Summary
Este protocolo pretende ser una herramienta para estudiar la esteatosis y los cambios moleculares, bioquímicos, celulares producidos por la sobreexposición de los hepatocitos a los lípidos in vitro.
Abstract
La enfermedad del hígado graso asociada a la disfunción metabólica (MAFLD), anteriormente conocida como enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), es la enfermedad hepática más prevalente en todo el mundo debido a su relación con la obesidad, la diabetes tipo 2 y la dislipidemia. La esteatosis hepática, la acumulación de gotas lipídicas en el parénquima hepático, es una característica clave de la enfermedad que precede a la inflamación observada en la esteatohepatitis, la fibrosis y la enfermedad hepática en etapa terminal. La acumulación de lípidos en los hepatocitos podría interferir con el metabolismo adecuado de los xenobióticos y las moléculas endógenas, así como inducir procesos celulares que conduzcan al avance de la enfermedad. Aunque el estudio experimental de la esteatosis se puede realizar in vivo, losenfoques in vitro para el estudio de la esteatosis son herramientas complementarias con diferentes ventajas. El cultivo de hepatocitos en medio condicionado por sobrecarga lipídica es una excelente opción reproducible para el estudio de la esteatosis hepática que permite la identificación de procesos celulares relacionados con la acumulación de lípidos, como tensiones oxidativas y reticulares, autofagia, proliferación, muerte celular, etcétera, así como otras pruebas que incluyen la eficacia de los fármacos y las pruebas toxicológicas, entre otras muchas posibles aplicaciones. Aquí, se tuvo como objetivo describir la metodología de cultivo de células de hepatocitos en medio condicionado por sobrecarga lipídica. Las células HepG2 se cultivaron en medio RMPI 1640 acondicionado con palmitato de sodio y oleato de sodio. Es importante destacar que la proporción de estos dos lípidos es crucial para favorecer la acumulación de gotas lipídicas, al tiempo que mantiene la proliferación celular y una tasa de mortalidad moderada, como ocurre en el hígado durante la enfermedad. Se muestra la metodología, a partir de la preparación de las existencias de solución lipídica, mezcla, adición al medio y cultivo de hepatocitos. Con este enfoque, es posible identificar gotas de lípidos en los hepatocitos que son fácilmente observables por tinción de O rojo aceite, así como curvas de tasas de proliferación / mortalidad.
Introduction
El hígado graso asociado con la disfunción metabólica es altamente prevalente en todo el mundo1,2; se estima que hasta el 25% de la población se ve afectada3. Esta enfermedad anteriormente conocida como enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), ha actualizado su nomenclatura a disfunción metabólica asociada a la enfermedad del hígado graso (MAFLD) para reflejar con precisión la patogénesis relacionada con la obesidad, la resistencia a la insulina, la diabetes tipo 2 y la dislipidemia, así como los posibles manejos de la enfermedad3,4.
Independientemente del nombre, la enfermedad incluye un amplio espectro de cambios histopatológicos caracterizados por una acumulación anormalmente alta de lípidos en el hígado (>5% de grasa en los hepatocitos5) y podría progresar a través de la acumulación de lípidos típicamente encontrada en la esteatosis simple a esteatohepatitis, que a su vez podría conducir al desarrollo de fibrosis, cirrosis, carcinoma hepatocelular e insuficiencia hepática5,6,7,8. Debido a su creciente prevalencia, se espera que MAFLD se convierta en la primera indicación de trasplante hepático y la principal causa de carcinoma hepatocelular9.
Aunque se ha considerado como una forma benigna o leve de enfermedad del hígado graso, la esteatosis hepática es de hecho la clave metabólica en MAFLD10. Diferentes vías metabólicas se ven afectadas por la acumulación de lípidos en el hígado, incluyendo pero no limitado a la síntesis de lípidos, la exportación y el metabolismo10. La resistencia a la insulina, el estrés oxidativo, el estrés reticular y la disfunción celular están fuertemente asociados a la lipotoxicidad hepática11,12. Por otro lado, los hepatocitos grasos son el objetivo de las especies reactivas de oxígeno, haciendo metabolitos como peróxidos lipídicos, carbonilos proteicos y aductos de ácidos nucleicos13. A nivel celular, los hepatocitos grasos pueden sufrir daño mitocondrial14,senescencia celular15,apoptosis 16,piroptosis12y autofagia17,entre otros eventos.
Los hepatocitos son altamente responsables del metabolismo, la desintoxicación y la síntesis de una amplia gama de moléculas. Muchas de estas funciones podrían verse comprometidas por la acumulación de lípidos observada en la esteatosis. Por lo tanto, es de gran importancia contar con herramientas reproducibles que permitan una evaluación precisa de la esteatosis. En este sentido, los modelos in vitro son fácilmente aplicables y altamente reproducibles. La esteatosis in vitro se ha utilizado con diferentes objetivos16,18,19. Las células HepG2 son ampliamente utilizadas como línea celular de hepatocitos. Tiene ventajas como ser fácil de cultivar y bien caracterizado. Quizás, la única desventaja de las células HepG2 es el hecho de que es una línea celular cancerígena, por lo que esto debe tenerse en cuenta al analizar los resultados. Aquí, se muestra la aplicación de una mezcla de ácidos grasos muy utilizada en cultivo celular: ácido palmítico (PA) y ácido oleico (OA). Tanto la AP como la OA ofrecen resultados diferentes en la cultura20. PA (C 16:0) es el ácido graso saturado más común obtenido de la dieta16. La AF es considerada como un biomarcador de lipogénesis de novo,un paso crucial en el desarrollo de NAFLD21. La AP ha demostrado ser altamente tóxica22; por lo tanto, es posible que no se recomiende inducir esteatosis in vitro. OA (C 18:1) es un ácido graso monoinsaturado. A diferencia de la AP, se ha sugerido que la OA posee propiedades antiinflamatorias y antioxidantes, pudiendo contrarrestar la PA12. Tanto la AF como la OA son los principales ácidos grasos presentes en los triglicéridos, independientemente del estado de salud o enfermedad16. La Tabla 1 proporciona ejemplos del cultivo de hepatocitos con AF, OA y su mezcla, así como los resultados informados12,23,24,25,26,27. Otros ácidos grasos también se han utilizado en el cultivo de hepatocitos, incluyendo el ácido esteárico (C 18:0)28,29,30,ácido linoleico (C 18:1)28,30,31 y sus conjugados (CLA)28,32,ácido palmitoleico (C 16:1)29. Sin embargo, su uso se informa con menos frecuencia en la literatura, tal vez porque su abundancia hepática es menor que PA y OA16.
En conjunto, ambos ácidos grasos se asemejan a la esteatosis in vitro,proporcionando células proliferantes, con mayor muerte celular y menor viabilidad en comparación con las condiciones de control. Vale la pena mencionar que las respectivas sales de estos ácidos grasos están disponibles y también se pueden usar. Uno de los principales problemas a la hora de valorar la sobrecarga lipídica en cultivo de células hepatocitarias se da en la diferenciación entre los modelos toxicológicos y el modelo que mejor representa la esteatosis. Muchos modelos se pueden contabilizar en el primer caso. De hecho, el uso de AF solo podría considerarse entre ellos, y la alta mortalidad es el resultado más evidente12,16,23,24,25,26,27. El uso de dosis altas incluso en el caso de OA también puede considerarse como un modelo toxicológico. El protocolo aquí mostrado es mayor acorde con el desarrollo de esteatosis ya que muestra baja mortalidad en comparación con la observada en otros modelos y permite seguirlo durante varios días con acumulación progresiva de lípidos tal y como ocurre en NAFLD. La posibilidad de evaluar la esteatosis leve y grave a través de condiciones experimentales se considera otra ventaja.
| Ácidos grasos | Condiciones | Resultados | Referencia | ||
| PAPÁ | Concentración: 200 μM | Acumulación de lípidos | Yan et al, 201925. | ||
| Tiempo de exposición: 24 h | Daño a hepatocitos | ||||
| Elevación de transaminasas | |||||
| PAPÁ | Concentración: 50, 100 y 200 μM | Acumulación de lípidos | Xing et al, 201924. | ||
| Tiempo de exposición: 24 h | |||||
| PAPÁ | Concentración: 250 μM, 500 μM, 750 μM y 1.000 μM | Acumulación de lípidos | Wang et al, 202026. | ||
| Tiempo de exposición: 24 h | Reducción progresiva de la viabilidad celular | ||||
| Mezcla de OA/PA | Concentración: 1 mM | Acumulación de lípidos | Xiao et al, 202027. | ||
| Tiempo de exposición: 24 h | No reporta lipotoxicidad | ||||
| Precio: 2OA:1PA | |||||
| Mezcla de OA/PA | Primera estimulación con 200 μM y 400 μM de PA y luego segunda estimulación con 200 μM de OA | Acumulación de lípidos. | Zeng et al, 202012. | ||
| Concentración: 400 μM PA: 200 μM OA | La evidencia de lipotoxicidad inducida por AF se redujo mediante la estimulación de la OA. | ||||
| Precio: 2PA:1OA | |||||
| Tiempo de exposición: 24 h | |||||
| Mezcla de OA/PA | Concentración: 400 μM PA: 200 μM OA | Acumulación de lípidos | Chen et al, 201823. | ||
| Precio: 2PA:1OA | |||||
| Tiempo de exposición: 24 h | |||||
| Mezcla de OA/PA | Concentración: 50 y 500 μM | Generación de dos tipos de esteatosis: esteatosis leve y esteatosis severa. |
Campos y Guzmán 2021 | ||
| Precio: 2PA:1OA | Simula la exposición crónica de la sobrecarga lipídica | ||||
| Tiempo de exposición: 24 h, 2 días, 3 días y 4 días. | |||||
Tabla 1. Cultivo de hepatocitos en condiciones esteatogénicas. La tabla presenta el tipo de ácido graso utilizado, las condiciones mantenidas y los resultados observados en el cultivo de hepatocitos. PA: Ácido palmítico. OA: Ácido oleico.
Finalmente, este modelo es aplicable no solo al estudio de la esteatosis y el hígado graso, sino también a las vías metabólicas hepáticas, sintéticas y de desintoxicación en el contexto de la esteatosis. Además, la esteatosis inducida in vitro podría proporcionar evidencia para la identificación de marcadores potenciales de la enfermedad, así como objetivos terapéuticos.
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Protocol
1. Preparación de medio estándar y acondicionado
- Para preparar el RPMI 1640 estándar, complemente el medio de cultivo RPMI 1640 con 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS, previamente inactivado por calor) y 1% (v/v) de solución de penicilina-estreptomicina. Conservar el medio a 4 °C.Esterilizar con filtros de 0,22 μm.
- Para preparar la solución de caldo de palmitato, prepare una solución de palmitato de 50 mM en el estándar RPMI 1640 previamente suplementada con 1% de albúmina sérica bovina (libre de lípidos). Un volumen de 5-10 ml de este stock será suficiente. Esterilizar la solución de material mediante el uso de filtros de 0,22 μm. Conservar a 4 °C protegido de la luz durante un tiempo límite de 1 mes.
- Para preparar la solución de caldo de oleato, prepare una solución de oleato de 50 mM en el estándar RPMI 1640 previamente suplementada con 1% de albúmina sérica bovina (libre de lípidos). Un volumen de 10 ml será suficiente. Esterilizar la solución de material mediante el uso de filtros de 0,22 μm. Conservar a -20 °C protegido de la luz durante un plazo de hasta 1 mes.
- Para preparar el medio esteatogénico a partir de las existencias preparadas previamente, prepare un palmitato de 1 parte: medio esteatogénico de oleato de 2 partes en dos niveles posibles: esteatosis leve y grave.
- Esteatosis leve: Preparar 100 ml de una mezcla de palmitato de 1 parte: oleato de 2 partes (50 μM) en RPMI 1640 estándar. Esterilizar mediante filtros de 0,22 μm. Conservar a 4 °C durante un tiempo de hasta 1 semana.
- Esteatosis severa: Prepare 100 ml de una mezcla de palmitato de 1 parte: oleato de 2 partes (500 μM) en RPMI 1640 estándar. Esterilizar mediante filtros de 0,22 μm. Conservar a 4 °C durante un tiempo de hasta 1 semana.
- Preparación alternativa para las soluciones de stock.
- Prepare ambas soluciones de caldo utilizando los ácidos grasos respectivos mediante el uso de albúmina lipídica libre como se indicó anteriormente.
- Cuando carezca de albúmina lipídica libre, use sales de palmitato y oleato.
- Disuelva el palmitato o el oleato en 2 ml de etanol absoluto y luego mezcle el volumen final del RPMI 1640 estándar (5-10 ml). Disolver el oleato directamente agitando en el medio de cultivo estándar RPMI 1640.
- Permitir la evaporación del etanol incubando en un baño de agua a 70 °C; Homogeneizar.
- En todos los casos, esterilice ambas soluciones de stock utilizando filtros de 0,22 μm. Almacene la solución de caldo de palmitato a 4 °C y la solución de caldo de oleato a - 20 °C. Proteja ambas soluciones de la luz. Estas soluciones son estables durante 1 mes.
2. Pre-cultura
- Seed 100.000 células HepG2 por pozo en una placa de 24 pozos. Agregue 1 ml de RPMI 1640 estándar.
- Preincubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h, permitiendo la unión celular.
3. Cultivo esteatogénico
- Después del precultivo, deseche el medio estándar RPMI 1640 y agregue el medio esteatogénico en consecuencia.
- Deseche el sobrenadante y agregue el medio esteatogénico fresco cada 24 h.
4. Evaluación de la viabilidad y la mortalidad
- Seed 100.000 células HepG2 por pozo en una placa de 24 pozos. Agregue 1 ml de RPMI 1640 estándar.
- Preincubar durante 24 h a 37 °C y 5% CO2.
- Cambie el medio estándar RPMI 1640 por el medio esteatogénico.
- Incubar durante 24 h, 2 días, 3 días y 4 días refrescando el medio esteatogénico cada 24 h.
- Después del tiempo apropiado, deseche el sobrenadante.
- Separe las células del pozo agregando 500 μL de Tripsina-EDTA al 0,05%. Incubar durante 5 min a 37 °C y 5% CO2.
- Recoge las células resuspendidas en un microtubo.
- Centrifugar a 300 x g y desechar el sobrenadante.
- Agregue 200 μL de RPMI 1640 estándar y resuspenda las células.
- Añadir 15 μL de solución de azul de tripano al 0,4% en un microtubo fresco. Mezclar con 15 μL de la suspensión celular anterior.
- Cuente las células teñidas y no teñidas en un hemocitómetro.
- Calcule las tasas de viabilidad y mortalidad en consecuencia.
Viabilidad =
Mortalidad =
5. Tinción lipídica con Oil-Red O
- Coloque una cubierta de cultivo celular en cada pozo en una placa de 24 pozos.
- Seed 100.000 células HepG2 por pozo. Agregue 1 ml de RPMI 1640 estándar.
- Preincubar a 37 °C y 5% co2 durante 24 h.
- Cambie el medio estándar RPMI 1640 por el medio esteatogénico.
- Incubar durante 24 h, 2 días, 3 días y 4 días, refrescando el medio esteatogénico cada 24 h.
- Después del tiempo apropiado, deseche el sobrenadante.
- Lavar con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Deseche el sobrenadante.
- Fijar con 1 mL de paraformaldehído al 4% en PBS.
- Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
- Desechar el exceso de paraformaldehído.
- Enjuague las células con 1 ml de agua destilada.
- Añadir 1 ml de isopropanol al 70% e incubar durante 5 min.
- Deseche el exceso de isopropanol. Un lavado de PBS no es necesario en este momento.
- Añadir 1 ml de solución de O rojo aceite e incubar durante 30 min.
- Deseche el exceso de la solución de O rojo aceite.
- Enjuague con 1 ml de agua destilada.
- Añadir 500 μL de solución de hematoxilina. Incubar durante 3 min.
- Deseche el exceso de solución de hematoxilina.
- Enjuague con 1 ml de agua destilada.
- Observar bajo el microscopio a un aumento de 400x (Objetivo 40x, Ocular 10x).
6. Evaluación morfométrica del contenido lipídico
- Seleccione y capture aleatoriamente fotografías de 10 campos ópticos del área completa del pozo. Repetir para cada pozo.
- Evalúe el porcentaje de área teñida de rojo utilizando la herramienta Umbral de color en el software ImageJ de acuerdo con Ferreira y Rasband33.
- Compare el área teñida con el área completa del campo óptico utilizando la herramienta Analizar partículas en el software ImageJ según Ferreira y Rasband33.
- Calcule el porcentaje promedio de cada pozo.
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Representative Results
Los hepatocitos cultivados en el medio esteatogénico muestran crecimiento en toda la superficie del pozo; sin embargo, los hepatocitos grasos muestran una tasa de crecimiento más baja en comparación con las células cultivadas en medio de control. La relación y concentración propuesta de OA y PA, garantizan la supervivencia celular durante el cultivo. La siembra de 1 x 105 células por pozo en placas de 24 pozos proporciona una confluencia óptima como se muestra en la Figura 1.
La viabilidad en células cultivadas fue menor en los grupos esteatogénicos, Leve y Grave, en comparación con las condiciones de control. De hecho, la viabilidad disminuyó progresivamente a medida que aumentaba el tiempo de cultivo, alcanzando el más bajo del 60% a los 4 días en la esteatosis severa(Figura 2A). En consecuencia, la tasa de mortalidad fue mayor en los hepatocitos cultivados en las condiciones esteatogénicas, y aumentó progresivamente con el tiempo de exposición a los lípidos (Figura 2B). El número de células aumentó progresivamente como resultado de la proliferación(Figura 2C). Sin embargo, la tasa de proliferación fue menor en la esteatosis leve a los 3 días y 4 días. Por el contrario, la esteatosis severa se asoció con una menor proliferación a partir de las 24 h.
Las células HepG2 cultivadas en el protocolo propuesto muestran la característica más importante de la esteatosis, la acumulación intracelular de lípidos. La tinción de células con Aceite Rojo O permitió observar al menos un aumento de dos veces de las gotas lipídicas en células cultivadas en condiciones esteatogénicas como se muestra en la Figura 3 y la Figura 4. La grasa intracelular aumentó según el tiempo de exposición del cultivo en el medio esteatogénico (Figura 3). En la esteatosis leve, los contenidos de lípidos aumentaron a partir del día 2, mientras que en la esteatosis grave, fueron significativamente altos a partir de las 24 h.
Figura 1: Crecimiento celular. Cultivo de hepatocitos HepG2 en control (Figura 1A-D) y condiciones esteatogénicas leves (Figura 1E-H). Las fotografías muestran el crecimiento de 1-4 días de cultura. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Tasas de viabilidad y mortalidad. (A) Viabilidad. B)Mortalidad. (C) Número de celda. El cultivo de hepatocitos HepG2 en condiciones control y esteatogénicas se evaluó para determinar la viabilidad y las tasas de mortalidad mediante tinción de azul de tripano. Media ± SD. Dos experimentos independientes por triplicado por tiempo de cultivo. Círculos: condiciones de control; Cuadrados: esteatosis leve; Triángulos: esteatosis severa. Se utilizó ANOVA unidireccional para comparar entre condiciones y tiempo de cultivo para la misma condición. p < 0,05 se consideró significativo: "*"- control vs esteatosis grave; "§"- control vs esteatosis leve; "¶"- esteatosis leve vs severa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Acumulación de lípidos. El cultivo de hepatocitos HepG2 en condiciones control y esteatogénicas se evaluó para determinar el contenido de lípidos mediante tinción de O rojo aceite seguido de un análisis morfométrico utilizando el software ImageJ (NIH, EE. UU.). Porcentaje de lípidos se refiere al porcentaje de área teñida por Oil-Red O (lípidos) considerando el 100% como el área completa de cada campo óptico analizado. Media ± SD. Dos experimentos independientes por triplicado por tiempo de cultivo. Círculos: condiciones de control; Cuadrados: esteatosis leve; Triángulos: esteatosis severa. Se utilizó ANOVA unidireccional para comparar entre condiciones y tiempo de cultivo para la misma condición. p < 0,05 se consideró significativo: "*"- control vs esteatosis grave; "§"- control vs esteatosis leve; "¶"- esteatosis leve vs severa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Esteatosis in vitro. Se evaluaron las condiciones de cultivo de hepatocitos hepG2 en control (Figura 4A-D), esteatogénicos leves (Figura 4E-H) y esteatogénicos severos (Figura 4I-L) para el contenido de lípidos por tinción de O rojo aceite. Las fotografías muestran gotas lipídicas de hepatocitos de 24 h a 4 días. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo pretende proporcionar una estrategia para estudiar la esteatosis in vitro. El cultivo celular es una herramienta poderosa para estudiar aspectos celulares, moleculares, bioquímicos y toxicológicos de las células expuestas a diferentes condiciones. Con este enfoque, la esteatosis se puede visualizar no solo como una etapa de la enfermedad compleja que es MAFLD, sino también como la sobreexposición de los hepatocitos a los lípidos y los posibles resultados resultantes de dicha exposición. Por lo tanto, su aplicación no se limita a la fisiopatología de MAFLD, sino al hecho de que los pacientes con hígado graso están expuestos a medicamentos terapéuticos, contaminantes, entre otras afecciones que podrían verse afectadas por la esteatosis. Por lo tanto, este protocolo tiene aplicaciones potenciales en toxicología, farmacología y la identificación de dianas terapéuticas para el tratamiento de la enfermedad.
En el desarrollo de este protocolo, uno de los pasos más críticos es la preparación de la mezcla esteatogénica: 1 parte de palmitato: 2 partes de oleato, que induce la esteatosis desde el día 2(Figura 3, Figura 4),permitiendo que los hepatocitos proliferen, a pesar de una modesta disminución en la tasa de viabilidad y un aumento de la tasa de mortalidad(Figura 2). Sin embargo, la disminución de la viabilidad no debe exceder el 30%-40%, ya que eso podría representar un efecto tóxico en lugar de uno que podría seguirse a largo plazo. La esteatosis hepática es el resultado de una sobreexposición a largo plazo a los lípidos. En este sentido, los lípidos se acumulan, en un primer momento, con afecciones leves sobre los hepatocitos, tal y como se observa en este modelo. Otra característica es el perfil de gotas lipídicas. En la esteatosis leve, se observa un aumento de tamaño en las gotas lipídicas durante la progresión del cultivo (Figura 4E-H). En la esteatosis grave, el tamaño de las gotas es considerablemente mayor en comparación con la esteatosis leve (Figura 4I-L), mientras que los controles no muestran cambios en el tamaño de las gotas lipídicas (Figura 4A-D).
Es preferible almacenar los medios esteatogénicos leves y severos a 4 °C durante un hasta una semana. Después, se recomienda preparar medio esteatogénico fresco. Sin embargo, el stock de OA se puede conservar a -20 °C durante un mes, mientras que el stock de PA se puede almacenar a 4 °C durante un mes. El uso de estas soluciones de stock después del tiempo sugerido podría representar un riesgo de degradación de los ácidos grasos. Para garantizar la concentración adecuada de las soluciones antes de cada uso, se recomienda medir las concentraciones de ácidos grasos mediante un kit de ensayo de ácidos grasos no esterificados (NEFA).
PA y OA, así como sus respectivas sales, se han utilizado por separado para inducir la acumulación de lípidos; sin embargo, se observan diferencias por cada ácido graso16,20. Por un lado, el palmitato utilizado solo es un buen inductor de la esteatosis. Induce muerte celular, resistencia hepática a la insulina, disfunción mitocondrial, estrés reticular16,34,35,36. Sin embargo, el palmitato es altamente tóxico16,34,y los resultados esperados de usarlo solo en cultivo incluyen una menor viabilidad y una mayor mortalidad en comparación con la mezcla de AF y OA16,20. Por otro lado, el oleato también induce la esteatosis. Induce lipogénesis de novo, resistencia a la insulina37,38e hiperproliferación38. Sin embargo, los resultados observados con oleato son a menudo más leves en comparación con el palmitato y la mezcla16,20. Esto podría estar relacionado con su papel protector. El oleato es el componente principal del aceite de oliva, un ingrediente clave en la dieta mediterránea, una de las estrategias exitosas bien conocidas contra MAFLD39.
Este protocolo podría considerarse como una buena herramienta para estudiar la esteatosis debido a su reproducibilidad y al poco tiempo que se tarda en obtener resultados. Esto es en comparación con el uso de modelos experimentales de MAFLD, agregando el hecho de que no implica los problemas éticos inherentes al uso de modelos de roedores. Este protocolo permite seguirlo durante varios días, siempre que el medio esteatogénico se refresque cada 24 h. Este modelo también es rentable y posee una amplia gama de aplicaciones. También se puede ajustar a otras líneas celulares, no solo a los hepatocitos, sino a una amplia gama de células afectadas por la sobreexposición lipídica durante la obesidad. Una de las limitaciones de este protocolo es el uso de células HepG2. Dado que esta es una línea celular cancerígena, podría ocultar o aumentar algunos resultados. Sin embargo, la aplicación de células HepG2 en este tipo de estudios es ampliamente aceptada debido a su parecido en el metabolismo lipídico con hepatocitos sanos40. El uso de la mezcla PA:2OA también podría resultar controvertido ya que no se parece completamente a los perfiles de NEFA observados en la sangre de pacientes con NAFLD/MAFLD41. Otros ácidos grasos, incluidos los ácidos linolénico o esteárico, podrían incluirse en otras modificaciones y mejoras de este protocolo. Otra limitación es el hecho de que solo se estudia un tipo de célula, los hepatocitos, que carecen de la interacción con otras células hepáticas presentes en el hígado, incluidas las células endoteliales sinusoidales, Kupffer, estrelladas hepáticas, etc., que participan en la progresión de MAFLD. Además, este es un modelo para inducir esteatosis exclusivamente, sin progresión a esteatohepatitis y fibrosis.
En conclusión, el estudio proporciona un protocolo in vitro de esteatosis de hepatocitos que es fácil de implementar, reproducible y con una amplia gama de aplicaciones en el estudio de la esteatosis, así como la función de los hepatocitos en el contexto del hígado graso.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). Adriana Campos es estudiante de doctorado en el Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, y contó con el apoyo del Conacyt (CVU: 1002502).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety cabinet | ESCO Airstream | AC2-452+C2:C26 | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Bottle top filter | Corning, US | 430513 | Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL. |
| Bovine serum albimun (BSA) | Gold Biotechnology, US | A-421-10 | BSA Fatty Acid Free for cell culture |
| Culture media RPMI 1640 | ThermoFisher-Gibco, US | 31800-022 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher-Gibco, US | A4766801 | - |
| Hemocytometer | Marienfeld, DE | 640010 | - |
| HepG2 cell line | ATCC, US | HB-8065 | Hepatocellular carcinoma human cells. |
| Humidified incubator | Thermo Electronic Corporation,US | Model: 3110 | Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%) |
| Inverted microscope Eclipse | NIKON, JPN | Model: TE2000-S | - |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, US | I9030-4L | - |
| Oil Red O Kit | Abcam, US | ab150678 | Kit for histological visualization of neutral fat. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, US | P6148-500G | - |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher-Gibco, US | 15140-122 | Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin |
| pH meter | Beckman, US | Model: 360 PH/Temp/MV Meter | - |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher-Gibco, US | 10010-023 | - |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1253.001 | Non-pyrogenic, sterile, 5 mL |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1254.001 | Non-pyrogenic, sterile, 10 mL |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, US | S5761-1KG | Preparation of culture media |
| Sodium oleate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215879A | - |
| Sodium palmitate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215881 | - |
| Syring filter | Corning, US | 431219 | Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm. |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich, US | T6146-25G | - |
| Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM | Corning, US | 25-052-Cl | - |
| 24 well cell culture cluster | Corning, US | 3524 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
| 96 well cell culture cluster | Corning, US | 3599 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
References
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