Summary
Detta protokoll är avsett att vara ett verktyg för att studera steatos och de molekylära, biokemiska, cellulära förändringar som produceras av överexponering av hepatocyter för lipider in vitro.
Abstract
Metabolisk dysfunktion-associerade fettleversjukdom (MAFLD), tidigare känd som alkoholfri fettleversjukdom (NAFLD), är den vanligaste leversjukdomen i världen på grund av dess förhållande till fetma, diabetes typ 2 och dyslipidemi. Leversteatos, ackumulering av lipiddroppar i leverparenkym, är ett viktigt inslag i sjukdomen före inflammationen som observerats vid steatohepatit, fibros och leversjukdom i slutstadiet. Lipid ackumulering i hepatocyter kan störa korrekt metabolism av xenobiotika och endogena molekyler, samt att inducera cellulära processer som leder till sjukdomsförloppet. Även om den experimentella studien av steatos kan utföras in vivo, är in vitro-metoder för studier av steatos kompletterande verktyg med olika fördelar. Hepatocyt kultur i lipid överbelastning-konditionerade medium är ett utmärkt reproducerbart alternativ för studier av lever steatosis tillåter identifiering av cellulära processer relaterade till lipid ackumulering, såsom oxidativa och reticular påfrestningar, autofagi, spridning, celldöd, etcetera, liksom andra tester inklusive läkemedelseffektivitet, och toxikologiska tester, bland många andra möjliga tillämpningar. Här syftade det till att beskriva metoden för hepatocyt cell kultur i lipid överbelastning-konditionerade medium. HepG2 celler odlades i RMPI 1640 medium konditionerade med natriumpalmitat och natriumoleat. Viktigt är förhållandet mellan dessa två lipider avgörande för att gynna lipiddroppe ackumulering, samtidigt upprätthålla cellproliferation och en måttlig dödlighet, som förekommer i levern under sjukdomen. Metoden, från beredningen av lipidlösningsbestånden, blandningen, tillsatsen till mediet och hepatocytkulturen visas. Med detta tillvägagångssätt är det möjligt att identifiera lipiddroppar i hepatocyterna som lätt kan observeras av oljeröd O-färgning, liksom kurvor av spridning / dödlighet.
Introduction
Fettlever i samband med metabolisk dysfunktion är mycket utbredd överhela världen 1,2; det uppskattas att upp till 25% av befolkningen påverkas3. Denna sjukdom som tidigare var känd som alkoholfri fettleversjukdom (NAFLD), har uppdaterat sin nomenklatur till metabolisk dysfunktion associerad fettleversjukdom (MAFLD) för att noggrant återspegla patogenesen i samband med fetma, insulinresistens, diabetes typ 2 och dyslipidemi, liksom de möjliga hanteringarna av sjukdomen3,4.
Oavsett namn innehåller sjukdomen ett brett spektrum av histopatologiska förändringar som kännetecknas av onormalt hög ackumulering av lipider i levern (>5% fett i hepatocyterna5) och kan utvecklas genom lipidackumuleringen som vanligtvis finns i enkel steatohepatit, vilket i sin tur kan leda till utveckling av fibros, cirros, hepatocellulärt carcinom och leversvikt5,6,7,8. På grund av dess ökande prevalens förväntas MAFLD bli den första indikationen på levertransplantation och den främsta orsaken till hepatocellulär carcinom9.
Även om det har betraktats som en godartad eller mild form av fettlever sjukdom, lever steatosis är i själva verket den metaboliska nyckeln i MAFLD10. Olika metaboliska vägar påverkas av lipid ackumulering i levern, inklusive men inte begränsat till lipidsyntes, export och metabolism10. Insulinresistens, oxidativ stress, retikulär stress och cellulär dysfunktion är starkt förknippade med lever lipotoxicity11,12. Å andra sidan är feta hepatocyter målet för reaktiva syrearter, vilket gör metaboliter som lipidperoxider, proteinkarbonyler och addukter av nukleinsyror13. På cellnivå kan feta hepatocyter genomgå mitokondriell skada14, cellulär senescens15, apoptos16, pyroptos12, och autofagi17, bland andra händelser.
Hepatocyter är mycket ansvariga för metabolism, avgiftning och syntes av ett brett spektrum av molekyler. Många av dessa funktioner kan äventyras av lipid ackumulering observeras i steatosis. Därför är det av stor betydelse att ha reproducerbara verktyg som möjliggör en korrekt utvärdering av steatos. I den meningen är in vitro-modeller lätt tillämpliga och mycket reproducerbara. Steatos in vitro har använts med olika mål16,18,19. HepG2-cellerna används ofta som hepatocytcelllinje. Det har fördelar som att vara lätt att odla och väl karakteriserad. Kanske är den enda nackdelen med HepG2-celler det faktum att det är en cancerframkallande cellinje, så detta måste beaktas när man analyserar resultaten. Här visas applicering av en blandning av fettsyror som ofta används i cellkulturen: palmitinsyra (PA) och oljesyra (OA). Både PA och OA erbjuder olika resultat i kultur20. PA (C 16:0) är den vanligaste mättade fettsyran som erhålls från kosten16. PA anses vara en biomarkör av de-novo lipogenes ,ett avgörande steg i utvecklingen av NAFLD21. PA har visat sig vara mycketgiftigt 22. Därför kanske det inte rekommenderas att inducera steatos in vitro. OA (C 18:1) är en enkelomättad fettsyra. I motsats till PA har OA föreslagits att ha antiinflammatoriska och antioxidantegenskaper, kunna motverka PA12. Både PA och OA är de viktigaste fettsyrorna som finns i triglycerider, oavsett hälsotillstånd eller sjukdom16. Tabell 1 ger exempel på hepatocytkulturen med PA, OA och deras blandning, liksom de rapporteraderesultaten 12,23,24,25,26,27. Andra fettsyror har också använts i hepatocytkultur, inklusive stearinsyra (C 18:0)28,29,30, linolsyra (C 18:1)28,30,31 och dess konjugat (CLA)28,32, palmitoleinsyra (C 16:1)29. Deras användning rapporteras dock minst ofta i litteraturen, kanske för att deras leveröverskott är lägre än PA och OA16.
Tillsammans liknar båda fettsyrorna steatos in vitro, vilket ger prolifererande celler, med ökad celldöd och lägre livskraft jämfört med kontrollförhållanden. Det är värt att nämna att respektive salter av dessa fettsyror finns tillgängliga och kan användas också. Ett av de största problemen vid bedömning av lipidöverbelastning i hepatocytcellkulturen ges i differentiering mellan toxikologiska modeller och en modell som bäst representerar steatos. Många modeller kan redovisas i det första fallet. Faktum är att användningen av PA ensam kan övervägas bland dem, och den höga dödligheten är det mest uppenbararesultatet 12,16,23,24,25,26,27. Användningen av höga doser även när det gäller OA kan också betraktas som en toxikologisk modell. Protokollet som visas här är i högre överensstämmelse med steatosutveckling eftersom det visar låg dödlighet jämfört med det som observerats i andra modeller och gör det möjligt att följa det under flera dagar med progressiv lipidackumulering som det förekommer i NAFLD. Möjligheten att bedöma mild och svår steatos genom experimentella tillstånd anses vara en annan fördel.
| Fettsyror | Villkor | Resultat | Hänvisning | ||
| PA | Koncentration: 200 μM | Lipidackumulering | Yan et al, 201925. | ||
| Tidsexponering: 24 timmar | Skador på hepatocyter | ||||
| Transaminas höjd | |||||
| PA | Koncentration: 50, 100 och 200 μM | Lipidackumulering | Xing et al, 201924. | ||
| Tidsexponering: 24 timmar | |||||
| PA | Koncentration: 250 μM, 500 μM, 750 μM och 1 000 μM | Lipidackumulering | Wang et al, 202026. | ||
| Tidsexponering: 24 timmar | Progressiv minskning av cellens livskraft | ||||
| Blandning av OA/PA | Koncentration: 1 mM | Lipidackumulering | Xiao et al, 202027. | ||
| Tidsexponering: 24 timmar | Rapporterar inte lipotoxicity | ||||
| Pris: 2OA:1PA | |||||
| Blandning av OA/PA | Första stimuleringen med 200 μM och 400 μM PA och sedan andra stimuleringen med 200 μM OA | Lipid ackumulering. | Zeng et al, 202012. | ||
| Koncentration:400 μM PA: 200 μM OA | Bevis på lipotoxicity framkallas av PA minskades genom stimulering av OA. | ||||
| Pris: 2PA:1OA | |||||
| Tidsexponering: 24 timmar | |||||
| Blandning av OA/PA | Koncentration: 400 μM PA: 200 μM OA | Lipidackumulering | Chen et al, 201823. | ||
| Pris: 2PA:1OA | |||||
| Tidsexponering: 24 timmar | |||||
| Blandning av OA/PA | Koncentration :50 och 500 μM | Generering av två typer av steatos: mild steatos och svår steatos. |
Campos och Guzmán 2021 | ||
| Pris: 2PA:1OA | Simulerar kronisk utställning av lipidöverbelastning | ||||
| Tidsexponering: 24 timmar, 2 dagar, 3 dagar och 4 dagar. | |||||
Tabell 1. Hepatocyt kultur i steatogenic villkor. Tabellen presenterar vilken typ av fettsyra som används, de villkor som upprätthålls och de observerade resultaten i hepatocytkulturen. Palmitsyra. OA: Oljesyra.
Slutligen är denna modell tillämplig inte bara på studier av steatos och fettlever, men också på levermetaboliska, syntetiska och avgiftningsvägar i samband med steatos. In vitro-inducerad steatos kan också ge bevis för identifiering av potentiella markörer för sjukdomen samt terapeutiska mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Standard och konditionerad medium förberedelse
- För att förbereda standard RPMI 1640, komplettera RPMI 1640 odlingsmedium med 10% (v/v) fetala nötkreatur serum (FBS, tidigare värme inaktiverad) och 1% (v/v) av Penicillin-Streptomycin lösning. Förvara mediet vid 4 °C.Sterilisera med hjälp av 0,22 μm filter.
- För att förbereda palmitatbuljonglösning, bered en 50 mM lösning av palmitat i standard RPMI 1640 tidigare kompletterad med 1% av bovint serumalbumin (lipidfritt). En volym på 5-10 ml av detta lager kommer att räcka. Sterilisera stamlösningen med hjälp av 0,22 μm filter. Förvara vid 4 °C skyddad mot ljus i upp till 1 månad.
- För att förbereda oleate stock lösning, förbereda en 50 mM lösning av oleat i standard RPMI 1640 tidigare kompletterad med 1% av nötkreatur serum albumin (lipidfri). En volym på 10 ml kommer att räcka. Sterilisera stamlösningen med hjälp av 0,22 μm filter. Förvara vid -20 °C skyddad mot ljus i upp till 1 månad.
- För att förbereda steatogent medium från de tidigare beredda lagren, förbered ett 1-del palmitat: 2-del oleate steatogenic medium på två möjliga nivåer: mild och svår steatoosis.
- Mild Steatos: Förbered 100 ml av ett 1-delpalmitat: 2-del oleate (50 μM) blanda i standard RPMI 1640. Sterilisera med hjälp av 0,22 μm filter. Förvara vid 4 °C i upp till 1 vecka.
- Svår Steatos: Förbered 100 ml av ett 1-delpalmitat: 2-del oleate (500 μM) blandning i standard RPMI 1640. Sterilisera med hjälp av 0,22 μm filter. Förvara vid 4 °C i upp till 1 vecka.
- Alternativ förberedelse för lagerlösningarna.
- Förbered båda lagerlösningarna med respektive fettsyror med hjälp av fri lipidalbumin enligt ovan.
- När du saknar fri lipidalbumin, använd palmitat och oleatesalter.
- Lös upp antingen palmitat eller oleat i 2 ml absolut etanol och blanda sedan i den slutliga volymen av standard RPMI 1640 (5-10 ml). Lös upp oleatet direkt genom omrörning i standard RPMI 1640 odlingsmedium.
- Tillåt avdunstning av etanol genom att inkubera i ett vattenbad vid 70 °C. blanda noggrant.
- Sterilisera i varje fall båda stamlösningarna med 0,22 μm filter. Förvara palmitate stocklösning vid 4 °C och oleate stamlösning vid - 20 °C. Skydda båda lösningarna från ljus. Dessa lösningar är stabila i 1 månad.
2. Förkultur
- Frö 100 000 HepG2-celler per brunn i en 24-brunnsplatta. Tillsätt 1 ml standard RPMI 1640.
- Förinkubera vid 37 °C och 5 % CO2 i 24 timmar, vilket möjliggör celltillsats.
3. Steatogenic kultur
- Efter förkultur kasserar du standard RPMI 1640 medium och tillsätt det steatogena mediet i enlighet därmed.
- Kassera supernaten och tillsätt färskt steatogent medium var 24: e timme.
4. Bedömning av livskraft och dödlighet
- Frö 100 000 HepG2-celler per brunn i en 24-brunnsplatta. Tillsätt 1 ml standard RPMI 1640.
- Förinkubera i 24 timmar vid 37 °C och 5 % CO2.
- Byt standard RPMI 1640 medium för det steatogena mediet.
- Inkubera i 24 timmar, 2 dagar, 3 dagar och 4 dagar uppfriskande det steatogena mediet var 24: e timme.
- Efter lämplig tid, kassera supernaten.
- Lossa celler från brunnen genom att tillsätta 500 μL 0,05% Trypsin-EDTA. Inkubera i 5 min vid 37 °C och 5 % CO2.
- Samla de återanvända cellerna i ett mikrorör.
- Centrifug vid 300 x g och kassera supernaten.
- Tillsätt 200 μL standard RPMI 1640 och återanvänd cellerna.
- Tillsätt 15 μL 0,4% trypanblå lösning i ett färskt mikrorör. Blanda med 15 μL av den tidigare cellupphängningen.
- Räkna de färgade och icke-färgade cellerna i en hemocytometer.
- Beräkna livskraften och dödligheten i enlighet därmed.
Livskraft =
Dödlighet =
5. Lipidfärgning med oljerött O
- Sätt en cellkultur coverlip i varje brunn i en 24-brunnsplatta.
- Frö 100 000 HepG2 celler per brunn. Tillsätt 1 ml standard RPMI 1640.
- Förinkubera vid 37 °C och 5 % CO2 i 24 timmar.
- Byt standard RPMI 1640 medium för det steatogena mediet.
- Inkubera i 24 timmar, 2 dagar, 3 dagar och 4 dagar, uppdatera det steatogena mediet var 24: e timme.
- Efter lämplig tid, kassera supernaten.
- Tvätta med 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Kassera supernaten.
- Fixera med 1 ml 4% paraformaldehyd i PBS.
- Inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
- Kassera överskottet av paraformaldehyd.
- Skölj cellerna med 1 ml destillerat vatten.
- Tillsätt 1 ml 70% isopropanol och inkubera i 5 min.
- Kassera överskottet av isopropanol. En PBS-tvätt behövs inte vid denna tidpunkt.
- Tillsätt 1 ml oljeröd O-lösning och inkubera i 30 min.
- Kassera överskottet av den oljeröda O-lösningen.
- Skölj med 1 ml destillerat vatten.
- Tillsätt 500 μL hematoxylinlösning. Inkubera i 3 min.
- Kassera överskottet av hematoxylinlösning.
- Skölj med 1 ml destillerat vatten.
- Observera under mikroskopet vid en förstoring av 400x (mål 40x, Okulär 10x).
6. Morfometrisk bedömning av lipidinnehåll
- Slumpmässigt välja och ta fotografier av 10 optiska fält från hela brunnen. Upprepa för varje brunn.
- Utvärdera procentandelen rödbetsat område med hjälp av färgtröskelverktyget i ImageJ-programvaran enligt Ferreira och Rasband33.
- Jämför det färgade området med hela området i det optiska fältet med hjälp av analyspartiklarverktyget i ImageJ-programvaran enligt Ferreira och Rasband33.
- Beräkna den genomsnittliga procentandelen av varje brunn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatocyter odlade i det steatogena mediet visar tillväxt över hela brunnens yta; Feta hepatocyter visar dock lägre tillväxthastighet jämfört med celler odlade i kontrollmedium. Det föreslagna förhållandet och koncentrationen av OA och PA, garanterar cellens överlevnad under kulturen. Sådd av 1 x 105 celler per brunn i 24-brunnsplattor ger optimal sammanflöde enligt figur 1.
Livskraften i odlade celler var lägre i de steatogena grupperna Mild och Severe jämfört med kontrollförhållandena. Faktum är att livskraften gradvis minskade när tiden för kulturen ökade och nådde den lägsta av 60% vid 4 dagar i svår steatos (Figur 2A). Följaktligen var dödligheten högre hos hepatocyter som odlades under de steatogena förhållandena, och den ökade gradvis med tidpunkten för exponering för lipider (figur 2B). Cellantalet ökade successivt till följd av spridning (figur 2C). Spridningshastigheten var dock lägre vid mild steatos vid 3 dagar och 4 dagar. Däremot var allvarliga steatosis associeras med lägre spridning från 24 h.
HepG2 celler odlas i det föreslagna protokollet visar den viktigaste funktionen av steatosis, intracellulära lipid ackumulering. Färgningsceller med olja Röd O får observera minst en tvåfaldig ökning av lipiddroppar i celler som odlas under steatogena förhållanden enligt figur 3 och figur 4. Intracellulärt fett ökade beroende på tidpunkten för exponering av kultur i det steatogena mediet (figur 3). I mild steatos ökade lipidinnehållet från dag 2, medan de i svår steatos var signifikant höga från 24 timmar.
Figur 1: Celltillväxt. HepG2 hepatocytkultur under kontroll (figur 1A-D) och milda steatogena förhållanden (Figur 1E-H). Fotografier visar tillväxt från 1-4 dagar av kultur. Skalbar = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Livskraft och dödlighet. B)Dödlighet. C)Cellnummer. HepG2 hepatocyter kultur i kontroll och steatogenic villkor bedömdes för livskraft och dödlighet priser av trypan blå färgning. Menar ± SD. Två oberoende experiment i triplicate per kulturtid. Cirklar: kontrollförhållanden; Kvadrater: mild steatos; Trianglar: svår steatos. Enkelvägs ANOVA användes för att jämföra mellan förhållanden och kulturtid för samma tillstånd. p < 0,05 ansågs signifikant: "*"- kontroll kontra svår steatos; "§"- kontroll kontra mild steatos; "¶"- mild vs svår steatos. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Lipidackumulering. HepG2 hepatocyter kultur i kontroll och steatogenic villkor bedömdes för lipid innehåll av olja röd O färgning följt av en morfometrisk analys med ImageJ programvara (NIH, USA). Procentandel lipider avser andelen area som färgas av oljerött O (lipider) med tanke på 100% som hela området i varje optiskt fält analyserat. Menar ± SD. Två oberoende experiment i triplicate per kulturtid. Cirklar: kontrollförhållanden; Kvadrater: mild steatos; Trianglar: svår steatos. Enkelvägs ANOVA användes för att jämföra mellan förhållanden och kulturtid för samma tillstånd. p < 0,05 ansågs signifikant: "*"- kontroll kontra svår steatos; "§"- kontroll kontra mild steatos; "¶"- mild vs svår steatos. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Steatos in vitro. HepG2 hepatocytkultur under kontroll (Figur 4A-D), mild steatogenic (Figur 4E-H) och svåra steatogenic (Figur 4I-L) villkor bedömdes för lipidinnehåll genom oljeröd O färgning. Fotografier visar hepatocyt lipid droppar från 24 h till 4 dagar. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll är avsett att ge en strategi för att studera steatos in vitro. Cellkultur är ett kraftfullt verktyg för att studera cellulära, molekylära, biokemiska och toxikologiska aspekter av de celler som utsätts för olika tillstånd. Med detta tillvägagångssätt kan steatos visualiseras inte bara som ett stadium av den komplexa sjukdomen som är MAFLD, men också som hepatocyt överexponering för lipider och de möjliga resultaten som härrör från sådan exponering. Därför är dess tillämpning inte begränsad till maflds fysiopatologi, utan till det faktum att patienter med fettlever utsätts för terapeutiska läkemedel, föroreningar, bland andra tillstånd som kan påverkas av steatos. Detta protokoll har således potentiella tillämpningar inom toxikologi, farmakologi och identifiering av terapeutiska mål för behandling av sjukdomen.
Vid utvecklingen av detta protokoll är ett av de mest kritiska stegen beredningen av den steatogena blandningen: 1 del av palmitat: 2 delar oleat, vilket inducerar steatoosis från dag 2 (Figur 3, Figur 4), vilket gör det möjligt för hepatocyter att föröka sig - trots en blygsam minskning av livskraften och ökad dödlighet (Figur 2). Den minskade lönsamheten bör dock inte överstiga 30-40 procent, eftersom det kan innebära en toxisk effekt snarare än en effekt som kan följas på lång sikt. Leversteatos är resultatet av en långsiktig överexponering för lipider. I den meningen ackumuleras lipider först med milda känslor på hepatocyterna, som observerats i denna modell. En annan funktion är lipiddropparprofilen. Vid mild steatos observeras en ökad storlek i lipiddroppar under kulturens utveckling (figur 4E-H). Vid svår steatos är droppstorleken betydligt högre jämfört med mild steatos (figur 4I-L), medan kontrollerna inte visar förändringar i lipiddroppar (Figur 4A-D).
Det är att föredra att lagra både milda och svåra steatogena medier vid 4 °C i upp till en vecka. Efteråt rekommenderas att förbereda färskt steatogent medium. OA-beståndet kan dock bevaras vid -20 °C i upp till en månad, medan pa-beståndet kan lagras vid 4 °C i upp till en månad. Att använda dessa stamlösningar efter den föreslagna tiden kan utgöra en risk för nedbrytning av fettsyrorna. För att säkerställa en korrekt koncentration av lösningarna före varje användning rekommenderas att man mäter fettsyrakoncentrationerna med ett icke-föresterat fettspapp (NEFA) analyskit.
PA och OA, liksom deras respektive salter, har använts separat för att inducera lipidackumulering. skillnader observeras dock för varje fettsyra16,20. Å ena sidan är palmitat som används ensam en bra induktor av steatos. Det inducerar celldöd, leverinsulinresistens, mitokondriell dysfunktion, retikulär stress16,34,35,36. Palmitat är dock mycketgiftigt 16,34, och de resultat som förväntas använda det ensamt i kultur inkluderar lägre livskraft och högre dödlighet jämfört med blandningen av PA och OA16,20. Å andra sidan inducerar oleat också steatos. Det inducerar de novo lipogenes, insulinresistens37,38, och hyperproliferation38. De resultat som observeras med oleat är dock ofta mildare jämfört med palmitat ochblandningen 16,20. Detta kan vara relaterat till dess skyddande roll. Oleate är den viktigaste komponenten i olivolja, en viktig ingrediens i Medelhavsdieten, en av de välkända framgångsrika strategierna mot MAFLD39.
Detta protokoll kan betraktas som ett trevligt verktyg för att studera steatos på grund av dess reproducerbarhet och den korta tid det tar att få resultat. Detta kan jämföras med att använda experimentella modeller av MAFLD, och tillägger det faktum att det inte innebär de etiska problem som är inneboende i användningen av gnagaremodeller. Detta protokoll tillåter att följas i flera dagar, förutsatt att steatogenic medium uppdateras var 24: e timme. Denna modell är också kostnadseffektiv och har ett brett utbud av applikationer. Det kan också justeras till andra cellinjer, inte bara hepatocyter, men ett brett spektrum av celler som påverkas av lipid överexponering under fetma. En av begränsningarna i detta protokoll är användningen av HepG2-celler. Eftersom detta är en cancerframkallande cellinje kan det dölja eller öka vissa resultat. Tillämpningen av HepG2-celler i dessa typer av studier är dock allmänt accepterad på grund av dess likhet i lipidmetabolism med friska hepatocyter40. Användningen av blandningen PA:2OA kan också visa sig vara kontroversiell eftersom den inte helt liknar de profiler av NEFA som observerats i blodet hos NAFLD/ MAFLD-patienter41. Andra fettsyror, inklusive linolensyror eller stearinsyror, kan ingå i ytterligare ändringar och förbättringar av detta protokoll. En annan begränsning är det faktum att endast en celltyp, hepatocyter, studeras, saknar interaktionen med andra leverceller som finns i levern, inklusive sinusoidal endotel, Kupffer, lever stellatceller, etc., som är engagerade i utvecklingen av MAFLD. Dessutom är detta en modell för att inducera steatoosis uteslutande, utan progression till steatohepatitis och fibros.
Sammanfattningsvis ger studien ett in vitro-protokoll av hepatocytsteatos som är lätt att genomföra, reproducerbar och med ett brett spektrum av applikationer i studien av steatos samt hepatocytfunktionen i samband med fettlever.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). Adriana Campos är doktorand vid Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, och fick stöd av Conacyt (CVU: 1002502).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety cabinet | ESCO Airstream | AC2-452+C2:C26 | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Bottle top filter | Corning, US | 430513 | Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL. |
| Bovine serum albimun (BSA) | Gold Biotechnology, US | A-421-10 | BSA Fatty Acid Free for cell culture |
| Culture media RPMI 1640 | ThermoFisher-Gibco, US | 31800-022 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher-Gibco, US | A4766801 | - |
| Hemocytometer | Marienfeld, DE | 640010 | - |
| HepG2 cell line | ATCC, US | HB-8065 | Hepatocellular carcinoma human cells. |
| Humidified incubator | Thermo Electronic Corporation,US | Model: 3110 | Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%) |
| Inverted microscope Eclipse | NIKON, JPN | Model: TE2000-S | - |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, US | I9030-4L | - |
| Oil Red O Kit | Abcam, US | ab150678 | Kit for histological visualization of neutral fat. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, US | P6148-500G | - |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher-Gibco, US | 15140-122 | Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin |
| pH meter | Beckman, US | Model: 360 PH/Temp/MV Meter | - |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher-Gibco, US | 10010-023 | - |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1253.001 | Non-pyrogenic, sterile, 5 mL |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1254.001 | Non-pyrogenic, sterile, 10 mL |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, US | S5761-1KG | Preparation of culture media |
| Sodium oleate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215879A | - |
| Sodium palmitate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215881 | - |
| Syring filter | Corning, US | 431219 | Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm. |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich, US | T6146-25G | - |
| Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM | Corning, US | 25-052-Cl | - |
| 24 well cell culture cluster | Corning, US | 3524 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
| 96 well cell culture cluster | Corning, US | 3599 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
References
- Younossi, Z. M. Non-alcoholic fatty liver disease - a global public health perspective. Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).
- Younossi, Z., et al. Global perspectives on nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 69 (6), 2672-2682 (2019).
- Eslam, M., et al. A new definition for metabolic dysfunction-associated fatty liver disease: An international expert consensus statement. Journal of Hepatology. 73 (1), 202-209 (2020).
- Eslam, M., Sanyal, A. J., George, J. MAFLD: A consensus-driven proposed nomenclature for metabolic associated fatty liver disease. Gastroenterology. 158 (7), 1999-2014 (2020).
- Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American association for the study of liver diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
- Calzadilla Bertot, L., Adams, L. A. The natural course of non-alcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Science. 17 (5), 774 (2016).
- Reccia, I., et al. Non-alcoholic fatty liver disease: A sign of systemic disease. Metabolism. 72, 94-108 (2017).
- Tomita, K., et al. Free cholesterol accumulation in hepatic stellate cells: Mechanism of liver fibrosis aggravation in nonalcoholic steatohepatitis in mice. Hepatology. 59 (1), 154-169 (2014).
- Byrne, C. D., Targher, G.
- Ipsen, D. H., Lykkesfeldt, J., Tveden-Nyborg, P. Molecular mechanisms of hepatic lipid accumulation in non-alcoholic fatty liver disease. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (18), 3313-3327 (2018).
- Diehl, A. M., Day, C. Cause, pathogenesis, and treatment of nonalcoholic steatohepatitis. New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).
- Zeng, X., et al. Oleic acid ameliorates palmitic acid induced hepatocellular lipotoxicity by inhibition of ER stress and pyroptosis. Nutrition and Metabolism. 17, London. 11 (2020).
- Ore, A., Akinloye, O. A. Oxidative stress and antioxidant biomarkers in clinical and experimental models of non-alcoholic fatty liver disease. Medicina (Kaunas). 55 (2), 26 (2019).
- Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. Oxidative stress, cardiolipin and mitochondrial dysfunction in nonalcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 20 (39), 14205-14218 (2014).
- Aravinthan, A., et al. Hepatocyte senescence predicts progression in non-alcohol-related fatty liver disease. Journal of Hepatology. 58 (3), 549-556 (2013).
- Gomez, M. J., et al. A human hepatocellular in vitro model to investigate steatosis. Chemico Biological Interactions. 165 (2), 106-116 (2007).
- Wu, W. K. K., Zhang, L., Chan, M. T. V. Autophagy, NAFLD and NAFLD-related HCC. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1061, 127-138 (2018).
- Levy, G., Cohen, M., Nahmias, Y. In vitro cell culture models of hepatic steatosis. Methods in Molecular Biology. 1250, 377-390 (2015).
- Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Science. 14 (6), 11963-11980 (2013).
- Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
- Lee, Y., et al. Serial biomarkers of de novo lipogenesis fatty acids and incident heart failure in older adults: The cardiovascular health study. Journal of the American Heart Association. 9 (4), 014119 (2020).
- Alnahdi, A., John, A., Raza, H. Augmentation of glucotoxicity, oxidative stress, apoptosis and mitochondrial dysfunction in Hepg2 cells by palmitic acid. Nutrients. 11 (9), 1979 (2019).
- Chen, X., et al. Oleic acid protects saturated fatty acid mediated lipotoxicity in hepatocytes and rat of non-alcoholic steatohepatitis. Life Sciences. 203, 291-304 (2018).
- Xing, J. H., et al. NLRP3 inflammasome mediate palmitate-induced endothelial dysfunction. Life Sciences. 239, 116882 (2019).
- Yan, H., et al. Insulin-like Growth Factor Binding Protein 7 accelerates hepatic steatosis and insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 46 (12), 1101-1110 (2019).
- Wang, J., Hu, R., Yin, C., Xiao, Y. Tanshinone IIA reduces palmitate-induced apoptosis via inhibition of endoplasmic reticulum stress in Hepg2 liver cells. Fundamental and Clinical Pharmacology. 34 (2), 249-262 (2020).
- Xiao, Z., Chu, Y., Qin, W. IGFBP5 modulates lipid metabolism and insulin sensitivity through activating ampk pathway in non-alcoholic fatty liver disease. Life Sciences. 256, 117997 (2020).
- Avila, G., et al. In vitro effects of conjugated linoleic acid (CLA) on inflammatory functions of bovine monocytes. Journal of Dairy Science. 103 (9), 8554-8563 (2020).
- Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 12093-12101 (2006).
- Oh, J. M., et al. Effects of palmitic acid on TNF-alpha-induced cytotoxicity in SK-Hep-1 cells. Toxicology In Vitro: An International Journal Published in Association with BIBRA. 26 (6), 783-790 (2012).
- Stellavato, A., et al. In vitro assessment of nutraceutical compounds and novel nutraceutical formulations in a liver-steatosis-based model. Lipids in Health and Disease. 17 (1), 24 (2018).
- Pachikian, B. D., et al. Implication of trans-11, trans-13 conjugated linoleic acid in the development of hepatic steatosis. PLoS One. 13 (2), 0192447 (2018).
- Ferreira, T., Rasband, W. Analyze. ImageJ User Guide. , Ch. 30 132-135 (2012).
- Geng, Y., Wu, Z., Buist-Homan, M., Blokzijl, H., Moshage, H. Hesperetin protects against palmitate-induced cellular toxicity via induction of GRP78 in hepatocytes. Toxicology and Applied Pharmacology. , 404 (2020).
- Geng, Y., et al. Protective effect of metformin against palmitate-induced hepatic cell death. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1866 (3), 165621 (2020).
- Sarnyai, F., et al. Effect of cis- and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Science. 21 (7), 2626 (2020).
- Chen, J. W., et al. Tetrahydrocurcumin ameliorates free fatty acid-induced hepatic steatosis and improves insulin resistance in HepG2 cells. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (3), 1075-1085 (2018).
- Burhans, M. S., et al. Hepatic oleate regulates adipose tissue lipogenesis and fatty acid oxidation. Journal of Lipid Research. 56 (2), 304-318 (2015).
- Abenavoli, L., Milanovic, M., Milic, N., Luzza, F., Giuffre, A. M. Olive oil antioxidants and non-alcoholic fatty liver disease. Expert Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 13 (8), 739-749 (2019).
- Nagarajan, S. R., et al. Lipid and glucose metabolism in hepatocyte cell lines and primary mouse hepatocytes: A comprehensive resource for in vitro studies of hepatic metabolism. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 316 (4), 578-589 (2019).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
