Summary
Denne protokol er beregnet til at være et værktøj til at studere steatose og molekylær, biokemiske, cellulære ændringer produceret af overeksponering af hepatocytter til lipider in vitro.
Abstract
Metabolisk dysfunktion-associeret fedtlever sygdom (MAFLD), tidligere kendt som ikke-alkoholiske fedtlever sygdom (NAFLD), er den mest udbredte leversygdom på verdensplan på grund af sin sammenhæng med fedme, diabetes type 2, og dyslipidæmi. Lever steatose, ophobning af lipid dråber i leveren parenkym, er et centralt element i sygdommen forud for betændelse observeret i steatohepatitis, fibrose, og slutstadiet leversygdom. Lipid ophobning i hepatocytter kan forstyrre korrekt metabolisme af xenobiotika og endogene molekyler, samt at fremkalde cellulære processer, der fører til fremme af sygdommen. Selvom den eksperimentelle undersøgelse af steatose kan udføres in vivo, er in vitro-tilgange til studiet af steatose komplementære værktøjer med forskellige fordele. Hepatocyt kultur i lipid overbelastning-betinget medium er en glimrende reproducerbar mulighed for studiet af lever steatose tillader identifikation af cellulære processer relateret til lipid ophobning, såsom oxidative og retikulære belastninger, autofagi, spredning, celledød, etcetera, samt andre test, herunder lægemiddeleffektivitet, og toksikologiske test, blandt mange andre mulige anvendelser. Her var det formålet at beskrive metoden for hepatocyt cellekultur i lipid overbelastning-betinget medium. HepG2 celler blev dyrket i RMPI 1640 medium konditioneret med natrium palmitat og natrium oleat. Vigtigere, forholdet mellem disse to lipider er afgørende for at favorisere lipid dråbe ophobning, samtidig med at cellespredning og en moderat dødelighed, som opstår i leveren under sygdommen. Metoden, fra udarbejdelsen af lipidopløsningslagrene, blandingen, tilføjelsen til mediet og hepatocytkulturen vises. Med denne tilgang, er det muligt at identificere lipid dråber i hepatocytter, der er let observerbare af olie-rød O farvning, samt kurver af spredning / dødelighed.
Introduction
Fedtlever forbundet med metabolisk dysfunktion er meget udbredt på verdensplan1,2; Det anslås , at op til 25 % af befolkningen er berørtaf 3. Denne sygdom, der tidligere var kendt som ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD), har opdateret sin nomenklatur til metabolisk dysfunktion associeret fedtleversygdom (MAFLD) for nøjagtigt at afspejle patogenesen relateret til fedme, insulinresistens, diabetes type 2 og dyslipidæmi samt de mulige styringer af sygdommen3,4.
Uanset navnet omfatter sygdommen et bredt spektrum af histopatologiske ændringer karakteriseret ved unormalt høj ophobning af lipider i leveren (>5% fedt i hepatocytterne5) og kan udvikle sig gennem lipidakkumuleringen, der typisk findes i simpel steatose til steatohepatitis, hvilket igen kan føre til udvikling af fibrose, skrumpelever, hepatocellulært karcinom og leversvigt5,6,7,8. På grund af den stigende udbredelse forventes MAFLD at blive den første indikation af levertransplantation og den hyppigste årsag til hepatocellulært karcinom9.
Selv om det er blevet betragtet som en godartet eller mild form for fedtlever sygdom, lever steatose er i virkeligheden den metaboliske nøgle i MAFLD10. Forskellige metaboliske veje påvirkes af lipidakkumulering i leveren, herunder men ikke begrænset til lipidsyntese, eksport og metabolisme10. Insulinresistens, oxidativ stress, retikulær stress og cellulær dysfunktion er stærkt forbundet med lever lipotoxicitet11,12. På den anden side er fede hepatocytter målet for reaktive iltarter, hvilket gør metabolitter som lipidperoxider, proteincarbonyller og adducts af nukleinsyrer13. På celleniveau kan fede hepatocytter gennemgå mitokondrieskader14, cellulær senescence15,apoptose16, pyroptose12og autofagi17, blandt andre begivenheder.
Hepatocytter er meget ansvarlige for metabolisme, afgiftning og syntese af en bred vifte af molekyler. Mange af disse funktioner kan blive kompromitteret af lipid ophobning observeret i steatose. Derfor er det af stor betydning at have reproducerbare værktøjer, der muliggør en nøjagtig evaluering af steatose. I denne forstand er in vitro-modeller let anvendelige og meget reproducerbare. Steatosis in vitro er blevet brugt med forskellige mål16,18,19. HepG2-cellerne er meget udbredt som hepatocytcellelinje. Det har fordele som at være let at kultur og godt karakteriseret. Måske er den eneste ulempe ved HepG2-celler det faktum, at det er en kræftfremkaldende cellelinje, så dette skal overvejes, når man analyserer resultaterne. Her vises anvendelsen af en blanding af fedtsyrer, der i vid udstrækning anvendes i cellekulturen: palmitic syre (PA) og oliesyre (OA). Både PA og OA tilbyder forskellige resultater i kultur20. PA (C 16:0) er den mest almindelige mættede fedtsyrer fremstillet af kosten16. PA betragtes som en biomarkør for de-novo lipogenese, et afgørende skridt i udviklingen af NAFLD21. Pa har vist sig at være megetgiftigt 22; Derfor kan det ikke anbefales at fremkalde steatose in vitro. OA (C 18:1) er en enkeltumættet fedtsyre. I modsætning til PA, OA er blevet foreslået at besidde anti-inflammatoriske og anti-oxidant egenskaber, at være i stand til at modvirke PA12. Både PA og OA er de vigtigste fedtsyrer, der findes i triglycerider, uanset tilstanden af sundhed eller sygdom16. Tabel 1 indeholder eksempler på hepatocytkulturen med PA, OA og deres blanding samt de rapporterede resultater12,23,24,25,26,27. Andre fedtsyrer er også blevet anvendt i hepatocytkultur, herunder stearinsyre (C 18:0)28,29,30, linolsyre (C 18:1)28,30,31 og dens konjugates (CLA)28,32, palmitolesyre (C 16:1)29. Men deres anvendelse er mindst hyppigt rapporteret i litteraturen, måske fordi deres lever overflod er lavere end PA og OA16.
I forbindelse ligner begge fedtsyrer steatose in vitro, hvilket giver spredte celler med øget celledød og lavere levedygtighed sammenlignet med kontrolbetingelser. Det er værd at nævne, at de respektive salte af disse fedtsyrer er tilgængelige og kan også bruges. Et af de største problemer ved vurderingen af lipid overbelastning i hepatocyt cellekultur er givet i differentiering mellem toksikologiske modeller og en model, der bedst repræsenterer steatose. Mange modeller kan redegøres i det første tilfælde. Faktisk kan brugen af PA alene betragtes blandt dem, og den høje dødelighed er det mest tydelige resultat12,16,23,24,25,26,27. Brugen af høje doser selv i tilfælde af OA kan også betragtes som en toksikologisk model. Protokollen vist her er i højere overensstemmelse med steatose udvikling, da det viser lav dødelighed i forhold til den, der observeres i andre modeller og gør det muligt at blive fulgt i løbet af flere dage med progressiv lipid ophobning, som det sker i NAFLD. Muligheden for at vurdere mild og svær steatose gennem eksperimentelle tilstande betragtes som en anden fordel.
| Fedtsyrer | Kår | Resultater | Henvisning | ||
| PA | Koncentration: 200 μM | Lipid ophobning | Yan et al, 201925. | ||
| Tidseksponering: 24 timer | Hepatocyte skader | ||||
| Transaminaser elevation | |||||
| PA | Koncentration: 50, 100 og 200 μM | Lipid ophobning | Xing et al, 201924. | ||
| Tidseksponering: 24 timer | |||||
| PA | Koncentration: 250 μM , 500 μM , 750 μM og 1.000 μM | Lipid ophobning | Wang et al, 202026. | ||
| Tidseksponering: 24 timer | Gradvis reduktion af celle levedygtighed | ||||
| Blanding af OA/PA | Koncentration: 1 mM | Lipid ophobning | Xiao et al, 202027. | ||
| Tidseksponering: 24 timer | Rapporterer ikke lipotoxicitet | ||||
| Pris: 2OA:1PA | |||||
| Blanding af OA/PA | Først stimulering med 200 μM og 400 μM PA og derefter anden stimulering med 200 μM OA | Lipid ophobning. | Zeng et al, 202012. | ||
| Koncentration:400 μM PA: 200 μM OA | Tegn på lipotoxicitet forårsaget af PA blev reduceret ved stimulering af OA. | ||||
| Pris: 2PA:1OA | |||||
| Tidseksponering: 24 timer | |||||
| Blanding af OA/PA | Koncentration: 400 μM PA: 200 μM OA | Lipid ophobning | Chen et al, 201823. | ||
| Pris: 2PA:1OA | |||||
| Tidseksponering: 24 timer | |||||
| Blanding af OA/PA | Koncentration :50 og 500 μM | Generering af to typer steatose: mild steatose og alvorlig steatose. |
Campos og Guzmán 2021 | ||
| Pris: 2PA:1OA | Simulerer kronisk redegørelse for lipid overbelastning | ||||
| Tidseksponering: 24 timer, 2 dage, 3 dage og 4 dage. | |||||
Tabel 1. Hepatocyt kultur i steatogenic betingelser. Tabellen præsenterer den type fedtsyre, der anvendes, de betingelser, der opretholdes, og de observerede resultater i hepatocyt kultur. PA: Palmitic syre. OA: Oliesyre.
Endelig gælder denne model ikke kun for studiet af steatose og fedtlever, men også for hepatiske metaboliske, syntetiske og afgiftning veje i forbindelse med steatose. Også, in vitro induceret steatose kan give dokumentation for identifikation af potentielle markører for sygdommen samt terapeutiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Standard og konditioneret medium forberedelse
- For at forberede standard RPMI 1640 skal du supplere RPMI 1640-kulturmediet med 10 % (v/v) fosterkvægserum (FBS, tidligere varmeinaktiveret) og 1 % (v/v) penicillin-Streptomycin-opløsning. Mediet opbevares ved 4 °C.Steriliser ved hjælp af 0,22 μm filtre.
- For at forberede palmitat lageropløsning, forberede en 50 mM opløsning af palmitat i standard RPMI 1640 tidligere suppleret med 1% af kvæg serum albumin (lipid fri). Et volumen på 5-10 mL af denne bestand vil være tilstrækkelig. Sterilisere lageropløsningen ved hjælp af 0,22 μm filtre. Opbevares ved 4 °C beskyttet mod lys i op til 1 måned.
- For at forberede oleate stock løsning, forberede en 50 mM opløsning af oleat i standard RPMI 1640 tidligere suppleret med 1% af kvæg serum albumin (lipid fri). Et volumen på 10 mL vil være tilstrækkeligt. Sterilisere lageropløsningen ved hjælp af 0,22 μm filtre. Opbevares ved -20 °C beskyttet mod lys i op til 1 måned.
- For at forberede steatogenic medium fra de tidligere forberedte bestande skal du forberede en 1-del palmitat: 2-del oleat steatogent medium på to mulige niveauer: mild og alvorlig steatose.
- Mild steatose: Tilbered 100 mL af en 1-del palmitat: 2-del oleat (50 μM) mix i standard RPMI 1640. Steriliseres ved hjælp af 0,22 μm filtre. Opbevares ved 4 °C i op til 1 uge.
- Alvorlig steatose: Forbered 100 mL af en 1-del palmitat: 2-del oleat (500 μM) mix i standard RPMI 1640. Steriliseres ved hjælp af 0,22 μm filtre. Opbevares ved 4 °C i op til 1 uge.
- Alternativ forberedelse til lagerløsningerne.
- Forbered begge lagerløsninger ved hjælp af de respektive fedtsyrer ved hjælp af gratis lipid albumin som angivet ovenfor.
- Når du mangler gratis lipid albumin, skal du bruge palmitat og oleate salte.
- Rengør enten palmitat eller oleat i 2 mL absolut ethanol, og bland derefter det sidste volumen af standard RPMI 1640 (5-10 mL). Opløs oleat direkte ved omrøring i standard RPMI 1640 kulturmedium.
- Tillade fordampning af ethanol ved inkubation i et vandbad ved 70 °C blandes grundigt.
- Steriliser i alle tilfælde begge lageropløsninger ved hjælp af 0,22 μm filtre. Opbevar palmitatlageropløsning ved 4 °C og oleatlageropløsning ved - 20 °C. Beskyt begge løsninger mod lys. Disse løsninger er stabile i 1 måned.
2. Prækultur
- Frø 100.000 HepG2 celler pr brønd i en 24-brønd plade. Tilføj 1 mL standard RPMI 1640.
- Præinkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 24 timer, hvilket giver mulighed for celletilbehør.
3. Steatogene kultur
- Efter forkulturen skal du kassere standard RPMI 1640 medium og tilsæt det steatogene medium i overensstemmelse hermed.
- Kassér supernatanten og tilsæt frisk steatogen medium hver 24 timer.
4. Vurdering af levedygtighed og dødelighed
- Frø 100.000 HepG2 celler pr brønd i en 24-brønd plade. Tilføj 1 mL standard RPMI 1640.
- Præinkubation i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
- Skift standard RPMI 1640 medium for det steatogene medium.
- Inkuber i 24 timer, 2 dage, 3 dage og 4 dage forfriskende det steatogene medium hver 24 timer.
- Efter det rette tidspunkt skal du kassere supernatanten.
- Løsriv celler fra brønden ved at tilsætte 500 μL på 0,05% Trypsin-EDTA. Inkuberes i 5 min ved 37 °C og 5% CO2.
- Saml de opslbd opslbdte celler i en mikrotube.
- Centrifuge ved 300 x g og kassér supernatanten.
- Der tilsættes 200 μL standard RPMI 1640, og cellerne genbruges.
- Der tilsættes 15 μL 0,4% Trypan blå opløsning i en frisk mikrotube. Bland med 15 μL af den tidligere celleaffjedring.
- Tæl de farvede og ikke-farvede celler i et hæmocytometer.
- Beregn levedygtigheden og dødeligheden i overensstemmelse hermed.
Levedygtighed =
Dødelighed =
5. Lipid farvning med olierød o
- Sæt en cellekultur coverslip i hver brønd i en 24-brønd plade.
- Frø 100.000 HepG2 celler pr brønd. Tilføj 1 mL standard RPMI 1640.
- Præinkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 24 timer.
- Skift standard RPMI 1640 medium for det steatogene medium.
- Inkuber i 24 timer, 2 dage, 3 dage og 4 dage, forfriskende det steatogene medium hver 24 timer.
- Efter det rette tidspunkt skal du kassere supernatanten.
- Vask med 1 mL fosfatbufferet saltvand (PBS). Kassér supernatanten.
- Fastgør med 1 mL 4% paraformaldehyd i PBS.
- Inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
- Kassér overskuddet af paraformaldehyd.
- Skyl cellerne med 1 mL destilleret vand.
- Tilsæt 1 mL på 70% isopropanol og inkuber i 5 min.
- Kassér overskuddet af isopropanol. En PBS vask er ikke nødvendig på dette tidspunkt.
- Tilsæt 1 mL olierød O-opløsning og inkuber i 30 min.
- Kassér overskuddet af den olierøde O-opløsning.
- Skyl med 1 mL destilleret vand.
- Der tilsættes 500 μL hæmatoxylinopløsning. Inkuber i 3 min.
- Kassér overskydende hæmatoxylinopløsning.
- Skyl med 1 mL destilleret vand.
- Overhold under mikroskopet ved en forstørrelse på 400x (Mål 40x, Okulær 10x).
6. Morfometrisk vurdering af lipidindhold
- Tilfældigt vælge og fange fotografier af 10 optiske felter fra det komplette område af brønden. Gentag for hver brønd.
- Vurder procentdelen af rødt farvet område ved hjælp af color threshold-værktøjet i ImageJ-softwaren i henhold til Ferreira og Rasband33.
- Sammenlign det farvede område med hele området af det optiske felt ved hjælp af værktøjet Analyser partikler i ImageJ-softwaren i henhold til Ferreira og Rasband33.
- Beregn den gennemsnitlige procentdel af hver brønd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatocytter, der dyrkes i det steatogene medium, viser vækst over hele brøndens overflade; imidlertid viser fede hepatocytter lavere vækstrate sammenlignet med celler, der dyrkes i kontrolmediet. Det foreslåede forhold og koncentrationen af OA og PA garanterer celleoverlevelse under kultur. Såning 1 x 105 celler pr. brønd i 24-brønds plader giver optimal sammenløb som vist i figur 1.
Levedygtigheden i kultiverede celler var lavere i de steatogene grupper, Mild og Svær, sammenlignet med kontrolforholdene. Faktisk faldt levedygtigheden gradvist, efterhånden som kulturens tid steg og nåede den laveste på 60% ved 4 dage i alvorlig steatose (figur 2A). Dødeligheden var derfor højere hos hepatocytter, der blev kultiveret under steatogene forhold, og den steg gradvist med tidspunktet for eksponering for lipider (figur 2B). Antallet af celler steg gradvist som følge af spredning (figur 2C). Imidlertid var spredningsraten lavere i mild steatose ved 3 dage og 4 dage. I modsætning hertil var svær steatose forbundet med lavere spredning fra 24 timer.
HepG2 celler dyrkes i den foreslåede protokol viser det vigtigste træk ved steatose, intracellulær lipid ophobning. Farvningsceller med olierød O har lov til at observere mindst en dobbelt stigning i lipiddråber i celler, der dyrkes under steatogene forhold som vist i figur 3 og figur 4. Intracellulært fedt steg i henhold til tidspunktet for eksponering af kultur i det steatogene medium (Figur 3). I Mild steatose blev lipidindholdet øget fra dag 2, mens de i svær steatose var signifikant høje fra 24 timer.
Figur 1: Cellevækst. HepG2 hepatocytter kultur i kontrol (Figur 1A-D) og milde steatogenic betingelser (Figur 1E-H). Fotografier viser vækst fra 1-4 dages kultur. Skalalinje = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Levedygtighed og dødelighed. (A) Levedygtighed. (B) Dødelighed. (C) Cellenummer. HepG2 hepatocytter kultur i kontrol og steatogenic betingelser blev vurderet for levedygtighed og dødelighed ved trypan blå farvning. Mean ± SD. To uafhængige eksperimenter i tredobling pr. kulturtid. Cirkler: kontrolbetingelser; Kvadrater: mild steatose; Trekanter: alvorlig steatose. Envejs ANOVA blev brugt til at sammenligne mellem betingelser og kulturtid for samme tilstand. p < 0,05 blev anset for signifikant: "*"- kontrol vs svær steatose; "§" - kontrol vs mild steatose; "*- mild vs svær steatose. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Lipid ophobning. HepG2 hepatocytter kultur i kontrol og steatogenic betingelser blev vurderet for lipid indhold af olierød O farvning efterfulgt af en morfometrisk analyse ved hjælp af ImageJ software (NIH, USA). Procentdel af lipider refererer til den procentdel af området farves af Olie-Røde O (lipider) overvejer 100% som det komplette areal af hvert optisk felt analyseret. Mean ± SD. To uafhængige eksperimenter i tredobling pr. kulturtid. Cirkler: kontrolbetingelser; Kvadrater: mild steatose; Trekanter: alvorlig steatose. Envejs ANOVA blev brugt til at sammenligne mellem betingelser og kulturtid for samme tilstand. p < 0,05 blev anset for signifikant: "*"- kontrol vs svær steatose; "§" - kontrol vs mild steatose; "*- mild vs svær steatose. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Steatosis in vitro. HepG2 hepatocytter kultur i kontrol (Figur 4A-D), mild steatogenic (Figur 4E-H),og alvorlige steatogenic (Figur 4I-L) betingelser blev vurderet for lipid indhold ved olierød O farvning. Fotografier viser hepatocyte lipid dråber fra 24 timer til 4 dage. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol har til formål at give en strategi til undersøgelse af steatose in vitro. Cellekultur er et kraftfuldt værktøj til at studere cellulære, molekylære, biokemiske og toksikologiske aspekter af de celler, der udsættes for forskellige forhold. Med denne tilgang kan steatose visualiseres ikke kun som et stadium af den komplekse sygdom, der er MAFLD, men også som hepatocyt overeksponering for lipider og de mulige resultater som følge af en sådan eksponering. Derfor er dens anvendelse ikke begrænset til Fysiopatologi af MAFLD, men til det faktum, at patienter med fedtlever udsættes for terapeutiske lægemidler, forurenende stoffer, blandt andre betingelser, der kan blive påvirket af steatose. Således har denne protokol potentielle anvendelser inden for toksikologi, farmakologi og identifikation af terapeutiske mål for behandling af sygdommen.
Ved udviklingen af denne protokol er et af de mest kritiske trin forberedelsen af den steatogene blanding: 1 del af palmitat: 2 dele af oleat, som fremkalder steatose fra dag 2 (Figur 3, Figur 4), hvilket gør det muligt for hepatocytter at formere sig på trods af et beskedent fald i levedygtigheden og øget dødelighed (Figur 2). Nedsat levedygtighed bør dog ikke overstige 30-40 %, da det kan udgøre en toksisk virkning snarere end en, der kan følges på lang sigt. Lever steatose er resultatet af en langsigtet overeksponering for lipider. I denne forstand akkumuleres lipider i første omgang med milde følelser på hepatocytterne, som observeret i denne model. En anden funktion er lipid dråbeprofilen. I mild steatose observeres en øget størrelse i lipiddråber under udviklingen af kulturen (Figur 4E-H). I alvorlig steatose er dråbestørrelsen betydeligt højere sammenlignet med mild steatose (Figur 4I-L), mens kontrollerne ikke viser ændringer i lipiddråbestørrelsen (Figur 4A-D).
Det er at foretrække at opbevare både de milde og alvorlige steatogene medier ved 4 °C i op til en uge. Derefter anbefales det at forberede frisk steatogen medium. OA-bestanden kan dog opbevares ved -20 °C i op til en måned, mens PA-bestanden kan opbevares ved 4 °C i op til en måned. Brug af disse lagerløsninger efter den foreslåede tid kan udgøre en risiko for nedbrydning af fedtsyrerne. For at sikre en korrekt koncentration af opløsningerne før hver brug anbefales det at måle fedtsyrernes koncentrationer med et ikke-esterificeret fedtsyrer (NEFA) analysesæt.
PA og OA, samt deres respektive salte, er blevet brugt separat til at fremkalde lipid ophobning; der observeres dog forskelle for hver fedtsyre16,20. På den ene side er palmitat, der bruges alene, en god induktor af steatose. Det fremkalder celledød, leverinsulinresistens, mitokondrie dysfunktion, reticular stress16,34,35,36. Palmitat er imidlertid meget giftigt16,34, og de resultater , der forventes at bruge det alene i kulturen , omfatter lavere levedygtighed og højere dødelighed sammenlignet med blandingen af PA og OA16,20. På den anden side fremkalder oleat også steatose. Det fremkalder de novo lipogenese, insulinresistens37,38og hyperproliferation38. De resultater , der observeres med oleat , er dog ofte mildere sammenlignet med palmitat og blandingen16,20. Dette kan være relateret til dets beskyttende rolle. Oleate er den vigtigste komponent i olivenolie, en vigtig ingrediens i Middelhavskosten, en af de velkendte vellykkede strategier mod MAFLD39.
Denne protokol kan betragtes som et godt redskab til at studere steatose på grund af dens reproducerbarhed og den korte tid, det tager at opnå resultater. Dette er i sammenligning med at bruge eksperimentelle modeller af MAFLD, tilføjer det faktum, at det ikke indebærer de etiske spørgsmål iboende ved at bruge gnaver modeller. Denne protokol gør det muligt at blive fulgt i flere dage, forudsat at steatogen medium opdateres hver 24 timer. Denne model er også omkostningseffektiv og har en bred vifte af applikationer. Det kan også justeres til andre cellelinjer, ikke kun hepatocytter, men en bred vifte af celler påvirket af lipid overeksponering under fedme. En af begrænsningerne i denne protokol er brugen af HepG2-celler. Da dette er en kræftfremkaldende celle linje, det kan skjule eller øge nogle resultater. Men anvendelsen af HepG2 celler i disse typer af undersøgelser er almindeligt accepteret på grund af dens lighed i lipid metabolisme til sunde hepatocytter40. Brugen af blandingen PA:2OA kan også vise sig at være kontroversiel, da det ikke fuldt ud ligner profilerne af NEFA observeret i blodet af NAFLD / MAFLD patienter41. Andre fedtsyrer, herunder linolensyrer eller stearinsyrer, kan indgå i yderligere ændringer og forbedringer af denne protokol. En anden begrænsning er det faktum, at kun én celletype, hepatocytter, studeres, mangler interaktion med andre leverceller til stede i leveren, herunder sinusoide endotel, Kupffer, lever stellate celler, osv., der er involveret i progressionen af MAFLD. Desuden er dette en model til at fremkalde steatose udelukkende, uden progression til steatohepatitis og fibrose.
Afslutningsvis giver undersøgelsen en in vitro-protokol af hepatocyt steatose, der er let at implementere, reproducerbar og med en bred vifte af applikationer i studiet af steatose samt hepatocytfunktionen i forbindelse med fedtlever.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). Adriana Campos er ph.d.-studerende ved Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, og blev støttet af Conacyt (CVU: 1002502).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety cabinet | ESCO Airstream | AC2-452+C2:C26 | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Bottle top filter | Corning, US | 430513 | Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL. |
| Bovine serum albimun (BSA) | Gold Biotechnology, US | A-421-10 | BSA Fatty Acid Free for cell culture |
| Culture media RPMI 1640 | ThermoFisher-Gibco, US | 31800-022 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher-Gibco, US | A4766801 | - |
| Hemocytometer | Marienfeld, DE | 640010 | - |
| HepG2 cell line | ATCC, US | HB-8065 | Hepatocellular carcinoma human cells. |
| Humidified incubator | Thermo Electronic Corporation,US | Model: 3110 | Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%) |
| Inverted microscope Eclipse | NIKON, JPN | Model: TE2000-S | - |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, US | I9030-4L | - |
| Oil Red O Kit | Abcam, US | ab150678 | Kit for histological visualization of neutral fat. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, US | P6148-500G | - |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher-Gibco, US | 15140-122 | Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin |
| pH meter | Beckman, US | Model: 360 PH/Temp/MV Meter | - |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher-Gibco, US | 10010-023 | - |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1253.001 | Non-pyrogenic, sterile, 5 mL |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1254.001 | Non-pyrogenic, sterile, 10 mL |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, US | S5761-1KG | Preparation of culture media |
| Sodium oleate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215879A | - |
| Sodium palmitate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215881 | - |
| Syring filter | Corning, US | 431219 | Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm. |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich, US | T6146-25G | - |
| Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM | Corning, US | 25-052-Cl | - |
| 24 well cell culture cluster | Corning, US | 3524 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
| 96 well cell culture cluster | Corning, US | 3599 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
References
- Younossi, Z. M. Non-alcoholic fatty liver disease - a global public health perspective. Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).
- Younossi, Z., et al. Global perspectives on nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 69 (6), 2672-2682 (2019).
- Eslam, M., et al. A new definition for metabolic dysfunction-associated fatty liver disease: An international expert consensus statement. Journal of Hepatology. 73 (1), 202-209 (2020).
- Eslam, M., Sanyal, A. J., George, J. MAFLD: A consensus-driven proposed nomenclature for metabolic associated fatty liver disease. Gastroenterology. 158 (7), 1999-2014 (2020).
- Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American association for the study of liver diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
- Calzadilla Bertot, L., Adams, L. A. The natural course of non-alcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Science. 17 (5), 774 (2016).
- Reccia, I., et al. Non-alcoholic fatty liver disease: A sign of systemic disease. Metabolism. 72, 94-108 (2017).
- Tomita, K., et al. Free cholesterol accumulation in hepatic stellate cells: Mechanism of liver fibrosis aggravation in nonalcoholic steatohepatitis in mice. Hepatology. 59 (1), 154-169 (2014).
- Byrne, C. D., Targher, G.
- Ipsen, D. H., Lykkesfeldt, J., Tveden-Nyborg, P. Molecular mechanisms of hepatic lipid accumulation in non-alcoholic fatty liver disease. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (18), 3313-3327 (2018).
- Diehl, A. M., Day, C. Cause, pathogenesis, and treatment of nonalcoholic steatohepatitis. New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).
- Zeng, X., et al. Oleic acid ameliorates palmitic acid induced hepatocellular lipotoxicity by inhibition of ER stress and pyroptosis. Nutrition and Metabolism. 17, London. 11 (2020).
- Ore, A., Akinloye, O. A. Oxidative stress and antioxidant biomarkers in clinical and experimental models of non-alcoholic fatty liver disease. Medicina (Kaunas). 55 (2), 26 (2019).
- Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. Oxidative stress, cardiolipin and mitochondrial dysfunction in nonalcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 20 (39), 14205-14218 (2014).
- Aravinthan, A., et al. Hepatocyte senescence predicts progression in non-alcohol-related fatty liver disease. Journal of Hepatology. 58 (3), 549-556 (2013).
- Gomez, M. J., et al. A human hepatocellular in vitro model to investigate steatosis. Chemico Biological Interactions. 165 (2), 106-116 (2007).
- Wu, W. K. K., Zhang, L., Chan, M. T. V. Autophagy, NAFLD and NAFLD-related HCC. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1061, 127-138 (2018).
- Levy, G., Cohen, M., Nahmias, Y. In vitro cell culture models of hepatic steatosis. Methods in Molecular Biology. 1250, 377-390 (2015).
- Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Science. 14 (6), 11963-11980 (2013).
- Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
- Lee, Y., et al. Serial biomarkers of de novo lipogenesis fatty acids and incident heart failure in older adults: The cardiovascular health study. Journal of the American Heart Association. 9 (4), 014119 (2020).
- Alnahdi, A., John, A., Raza, H. Augmentation of glucotoxicity, oxidative stress, apoptosis and mitochondrial dysfunction in Hepg2 cells by palmitic acid. Nutrients. 11 (9), 1979 (2019).
- Chen, X., et al. Oleic acid protects saturated fatty acid mediated lipotoxicity in hepatocytes and rat of non-alcoholic steatohepatitis. Life Sciences. 203, 291-304 (2018).
- Xing, J. H., et al. NLRP3 inflammasome mediate palmitate-induced endothelial dysfunction. Life Sciences. 239, 116882 (2019).
- Yan, H., et al. Insulin-like Growth Factor Binding Protein 7 accelerates hepatic steatosis and insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 46 (12), 1101-1110 (2019).
- Wang, J., Hu, R., Yin, C., Xiao, Y. Tanshinone IIA reduces palmitate-induced apoptosis via inhibition of endoplasmic reticulum stress in Hepg2 liver cells. Fundamental and Clinical Pharmacology. 34 (2), 249-262 (2020).
- Xiao, Z., Chu, Y., Qin, W. IGFBP5 modulates lipid metabolism and insulin sensitivity through activating ampk pathway in non-alcoholic fatty liver disease. Life Sciences. 256, 117997 (2020).
- Avila, G., et al. In vitro effects of conjugated linoleic acid (CLA) on inflammatory functions of bovine monocytes. Journal of Dairy Science. 103 (9), 8554-8563 (2020).
- Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 12093-12101 (2006).
- Oh, J. M., et al. Effects of palmitic acid on TNF-alpha-induced cytotoxicity in SK-Hep-1 cells. Toxicology In Vitro: An International Journal Published in Association with BIBRA. 26 (6), 783-790 (2012).
- Stellavato, A., et al. In vitro assessment of nutraceutical compounds and novel nutraceutical formulations in a liver-steatosis-based model. Lipids in Health and Disease. 17 (1), 24 (2018).
- Pachikian, B. D., et al. Implication of trans-11, trans-13 conjugated linoleic acid in the development of hepatic steatosis. PLoS One. 13 (2), 0192447 (2018).
- Ferreira, T., Rasband, W. Analyze. ImageJ User Guide. , Ch. 30 132-135 (2012).
- Geng, Y., Wu, Z., Buist-Homan, M., Blokzijl, H., Moshage, H. Hesperetin protects against palmitate-induced cellular toxicity via induction of GRP78 in hepatocytes. Toxicology and Applied Pharmacology. , 404 (2020).
- Geng, Y., et al. Protective effect of metformin against palmitate-induced hepatic cell death. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1866 (3), 165621 (2020).
- Sarnyai, F., et al. Effect of cis- and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Science. 21 (7), 2626 (2020).
- Chen, J. W., et al. Tetrahydrocurcumin ameliorates free fatty acid-induced hepatic steatosis and improves insulin resistance in HepG2 cells. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (3), 1075-1085 (2018).
- Burhans, M. S., et al. Hepatic oleate regulates adipose tissue lipogenesis and fatty acid oxidation. Journal of Lipid Research. 56 (2), 304-318 (2015).
- Abenavoli, L., Milanovic, M., Milic, N., Luzza, F., Giuffre, A. M. Olive oil antioxidants and non-alcoholic fatty liver disease. Expert Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 13 (8), 739-749 (2019).
- Nagarajan, S. R., et al. Lipid and glucose metabolism in hepatocyte cell lines and primary mouse hepatocytes: A comprehensive resource for in vitro studies of hepatic metabolism. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 316 (4), 578-589 (2019).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
