Summary
Tarmepitel giver ikke kun næringsstofabsorption, men beskyttelse mod skadelige stoffer. Det apikaleste epitel intercellulære kryds, dvs. det stramme kryds, regulerer paracellulært opløst stof og ionpermeabilitet. Her beskrives en protokol til fremstilling af slimhindeplader og vurdering af ionselektiviteten af tætte kryds ved hjælp af Ussing-kammerteknik.
Abstract
Ussing-kammerteknikken blev først opfundet af den danske videnskabsmand Hans Ussing i 1951 for at studere natriums tværcellulære transport hen over frøhud. Siden da er denne teknik blevet anvendt på mange forskellige væv for at studere de fysiologiske parametre for transport over membraner. Ussing-kammermetoden foretrækkes frem for andre metoder, fordi indfødt væv kan bruges, hvilket gør det mere anvendeligt til, hvad der sker in vivo. Men fordi indfødt væv anvendes, er gennemstrømningen lav, tiden er begrænset, og vævsforberedelse kræver dygtighed og træning. Disse kamre er blevet brugt til at studere specifikke transportproteiner i forskellige væv, forstå sygdomspatofysiologi såsom i cystisk fibrose, studere lægemiddeltransport og optagelse og især bidraget til forståelsen af næringsstoftransport i tarmen. I betragtning af hele epiteltransportprocessen i et væv er ikke kun transepitelveje, men også paracellulære veje vigtige. Stramme kryds er en nøgledeterminant for vævsspecifik paracellulær permeabilitet over tarmen. I denne artikel vil Ussing-kammerteknikken blive brugt til at vurdere ioners paracellulære permselektivitet ved at måle transepitelial konduktans og fortyndingspotentialer.
Introduction
Ussing-kammermetoden blev først udviklet af den danske videnskabsmand Hans Ussing. Ussing brugte det først til at måle kortslutningsstrømmen af natriumtransport over frøhud, efter at det blev observeret, at NaCl kunne transporteres over huden mod en stejl koncentrationsgradient1. Hans system bestod af frøhuden monteret mellem to kamre med adgang til hver side af huden. Hvert kammer indeholdt Ringers opløsning, som blev cirkuleret og luftet. To smalle agar ringebroer placeret nær huden og forbundet med mættede KCl-kalomelelektroder målte potentialeforskellen som aflæst af en potentiator. Et andet par agar-ringbroer var placeret i den modsatte ende af hvert kammer forbundet med bægerglas med mættet KCl mættet med AgCl for at anvende en elektromotorisk kraft tilvejebragt af et batteri. En potentiel skillevæg blev brugt til at justere spændingen, så den potentielle forskel på tværs af huden forblev nul, hvilket skabte kortslutningsforhold. En mikroamperemåler blev også forbundet for at aflæse strømmen, der passerer gennem huden (se figuren i ref.1 for originalt kammerdesign).
I løbet af de sidste 70 år er denne teknik blevet anvendt på mange forskellige væv, især tarmvæv, for at studere næringsstof- og iontransport. For eksempel blev mekanismen for kolera-induceret diarré undersøgt ved montering af kaninileum i disse kamre, og det blev konstateret, at koleratoksininduceret diarré formidles af cAMP2. Derudover blev disse kamre også brugt til at studere den mekanisme, der ligger til grund for glukosetransport via Na+-glucose-cotransporter 1 (SGLT1)3. Vores laboratorium fokuserer på transcellulær og paracellulær transport i tarmepitelceller. Ved hjælp af Ussing-kammermetoden blev peptidtransport vurderet i Claudin 15 knockout-mus, som har nedsat paracellulær natriumtransport, ved hjælp af Ussing-kamre til måling af absorptionen af det ikke-hydrolyserbare dipeptidglycylsarcosin. Det blev konstateret, at luminal Na+ homeostase er vigtig for protonkoblet peptidtransport4. Derudover blev disse kamre også brugt til at undersøge anionsekretion i murine cecum som reaktion på submucosal aktivering af proteinaseaktiveret receptor 1 af serinprotease trypsin5.
Ussing kamre er også for nylig blevet brugt til at vurdere de paracellulære veje i epitelvæv. Paracellulære veje reguleres af tætte kryds, som er komplekser af proteiner, der dannes på det punkt, hvor to eller flere celler mødes6. Barrierefunktionen og ionselektiviteten (uanset om anioner eller kationer selektivt er i stand til at passere gennem det tætte kryds) bestemmes af tilstedeværelsen af claudinfamilieproteiner; hvoraf nogle fungerer som barrierer (claudin 3 og 7), anionporer (claudin 10a) eller kationporer (claudin 2, 10b og 15)7. Andre metoder er blevet anvendt til at vurdere den paracellulære vej, såsom oral gavage af FITC ledsaget af BLODPLASMA FITC-koncentration8 eller EDTA-Cr9; Disse teknikker har imidlertid en lavere opløsning og kan ikke vurdere ionselektiviteten eller et specifikt afsnit af sektionerne i tarmkanalen. Ussingkamre kan imidlertid bruges til at vurdere fortyndingspotentialet for målioner og derfor bestemme ionselektiviteten af de tætte kryds. For eksempel med NaCl kan selektiviteten af de tætte kryds for Na + og Cl- beregnes ved at fortynde den ene side af membranen (normalt slimhindesiden) og måle ændringen i transepitelpotentialeforskellen. De relative permeabiliteter af Na+ og Cl- kan estimeres ved hjælp af Goldman-Hodgkin-Katz-ligningen10, og selektiviteten af det tætte kryds kan estimeres ved hjælp af Kimizuka-Koketsu-ligningen11. Disse kamre har derfor den fordel, at de måler vævets elektrofysiologiske parametre og som følge heraf giver mere information om ionernes passage gennem de tætte kryds end andre metoder med lavere opløsning.
Ussing-kammermetoden er ikke kun begrænset til tarmkanalen, selvom den er meget udbredt i undersøgelser vedrørende tarmen, har den også mange andre anvendelser. For eksempel er disse kamre blevet brugt til at studere cystisk fibrose, og specifikt kloridkanalen cystisk fibrose transmembran konduktansregulator (CFTR)12. Cystisk fibrose er forårsaget af en mutation i CFTR13, hvilket resulterer i nedsat kloridsekretion og væsketransport af respiratoriske epitelceller og et resulterende tykkere, tørrere slimlag14. Undersøgelse af luftvejsepitel CFTR er blevet udført med disse kamre for ikke kun at forstå sygdommen, men for at opdage måder at behandle sygdommen på. Hos patienter med sjældne mutationer, der forårsager cystisk fibrose, er analyse af patientens respiratoriske epitelceller f.eks. blevet anvendt til at teste terapier som Orkambi og en forstærker-co-terapi15.
Ussing-kamre er også blevet brugt til at studere veje til lægemiddellevering, f.eks. med humant biopsivæv for at studere lægemiddeloptagelse og farmakokinetik16. Intestinal optagelse er ikke den eneste vej til lægemiddellevering. Disse kamre er også blevet brugt til at studere nasale lægemiddelleveringssystemer17. Lægemiddelleveringsundersøgelser med Ussing-kamre er også blevet udført for øjet. I kaninhornhinden blev der udført permeabilitets- og optagelsesundersøgelser med Labrasol, et lægemiddel, der er designet til at øge absorptionen af lægemidler på tværs af væv18. En anden undersøgelse undersøgte virkningen af benzylalkoniumchlorid på transskleral lægemiddelafgivelse i kaninsclera19.
Ussing-kammermetoden er nyttig, fordi indfødt væv kan bruges. Som sådan foretrækkes det frem for in vitro-modeller såsom Caco-2-cellelinjer. Teknikken kræver imidlertid dygtighed og tid til at forberede prøver, så den er ikke egnet til applikationer med høj gennemstrømning. De elektrofysiologiske egenskaber af cellemonolag kan studeres ved hjælp af cellekulturindsatser i disse kamre. Nylige opdagelser har gjort det muligt at dyrke organoider, som er miniorganer dyrket i kultur fra høsten af epitel- eller endotelstamceller20. Organoidkultur kan manipuleres til at blive dyrket i et monolag, hvilket gør det muligt at montere organoider i et Ussing-kammer21. Organoider af forskellige epitel- og endotelvæv kan undersøges, hvilket sænker antallet af nødvendige dyr, da organoidkultur kan opretholdes på lang sigt. Dette vil også øge gennemstrømningen, da tidskrævende og besværlige vævsdissektions- og forberedelsestrin ikke er nødvendige. I fremtiden vil Ussing-kammerstudier fortsat være meget nyttige til at studere vævstransport, og de vil være særligt vigtige inden for personlig medicin.
Følgende protokol demonstrerer anvendelsen af Ussing-kammermetoden til at vurdere permselektiviteten og barrierefunktionen af de stramme kryds i tyndtarmen af Claudin 15 knockout (Cldn15-/-) mus og vildtypekontroller (WT) ved at måle fortyndingspotentialet for NaCl. Stramme kryds (TJ) dannes på det punkt, hvor to eller flere celler mødes i epitel- og endotelvæv. Bicellulære tætte kryds (bTJ), især claudinfamiliens proteiner, der findes i bTJ, menes at bestemme barrierefunktionen og permselektiviteten af TJ7. Cldn15-/- mus har en mega tyndtarm22 og nedsat næringsoptagelsesevne på grund af tabet af intestinal Na+ genanvendelse, der sker via claudin 154,23,24. Cldn15-/- mus har nedsat Na+ homeostase, hvilket gør dem til en interessant model til at studere PERMSELECTIVITETEN AF TJ. Følgende protokol vurderer permeabiliteten af TJ til NaCl ved at måle fortyndingspotentialet for NaCl (PNa/PCl) i den midterste tyndtarm. Kort fortalt kan ændringen i membranpotentialeforskellen, der opstår ved fortynding af den ene side af membranen (M-siden eller S-siden, begge måles i nedenstående protokol) bruges til at beregne permeabiliteten af Na+ (PNa) og Cl- (PCl), og fortyndingspotentialet (PNa / PCl) vil vise, om det stramme kryds har en kationisk eller anionisk selektivitet.
Eksperimenterne i denne protokol blev udført ved hjælp af et tilpasset Ussing-kammer (figur 1A), som består af to halvdele, mellem hvilke tarmpræparatet er monteret lodret, spændingsklemmeforstærker, elektrisk optager, elektroder, saltbroer, Ringers opløsning, HEPES-buffer (150 mM NaCl), fortyndet HEPES-buffer (75 mM NaCl), tarmforberedelse (for detaljer om udstyr se materialetabellen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr, der blev brugt i disse forsøg, blev opretholdt i dyreplejefaciliteten ved University of Shizuoka, og forsøgene blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for dyreforskning fastsat af University of Shizuoka. Alle forsøg blev udført med godkendelse fra Animal Care and Use Committee ved University of Shizuoka (Tilladelser #205272 og #656-2303).
1. Fremstilling af NaCl-elektroder
BEMÆRK: Elektroderne, der anvendes i disse eksperimenter, består af koncentreret NaCl eller KCl. KCl/kalomelelektroder købes kommercielt. Før du starter eksperimentet, skal du sørge for, at alle elektroder er fyldt til toppen med koncentreret NaCl- eller KCl-opløsning.
- Forbered små glasburer med plastlåg (volumen 20 ml).
- Bor to huller i plastlågene, det ene til NaCl-saltbroen (2,5 mm i diameter) og det andet til sølvtråd (1 mm diameter; Figur 1C, NaCl-elektrode).
- Fyld glasburken med mættet NaCl-opløsning (ca. 15 ml, indtil den er fuld).
- Indsæt sølvtråd (0,8 mm diameter, 7 cm lang) i krukken, men sørg for, at tråddelen uden for krukken kan tilsluttes via alligatorclips (lille størrelse) til forstærkersystemet.
- Når de ikke er i brug, skal du pakke elektroderne ind og sørge for, at hullerne er dækket med parafilm for at forhindre tørring.
2. Forberedelse af saltbroer
BEMÆRK: Forbered saltbroer mindst en dag før eksperimentet for at give tilstrækkelig tid til at størkne. Saltbroer kan bruges gentagne gange, men brug efter 2 måneder anbefales ikke.
- NaCl saltbroer
- Forbered #7 polyethylslange (udvendig diameter 2,3 mm, indvendig diameter 1,3 mm), 19 G nål og låsesprøjte, 200 ml 1 M NaCl-opløsning, 2 g agar, forseglbar plastbeholder til opbevaring af saltbroer.
- Forbered et passende antal saltbroer ved at skære slangen til den størrelse, der er nødvendig for Ussing-kammeret, der er oprettet (hvert kammer kræver to saltbroer).
- Før injektion af agar skal du lave en U-form med rørene og placere dem i et bæger med varmt vand (for at skabe en let form til opsætning af saltbroer).
- Lav 200 ml 1 M NaCl ved at opløse 11.688 g NaCl i 200 ml i deioniseret vand.
- Opdel 1 M NaCl i 100 ml portioner: Lav 100 ml 2% agar i 1 M NaCl (bland 2 g agar i NaCl, opvarm i mikrobølgeovn for at opløse).
- Brug en 19 G nål og låsesprøjte til at fylde sprøjten med 1 M NaCl/agaropløsning. Begynd forsigtigt at udvise opløsningen dråbe for dråbe, og indsæt nålen i den ene ende af røret og fyld, indtil blandingen kommer ud fra den anden side.
- Træk langsomt nålen ud, mens du stadig udtrykker opløsningen, og gentag, indtil alle de nødvendige saltbroer er lavet. (Hvis opløsningen størkner i sprøjten eller nålen, opvarmes den kortvarigt i varmt vand, indtil opløsningen kan udtrykkes igen.)
- Kontroller saltbroer for at sikre, at der ikke er bobler, og opbevar i den resterende 1 M NaCl-opløsning i en forseglbar beholder.
- KCl saltbroer
BEMÆRK: Tyndere slanger bruges til KCl agarbroerne for at undgå forøgelse af K + -koncentrationen i bufferen, da saltbrospidserne kan opløses, og K + kan lække ind i bufferen.- Forbered #3 polyethylslange (udvendig diameter 1,0 mm, indvendig diameter 0,5 mm), 23 G nål og lås type sprøjte, 200 ml 1 M KCl opløsning, 2 g agar, forseglbar plastbeholder til opbevaring af saltbroer.
- Forbered et passende antal saltbroer ved at skære slangen til den størrelse, der er nødvendig for Ussing-kammeret, der er oprettet (hvert kammer kræver to saltbroer).
- Lav 200 ml 1 M KCl ved at opløse 14,91 g KCl i 200 ml deioniseret vand.
- Opdelt i to 100 ml portioner: Lav 100 ml 2% agar i 1 M KCl (bland 2 g agar i KCl, opvarm i en mikrobølgeovn for at opløse).
- Brug en 23 G nål og låsesprøjte til at injicere slangen med 2% agar 1 M KCl-blanding (sørg for, at rørene er helt fyldte, og at der ikke er bobler) på samme måde som med NaCl-saltbroerne.
- Kontroller saltbroer for at sikre, at der ikke er bobler, og opbevar dem i den resterende 1 M KCl-opløsning i en forseglbar beholder.
3. Fremstilling af Ringers opløsning og HEPES-buffer
BEMÆRK: Afhængigt af vævet monteret i Ussing-kammeret kan komponenterne i Ringers opløsning variere. Opskrifterne, der præsenteres her, er specifikke for tyndtarmen og tyktarmen.
- Gør Ringers løsning frisk på dagen for forsøgene som beskrevet i tabel 1.
- Boble opløsningen med 95% O2/5% CO2 for at tilvejebringe O2 til vævet og en bufferkapacitet.
| Ringers opløsning (tyndtarmen) | Ringers opløsning (tyktarmen) |
| NaHCO3 – 21,0 mM | NaHCO3 – 21,0 mM |
| K2HPO4 – 2,4 mM | K2HPO4 – 2,4 mM |
| KH2PO4 – 0,6 mM | KH2PO4 – 0,6 mM |
| NaCl – 119,0 mM | NaCl – 119,0 mM |
| MgCl2 – 1,2 mM | MgCl2 – 1,2 mM |
| CaCl2 – 1,2 mM | CaCl2 – 1,2 mM |
| Indomethacin - 10 μM (Lav 1 mM lager i 21 mM NaHCO3, tilsæt 10 ml lager til 1 L af Ringers opløsning) | Indomethacin - 10 μM (Lav 1 mM lager i 21 mM NaHCO3, tilsæt 10 ml lager til 1 L af Ringers opløsning) |
| 1 mM glutamin (0,146 g/l) | 10 mM glukose |
Tabel 1: Ringers løsningsopskrift. For at fremstille Ringers opløsning blandes alle komponenter sammen med deioniseret vand. Ringers løsning laves bedst frisk før eksperimenter. Opbevares i køleskabet eller på is indtil brug. Før brug, gas med 95% O2/5% CO2.
- Hepes-bufferen gøres frisk på forsøgsdagen som beskrevet i tabel 2 ved at blande ingredienser i deioniseret vand.
- Juster ikke til det endelige volumen buffer før efter pH-justering.
- Varm HEPES-bufferen til 37 °C, og pH-værdien justeres til 7,4 ved langsomt at tilsætte dråber af 1 M Tris-opløsning under omrøring.
- Juster til det endelige volumen ved at tilsætte den passende mængde deioniseret vand.
| HEPES Buffer | Fortynding HEPES buffer |
| HEPES – 10 mM | HEPES – 10 mM |
| Glukose – 10 mM (tyktarmen) | Glukose – 10 mM (tyktarmen) |
| 1 mM glutamin (0,146 g/l) (tyndtarmen) | 1 mM glutamin (0,146 g/l) (tyndtarmen) |
| NaCl – 150 mM | NaCl – 75 mM + 150 mM mannitol (for at justere for osmolalitetsforskelle) |
| MgCl2 – 1 mM | MgCl2 – 1 mM |
| CaCl2 – 2 mM | CaCl2 – 2 mM |
| Indomethacin - 10 μM (Lav 1 mM lager i 21 mM NaHCO3, tilsæt 10 ml lager til 1 L Ringer's Solution) | Indomethacin - 10 μM (Lav 1 mM lager i 21 mM NaHCO3, tilsæt 10 ml lager til 1 L Ringer's Solution) |
| Juster til pH 7,40 (37 °C) ved hjælp af 1 M Tris | |
Tabel 2: HEPES Buffer opskrift. For at gøre HEPES-buffer og fortynding HEPES-buffer opløses alle ingredienser i deioniseret vand. Opløsninger skal pH-justeres med 1 M Tris-opløsning, så tilsæt ikke fuld mængde vand (f.eks. Når du laver 1 L, opløses alle ingredienser i ca. 800 ml vand). Derefter opvarmes opløsningen til 37 °C, pH-værdien justeres til 7,4, og det endelige volumen justeres derefter.
4. Opsætning af ussingkammer
BEMÆRK: Ussing-kamrene, der anvendes i denne protokol, er specialfremstillede kontinuerlige perfusionskamre. For at vurdere musens tarmbarrierefunktion eller næringsoptagelse anbefales kamre med en åbning med en diameter på 4 eller 5 mm25 (figur 1A-C).
- For at reducere kanteffekten26 og hjælpe med at forsegle kamrene skal du fastgøre 4 eller 5 mm hulstanset paraffinfilm (ca. 4 cm2) inden opsætning (figur 1B).
- Opsætning i åbne kredsløbsbetingelser til måling af fortyndingspotentiale. Indstil i aktuel klemmetilstand. Indstil udgangen som strøm, og indstil strømpulsen til ±20 μA.
- Ved opsætning i kortslutningsbetingelser til måling af kortslutningsstrøm og transmukosal modstand indstilles i spændingsklemmetilstand. Indstil udgangen som spænding, og indstil spændingspulsen til ±5 mV.
- Sørg for, at der cirkulerer 37 °C vand i vandkappen.
- Fyld hvert kammer med Ringers opløsning eller HEPES-buffer (mængden afhænger af det anvendte system, de her anvendte kamre kræver 5 ml for hver side) og sørg for, at der ikke er lækager.
- Tilslut saltbroer og elektroder.
- Sørg for, at spændingen er 0 og stabil, pulsstrøm for at sikre, at saltbroer og elektroder er korrekt konfigureret.
- Lad systemet og Ringers opløsningstemperatur udligne i mindst 20 minutter.
- Efter ligevægt skal du korrigere asymmetrisk spændingsforskel mellem KCl-elektroder og kompensere for væskemodstand ved at ændre den til nul (se manualen til Ussing-kammersystemet, der bruges til at bestemme den korrekte måde).
5. Dissektion af tarmvæv
BEMÆRK: Alle dyreforsøg skal udføres inden for de regler, der er fastsat af landet og universitetet.
- Før du tager tarmvævet, skal du forberede frisk, iskold Ringers opløsning og boble med 95% O2 og 5% CO2 i 15 minutter (trin 3).
- Anæstesi mus i henhold til retningslinjer for brug af dyr i forskning. Til dette forsøg blev mus anæstetiseret med 2% -3% isofluran administreret af en anæstesi. Kontroller for den korrekte anæstesi ved at klemme tæer og sikre, at der ikke er nogen smerterespons.
- Lav et snit i maven med en saks fra bækkenet til membranen; find maven og skær den pyloriske ende af maven.
- Tag fat i mavedelen, der er fastgjort til tyndtarmen med tang, og træk forsigtigt tyndtarmen, mens du skærer de mesenteriske vedhæftede filer væk. Pas på ikke at skære eller beskadige tarmvævet på nogen måde.
- Fortsæt med at dissekere tarmen helt til anus. For fuldstændig fjernelse af tyktarmen skal du skære bækkenbenene for at afsløre den distale del af tyktarmen og forsigtigt fjerne resten af tarmen ved at skære vedhæftede filer væk.
- Mål tarmens længde og opdel i ønskede segmenter. Til dette eksperiment skal du opdele tyndtarmen i tre segmenter og bruge det midterste segment.
- Anbring de ønskede segmenter i iskold, boblet Ringers opløsning; Åbn derefter hvert segment i længderetningen ved at skære langs de mesenteriske vedhæftede filer. Trim fedt og bindevæv væk.
- Returner segmenterne til den iskolde Ringers opløsning og vask grundigt (selv i den iskolde opløsning er iltning af det lysende epitel vigtigt for at opretholde epitelfunktionen).
6. Stripping af muskellaget og forberedelse af tarmpladen
BEMÆRK: Fjernelse af serosa (muskellag) er vigtig for transportundersøgelser ved hjælp af tarmen. Hvis serosa forbliver, kan tarmvævet blive udsat for tilfældige muskelkontraktioner, der vil forvrænge de elektrofysiologiske data, og transport kan hæmmes. Unstripped væv forringes hurtigt, når det monteres i Ussing-kamre, da serosa er en betydelig diffusionsbarriere for substrat og ilt. I nogle særlige tilfælde kan det være nødvendigt at beholde muskellaget, så beslutningen er op til forskeren og det eksperimentelle design. Tarmpladerne kan fremstilles på to måder afhængigt af hvilket lag der fjernes (figur 2). Til dette eksperiment kræves slimhinde og submukosale præparater (figur 2, 2. panel).
- Forbered dissektionsplader (10 cm diameter) dækket med silikonegummi, stifter (små akupunkturnåle), 5 mm stanset filterpapir og parafilmfirkanter (2 cm x 2 cm; er muligvis ikke nødvendige for andre systemer).
- Hæld frisk, iskold, boblet Ringers opløsning i dissektionspladen (nok til at dække vævet, ca. 2-3 ml).
- Under et stereomikroskop skal du fastgøre enderne af tarmvævet (slimhindesiden nedad).
- Ved hjælp af fine tang skal du direkte dissekere muskellaget fra den underliggende slimhinde.
- Pas på ikke at rive eller indføre huller i vævet.
- Når muskellaget er fjernet, skal du skære et stykke, der er stort nok til en åbning med en diameter på 5 mm. Ved tilberedning af tyndtarmen skal fjernelse af serosa-muskellaget ske inden for 10 minutter, da luminal iltning er vanskelig under disse forhold.
- Vådt 5 mm stanset filterpapir firkantet i Ringers opløsning og læg tarmvævet på det med slimhindesiden nedad, da submukosale præparater spontant vikles rundt med slimhindesiden udenfor.
- Sørg for, at åbningen er helt dækket af tarmvævet, og at der ikke er rynker til stede. Brug en sort tavle under præparatet til at undersøge, om åbningen er helt dækket.
- Gentag denne procedure for det krævede antal slimhindepræparater (i dette eksperiment kræves to præparater: et præparat vil blive brugt til at måle fortyndingspotentiale, og det andet vil blive brugt til at måle baseline elektriske parametre).
7. Montering af tarmpræparater i Ussing-kamre
BEMÆRK: Opsætningen afhænger af typen af det anvendte Ussing-kammersystem og optagelsessystem.
- Udsugning af Ringers opløsning/HEPES-buffer fra Ussing-kammeret.
- Demonter Ussing-kammeret og læg filterpapiret med tarmpræparatet slimhindesiden nedad på slimhindesidekammeret og juster, så kammerets vindue flugter med filterpapirets hul (figur 1A, sort markering omkring kammervinduet er nyttig til justering af præparaterne).
- Placer forsigtigt det serosale sidekammer på slimhindens sidekammer og luk tæt, men sørg for, at tarmpladen ikke har bevæget sig under tilslutning.
- Genopfyld hurtigt begge kamre med Ringers opløsning eller HEPES-buffer, og læg boblende tryllestave (Ringers opløsning: 95% O2/5% CO2; HEPES-buffer: 100% O2) i den modsatte ende af kamrene, væk fra membranen (boblende for tæt på præparatet kan have en effekt på målingerne).
- Tilslut saltbroer igen, og kontroller, om spændingen er stabil og pulsstrømmen for at sikre, at forbindelserne er i orden (figur 1C).
- Gentag for hvert tarmpræparat.
- Lad systemet udligne i ca. 15 min. Hvis du bruger et optagelsessystem, skal du lade konduktansen og Isc/membranens potentialeforskel stabilisere sig, inden forsøgene påbegyndes.
8. Fortyndingspotentiale eksperiment (åbne kredsløbsbetingelser)
- Vask begge sider af kammeret ved at suge HEPES-bufferen og tilsætte 5 ml frisk forvarmet HEPES-buffer til hver side.
- Tænd for optagesystemet. Indstil rækkevidden til 250 mV, (det system, der bruges her, forstærker udgangsspændingen 10x), indstil markørpositioner, og indstil optagelsessystemet til at måle.
- Drej Ussing-kammersystemer til klemmetilstand, og begynd at måle. Når membranpotentialet er stabiliseret (~15-20 min), kan vurderingen begynde.
- Sug HEPES-bufferen fra slimhindesiden, og udskift hurtigt med 5 ml opvarmet fortynding HEPES-buffer indeholdende 75 mM NaCl.
- Når membranpotentialet har toppet (5-10 min), skal fortyndingsbufferen fjernes fra "Slimhindesiden" og udskiftes med HEPES-buffer.
- Gentag om nødvendigt trin 3 for den serosale side, og tilsæt fortyndings-HEPES-bufferen til den serosale side.
- For at sikre, at vævet er levedygtigt, tilsættes adenylatcyklaseaktivatoren Forskolin (endelig koncentration 10 μM) til den serosale side.
- Når membranpotentialeforskellen har nået et højdepunkt og er begyndt at falde, er eksperimentet slut.
9. Måling af transepitelial elektrisk konduktans og baseline Isc (kortslutningsbetingelser)
- Vask begge sider af kammeret ved at suge Ringers opløsning og tilsætte 5 ml frisk boblet Ringers opløsning til hver side.
- Tænd for optagesystemet. Indstil området til 2,5 V (det system, der bruges her, forstærker udgangsspændingen 10x), indstil markørpositioner, og indstil optagelsessystemet til at måle.
- Drej Ussing-kammersystemer til klemmetilstand og start måling; når Isc og konduktans er stabiliseret (~ 15-20 min), kan baselinemålinger opnås.
- For at sikre, at vævet er levedygtigt, tilsættes adenylatcyklaseaktivatoren Forskolin (endelig koncentration 10 μM) til den serosale side.
- Når membranpotentialeforskellen har nået et højdepunkt og er begyndt at falde, udføres eksperimentet.
10. Analyse af resultater
- Under åbne kredsløbsforhold beregnes transmukosal konduktans fra spændingsændringen som reaktion på strømimpulser i henhold til Ohms lov. Bestem den ækvivalente kortslutningsstrøm (Isc) fra transmukosal spænding og konduktans ved anvendelse af Ohms lov.
- Brug Fortyndingspotentialet for NaCl til beregning af den relative ioniske selektivitet (PNa/PCl) med Goldman-Hodgkin-Katz-ligningen10.
- Anslå den absolutte selektivitet af det tætte kryds for hver ion ved hjælp af Kimizuka-Koketsu ligningen11.
- Beregn PNa/PCl ved hjælp af Goldman-Hodgkin-Katz-ligningen ud fra fortyndingspotentialer, og bestem absolutte permeabiliteter PNa og PCl ud fra Kimizuka-Koketsu-ligningen som beskrevet af Yu et al.10 som følger:
hvor, V: Fortyndingspotentiale (mV); α: Aktivitetsforhold. Den beregnede aktivitet af NaCl i HEPES-bufferen divideret med den beregnede aktivitet af NaCl i fortyndings-HEPES-bufferen (for dette forsøg blev den beregnet som 1,8966); e: Matematisk konstant, 2.71828; GM: Transmukosal konduktans (mS/cm2); F: Faraday-konstant (96.485,3329 C/mol); R: Gaskonstant (8,314 J/mol K); T: Temperatur (310,15 K)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne i dette papir er resultater, der var en del af et større projekt, der er afsluttet (se ref.4,23,24).
Transepitelial elektrisk konduktans i tyndtarmen er nedsat hos Cldn15-/- mus.
Baseline transmukosal konduktans (under kortslutningsbetingelser) for det midterste tyndtarmssegment i Cldn15-/- mus var lavere end den, der blev målt i henholdsvis vildtypemus (figur 3A; 22,3 mS/cm2 og 48,7 mS/cm2 i Cldn15-/- og vildtypemus). Baseline kortslutningsstrøm (Isc) blev også målt i Cldn15-/- mus (figur 3B). Baseline Isc blev øget (da Na-afhængig glutamintransport er opreguleret, se reference23) hos Cldn15-/- mus sammenlignet med kontroller (figur 3B; 36,0 μA/cm2 og 26,9 μA/cm2 i henholdsvis Cldn15-/- og vildtypemus).
Fortyndingspotentialet er nedsat i Cldn15-/- mus
For at vurdere selektiviteten af tyndtarmsslimhinden til NaCl i Cldn15-/- mus blev fortyndingspotentialerne målt med en koncentrationsgradient (60 mmol/L NaCl på slimhindesiden og 119 mmol/L NaCl på den serosale side). Ved luminal NaCl-fortynding blev der observeret en positiv potentialeforskel (9,2 mV) med hensyn til serosal side hos WT-mus (figur 3C). Dette positive fortyndingspotentiale blev imidlertid reduceret hos Cldn15-/- mus (figur 3C; 0,8 mV). Den relative permeabilitet af NaCl (PNa/PCl) blev beregnet som ovenfor, og det blev konstateret, at den var nedsat hos Cldn15-/- mus, svarende til den nedsatte potentielle forskel (figur 3D; 1,1 og 3,5, cldn15-/- og WT-mus , henholdsvis). PNa/PCl > 0,7 betyder, at Na+ og Cl diffunderer via en kationisk selektiv pore (se figur 4 i ref.27). Ud fra disse data kan man sige, at den kationiske selektivitet af den midterste tyndtarm i Cldn15-/- mus er nedsat. Dette stemmer overens med konduktansdataene (figur 3A), som viser en reduktion for Cldn15-/- mus, hvilket betyder, at de paracellulære veje er faldet.
Dernæst blev de absolutte permeabiliteter af Na + (PNa) og Cl- (PCl) beregnet. PNa viste sig at være nedsat hos Cldn15-/- mus (figur 3E; henholdsvis 3,28 x 10-4 cm/s og 10,92 x 10-4 cm/s, Cldn15-/- og WT-mus); PCl syntes imidlertid ikke at ændre sig (figur 3F), hvilket viser, at faldet i den relative permeabilitet skyldes et fald i permeabiliteten af Na+. Dette resultat giver mening, da Cldn15-/- mus har mistet en Na+ pore i claudin 15, hvilket betyder, at de veje, der er tilgængelige for Na+, er blevet reduceret.
Vurdering af levedygtighed i tarmpræparat
Endelig, for at kontrollere levedygtigheden af tarmpræparatet, blev adenylatcyklaseaktivatoren, forskolin, tilsat til den serosale side, som aktiverer CFTR-chloridkanalen, hvilket resulterer i stigninger i kortslutningsstrømmen (Isc). Der er ikke den store forskel mellem Cldn15-/- og WT-mus (figur 3G; henholdsvis 341,5 μA/cm2 og 320,1 μA/cm2, Cldn15-/- og WT-mus). Da tarmsegmenterne reagerede på serosal anvendelse af forskolin, anses membranpræparatet for at være levedygtigt.
Figur 1: Ussingkammer oprettet. (A) Ussingkammer består af to halvdele, og tarmpræparatet monteres lodret. (B) Nærbillede af kammeråbningerne (5 mm), som har parafilm stanset med et 5 mm hul fastgjort. (C) Samlet apparatur. Kalomelelektrode anvendes til potentialforskelsmålinger, som er forbundet til kammeret via KCl-saltbroer. Ag-AgCl-elektrode anvendes til Isc-måling, som passerer over slimhindepræparatet og er forbundet til kamrene via NaCl-saltbroer. Vandkappen cirkulerer kontinuerligt vand ved 37 °C drevet af en vandpumpe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: H&E farvet repræsentativt billede af et Ussing-kammerpræparat fra musekolon. Det første panel viser en hel tykkelse (unstripped) forberedelse. Det andet panel viser en slimhinde og submucosal forberedelse (serosa-muskellag er blevet strippet). Det tredje panel viser et slimhindepræparat. Skalabjælken repræsenterer 100 μm, forstørrelse 20x. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Effekten af deletion af claudin 15 på elektrofysiologiske parametre. (A) Baseline transmukosal konduktans i Cldn15-/- og WT-mus (n = henholdsvis 2 og 11). (B) Baseline kortslutningsstrøm (Isc) i Cldn15-/- og WT-mus (n = henholdsvis 2 og 11). (C) Fortyndingspotentialet for NaCl i Cldn15-/- og WT-mus (henholdsvis n = 2 og 4). (D) Den relative permeabilitet af NaCl i Cldn15-/- og WT-mus (henholdsvis n = 2 og 4). De absolutte permeabiliteter af Na+ (E) og Cl- (F) i Cldn15-/- og WT-mus (henholdsvis n = 2 og 4). (G) Forskolin-induceret Isc-forøgelse til måling af vævets levedygtighed hos Cldn15-/- og WT-mus (henholdsvis n = 2 og 7). Værdierne repræsenterer gennemsnittet ± SEM (hvis relevant). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette eksperiment blev Ussing-kamre brugt til at måle de elektriske parametre i basislinjen og fortyndingspotentialet for NaCl i tyndtarmen hos Cldn15-/- og WT-mus. Det er meget vigtigt, når man laver Ussing-kammereksperimenter for at kontrollere, at membranpræparatet, der anvendes i forsøgene, er levedygtigt. Dette gøres normalt ved at tilsætte glukose eller adenylatcyklaseaktivatoren forskolin og se, om der er en passende stigning i Isc (100-300 μA / cm2 hos mus). En anden måde at vurdere, om tarmpræparatet var acceptabelt til brug, er ved at se på vævets konduktans. Beskadiget væv vil ofte have højere end normal konduktans (normal konduktans: ~20-60 mS/cm2 i mus), mens væv, hvor muskellaget ikke er blevet fjernet tilstrækkeligt, vil have en tendens til at have en lavere konduktans end normalt (figur 2). Det mest kritiske trin i alle Ussing-kammerprotokoller er vævsforberedelsen og at sikre, at der ikke er nogen skade på det. Derudover bør membranpræparater med tyndtarmen ideelt set monteres i kamrene inden for 10 minutter efter dissektion for at undgå nedbrydning af vævet. Efter montering af vævet er det ikke en god ide at forsøge at justere præparatet igen, da der kan opstå skader. Under forsøgene, når du fjerner buffer fra kamrene eller justerer saltbroerne eller boblende tryllestave, skal du undgå at røre tarmpræparatet for enhver pris. Et andet vigtigt punkt for Ussing-kammereksperimenter er korrekt opvarmning af kamrene og tilstrækkelig boblende bufferopløsningerne. Ved brug af Ringer-opløsning er bobler med 95% O2/5% CO2 meget vigtigt for buffersystemet. Derudover blandes boblende, der er for svag, ikke godt nok, og hvis boblen er for stærk, kan membranen og de elektriske målinger blive påvirket. Hvis der er et hul i tarmpræparatet, vil fortyndingspotentialeforsøg sandsynligvis ikke have en stor membranpotentialeforskel (PD) efter en fortynding. Hvis PD er lille efter en fortynding, kan det skyldes et hul i tarmpræparatet, eller det kan indikere, at vævet ikke var monteret korrekt i kammeret.
Når du udfører Ussing-kammereksperimenter, kan en række ting gå galt. Oftest udvikler en boble sig ved spidsen af en saltbro. Når dette sker, hvis det er den tynde KCl-saltbro, der påvirkes, vil Isc eller membranen PD sandsynligvis blive meget uregelmæssig, og forstærkeren kan blive overbelastet. I denne situation skal du først slukke for klemmetilstanden. Brug derefter tang til forsigtigt at klemme spidsen af saltbroen, indtil boblen fjernes. Vær meget forsigtig med ikke at røre membranen, mens du gør dette. Hvis boblen udvikler sig i spidsen af den tykkere NaCl-saltbro, vil konduktansmålingen blive påvirket. Proceduren for at fjerne boblen er den samme. Det er meget vigtigt at overvåge registreringen af dataene for at sikre, at der ikke er nogen abnormiteter i dataene. Derudover er det vigtigt at indse, at parametrene ikke pludselig ændres uden stimulus, så hvis dataoptagelsen har pludselige drastiske ændringer, skal du kontrollere saltbroerne og elektrodernes forbindelser.
Måling af barrierefunktionen og ionselektiviteten af de tætte kryds er ikke mulig ved hjælp af andre almindeligt anvendte metoder til vurdering af paracellulær permeabilitet. En almindeligt anvendt protokol til estimering af paracellulær permeabilitet er oral gavage af FITC og måling af plasma FITC på et senere tidspunkt8. Denne metode måler den samlede permeabilitet af hele tarmkanalen til FITC. Desuden transporteres FITC sandsynligvis via lækagevejene. Paracellulær transport menes at omfatte lækagevejen og porevejen28. Lækagevejen er en ikke-selektiv vej med lav kapacitet for større ladede eller uladede molekyler til at passere gennem de stramme kryds, mens porevejen er en selektiv vej med høj kapacitet, der gør det muligt for molekyler at passere baseret på deres størrelse og ladning28. FITC og andre makromolekylesporstoffer kan vurdere lækagevejen, men de afslører ingen oplysninger om et vævs ion- eller ladningsselektivitet. Oral gavage af FITC eller andre makromolekylære sporstoffer giver heller ikke oplysninger om, hvor i tarmen lækage forekommer. I modsætning hertil kan den metode, der præsenteres her, bruges til at vurdere den ioniske selektivitet af et specifikt segment af væv, og specifikt kan den estimere den relative permeabilitet af specifikke ioner. Et vævs tæthed kan vurderes ved at måle baseline-konduktansen, og i utætte væv såsom tyndtarmen anses >90% af konduktansen for at skyldes bidraget fra den paracellulære vej29. Således giver den transepiteliale konduktansmåling information om mængden af paracellulær ionbevægelse, men den er ikke specifik og afslører ikke, om et væv har kationisk eller anionisk selektivitet. For at forstå permselektiviteten af de tætte kryds er måling af fortyndingspotentiale nødvendig. Her blev Cldn15-/- mus anvendt, som mangler den paracellulære Na+ poredannende claudin 15. Ved at måle membranens potentielle forskel som reaktion på fortynding af NaCl kan den ioniske selektivitet samt permeabiliteten af Na+ og Cl- beregnes. Som forventet havde Cldn15-/- mus en nedsat potentiel forskel og nedsat PNa/PCl (figur 3D) sammenlignet med WT-mus. Knockout af claudin 15 resulterer i en lavere kationisk selektivitet (PNa/PCl) og nedsat relativ permeabilitet af Na+ (PNa) (figur 3E). Derudover blev den elektriske konduktans ved baseline nedsat hos Cldn15-/- mus (figur 3A), hvilket afslører, at TJ er blevet strammere, og barrierefunktionen er steget.
Mens fortyndingspotentiale er et meget nyttigt værktøj til at vurdere permselektiviteten af de stramme kryds samt definere claudinproteinernes rolle, har det begrænsninger. En væsentlig begrænsning af denne teknik er, at det er et gennemsnit af vævet. Inden for tyndtarmsepitelen er der villi og krypter, og parametrene målt med Ussing-kamre vurderer ikke bidraget fra villi og kryptepitel separat. Dette kan være en faktor ved vurderingen af visse selektivt udtrykte claudiners rolle, for eksempel betragtes claudin 2 også som en kationpore, men det udtrykkes kun i krypterne24. En anden begrænsning er, at målingerne på grund af tilstedeværelsen af flere forskellige claudinproteiner i de tætte kryds ikke specifikt kan tilskrives et bestemt protein. Selvom fortyndingspotentialer har været meget nyttige til at udforske rollerne af claudinfamilieproteiner i eksogene claudin, der udtrykker cellemodeller10,30. Endelig bruger Ussing-kammerteknikker ex-vivo-væv, og denne protokol bruger tarmpræparater uden muskellaget, hvilket betyder, at betingelserne ikke er de samme som in vivo-tilstande. Forberedelse af tarmen til Ussing-kamre kræver dygtighed og tid, så eksperimenter i indfødt væv er ofte vanskelige at gennemføre med succes, har lav gennemstrømning og tager meget tid.
Ussing-kammeret er et meget vigtigt værktøj, der kan anvendes på mange forskellige epitel- og endotelvæv. En stor fordel er, at den bruger indfødt væv, hvilket er meget mere pålideligt end cellelinjemodeller, selvom cellemonolag og organoide monolag også kan vurderes i Ussing-kamre. Ussingkamre har bidraget til mange gode fund inden for membranfysiologi, og de vil fortsat være et vigtigt redskab i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen potentielle interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde understøttes af 17K00860 (til HH) og 19K20152 (til NI). WH vil gerne anerkende Otsuka Toshimi Scholarship Foundation for deres økonomiske støtte fra 2018-2021.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #3 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm | |
| #7 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm | |
| 10 mL locking syringe | Terumo | SS-10LZ | Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling |
| 19 g needle | Terumo | NN-1938R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 23 g needle | Terumo | NN-2332R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 5 mm punch | NA | NA | Use to punch holes in filter paper and parafilm |
| acupuncture needles | Seirin | NS | Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate |
| Agar | Fujifilm Wako | 010-15815 | |
| Alligator clips | NA | NA | Connects the electrode to the amplifier |
| CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
| D(-)-Mannitol | Fujifilm Wako | 133-00845 | This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer |
| D(+)-Glucose | Fujifilm Wako | 049-31165 | |
| Dissection kit | You will need, scissors and curved forceps | ||
| Dissection plates | We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber | ||
| DMSO | Sigma | 472301-500ML | For making forskolin stock |
| Electrical recorder | TOA Electronics | PRR-5041 | Other equivalent electrical recorders are available commercially |
| Epithelial voltage clamp amplifier | Nihon Kohden | CEZ9100 | Other equivalent amplifiers are available commerically |
| filter paper, cut into squares | NA | NA | Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation |
| fine forceps | Fast Gene | FG-B50476 | For blunt dissection of the muscle layer |
| Forskolin | Alomone Labs | F-500 | Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM |
| HEPES | Sigma | H4034-1KG | |
| Indomethacin | Sigma | I7338-5G | Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM |
| K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
| KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
| KCl/calomel electrode | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
| KH2PO4 | Kanto chemical | 32379-00 | |
| L(+)-Glutamine | Fujifilm Wako | 074-00522 | |
| MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
| Mixed Gas (95% O2/5% CO2) | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution | |
| NaCl | Fujifilm Wako | 191-01665 | |
| NaCl electrode | NA | NA | Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire |
| NaHCO3 | Fujifilm Wako | 191-01305 | |
| O2 Gas | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling chambers when using HEPES buffer | |
| parafilm | Bemis | PM-996 | Used to help seal Ussing chambers |
| pH meter | DKK-TOA Corp | HM-305 | HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C |
| pH meter electrode | DKK-TOA Corp | GST-5311C | |
| silicone rubber | Shinetsu Chemical | KE-12 | Used to fill dissection plates |
| silver wire | Used for making NaCl electrodes | ||
| Small jars w/ plastic lids | NA | NA | Use for NaCl electrodes |
| stereomicroscope | Zeiss | Stemi 305 | A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T1503-1KG | Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers |
| Ussing chambers | Sanki Kagaku Kougei | These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm | |
| Water pump and heating system | Tokyo Rikakikai Co. Ltd. | NTT-110 |
References
- Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23, 110-127 (1951).
- Field, M. Ion transport in rabbit ileal mucosa. II. Effects of cyclic 3', 5'-AMP. American Journal of Physiology - Legacy Content. 221, 992-997 (1971).
- Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 423-431 (2015).
- Ishizuka, N., et al. Luminal Na + homeostasis has an important role in intestinal peptide absorption in vivo. American Journal of Physiology - Gastorintestinal and Liver Physiology. 315, 799-809 (2018).
- Ikehara, O., et al. Subepithelial trypsin induces enteric nerve-mediated anion secretion by activating proteinase-activated receptor 1 in the mouse cecum. Journal of Physiological Sciences. 62, 211-219 (2012).
- Furuse, M. Molecular basis of the core structure of tight junctions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 002907 (2010).
- Tsukita, S., Tanaka, H., Tamura, A. The claudins: From tight junctions to biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 44, 141-152 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visual Experiments: JoVE. , e57032 (2018).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9, (2020).
- Yu, A. S. L., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: Identifi cation of an electrostatic interaction site. Journal of General Physiology. 133, 111-127 (2009).
- Kimizuka, H., Koketsu, K. Ion transport through cell membrane. Journal of Theoretical Biology. 6, 290-305 (1964).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3, 123-126 (2004).
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245, 1066-1073 (1989).
- Smith, J. J., Karp, P. H., Welsh, M. J. Defective fluid transport by cystic fibrosis airway epithelia. Journal of Clinical Investigation. 93, 1307-1311 (1994).
- Molinski, S. V., et al. Orkambi and amplifier co-therapy improves function from a rare CFTR mutation in gene-edited cells and patient tissue. EMBO Molecular Medicine. 9, 1224-1243 (2017).
- Kisser, B., et al. The Ussing chamber assay to study drug metabolism and transport in the human intestine. Current Protocols in Pharmacology. 77, John Wiley & Sons, Inc. 1-19 (2017).
- Östh, K. The horizontal Ussing chamber method in studies of nasal drug delivery - Method Delopment and Applications Using Different Formulations. , Uppsala University. Dissertation thesis (2002).
- Guo, P., et al. Study of penetration mechanism of labrasol on rabbit cornea by Ussing chamber, RT-PCR assay, Western blot and immunohistochemistry. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 14, 329-339 (2019).
- Okabe, K., et al. Effect of Benzalkonium Chloride on transscleral drug delivery. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46, 703 (2005).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).
- Tamura, A., et al.
- Nakayama, M., Ishizuka, N., Hempstock, W., Ikari, A., Hayashi, H. Na+-coupled nutrient cotransport induced luminal negative potential and Claudin-15 play an important role in paracellular Na+ recycling in mouse small intestine. International Journal of Molecular Sciences. 21, 376 (2020).
- Tamura, A., et al. Loss of claudin-15, but not claudin-2, causes Na+ deficiency and glucose malabsorption in mouse small intestine. Gastroenterology. 140, 913-923 (2011).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 296, (2009).
- Dobson, J. G., Kidder, G. W. Edge damage effect in in vitro frog skin preparations. American Journal of Physiology. 214, 719-724 (1968).
- Corman, B. Streaming potentials and diffusion potentials across rabbit proximal convoluted tubule. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 403, 156-163 (1985).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Frizzell, R. A., Schultz, S. G. Ionic conductances of extracellular shunt pathway in rabbit ileum. Journal of General Physiology. 59, 318-346 (1972).
- Otani, T., et al. Claudins and JAM-A coordinately regulate tight junction formation and epithelial polarity. Journal of Cell Biology. 218, 3372-3396 (2019).
