Summary
Этот протокол предназначен для изучения стеатоза и молекулярных, биохимических, клеточных изменений, вызванных чрезмерным воздействием липидов in vitro нагепатоциты.
Abstract
Метаболическая дисфункция,связанная с жировой болезнью печени (МАЖБП), ранее известная как неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП), является наиболее распространенным заболеванием печени во всем мире из-за его связи с ожирением, диабетом 2 типа и дислипидемией. Стеатоз печени, накопление липидных капель в паренхиме печени, является ключевым признаком заболевания, предшествующего воспалению, наблюдаемому при стеатогепатите, фиброзе и конечной стадии заболевания печени. Накопление липидов в гепатоцитах может мешать правильному метаболизму ксенобиотиков и эндогенных молекул, а также индуцировать клеточные процессы, ведущие к прогрессированию заболевания. Хотя экспериментальное исследование стеатоза может быть выполнено in vivo,подходы in vitro к изучению стеатоза являются дополнительными инструментами с различными преимуществами. Культура гепатоцитов в среде, обусловленной перегрузкой липидов, является отличным воспроизводимым вариантом для изучения стеатоза печеночной области, позволяя идентифицировать клеточные процессы, связанные с накоплением липидов, такие как окислительные и ретикулярные стрессы, аутофагия, пролиферация, гибель клеток и т. Д., А также другие испытания, включая эффективность лекарств, и токсикологическое тестирование, среди многих других возможных применений. Здесь было направлено на описание методики культивирование клеток гепатоцитов в липидной среде, обусловленной перегрузкой. Клетки HepG2 культивировали в среде RMPI 1640, кондиционированной пальмитатом натрия и олеатом натрия. Важно отметить, что соотношение этих двух липидов имеет решающее значение для благоприятство накоплению липидных капель, сохраняя при этом пролиферацию клеток и умеренную смертность, как это происходит в печени во время заболевания. Показана методика приготовления запасов липидного раствора, смеси, добавления в среду и культуры гепатоцитов. С помощью этого подхода можно идентифицировать липидные капли в гепатоцитах, которые легко наблюдаются при окрашивание Oil-red O, а также кривые показателей пролиферации / смертности.
Introduction
Жировая дистрофия печени, связанная с метаболической дисфункцией, широко распространена во всем мире1,2; по оценкам, до 25% населения страдает3. Это заболевание, ранее известное как неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП), обновило свою номенклатуру к метаболической дисфункции, связанной с жировой болезнью печени (МАЖБП), чтобы точно отразить патогенез, связанный с ожирением, резистентностью к инсулину, диабетом 2 типа и дислипидемией, а также возможные методы лечения заболевания3,4.
Независимо от названия, заболевание включает в себя широкий спектр гистопатологических изменений, характеризующихся аномально высоким накоплением липидов в печени (>5% жира в гепатоцитах5)и может прогрессировать через накопление липидов, обычно встречающееся при простом стеатозе, до стеатогепатита, что, в свою очередь, может привести к развитию фиброза, цирроза, гепатоцеллюлярная карцинома и печеночная недостаточность5,6,7,8. Ожидается, что из-за его растущей распространенности МАЖБП станет первым признаком трансплантации печени и основной причиной гепатоцеллюлярной карциномы9.
Хотя он считается доброкачественной или легкой формой жировой болезни печени, стеатоз печени на самом деле является метаболическим ключом в MAFLD10. Различные метаболические пути зависят от накопления липидов в печени, включая, но не ограничиваясь, синтезом, экспортом и метаболизмом липидов10. Инсулинорезистентность, окислительный стресс, ретикулярный стресс и клеточная дисфункция тесно связаны с печеночной липотоксичностью11,12. С другой стороны, жировые гепатоциты являются мишенью активных форм кислорода, претворяя метаболиты в виде перекисей липидов, белковых карбонилов и аддуктов нуклеиновых кислот13. На клеточном уровне жировые гепатоциты могут подвергаться митохондриальному повреждению14,клеточному старению15,апоптозу16,пироптозу12и аутофагии17,среди других событий.
Гепатоциты высоко отвечают за метаболизм, детоксикацию и синтез широкого спектра молекул. Многие из этих функций могут быть скомпрометированы накоплением липидов, наблюдаемым при стеатозе. Поэтому очень важно иметь воспроизводимые инструменты, позволяющие точно оценить стеатоз. В этом смысле модели in vitro легко применимы и воспроизводимы. Стеатоз in vitro использовался с различными целями16,18,19. Клетки HepG2 широко используются в качестве клеточной линии гепатоцитов. Он имеет такие преимущества, как легкость в культуре и хорошая характеристика. Пожалуй, единственным недостатком клеток HepG2 является тот факт, что это канцерогенная клеточная линия, поэтому это необходимо учитывать при анализе исходов. Здесь показано применение смеси жирных кислот, широко используемых в клеточной культуре: пальмитиновой кислоты (ПА) и олеиновой кислоты (ОА). И PA, и OA предлагают разные результаты в культуре20. ПА (С 16:0) является наиболее распространенной насыщенной жирной кислотой, получаемой из рациона16. ПА рассматривается как биомаркер де-ново липогенеза,важнейшего шага в развитии НАЖБП21. Показано, что ПА высокотоксична22; поэтому может быть не рекомендуется индуцировать стеатоз in vitro. ОА (C 18:1) является мононенасыщенной жирной кислотой. В отличие от ПА, было высказано предположение, что ОА обладает противовоспалительными и антиоксидантными свойствами, будучи способным противодействовать ПА12. Как ПА, так и ОА являются основными жирными кислотами, присутствующими в триглицеридах, независимо от состояния здоровья или заболевания16. В таблице 1 приведены примеры культуры гепатоцитов с ПА, ОА и их смесью, а также результаты, о которыхсообщается12,23,24,25,26,27. Другие жирные кислоты также использовались в культуре гепатоцитов, включая стеариновую кислоту (C 18:0)28,29,30,линолевую кислоту (C18:1) 28,30,31 и ее конъюгаты (CLA)28,32,пальмитолеиновую кислоту (C 16:1)29. Тем не менее, их использование реже всего сообщается в литературе, возможно, потому, что их печеночное изобилие ниже, чем PA и OA16.
В сочетании обе жирные кислоты напоминают стеатоз in vitro,обеспечивая пролиферируя клетки, с повышенной гибелью клеток и более низкой жизнеспособностью по сравнению с контрольными условиями. Стоит отметить, что соответствующие соли этих жирных кислот доступны и могут быть использованы. Одна из основных проблем при оценке липидной перегрузки в культуре клеток гепатоцитов приведена в дифференциации токсикологических моделей и модели, наилучшим образом представляющей стеатоз. Многие модели можно отнести в первом случае. Фактически, использование только ПА можно рассматривать среди них, и высокая смертность является наиболее очевидным исходом12,16,23,24,25,26,27. Применение высоких доз даже в случае ОА также можно рассматривать как токсикологическую модель. Показанный здесь протокол находится в более высоком соответствии с развитием стеатоза, поскольку он показывает низкую смертность по сравнению с той, которая наблюдается в других моделях, и позволяет соблюдать его в течение нескольких дней с прогрессирующим накоплением липидов, как это происходит при НАЖБП. Возможность оценить легкий и тяжелый стеатоз через экспериментальные условия считается еще одним преимуществом.
| Жирные кислоты | Условия | Результаты | Ссылка | ||
| ПАПА | Концентрация: 200 мкМ | Накопление липидов | Ян и др., 201925. | ||
| Время экспозиции: 24 ч | Повреждение гепатоцитов | ||||
| Возвышение трансаминаз | |||||
| ПАПА | Концентрация: 50, 100 и 200 мкМ | Накопление липидов | Xing et al, 201924. | ||
| Время экспозиции: 24 ч | |||||
| ПАПА | Концентрация: 250 мкМ, 500 мкМ, 750 мкМ и 1 000 мкМ | Накопление липидов | Wang et al, 202026. | ||
| Время экспозиции: 24 ч | Прогрессивное снижение жизнеспособности клеток | ||||
| Смесь ОА/ПА | Концентрация: 1 мМ | Накопление липидов | Xiao et al, 202027. | ||
| Время экспозиции: 24 ч | Не сообщает о липотоксичности | ||||
| Скорость: 2OA: 1PA | |||||
| Смесь ОА/ПА | Первая стимуляция 200 мкМ и 400 мкМ ПА, а затем вторая стимуляция 200 мкМ ОА | Накопление липидов. | Цзэн и др., 202012. | ||
| Концентрация:400 мкМ ПА: 200 мкМ ОА | Доказательства липотоксичности, индуцированной ПА, были уменьшены стимуляцией ОА. | ||||
| Скорость: 2PA: 1OA | |||||
| Время экспозиции: 24 ч | |||||
| Смесь ОА/ПА | Концентрация: 400 мкМ ПА: 200 мкМ ОА | Накопление липидов | Chen et al, 201823. | ||
| Скорость: 2PA: 1OA | |||||
| Время экспозиции: 24 ч | |||||
| Смесь ОА/ПА | Концентрация:50 и 500 мкМ | Генерация двух типов стеатоза: легкого стеатоза и тяжелый стеатоз. |
Кампос и Гусман 2021 | ||
| Скорость: 2PA: 1OA | Моделирует хроническую экспозицию липидной перегрузки | ||||
| Время экспозиции: 24 ч, 2 дня, 3 дня и 4 дня. | |||||
Таблица 1. Культура гепатоцитов в стеатогенных условиях. В таблице представлен тип используемой жирной кислоты, поддерживаемые условия и наблюдаемые результаты в культуре гепатоцитов. О.А.: Пальмитиновая кислота. ОА: Олеиновая кислота.
Наконец, эта модель применима не только к изучению стеатоза и жировой дистрофии печени, но и к печеночному метаболическому, синтетическому и детоксикационному пути в контексте стеатоза. Кроме того, индуцированный стеатоз in vitro может предоставить доказательства для идентификации потенциальных маркеров заболевания, а также терапевтических целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Стандартная и кондиционированная подготовка среды
- Для приготовления стандартного RPMI 1640 добавляем питательную среду RPMI 1640 10% (v/v) фетальной бычий сыворотки (FBS, предварительно инактивированную тепло) и 1% (v/v) раствора пенициллина-стрептомицина. Хранить среду при 4 °C.Стерилизуйте с помощью фильтров 0,22 мкм.
- Для приготовления раствора пальмитата готовят раствор пальмитата 50 мМ в стандартном RPMI 1640, предварительно дополненном 1% бычим сывороточным альбумином (без липидов). Достаточно будет объема в 5-10 мл этого запаса. Стерилизуйте раствор с помощью фильтров 0,22 мкм. Хранить при 4 °C защищенным от света до 1 месяца.
- Для приготовления раствора олеата готовят раствор олеата 50 мМ в стандартном RPMI 1640, предварительно дополненном 1% бычим сывороточным альбумином (без липидов). Достаточно будет объема в 10 мл. Стерилизуйте раствор с помощью фильтров 0,22 мкм. Хранить при -20 °C защищенным от света до 1 месяца.
- Для приготовления стеатогенной среды из предварительно приготовленных бульев готовят 1-частную пальмитат: 2-х части олеатную стеатогенную среду на двух возможных уровнях: легком и тяжелом стеатозе.
- Легкий стеатоз: Приготовьте 100 мл смеси из 1 части пальмитата: 2 части олеата (50 мкМ) в стандартном RPMI 1640. Стерилизуйте с помощью фильтров 0,22 мкм. Хранить при 4 °C до 1 недели.
- Тяжелый стеатоз: Приготовьте 100 мл 1-части пальмитата: 2-х части олеата (500 мкМ) смеси в стандартном RPMI 1640. Стерилизуйте с помощью фильтров 0,22 мкм. Хранить при 4 °C до 1 недели.
- Альтернативная подготовка для стоковых растворов.
- Приготовьте оба стоковых раствора, используя соответствующие жирные кислоты, используя свободный липидный альбумин, как указано выше.
- При недостатке свободного липидного альбумина используют пальмитатные и олеатные соли.
- Растворить либо пальмитат, либо олеат в 2 мл абсолютного этанола, а затем смешать в конечном объеме стандартного RPMI 1640 (5-10 мл). Растворяют олеат непосредственно путем перемешивания в стандартной питательной среде RPMI 1640.
- Допускать испарение этанола путем инкубации на водяной бане при 70 °C; тщательно перемешать.
- В каждом случае стерилизуйте оба стоковых раствора с помощью фильтров 0,22 мкм. Хранить раствор пальмитата при 4 °C и раствор олеата при - 20 °C. Защитите оба решения от света. Эти растворы стабильны в течение 1 месяца.
2. Докультура
- Посеять 100 000 клеток HepG2 на скважину в 24-скважинную пластину. Добавьте 1 мл стандарта RPMI 1640.
- Предварительно инкубировать при 37 °C и 5% CO2 в течение 24 ч, что позволяет прикреплять клетки.
3. Стеатогенная культура
- После предварительной культивки отбросьте стандартную среду RPMI 1640 и добавьте соответственно стеатогенную среду.
- Выбросьте супернатант и добавляйте свежую стеатогенную среду каждые 24 ч.
4. Оценка жизнеспособности и смертности
- Посеять 100 000 клеток HepG2 на скважину в 24-скважинную пластину. Добавьте 1 мл стандарта RPMI 1640.
- Предварительно инкубировать в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO2.
- Замените стандарт rpmI 1640 на стеатогенную среду.
- Инкубировать в течение 24 ч, 2 дней, 3 дней и 4 дней, обновляя стеатогенную среду каждые 24 ч.
- По истечении соответствующего времени выбросьте супернатант.
- Отсоедините клетки от скважины, добавив 500 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА. Инкубировать в течение 5 мин при 37 °C и 5% CO2.
- Соберите повторно суспендированные клетки в микропробирку.
- Центрифуга при 300 х г и выбросьте супернатант.
- Добавьте 200 мкл стандартного RPMI 1640 и повторно суспендируете ячейки.
- Добавить 15 мкл 0,4% раствора трипана синего в свежую микропробирку. Смешать с 15 мкл предыдущей клеточной суспензии.
- Подсчитайте окрашенные и неокраженные клетки в гемоцитометре.
- Рассчитайте показатели жизнеспособности и смертности соответственно.
Жизнеспособность =
Смертность =
5. Липидное окрашивание маслом Red O
- Поместите крышку клеточной культуры в каждую скважину в 24-скважинной пластине.
- Посеять 100 000 клеток HepG2 на скважину. Добавьте 1 мл стандарта RPMI 1640.
- Предварительно инкубировать при 37 °C и 5% CO2 в течение 24 ч.
- Замените стандарт rpmI 1640 на стеатогенную среду.
- Инкубировать в течение 24 ч, 2 дней, 3 дней и 4 дней, освежая стеатогенную среду каждые 24 ч.
- По истечении соответствующего времени выбросьте супернатант.
- Промыть 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Выбросьте супернатант.
- Фиксировать с 1 мл 4% параформальдегида в PBS.
- Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Отбросьте избыток параформальдегида.
- Промыть клетки 1 мл дистиллированной воды.
- Добавить 1 мл 70% изопропанола и инкубировать в течение 5 мин.
- Отбросьте избыток изопропанола. На данном этапе стирка PBS не требуется.
- Добавить 1 мл раствора Oil-red O и инкубировать в течение 30 мин.
- Отбросьте избыток раствора масло-красного О.
- Промыть 1 мл дистиллированной воды.
- Добавьте 500 мкл раствора гематоксилина. Инкубировать в течение 3 мин.
- Отбросьте избыток раствора гематоксилина.
- Промыть 1 мл дистиллированной воды.
- Наблюдать под микроскопом с увеличением 400х (Объектив 40х, Глаз 10х).
6. Морфометрическая оценка содержания липидов
- Случайным образом выберите и сфотографируйте 10 оптических полей со всей площади скважины. Повторите для каждой скважины.
- Оцените процент окрашенной в красный цвет области с помощью инструмента «Порог цвета» в программном обеспечении ImageJ в соответствии с Ferreira и Rasband33.
- Сравните окрашенную область с полной площадью оптического поля с помощью инструмента «Анализ частиц» в программном обеспечении ImageJ в соответствии с Ferreira и Rasband33.
- Рассчитайте средний процент каждой скважины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Гепатоциты, культивируется в стеатогенной среде, демонстрируют рост по всей поверхности колодца; однако жировые гепатоциты показывают более низкую скорость роста по сравнению с клетками, культивируемыми в контрольной среде. Предлагаемое соотношение и концентрация ОА и ПА, гарантируют выживание клеток во время культивирования. Посев 1 х 105 ячеек на скважину в 24-скважинных пластинах обеспечивает оптимальное слияние, как показано на рисунке 1.
Жизнеспособность культивируемых клеток была ниже в стеатогенных группах, легкой и тяжелой, по сравнению с контрольными условиями. Фактически, жизнеспособность постепенно уменьшалась по мере увеличения времени культуры, достигая самого низкого уровня в 60% через 4 дня при тяжелом стеатозе(рисунок 2А). Соответственно, смертность была выше в гепатоцитах, культивированных в стеатогенных условиях, и она прогрессивно увеличивалась со временем воздействия липидов(рисунок 2В). Количество клеток постепенно увеличивалось в результате пролиферации(рисунок 2C). Тем не менее, скорость пролиферации была ниже при легком стеатозе через 3 дня и 4 дня. Напротив, тяжелый стеатоз был связан с более низкой пролиферацией от 24 ч.
Клетки HepG2, культивированные в предлагаемом протоколе, показывают важнейшую особенность стеатоза , внутриклеточное накопление липидов. Окрашивание клеток маслом Red O позволило наблюдать как минимум двукратное увеличение липидных капель в клетках, культивированных в стеатогенных условиях, как показано на фиг.3 и фиг.4. Внутриклеточный жир увеличивался в зависимости от времени воздействия культуры в стеатогенную среду(рисунок 3). При легком стеатозе содержание липидов увеличивалось со 2-го дня, тогда как при тяжелом стеатозе они были значительно высокими через 24 ч.
Рисунок 1:Рост клеток. Гепатоциты гепатоцитов HepG2 в контроле(Фиг.1A-D)и легких стеатогенных условиях(Фиг.1Е-Н). Фотографии показывают рост от 1-4 дней культуры. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Жизнеспособность и показатели смертности. (A) Жизнеспособность. (B)Смертность. (C) Номер ячейки. Культуру гепатоцитов HepG2 в контрольных и стеатогенных условиях оценивали на жизнеспособность и смертность путем окрашивания трипан-синим цветом. Среднее ± SD. Два независимых эксперимента в трехкратном размере за время культуры. Круги: условия управления; Квадраты: легкий стеатоз; Треугольники: тяжелый стеатоз. Односторонняя ANOVA использовалась для сравнения условий и времени культуры для одного и того же состояния. p < 0,05 считалось значимым: "*" - контроль против тяжелого стеатоза; "§" - контроль против легкого стеатоза; "¶" - легкий vs тяжелый стеатоз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Накопление липидов. Культуру гепатоцитов HepG2 в контрольных и стеатогенных условиях оценивали на содержание липидов путем окрашивания маслом красного цвета O с последующим морфометрическим анализом с использованием программного обеспечения ImageJ (NIH, США). Процент липидов относится к проценту площади, окрашенной Oil-Red O (липиды), рассматривая 100% как полную площадь каждого анализируемого оптического поля. Среднее ± SD. Два независимых эксперимента в трехкратном размере за время культуры. Круги: условия управления; Квадраты: легкий стеатоз; Треугольники: тяжелый стеатоз. Односторонняя ANOVA использовалась для сравнения условий и времени культуры для одного и того же состояния. p < 0,05 считалось значимым: "*" - контроль против тяжелого стеатоза; "§" - контроль против легкого стеатоза; "¶" - легкий vs тяжелый стеатоз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Стеатоз in vitro. Культуру гепатоцитов HepG2 в контроле(Рисунок 4A-D),мягкие стеатогенные(Рисунок 4E-H)и тяжелые стеатогенные(Рисунок 4I-L)состояния оценивали на содержание липидов путем окрашивания маслом красного O. Фотографии показывают капли липидов гепатоцитов от 24 ч до 4 дней. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол предназначен для обеспечения стратегии изучения стеатоза in vitro. Клеточная культура является мощным инструментом для изучения клеточных, молекулярных, биохимических и токсикологических аспектов клеток, подвергающихся воздействию различных условий. При таком подходе стеатоз можно визуализировать не только как стадию сложного заболевания, которым является МАЖБП, но и как чрезмерное воздействие липидов гепатоцитов и возможные исходы, возникающие в результате такого воздействия. Поэтому его применение не ограничивается физиопатологией МАЖБП, а тем фактом, что пациенты с жировой дистрофией печени подвергаются воздействию терапевтических препаратов, загрязняющих веществ, среди других состояний, которые могут быть затронуты стеатозом. Таким образом, этот протокол имеет потенциальное применение в токсикологии, фармакологии и идентификации терапевтических мишеней для лечения заболевания.
При разработке этого протокола одним из наиболее важных этапов является получение стеатогенной смеси: 1 часть пальмитата: 2 части олеата, которая индуцирует стеатоз со 2-го дня(Рисунок 3, Рисунок 4),позволяя гепатоцитам размножаться - несмотря на умеренное снижение показателя жизнеспособности и повышенную смертность(Рисунок 2). Однако снижение жизнеспособности не должно превышать 30-40%, поскольку это может представлять собой токсический эффект, а не тот, который может последовать в долгосрочной перспективе. Стеатоз печеночной области является результатом длительного чрезмерного времени липидов. В этом смысле липиды накапливаются, поначалу, с легкими поражениями на гепатоцитах, как это наблюдается в этой модели. Еще одной особенностью является липидный капельный профиль. При легком стеатозе увеличение размера липидных капель наблюдается во время прогрессирования культуры(рисунок 4E–H). При тяжелом стеатозе размер капель значительно выше по сравнению с легким стеатозом(Рисунок 4I-L),тогда как контрольная часть не показывает изменения размера липидных капель(Рисунок 4A-D).
Предпочтительно хранить как легкую, так и тяжелую стеатогенную жиму при 4 °C в течение недели. После этого рекомендуется приготовить свежую стеатогенную среду. Тем не менее, запас ОА может сохраняться при -20 ° C в течение месяца, тогда как запас PA может храниться при 4 ° C в течение месяца. Использование этих стоковых растворов по истечении предполагаемого времени может представлять риск деградации жирных кислот. Чтобы обеспечить надлежащую концентрацию растворов перед каждым использованием, рекомендуется измерять концентрации жирных кислот с помощью набора для анализа неэтерифицированных жирных кислот (NEFA).
ПА и ОА, а также их соответствующие соли использовались отдельно для индуцирования накопления липидов; однако различия наблюдаются для каждой жирной кислоты16,20. С одной стороны, пальмитат, используемый отдельно, является хорошим индуктором стеатоза. Он индуцирует гибель клеток, резистентность печеночного инсулина, митохондриальную дисфункцию, ретикулярное напряжение16,34,35,36. Однако пальмитат является высокотоксичным16,34,и исходы, ожидаемые от его использования только в культуре, включают более низкую жизнеспособность и более высокую смертность по сравнению со смесью ПА и ОА16,20. С другой стороны, олеат также вызывает стеатоз. Он индуцирует de novo липогенез, резистентность к инсулину37,38и гиперпролиферацию38. Однако исходы, наблюдаемые при олеате, часто мягче по сравнению с пальмитатом и смесью16,20. Это может быть связано с его защитной ролью. Олеат является основным компонентом оливкового масла, ключевым ингредиентом средиземноморской диеты, одной из известных успешных стратегий против MAFLD39.
Этот протокол можно рассматривать как хороший инструмент для изучения стеатоза из-за его воспроизводимости и короткого времени, необходимого для получения результатов. Это в сравнении с использованием экспериментальных моделей МАФЛД, добавляя тот факт, что это не подразумевает этических вопросов, присущих использованию моделей грызунов. Этот протокол позволяет соблюдаться в течение нескольких дней при условии, что стеатогенная среда обновляется каждые 24 ч. Эта модель также является экономически эффективной и обладает широким спектром применения. Он также может быть адаптирован к другим клеточным линиям, не только гепатоцитам, но и к широкому кругу клеток, пораженных переэкспонированием липидов во время ожирения. Одним из ограничений этого протокола является использование клеток HepG2. Поскольку это канцерогенная клеточная линия, она может скрывать или увеличивать некоторые результаты. Однако применение клеток HepG2 в этих типах исследований широко признано из-за его сходства в липидном обмене со здоровыми гепатоцитами40. Использование смеси PA:2OA также может оказаться спорным, поскольку она не полностью напоминает профили NEFA, наблюдаемые в крови пациентов с НАЖБД/МАЖБД41. Другие жирные кислоты, включая линоленовую или стеариновую кислоты, могут быть включены в дальнейшие модификации и усовершенствования этого протокола. Другим ограничением является тот факт, что изучается только один тип клеток, гепатоциты, при отсутствии взаимодействия с другими печеночными клетками, присутствующими в печени, включая синусоидальные эндотелиальные, купферовские, печеночные звездчатые клетки и т. Д., Которые участвуют в прогрессировании МАЖБП. Более того, это модель, индуцированная исключительно стеатозом, без прогрессирования стеатогепатита и фиброза.
В заключение, исследование предоставляет протокол in vitro гепатоцитарного стеатоза, который легко реализуется, воспроизводим и с широким спектром применений при изучении стеатоза, а также функции гепатоцитов в контексте жировой дистрофии печени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Национальной национальной консилией науки и технологии (Conacyt, CB-221137). Адриана Кампос является докторантом в Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, и была поддержана Conacyt (CVU: 1002502).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety cabinet | ESCO Airstream | AC2-452+C2:C26 | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Bottle top filter | Corning, US | 430513 | Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL. |
| Bovine serum albimun (BSA) | Gold Biotechnology, US | A-421-10 | BSA Fatty Acid Free for cell culture |
| Culture media RPMI 1640 | ThermoFisher-Gibco, US | 31800-022 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher-Gibco, US | A4766801 | - |
| Hemocytometer | Marienfeld, DE | 640010 | - |
| HepG2 cell line | ATCC, US | HB-8065 | Hepatocellular carcinoma human cells. |
| Humidified incubator | Thermo Electronic Corporation,US | Model: 3110 | Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%) |
| Inverted microscope Eclipse | NIKON, JPN | Model: TE2000-S | - |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, US | I9030-4L | - |
| Oil Red O Kit | Abcam, US | ab150678 | Kit for histological visualization of neutral fat. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, US | P6148-500G | - |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher-Gibco, US | 15140-122 | Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin |
| pH meter | Beckman, US | Model: 360 PH/Temp/MV Meter | - |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher-Gibco, US | 10010-023 | - |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1253.001 | Non-pyrogenic, sterile, 5 mL |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1254.001 | Non-pyrogenic, sterile, 10 mL |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, US | S5761-1KG | Preparation of culture media |
| Sodium oleate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215879A | - |
| Sodium palmitate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215881 | - |
| Syring filter | Corning, US | 431219 | Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm. |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich, US | T6146-25G | - |
| Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM | Corning, US | 25-052-Cl | - |
| 24 well cell culture cluster | Corning, US | 3524 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
| 96 well cell culture cluster | Corning, US | 3599 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
References
- Younossi, Z. M. Non-alcoholic fatty liver disease - a global public health perspective. Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).
- Younossi, Z., et al. Global perspectives on nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 69 (6), 2672-2682 (2019).
- Eslam, M., et al. A new definition for metabolic dysfunction-associated fatty liver disease: An international expert consensus statement. Journal of Hepatology. 73 (1), 202-209 (2020).
- Eslam, M., Sanyal, A. J., George, J. MAFLD: A consensus-driven proposed nomenclature for metabolic associated fatty liver disease. Gastroenterology. 158 (7), 1999-2014 (2020).
- Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American association for the study of liver diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
- Calzadilla Bertot, L., Adams, L. A. The natural course of non-alcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Science. 17 (5), 774 (2016).
- Reccia, I., et al. Non-alcoholic fatty liver disease: A sign of systemic disease. Metabolism. 72, 94-108 (2017).
- Tomita, K., et al. Free cholesterol accumulation in hepatic stellate cells: Mechanism of liver fibrosis aggravation in nonalcoholic steatohepatitis in mice. Hepatology. 59 (1), 154-169 (2014).
- Byrne, C. D., Targher, G.
- Ipsen, D. H., Lykkesfeldt, J., Tveden-Nyborg, P. Molecular mechanisms of hepatic lipid accumulation in non-alcoholic fatty liver disease. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (18), 3313-3327 (2018).
- Diehl, A. M., Day, C. Cause, pathogenesis, and treatment of nonalcoholic steatohepatitis. New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).
- Zeng, X., et al. Oleic acid ameliorates palmitic acid induced hepatocellular lipotoxicity by inhibition of ER stress and pyroptosis. Nutrition and Metabolism. 17, London. 11 (2020).
- Ore, A., Akinloye, O. A. Oxidative stress and antioxidant biomarkers in clinical and experimental models of non-alcoholic fatty liver disease. Medicina (Kaunas). 55 (2), 26 (2019).
- Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. Oxidative stress, cardiolipin and mitochondrial dysfunction in nonalcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 20 (39), 14205-14218 (2014).
- Aravinthan, A., et al. Hepatocyte senescence predicts progression in non-alcohol-related fatty liver disease. Journal of Hepatology. 58 (3), 549-556 (2013).
- Gomez, M. J., et al. A human hepatocellular in vitro model to investigate steatosis. Chemico Biological Interactions. 165 (2), 106-116 (2007).
- Wu, W. K. K., Zhang, L., Chan, M. T. V. Autophagy, NAFLD and NAFLD-related HCC. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1061, 127-138 (2018).
- Levy, G., Cohen, M., Nahmias, Y. In vitro cell culture models of hepatic steatosis. Methods in Molecular Biology. 1250, 377-390 (2015).
- Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Science. 14 (6), 11963-11980 (2013).
- Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
- Lee, Y., et al. Serial biomarkers of de novo lipogenesis fatty acids and incident heart failure in older adults: The cardiovascular health study. Journal of the American Heart Association. 9 (4), 014119 (2020).
- Alnahdi, A., John, A., Raza, H. Augmentation of glucotoxicity, oxidative stress, apoptosis and mitochondrial dysfunction in Hepg2 cells by palmitic acid. Nutrients. 11 (9), 1979 (2019).
- Chen, X., et al. Oleic acid protects saturated fatty acid mediated lipotoxicity in hepatocytes and rat of non-alcoholic steatohepatitis. Life Sciences. 203, 291-304 (2018).
- Xing, J. H., et al. NLRP3 inflammasome mediate palmitate-induced endothelial dysfunction. Life Sciences. 239, 116882 (2019).
- Yan, H., et al. Insulin-like Growth Factor Binding Protein 7 accelerates hepatic steatosis and insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 46 (12), 1101-1110 (2019).
- Wang, J., Hu, R., Yin, C., Xiao, Y. Tanshinone IIA reduces palmitate-induced apoptosis via inhibition of endoplasmic reticulum stress in Hepg2 liver cells. Fundamental and Clinical Pharmacology. 34 (2), 249-262 (2020).
- Xiao, Z., Chu, Y., Qin, W. IGFBP5 modulates lipid metabolism and insulin sensitivity through activating ampk pathway in non-alcoholic fatty liver disease. Life Sciences. 256, 117997 (2020).
- Avila, G., et al. In vitro effects of conjugated linoleic acid (CLA) on inflammatory functions of bovine monocytes. Journal of Dairy Science. 103 (9), 8554-8563 (2020).
- Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 12093-12101 (2006).
- Oh, J. M., et al. Effects of palmitic acid on TNF-alpha-induced cytotoxicity in SK-Hep-1 cells. Toxicology In Vitro: An International Journal Published in Association with BIBRA. 26 (6), 783-790 (2012).
- Stellavato, A., et al. In vitro assessment of nutraceutical compounds and novel nutraceutical formulations in a liver-steatosis-based model. Lipids in Health and Disease. 17 (1), 24 (2018).
- Pachikian, B. D., et al. Implication of trans-11, trans-13 conjugated linoleic acid in the development of hepatic steatosis. PLoS One. 13 (2), 0192447 (2018).
- Ferreira, T., Rasband, W. Analyze. ImageJ User Guide. , Ch. 30 132-135 (2012).
- Geng, Y., Wu, Z., Buist-Homan, M., Blokzijl, H., Moshage, H. Hesperetin protects against palmitate-induced cellular toxicity via induction of GRP78 in hepatocytes. Toxicology and Applied Pharmacology. , 404 (2020).
- Geng, Y., et al. Protective effect of metformin against palmitate-induced hepatic cell death. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1866 (3), 165621 (2020).
- Sarnyai, F., et al. Effect of cis- and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Science. 21 (7), 2626 (2020).
- Chen, J. W., et al. Tetrahydrocurcumin ameliorates free fatty acid-induced hepatic steatosis and improves insulin resistance in HepG2 cells. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (3), 1075-1085 (2018).
- Burhans, M. S., et al. Hepatic oleate regulates adipose tissue lipogenesis and fatty acid oxidation. Journal of Lipid Research. 56 (2), 304-318 (2015).
- Abenavoli, L., Milanovic, M., Milic, N., Luzza, F., Giuffre, A. M. Olive oil antioxidants and non-alcoholic fatty liver disease. Expert Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 13 (8), 739-749 (2019).
- Nagarajan, S. R., et al. Lipid and glucose metabolism in hepatocyte cell lines and primary mouse hepatocytes: A comprehensive resource for in vitro studies of hepatic metabolism. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 316 (4), 578-589 (2019).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
