutningen er opp til forskeren og den eksperimentelle designen. Tarmplatene kan tilberedes på to måter, avhengig av hvilket lag som fjernes (figur 2). For dette eksperimentet er det nødvendig med slimhinne- og submukosale preparater (figur 2, andre panel).
- Forbered disseksjonsplater (10 cm diameter) dekket med silikongummi, pinner (små akupunkturnåler), 5 mm stanset filterpapir og parafilm firkanter (2 cm x 2 cm; er kanskje ikke nødvendig for andre systemer).
- Hell fersk, iskald, boblet Ringers løsning i disseksjonsplaten (nok til å dekke vevet, ca. 2-3 ml).
- Under et stereomikroskop, fest endene av tarmvevet (mucosal side ned).
- Ved hjelp av fine tang, må du direkte dissekere muskellaget fra den underliggende slimhinnen.
- Vær forsiktig så du ikke eller introduserer hull i vevet.
- Når muskellaget er fjernet, kutt et stykke stort nok til en 5 mm diameteråpning. Når du forbereder tynntarmen, bør fjerning av serosa-muskellaget gjøres innen 10 minutter, siden luminal oksygenering er vanskelig under disse forholdene.
- Våt 5 mm stanset filterpapir firkantet i Ringers løsning og legg tarmvevet på det med mucosal side ned, siden submukosale preparater spontant vikles rundt med mucosal side utenfor.
- Forsikre deg om at åpningen er helt dekket av tarmvevet og ingen rynker er til stede. Bruk et svart bord under preparatet for å undersøke om åpningen er helt dekket.
- Gjenta denne prosedyren for det nødvendige antall slimhinnepreparater (i dette eksperimentet er det nødvendig med to preparater: ett preparat vil bli brukt til å måle fortynningspotensial, og det andre vil bli brukt til å måle grunnleggende elektriske parametere).
7. Montering av tarmpreparater i Ussing-kamre
MERK: Oppsettet avhenger av hvilken type Ussing-kammersystem og opptakssystem som brukes.
- Sug ut Ringers løsning/HEPES-buffer fra Ussing-kammeret.
- Demonter Ussing-kammeret og legg filterpapiret med tarmpreparatets mukosalside ned på slimhinnens sidekammer og juster slik at kammerets vindu justeres etter hullet på filterpapiret (figur 1A, svart merking rundt kammervinduet er nyttig for justering av preparatene).
- Plasser serosal sidekammeret forsiktig på Mucosal sidekammer og lukk tett, men pass på at tarmplaten ikke har beveget seg under tilkobling.
- Fyll raskt på begge kamrene med Ringers løsning eller HEPES-buffer, og plasser boblende staver (Ringers løsning: 95% O2/5% CO2; HEPES buffer: 100% O2) i motsatt ende av kamrene, vekk fra membranen (bobler for nær preparatet kan ha en effekt på målingene).
- Koble til saltbroer igjen og kontroller om spenningen er stabil og pulsstrømmen for å sikre at tilkoblingene er i orden (figur 1C).
- Gjenta for hvert tarmpreparat.
- La systemet likevekte i ca 15 min. Hvis du bruker et opptakssystem, la ledningsevnen og Isc/membranens potensielle forskjell stabilisere seg før du starter forsøkene.
8. Fortynning potensielt eksperiment (åpne kretsforhold)
- Vask begge sider av kammeret ved å suge HEPES-bufferen og tilsett 5 ml fersk forvarmet HEPES-buffer på hver side.
- Slå på opptakssystemet. Sett området til 250 mV (systemet som brukes her forsterker utgangsspenningen 10x), sett markørposisjoner og sett opptakssystemet til å måle.
- Vri Ussing kammersystemer til klemmemodus og begynn å måle. Når membranpotensialet har stabilisert seg (~15-20 min), kan vurderingen begynne.
- Suge HEPES-bufferen fra Mucosal-siden og raskt erstatte med 5 ml oppvarmet fortynning HEPES buffer som inneholder 75 mM NaCl.
- Når membranpotensialet har nådd toppen (5-10 min), fjern fortynningsbufferen fra "Mucosal" -siden og erstatt med HEPES-buffer.
- Gjenta om nødvendig trinn 3 for Serosal-siden, og legg til fortynning HEPES-buffer på Serosal-siden.
- For å sikre at vevet er levedyktig, legg til adenylatcyklaseaktivatoren Forskolin (sluttkonsentrasjon 10 μM) til Serosal-siden.
- Når membranpotensialforskjellen har nådd en topp og har begynt å avta, er eksperimentet over.
9. Måling av transepithelial elektrisk ledning og baseline Isc (kortslutningsforhold)
- Vask begge sider av kammeret ved å suge Ringers løsning og tilsett 5 ml fersk boblet Ringers løsning på hver side.
- Slå på opptakssystemet. Sett området til 2,5 V (systemet som brukes her forsterker utgangsspenningen 10x), sett markørposisjoner og sett opptakssystemet til å måle.
- Vri Ussing kammersystemer til klemmemodus og begynn å måle; når Isc og ledningsevne har stabilisert seg (~15-20 min), kan baselinemålinger oppnås.
- For å sikre at vevet er levedyktig, legg til adenylatcyklaseaktivatoren Forskolin (sluttkonsentrasjon 10 μM) på Serosal-siden.
- Når membranpotensialforskjellen har nådd en topp og har begynt å avta, er eksperimentet ferdig.
10. Analysere resultater
- Under åpne kretsforhold beregner du transmukosal ledning fra spenningsskiftet som svar på gjeldende pulser i henhold til Ohms lov. Bestem den tilsvarende kortslutningsstrømmen (Isc) fra transmukosal spenning og ledning som gjelder Ohms lov.
- Bruk fortynningspotensialet til NaCl for å beregne den relative ioniske selektiviteten (PNa / PCl) med Goldman-Hodgkin-Katz-ligningen10.
- Beregn den absolutte selektiviteten til det tette krysset for hver ion ved hjelp av Kimizuka-Koketsu-ligningen11.
- Beregn PNa/PCl ved hjelp av Goldman-Hodgkin-Katz-ligningen fra fortynningspotensialer, og bestem absolutte permeabilities PNa og PCl fra Kimizuka-Koketsu-ligningen som beskrevet av Yu et al.10 som følger:
hvor, V: Fortynningspotensial (mV); α: Aktivitetsforhold. Den beregnede aktiviteten til NaCl i HEPES-bufferen delt på den beregnede aktiviteten til NaCl i fortynningsbufferen HEPES (For dette eksperimentet ble den beregnet som 1,8966); e: Matematisk konstant, 2,71828; GM: Transmucosal ledning (mS/cm2); K: Faraday konstant (96,485.3329 C/mol); R: Gass konstant (8.314 J / mol K); T: Temperatur (310,15 K)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene som vises i denne artikkelen er resultater som var en del av et større prosjekt som er fullført (se ref.4,23,24).
Transepithelial elektrisk ledning av tynntarmen reduseres hos Cldn15-/- mus.
Baseline transmucosal ledningsevne (under kortslutningsforhold) av det midterste lille tarmsegmentet i Cldn15-/- mus var lavere enn det som ble målt i villtypemus (henholdsvis figur 3A; 22,3 mS/cm2 og 48,7 mS/cm2 i Cldn15-/- og wild type mus). Baseline kortslutningsstrøm (Isc) ble også målt i Cldn15-/- mus (figur 3B). Baseline Isc ble økt (siden Na-avhengig glutamin transport er upregulert, se referanse23) i Cldn15-/- mus sammenlignet med kontroller (Figur 3B; 36.0 μA/cm2 en 26.9 μA/cm2 i Cldn15-/- og wild type mus, henholdsvis).
Fortynningspotensialet er redusert hos Cldn15-/- mus
For å vurdere selektiviteten til den lille tarmslimhinnen til NaCl i Cldn15-/- mus ble fortynningspotensialene målt med en konsentrasjonsgradient (60 mmol/L NaCl på slimhinnesiden og 119 mmol/L NaCl på serosalsiden). Ved luminal NaCl-fortynning ble det observert en positiv potensiell forskjell (9,2 mV) med hensyn til serosal side hos WT-mus (figur 3C). Dette positive fortynningspotensialet ble imidlertid redusert hos Cldn15-/- mus (figur 3C; 0,8 mV). Den relative permeabiliteten til NaCl (PNa/PCl) ble beregnet som ovenfor, og det ble funnet at den ble redusert hos Cldn15-/- mus, lik den reduserte potensielle forskjellen (henholdsvis figur 3D; 1,1 og 3,5, Cldn15-/- og WT-mus ). PNa/PCl > 0,7 betyr at Na+ og Cl- diffuserer via en kationisk selektiv pore (se figur 4 i ref.27). Fra disse dataene kan det sies at kationisk selektivitet av den midterste tynntarmen i Cldn15-/- mus reduseres. Dette er enig med ledningsdataene (figur 3A), som viser en reduksjon for Cldn15-/- mus, noe som betyr at paracellulære veier har gått ned.
Deretter ble de absolutte permeabilities av Na + (PNa) og Cl- (PCl) beregnet. PNa ble funnet å være redusert i Cldn15-/- mus (figur 3E; 3,28 x 10-4 cm/s og 10,92 x 10-4 cm/s, cldn15-/- og WT-mus, henholdsvis); PCl så imidlertid ikke ut til å endre seg (figur 3F), som viser at nedgangen i den relative permeabiliteten skyldes en reduksjon i permeabiliteten til Na +. Dette resultatet er fornuftig siden Cldn15-/- mus har mistet en Na + pore i claudin 15, noe som betyr at veiene som er tilgjengelige for Na + har blitt redusert.
Vurdering av levedyktighet i tarmpreparatet
Til slutt, for å sjekke levedyktigheten til tarmpreparatet, ble adenylatcyklaseaktivatoren, forskolin, lagt til serosalsiden, som aktiverer CFTR-kloridkanal, noe som resulterer i økning av kortslutningsstrøm (Isc). Det er ingen stor forskjell mellom Cldn15-/- og WT-mus (figur 3G; henholdsvis 341,5 μA/cm2 og 320,1 μA/cm2, Cldn15-/- og WT-mus). Siden tarmsegmentene reagerte på serosal påføring av forskolin, anses membranpreparatet å være levedyktig.
Figur 1: Ussing chamber set up. (A) Ussing chamber består av to halvdeler og tarmpreparatet monteres vertikalt. (B) Nærbilde av kammeråpningene (5 mm), som har parafilm stanset med et 5 mm hull festet. (C) Montert apparat. Calomel elektrode brukes til potensielle forskjellsmålinger, som er koblet til kammeret via KCl saltbroer. Ag-AgCl elektrode brukes til Isc-måling, som passerer over mukosalpreparatet og er koblet til kamrene via NaCl saltbroer. Vannjakken sirkulerer kontinuerlig vann ved 37 °C drevet av en vannpumpe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: H&E farget representativt bilde av et Ussing kammerpreparat fra musekolon. Det første panelet viser en hel tykkelse (uovertruffen) forberedelse. Det andre panelet viser en slimhinne og submucosal forberedelse (serosa-muskellaget har blitt strippet). Det tredje panelet viser et mukosalt preparat. Skalalinjen representerer 100 μm, forstørrelse 20x. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effekten av sletting av claudin 15 på elektrofysiologiske parametere. (A) Baseline transmukosal ledningsevne hos Cldn15-/- og WT-mus (henholdsvis n = 2 og 11). (B) Baseline kortslutningsstrøm (Isc) i Cldn15-/- og WT-mus (henholdsvis n = 2 og 11). (C) Fortynningspotensialet til NaCl i Cldn15-/- og WT-mus (henholdsvis n = 2 og 4). (D) Den relative permeabiliteten til NaCl i Cldn15-/- og WT-mus (henholdsvis n = 2 og 4). De absolutte permeabilities av Na + (E) og Cl- (F) i Cldn15-/- og WT mus (n = 2 og 4, henholdsvis). (G) Forskolin-indusert Isc-økning for å måle vevs levedyktighet hos Cldn15-/- og WT-mus (henholdsvis n = 2 og 7). Verdier representerer gjennomsnittet ± SEM (der det er aktuelt). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette eksperimentet ble Ussing-kamre brukt til å måle de grunnleggende elektriske parametrene og fortynningspotensialet til NaCl i tynntarmen til Cldn15-/- og WT-mus. Det er svært viktig når du gjør Ussing kammer eksperimenter for å verifisere at membranpreparatet som brukes i forsøkene er levedyktig. Dette gjøres vanligvis ved å legge til glukose eller adenylatcyklaseaktivator forskolin og se om det er en passende økning i Isc (100-300 μA / cm2 hos mus). En annen måte å vurdere om tarmpreparatet var akseptabelt for bruk, er ved å se på vevets ledningsevne. Skadet vev vil ofte ha høyere enn normalt ledningsevne (normal ledningsevne: ~20-60 mS/cm2 i musen), mens vev der muskellaget ikke er tilstrekkelig strippet, har en tendens til å ha en lavere enn normalt ledningsevne (figur 2). Det mest kritiske trinnet i alle Ussing kammerprotokoller, er vevsforberedelsene, og sikrer at det ikke er noen skade på det. I tillegg, med tynntarmen, bør ideelt membranpreparater monteres i kamrene innen 10 min av disseksjon for å unngå å bryte ned vevet. Etter montering av vevet er det ikke en god ide å prøve å justere preparatet, da skade kan oppstå. Under forsøkene, når du fjerner buffer fra kamrene eller justerer saltbroene eller boblende staver, unngå å berøre tarmpreparatet for enhver pris. Et annet viktig poeng for Ussing kammer eksperimenter er riktig oppvarming av kamrene og tilstrekkelig boblende av bufferløsningene. Ved bruk av Ringer-oppløsning er boblende med 95% O2/5% CO2 svært viktig for buffersystemet. I tillegg vil boblende som er for svak ikke blande seg godt nok, og hvis boblen er for sterk, kan membranen og elektriske målinger bli påvirket. Hvis det er et hull i tarmpreparatet, vil fortynningspotensialeksperimenter sannsynligvis ikke ha en stor membranpotensialforskjell (PD) etter en fortynning. Hvis PD er liten etter en fortynning, kan det skyldes et hull i tarmpreparatet, eller det kan indikere at vevet ikke ble montert riktig i kammeret.
Når du utfører Ussing-kammereksperimenter, kan en rekke ting gå galt. Vanligvis utvikler en boble på spissen av en saltbro. Når dette skjer, hvis det er den tynne KCl saltbroen som påvirkes, vil Isc eller membranen PD sannsynligvis bli svært uberegnelig og forsterkeren kan bli overbelastet. I dette tilfellet må du først slå av klemmemodus. Deretter klemmer du forsiktig spissen av saltbroen med tang til boblen er fjernet. Vær veldig forsiktig så du ikke berører membranen mens du gjør dette. Hvis boblen utvikler seg på spissen av den tykkere NaCl saltbroen, vil ledningsmålingen bli påvirket. Prosedyren for å fjerne boblen er den samme. Det er svært viktig å overvåke registreringen av dataene, for å sikre at det ikke er noen abnormiteter i dataene. I tillegg er det viktig å innse at parametrene ikke plutselig vil endres uten stimulans, så hvis dataregistreringen har plutselige drastiske endringer, kontroller saltbroene og tilkoblingene til elektrodene.
Måling av barrierefunksjonen og ion-selektiviteten til de tette kryssene er ikke mulig ved hjelp av andre vanlige metoder for å vurdere paracellulær permeabilitet. En vanlig brukt protokoll for å estimere paracellulær permeabilitet er oral gavage av FITC og måling av plasma FITC på et senere tidspunkt8. Denne metoden måler den generelle permeabiliteten til hele tarmkanalen til FITC. Videre blir FITC sannsynligvis transportert via lekkasjeveiene. Paracellulær transport antas å omfatte lekkasjebanen og poreveien28. Lekkasjebanen er en ikke-selektiv lavkapasitetsvei for større ladede eller uladede molekyler å passere gjennom de tette kryssene, mens porebanen er en selektiv vei med høy kapasitet som gjør at molekyler kan passere basert på størrelse og ladning28. FITC og andre makromolekyler kan vurdere lekkasjebanen, men de avslører ingen informasjon om ion- eller lade selectivity av et vev. Oral gavage av FITC eller andre makromolekylære sporstoffer gir heller ikke informasjon om hvor i tarmen lekkasje oppstår. I motsetning kan metoden som presenteres her brukes til å vurdere ionisk selektivitet av et bestemt segment av vev, og spesielt kan den estimere den relative permeabiliteten til spesifikke ioner. Lekkasjen av et vev kan vurderes ved å måle baseline ledningsevne, og i lekke vev som tynntarmen, anses >90% av ledningsevnen å skyldes bidraget fra den paracellulære banen29. Dermed gir den transepitheliale ledningsmålingen informasjon om mengden paracellulær ionbevegelse, men den er ikke spesifikk og avslører ikke om et vev har kationisk eller anionisk selektivitet. For å forstå permselectivity av de tette kryssene, er måling av fortynningspotensial nødvendig. Her ble Cldn15-/- mus brukt, som mangler den paracellulære Na + poredannende claudin 15. Ved å måle membranpotensialforskjellen som svar på fortynning av NaCl, kan ionisk selektivitet samt permeabilities av Na + og Cl- beregnes. Som forventet hadde Cldn15-/- mus en redusert potensiell forskjell, og reduserte PNa/PCl (figur 3D) sammenlignet med WT-mus. Knockout av claudin 15 resulterer i lavere kationisk selektivitet (PNa/PCl) og redusert relativ permeabilitet av Na+ (PNa) (figur 3E). I tillegg ble baseline elektrisk ledning redusert i Cldn15-/- mus (figur 3A), noe som avslørte at TJ har blitt strammere, og barrierefunksjonen har økt.
Mens fortynningspotensial er et veldig nyttig verktøy for å vurdere permselectivity av de tette kryssene, samt definere rollen som claudin proteiner, har den begrensninger. En stor begrensning av denne teknikken er at det er et gjennomsnitt av vevet. Innenfor den lille intestinale epitheliaen er det villi og krypter, og parametrene målt med Ussing-kamre vurderer ikke bidraget av villi og krypt epithelia separat. Dette kan være en faktor når man vurderer rollen som visse selektivt uttrykte claudins, for eksempel anses claudin 2 også som en kation pore, men det uttrykkes bare i kryptene24. En annen begrensning er at på grunn av tilstedeværelsen av flere forskjellige claudin proteiner i de tette kryssene, kan målingene ikke spesifikt tilskrives et bestemt protein. Selv om fortynningspotensialer har vært svært nyttige for å utforske rollene til claudin familieproteiner i eksogen claudin som uttrykker cellemodeller10,30. Til slutt bruker Ussing kammerteknikker ex-vivo vev, og denne protokollen bruker tarmpreparater uten muskellaget, noe som betyr at forholdene ikke er de samme som i vivo-forhold. Å forberede tarmen for Ussing-kamre krever dyktighet og tid, så eksperimenter i innfødt vev er ofte vanskelig å fullføre vellykket, er lav gjennomstrømning og tar mye tid.
Ussing-kammeret er et svært viktig verktøy som kan brukes på mange forskjellige epitel- og endotelvev. En stor fordel er at den bruker innfødt vev, som er mye mer pålitelig enn cellelinjemodeller, selv om cellemonolayere og organoide monolayers også kan vurderes i Ussing-kamre. Ussingkamre har bidratt til mange gode funn innen membranfysiologi, og de vil fortsatt være et viktig verktøy i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen potensielle interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av 17K00860 (til HH) og 19K20152 (til NI). WH ønsker å anerkjenne Otsuka Toshimi Scholarship Foundation for deres økonomiske støtte fra 2018-2021.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #3 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm | |
| #7 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm | |
| 10 mL locking syringe | Terumo | SS-10LZ | Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling |
| 19 g needle | Terumo | NN-1938R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 23 g needle | Terumo | NN-2332R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 5 mm punch | NA | NA | Use to punch holes in filter paper and parafilm |
| acupuncture needles | Seirin | NS | Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate |
| Agar | Fujifilm Wako | 010-15815 | |
| Alligator clips | NA | NA | Connects the electrode to the amplifier |
| CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
| D(-)-Mannitol | Fujifilm Wako | 133-00845 | This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer |
| D(+)-Glucose | Fujifilm Wako | 049-31165 | |
| Dissection kit | You will need, scissors and curved forceps | ||
| Dissection plates | We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber | ||
| DMSO | Sigma | 472301-500ML | For making forskolin stock |
| Electrical recorder | TOA Electronics | PRR-5041 | Other equivalent electrical recorders are available commercially |
| Epithelial voltage clamp amplifier | Nihon Kohden | CEZ9100 | Other equivalent amplifiers are available commerically |
| filter paper, cut into squares | NA | NA | Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation |
| fine forceps | Fast Gene | FG-B50476 | For blunt dissection of the muscle layer |
| Forskolin | Alomone Labs | F-500 | Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM |
| HEPES | Sigma | H4034-1KG | |
| Indomethacin | Sigma | I7338-5G | Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM |
| K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
| KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
| KCl/calomel electrode | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
| KH2PO4 | Kanto chemical | 32379-00 | |
| L(+)-Glutamine | Fujifilm Wako | 074-00522 | |
| MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
| Mixed Gas (95% O2/5% CO2) | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution | |
| NaCl | Fujifilm Wako | 191-01665 | |
| NaCl electrode | NA | NA | Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire |
| NaHCO3 | Fujifilm Wako | 191-01305 | |
| O2 Gas | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling chambers when using HEPES buffer | |
| parafilm | Bemis | PM-996 | Used to help seal Ussing chambers |
| pH meter | DKK-TOA Corp | HM-305 | HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C |
| pH meter electrode | DKK-TOA Corp | GST-5311C | |
| silicone rubber | Shinetsu Chemical | KE-12 | Used to fill dissection plates |
| silver wire | Used for making NaCl electrodes | ||
| Small jars w/ plastic lids | NA | NA | Use for NaCl electrodes |
| stereomicroscope | Zeiss | Stemi 305 | A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T1503-1KG | Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers |
| Ussing chambers | Sanki Kagaku Kougei | These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm | |
| Water pump and heating system | Tokyo Rikakikai Co. Ltd. | NTT-110 |
References
- Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23, 110-127 (1951).
- Field, M. Ion transport in rabbit ileal mucosa. II. Effects of cyclic 3', 5'-AMP. American Journal of Physiology - Legacy Content. 221, 992-997 (1971).
- Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 423-431 (2015).
- Ishizuka, N., et al. Luminal Na + homeostasis has an important role in intestinal peptide absorption in vivo. American Journal of Physiology - Gastorintestinal and Liver Physiology. 315, 799-809 (2018).
- Ikehara, O., et al. Subepithelial trypsin induces enteric nerve-mediated anion secretion by activating proteinase-activated receptor 1 in the mouse cecum. Journal of Physiological Sciences. 62, 211-219 (2012).
- Furuse, M. Molecular basis of the core structure of tight junctions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 002907 (2010).
- Tsukita, S., Tanaka, H., Tamura, A. The claudins: From tight junctions to biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 44, 141-152 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visual Experiments: JoVE. , e57032 (2018).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9, (2020).
- Yu, A. S. L., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: Identifi cation of an electrostatic interaction site. Journal of General Physiology. 133, 111-127 (2009).
- Kimizuka, H., Koketsu, K. Ion transport through cell membrane. Journal of Theoretical Biology. 6, 290-305 (1964).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3, 123-126 (2004).
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245, 1066-1073 (1989).
- Smith, J. J., Karp, P. H., Welsh, M. J. Defective fluid transport by cystic fibrosis airway epithelia. Journal of Clinical Investigation. 93, 1307-1311 (1994).
- Molinski, S. V., et al. Orkambi and amplifier co-therapy improves function from a rare CFTR mutation in gene-edited cells and patient tissue. EMBO Molecular Medicine. 9, 1224-1243 (2017).
- Kisser, B., et al. The Ussing chamber assay to study drug metabolism and transport in the human intestine. Current Protocols in Pharmacology. 77, John Wiley & Sons, Inc. 1-19 (2017).
- Östh, K. The horizontal Ussing chamber method in studies of nasal drug delivery - Method Delopment and Applications Using Different Formulations. , Uppsala University. Dissertation thesis (2002).
- Guo, P., et al. Study of penetration mechanism of labrasol on rabbit cornea by Ussing chamber, RT-PCR assay, Western blot and immunohistochemistry. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 14, 329-339 (2019).
- Okabe, K., et al. Effect of Benzalkonium Chloride on transscleral drug delivery. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46, 703 (2005).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).
- Tamura, A., et al.
- Nakayama, M., Ishizuka, N., Hempstock, W., Ikari, A., Hayashi, H. Na+-coupled nutrient cotransport induced luminal negative potential and Claudin-15 play an important role in paracellular Na+ recycling in mouse small intestine. International Journal of Molecular Sciences. 21, 376 (2020).
- Tamura, A., et al. Loss of claudin-15, but not claudin-2, causes Na+ deficiency and glucose malabsorption in mouse small intestine. Gastroenterology. 140, 913-923 (2011).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 296, (2009).
- Dobson, J. G., Kidder, G. W. Edge damage effect in in vitro frog skin preparations. American Journal of Physiology. 214, 719-724 (1968).
- Corman, B. Streaming potentials and diffusion potentials across rabbit proximal convoluted tubule. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 403, 156-163 (1985).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Frizzell, R. A., Schultz, S. G. Ionic conductances of extracellular shunt pathway in rabbit ileum. Journal of General Physiology. 59, 318-346 (1972).
- Otani, T., et al. Claudins and JAM-A coordinately regulate tight junction formation and epithelial polarity. Journal of Cell Biology. 218, 3372-3396 (2019).
