Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הערכת תגובות חיסוניות נשימתיות לשפעת המופילוס

Published: June 29, 2021 doi: 10.3791/62572
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 2,4, 5, 1,2
1Monash Lung and Sleep, Monash Medical Centre, 2Monash University Department of Medicine, Monash Medical Centre, 3Flow Cytometry Science Technology Platform, Francis Crick Institute, 4Clinical Immunology, Monash Medical Centre, 5Department of Biochemistry and Molecular Biology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University

Summary

המופילוס אינפלואנזה משרה דלקת בדרכי הנשימה. מאמר זה יתמקד בשימוש בציטומטריה של זרימה ובמיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להגדיר תגובות חיסוניות של פאגוציטים ולימפוציטים בתגובה לחיידק זה.

Abstract

המופילוס אינפלואנזה (Hi) הוא חיידק נפוץ המצוי במגוון מצבים נשימתיים. ניתן להשתמש במגוון מבחנים/טכניקות שונות כדי להעריך את התגובה החיסונית/דלקתית הנשימתית לחיידק זה. ציטומטריה של זרימה ומיקרוסקופיה קונפוקלית הן טכנולוגיות מבוססות פלואורסצנציה המאפשרות אפיון מפורט של תגובות ביולוגיות. ניתן להשתמש בצורות שונות של אנטיגן Hi, כולל רכיבי דופן התא, תכשירים מומתים/מושתקים וחיידקים חיים. היי הוא חיידק חזק הדורש מדיה מועשרת אך בדרך כלל קל לגדל אותו בסביבות מעבדה סטנדרטיות. דגימות רקמה לגירוי עם Hi עשויות להתקבל מדם היקפי, ברונכוסקופיה או ריאה כריתה (למשל, בחולים העוברים ניתוח לטיפול בסרטן ריאות). ניתן להעריך באופן מקיף את תפקוד המקרופאגים והנויטרופילים באמצעות ציטומטריה של זרימה עם מגוון פרמטרים שנמדדו, כולל פאגוציטוזה, מיני חמצן תגובתי וייצור ציטוקינים תוך-תאיים. ניתן להעריך באופן ספציפי את תפקוד הלימפוציטים (לדוגמה, תפקוד תאי T ותאי NK) באמצעות ציטומטריית זרימה, בעיקר לייצור ציטוקינים תוך-תאיים. זיהום היי הוא גורם רב עוצמה לייצור מלכודות חוץ-תאיות, הן על ידי נויטרופילים (NETs) והן על ידי מקרופאגים (METs). מיקרוסקופיה קונפוקלית היא ללא ספק הדרך האופטימלית ביותר להעריך ביטוי NET ו- MET, אשר עשוי לשמש גם להערכת פעילות פרוטאזות. ניתן להעריך את חסינות הריאות להמופילוס אינפלואנזה באמצעות ציטומטריה של זרימה ומיקרוסקופיה קונפוקלית.

Introduction

שפעת המופילוס (Hi) היא חיידק קומנסלי רגיל הנמצא בלוע של רוב המבוגרים הבריאים. היי יכולה להיות בעלת קפסולת רב-סוכר (סוגים A-F, למשל, סוג B או HiB) או חסרת קפסולה ואינה ניתנת להקלדה (NTHi)1. קולוניזציה של הרירית עם חיידק זה מתחילה בילדות המוקדמת, ויש תחלופה של זנים מתיישבים שונים2. חיידק זה מסוגל גם לפלישה של דרכי הנשימה העליונות והתחתונות; בהקשר זה, הוא עשוי לגרום להפעלת התגובה החיסונית ולדלקת 3,4. תגובה דלקתית זו עלולה לגרום למחלות קליניות ולתרום למגוון מצבים נשימתיים חשובים, כולל סינוסיטיס, דלקת אוזניים, ברונכיטיס, סיסטיק פיברוזיס, דלקת ריאות ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD). רוב התנאים האלה נובעים מזנים NTHi2. מאמר זה יתאר שיטות להערכת תגובות חיסוניות נשימתיות ל-Hi באמצעות ציטומטריה של זרימה ומיקרוסקופיה קונפוקלית.

השיטות המתוארות להלן הותאמו מטכניקות מבוססות היטב ששונו כדי להעריך את התגובה הדלקתית ל- Hi. הבחירה של צורה אנטיגנית מתאימה של היי היא חלק מרכזי בהערכה זו. תכשירים אנטיגניים נעים בין רכיבי דופן התא לחיידקים חיים. כדי לקבוע ולתקנן בדיקות, השימוש בדגימות דם היקפיות עשוי להיות מועיל מאוד בהתחלה.

ציטומטריה של זרימה מאפשרת מדידה של מגוון פרמטרים ומבחנים פונקציונליים מדגימה אחת ברמה התאית. לטכניקה זו יש יתרון בכך שניתן להעריך תגובות תאיות ספציפיות (למשל, ייצור של מיני חמצן תגובתי (ROS) או ייצור ציטוקינים תוך-תאיים) בהשוואה לשיטות כלליות יותר אחרות כגון בדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA) או ELISspot.

מלכודות חוץ-תאיות מבוטאות על-ידי נויטרופילים (NETs)5,6,7 ועל-ידי תאים אחרים כגון מקרופאגים (METs)8. הם מזוהים יותר ויותר כתגובה דלקתית מרכזית, במיוחד בזיהום בריאה9. הם עשויים להיות מוערכים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית. טכניקה זו מאפשרת זיהוי סופי של NETs/METs ומבדילה את הביטוי שלהם מצורות אחרות של מוות תאי6.

גם ציטומטריה של זרימה וגם מיקרוסקופיה קונפוקלית הן בדיקות מבוססות פלואורסצנציה. הצלחתם תלויה בפרוטוקולי מאמץ אופטימליים של דגימות ביולוגיות. שיטות אלה אכן לוקחות קצת זמן ללמוד ודורשות מומחיות פיקוח מתאימה. המכשירים המעורבים הם גם יקרים הן לרכישה והן להפעלה. ההגדרה האופטימלית לשימושם כוללת אוניברסיטאות גדולות ובתי חולים להפניה שלישונית.

השיטות המשמשות בפרוטוקול זה ניתנות להעברה לחקר אורגניזמים דומים אחרים המעורבים במחלות בדרכי הנשימה (למשל, מוקסרלה קטרליס ודלקת ריאות סטרפטוקוקוס). NTHi גם אינטראקציה עם חיידקים נשימתיים נפוצים אחרים10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

עבודה זו אושרה על ידי ועדת האתיקה למחקר אנושי של בריאות מונש. הפרוטוקול תואם את הנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי.

1. הכנה אנטיגנית

הערה: ניתן להשתמש בשלושה תכשירים אנטיגניים שונים כדי להעריך את התגובה החיסונית ל-Hi. אלה הם 1) מרכיב תת-תאי (בדרך כלל מדופן התא החיידקי); 2) חיידקים מומתים ומומתים; ו-3) חיידקים חיים. לקבוע את השימוש בכל תכשיר אנטיגני לפני תחילת כל הניסויים.

  1. רכיבים תת-תאיים
    1. להשיג רכיבים תת-תאיים ממקורות, כולל תכשירים מסחריים, רכיבים שפותחו בתוך החברה ו/או מחוקרים אחרים.
      הערה: ניתן להשתמש ברכיבים תת-תאיים המגיעים בדרך כלל מדופן תא החיידק וכוללים חלבונים בעלי קרום חיצוני כגון P6 וליפוליגוסכריד (LOS)11,12. רכיבים תת-תאיים אלה נגזרים בדרך כלל במרכזים מיוחדים. התיאור של איך הם נעשים הוא מעבר להיקף של מאמר זה. מומלץ ליצור קשר ישיר עם מומחים בתחום זה כדי להשיג רכיבים אלה.
  2. חיידקים מומתים/מושתקים
    1. השיגו את החיידקים מהדגימה המתאימה (למשל, כיח או ברונכוסקופיה). אשר את הזן כ - H. influenzae באמצעות מעבדה מיקרוביולוגית מתאימה. בצע הקלדה של דגימות H. influenzae כדי לאשר שהן אינן ניתנות להקלדה (על ידי מעבדה מיקרוביולוגית מומחית).
    2. כדי להשיג אנטיגן מייצג, השתמש במספר זני NTHi (לפחות 5, כל אחד בערך באותה כמות) כדי ליצור אנטיגן במאגר. אחסנו את הזנים בטמפרטורה של -70°C בציר גליצרול בצינורות מיקרוצנטריפוגה.
      הערה: בניסוי זה נעשה שימוש בעשרה זנים שונים.
    3. מפשירים את הזנים (צינור מיקרוצנטריפוגה אחד בכל פעם) החוצה על צלחות אגר שוקולד וגדלים בן לילה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. הוסיפו את החיידקים ל-500 μL של מי מלח עם אגירת פוספטים (PBS) ושטפו אותם פעמיים (סובבו ב-300 x גרם למשך 5 דקות). השתמש בתקן MacFarland 10 או בספקטרופוטומטר13 כדי לאליקוט NTHi לריכוז של10 8 מ"ל (באמצעות מיכל 5 מ"ל או שווה ערך).
    4. השבת את החיידקים בחום על ידי הצבתם באמבט מים בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    5. סוניקציה של החיידקים באמצעות הגדרת סוניקציה רציפה במהירות נמוכה-בינונית למשך 30 שניות.
    6. Aliquot את הנפח המתאים של דגימות לתוך צינורות microcentrifuge. עבור דגימה של 108 מ"ל, השתמש aliquots של 50 μL (כלומר, 20 דגימות למ"ל), להקפיא אותם ב -70 °C עד נדרש14.
  3. חיידקים חיים
    1. ראשית, אפיינו חיידקים חיים כפי שצוין בשלב 1.2.1. השתמש בזן אחד מאופיין היטב. ודא כי הזן מאוחסן גם בציר גליצרול ב -70 מעלות צלזיוס כעתודה.
    2. לגדל את החיידקים על מדיה מועשרת כגון צלחות אגר שוקולד או במרק.
      1. כדי להשתמש בצלחות אגר שוקולד, להפיץ את החיידקים במשך מינימום של כל 3-4 ימים עם מפיצים סטריליים.
      2. לחלופין, השתמשו בציר עירוי לב מוחי (BHI) המועשר בגורמים X (המינים) ו-V (β-ניקוטין-אמיד אדנין דינוקלאוטיד) כדי לגדל את החיידקים. יש לחסן את NTHi מצלחות לילה ב-5-10 מ"ל של ציר BHI בתוספת המרין ו-β-ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד (שניהם 10 מיקרוגרם/מ"ל) ותרבית למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5% CO2 .
        הערה: יש לכך יתרון של יכולת שכפול, יחידות יוצרות מושבה (CFU) גבוהות יותר נחשבות, וכל החיידקים נמצאים בשלב דומה של צמיחת לוג (על צלחות, הכדאיות של חיידקים יכולה להיות גדולה יותר בהתאם למיקום בתרבית)13,15.
    3. השתמש בריבוי של זיהום (MOI) של 100 חיידקים לתא אחד כדי לעורר תגובה חיסונית חזקה תוך שמירה על הכדאיות התאית. השתמש בתקן MacFarland10 או בספקטרופוטומטר13 כדי להעריך את מספר החיידקים.
    4. ודא כי התקשורת המשמשת עבור בדיקות NTHi חי הוא נקי מכל סרום אנושי, כמו זה יהרוג את החיידקים16. דגימות סרום של בעלי חיים (למשל, סרום עגל עוברי) אינן גורמות בדרך כלל לבעיה כלשהי.
      הערה: השתמש בשיטות המתוארות להלן כדי לנתח דגימות רקמה סטנדרטיות כגון דם היקפי, דגימות ברונכוסקופיה (במיוחד שטיפת ברונכואלוואולרית (BAL)) ורקמת ריאה שנכרתה. לדגום את הדגימות עם אנטיגן Hi מ 10 דקות עד 24 שעות או יותר.

2. הערכת תפקוד פאגוציטי על ידי ציטומטריה של זרימה

הערה: בדיקה זו דורשת תאים בתמיסה והיא נעשית בדרך כלל בדם שלם או באמצעות נוזל BAL. בדיקה זו שונה מפרוטוקול שפורסם בעבר המבוסס על שימוש בתכשיר סטפילוקוקוס אאורוס מומת ופנסורבין17. דם שלם מומת וקבוע H. שפעת מוחלף Pansorbin17.

  1. יש לערבב NTHi מומת ומומת (1.2) עם פרופילידיום יודיד (PI) במינון של 100 מיקרוגרם/מ"ל במי מלח עם אגירת פוספטים (PBS) ביחס של 1:1 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף ב 500 μL של PBS. סובבו כלפי מטה ב-450 x גרם למשך 5 דקות והחזירו את הכדור ל-500 μL של PBS.
  2. דגירה של 450 μL של דם היקפי (מ venepuncture של נבדק אנושי) עם 50 μL של PI מומת שכותרתו H. שפעת במשך 20 דקות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס בצינור 5 מ"ל.
  3. הסר את הדגימות מאמבט המים והוסף 5 μL של דיהידרורודאמין-1,2,3 (DHR). מערבולת במשך 10 שניות, ולאחר מכן מניחים אותו בחזרה באמבט המים למשך 10 דקות נוספות.
  4. הסר את הדגימות מאמבט המים ותמיסה את אריתרוציטים (500 μL של נפח כמפורט לעיל בשלב 2.2) עם 10:1 (כלומר, 5 מ"ל) של 0.8% אמוניום כלוריד (150 mM NH4Cl, 1 mM NaHCO3, ו 0.1 mM EDTA) פתרון.
    הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במערכת אוטומטית כגון Q-prep.
  5. נתח את הדגימות על ציטומטר זרימה תוך שעה. נתחו לפחות 3,000-5,000 תאים (מכל תת-קבוצה מעניינת) מכל דגימה כדי לקבל תוצאות מייצגות (איור 1).
    1. כדי לנתח את הדגימות עבור phagocytosis, לקבוע את שיעור התאים שיש להם חיידקים מסומנים (למדוד את שיעור התאים שיש כתם פלואורסצנטי).
    2. כימות ה-ROS על ידי חמצון של DHR, שמביא לאות פלואורסצנטי (השינוי בפלואורסצנטיות החציונית מושווה בין דגימות בסיס לדגימות מגורות).
      הערה: נויטרופילים הם גרעיניים יותר ויש להם יותר פיזור צדדי, בעוד מקרופאגים הם גדולים יותר ויש להם יותר פיזור קדימה.
    3. להבחין בין הנויטרופילים והמקרופאגים מבחינה מורפולוגית זה מזה לפי גודלם (מקרופאגים גדולים יותר) וגרעיות (נויטרופילים הם גרעיניים יותר).
      הערה: סמנים ספציפיים עבור נויטרופילים ומקרופאגים אינם משמשים בדרך כלל, אם כי CD14 עשוי לשמש לסימון מונוציטים בדם. ציטומטריה של זרימה עשויה לשמש להבחנה בין צורות פונקציונליות שונות של מונוציטים ומקרופאגים (לדוגמה, תת-קבוצות M1 ו-M2)18.
  6. שנה את הבדיקה בהתאם לצורך (לדוגמה, השתמש ב- NTHi חי ללא תווית כדי לעורר פאגוציטים ולמדוד את ביטוי ה- ROS על ידי מחשוף DHR).
    1. לבודד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים על ידי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות. מניחים את הדם מעל הפולימר המיועד לצנטריפוגה הדרגתית בצפיפות ומסתובבים ב-2300 x גרם למשך 30 דקות. הסר את השכבה החד-גרעינית באמצעות פיפטה, שטף אותה פעמיים עם PBS והשעה מחדש את התאים ב- PBS ב- 106 תאים למ"ל.
    2. כחלופה, השתמש במקרופאגים של BAL.
    3. להשעות את המונוציטים/מקרופאגים בריכוז של 106 תאים/מ"ל במדיום התרבית (RPMI). הדביקו אותם ב- NTHi חי במשרד הפנים של 100:1 למשך שעה אחת כמתואר בשלב 1.3.
    4. הוסף DHR למתלה כמתואר בשלב 2.3 למשך 10 דקות. בצע את הניתוח עבור ROS באמצעות ציטומטריה של זרימה.

3. הערכת תפקוד הלימפוציטים בדם ההיקפי

  1. השתמש בדם שלם או בתכשירים של תאים חד-גרעיניים למבחני ציטומטריה של זרימה14.
  2. קבל דוגמאות מכל נושא על ידי venepuncture. לאסוף 4 מ"ל של דם מווריד היקפי בצינור ליתיום הפרין ולחלק את הדגימות aliquots עבור שליטה וגירוי אנטיגן.
  3. הוסף נוגדנים קוסטימולטוריים (anti-CD28 ו- CD49d, 1 μL/mL) לשתי הדגימות. הוסף NTHi לדגימת האנטיגן ודגרה ב 37 °C ו 5% CO2 במשך 1 שעות. עבור הכנה NTHi נהרג, להוסיף 200 μL של האנטיגן ל 2 מ"ל של דם. עבור NTHi חי, הוסף תאי NTHi חיים ב- MOI של 100:1 לתאים הלבנים (כפי שנמדד על ידי המוציטומטר).
  4. הוסיפו את החומר החוסם את Golgi Brefeldin A (10 μL/mL) לדגימות ודגרו אותן למשך 5 שעות נוספות.
    הערה: חסימת מנגנון Golgi מונעת ייצוא של הציטוקינים אל מחוץ לתא.
  5. אם נעשה שימוש בדם שלם, lyse את אריתרוציטים עם 0.8% אמוניום כלוריד (שלב 2.4) כדי להשאיר רק לויקוציטים בתמיסה. לתקן את leukocytes באמצעות 500 μL של 1%-2% paraformaldehyde במשך 1 שעות.
  6. סופרים את התאים לפי המוציטומטר, מחלחלים ל-106 תאים עם 100 μL של 0.1% סאפונין למשך 15 דקות ודוגמים על התאים עם נוגדנים המסומנים בפלואורסצנט. לשטוף את התאים ולנתח אותם באמצעות ציטומטר זרימה.
    הערה: כמות הנוגדנים המסומנים בפלואורסצנט תהיה ספציפית עבור כל ציטוקין. בצע את הוראות היצרן. בדרך כלל, 106 תאים ב 100 μL של תמיסה יהיה מוכתם במשך שעה אחת. רוב הנוגדנים המתקבלים מסחרית יספיקו כדי לבצע 25-100 בדיקות.
  7. קבעו את שיעור התאים המגיבים לאנטיגן על-ידי מיון אוכלוסיית הלימפוציטים הרלוונטית (התאים מגודרים על-ידי CD45, לאחר מכן על-ידי CD3, ומאוחר יותר על-ידי ביטוי CD4 או CD8) כפי שמוצג באיור 2. בצע צביעת רקע על תאים שאינם מגורה כדי לנתח את כל הציטוקינים. מסך 100,000 תאים כדי לנתח כל ציטוקין הן עבור תאים מגורה והן עבור בקרה.

4. הערכת תפקוד לימפוציטים/מתווכי דלקת ברקמת הריאה

  1. זה בדרך כלל לא ניתן להשיג מספיק לימפוציטים מברונכוסקופיה; לכן, להשתמש ברקמת הריאה מדגימות lobectomy. אופטימיזציה של דגימות רקמת הריאה דורשת קשר הדוק עם שירות הפתולוגיה האנטומית. ודא שלרקמה יש שוליים של לפחות 3 ס"מ מהגידול והיא הרקמה התאית ללא אמפיזמה משמעותית (כפי שנקבע על ידי הפתולוג).
  2. לשבור את רקמת הריאה לתוך תרחיף סלולרי לפני שהוא יכול לשמש עבור בדיקות ציטומטריה זרימה. לעכל את רקמת הריאה באופן כימי (למשל, באמצעות קולגן) או לפרק אותה באופן מכני.
    הערה: ניתן להעדיף פירוק מכני של רקמות, שכן הדבר קשור להכתמת תאים טובה יותר על פני השטח (לדוגמה, תיוג CD3/4)19.
    1. קבל דגימות lobectomy מפתולוג (המתקבל בדרך כלל מחולים העוברים טיפול בסרטן הריאות). פורסים כ 20-40 גרם של הדגימה לתוך 3-5 מ"מ 3 חלקים . מקם אותם בתוך תא סטרילי של 50 μL לפני שהם מקוטעים מכנית באמצעות disaggregator מתאים.
    2. לאחר פירוק רקמות, lyse את תאי הדם האדומים עם 0.8% NH 4 Cl כפי שצוין בשלב2.4.
    3. השהה את התאים ב- RPMI סטרילי (הנפח יהיה תלוי במספרי התאים ובדרך כלל הוא 10-20 מ"ל), ולאחר מכן סנן אותם דרך רשת ניילון סטרילית של 100 מיקרומטר. ספור את מספר התאים בני הקיימא באמצעות שיטת ההדרה הכחולה של טריפאן.
  3. בדיקת זיהום NTHi
    1. יש לתלות את תאי הריאה לריכוז סופי של 4 x 106 תאים /מ"ל לכל צינור (דגימות בקרה וגירוי).
    2. השתמש במתלה של 4 x 10 6-6 x 106 תאים ב 1 מ"ל של RPMI עבור צינור הבקרה (שלילי). השתמש באותה כמות עבור צינור NTHi (כל דגימה נוספת עשויה לשמש כבקרה חיובית עם SEB). להדביק את התאים בצינור NTHi ב- MOI של 100 חיידקים לתא. שחררו את המכסה חצי סיבוב כדי לאפשר מעבר גז בצינורות.
    3. מניחים את התאים ברוטטור צינור ודוגרים אותם ב-37 מעלות צלזיוס תוך כדי סיבוב ב-12 סל"ד.
    4. כדי למנוע ייצוא חוץ-תאי של ציטוקינים, הוסיפו חוסם גולג'י (Brefeldin A) לתרחיף התאים שעה לאחר הגירוי לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל. החזירו את מתלי התאים לדגירה נוספת של 16-22 שעות בסיבוב (שלב 4.3.3).
    5. שטפו את מתלה התאים עם 500 μL של PBS המכיל 1% אלבומין בסרום בקר (BSA) ו-0.01% NaN3. תקן וחדיר את התאים כמתואר בשלב 3.5 ובשלב 3.6, בהתאמה.
    6. הוסף את הנוגדנים להכתמת ציטוקינים תוך תאיים (בחירת הנוגדנים תיקבע על ידי החוקר, כמפורט בהערה בשלב 3.6). הכתימו את תרחיף התאים עבור סמני פני שטח ספציפיים של תאי לימפוציטים אנושיים (למשל, CD45, CD3 וכו') למשך שעה אחת. לשטוף את התאים עם PBS, לתקן ולחדור אותם כמתואר בשלבים 3.5-3.6.
    7. דגירה על התאים עם נוגדנים מכתימים ציטוקינים תוך-תאיים (למשל, IFN-γ ו-TNF-α או IL-13 ו-IL-17A) למשך שעה אחת.
      הערה: מומלץ להכתים תחילה את סמני פני השטח, ולאחר מכן את התוך-תאיים שכן קיבוע עלול לגרום לשינויים קונפורמיים בחלבוני פני השטח שאליהם נקשרים נוגדנים.
    8. לשטוף את התאים עם 500 μL של PBS ולחזור 100 μL של PBS לפני רכישת נתונים על ציטומטר זרימה.
  4. ניתן להשתמש בבדיקת מערך חרוזים בשילוב כדי לנתח את הסופר-נטנט המתואר בשלב 3.2 (בצע זאת ללא ברפלדין A). זה מאפשר ניתוח של מגוון רחב של מתווכי דלקת שונים (פוטנציאלית עד 40-50 מתווכים). לאסוף את supernatant ב 100 μL aliquots ולאחסן ב -70 °C עד מוכן לניתוח. לחלופין, ניתן להשתמש במבחנים כימילומינסנטיים מולטיפלקס20.
    1. השתמש במערכי חרוזים מרובבים כדי לנתח את הדגימות המופשרות. השתמש בסופרנטנט המאוחסן כדי לנתח את ייצור הציטוקינים בהתאם להוראות היצרן.
    2. בצע את הרכישה של מערך חרוזי המולטיפלקס בציטומטר זרימה. השתמש בתוכנה רלוונטית כדי לבצע את ניתוח הנתונים במורד הזרם.
      הערה: ניתן לבצע בדיקת מערך חרוזים זו גם על סופרנטנט מדגימות דם היקפי ו/או BAL.

5. הערכת פרוטאוליזה של הריאות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית

הערה: מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית היא ללא תשלום לציטומטריה של זרימה וניתן להשתמש בה כדי להעריך תגובות דלקתיות של פרוטאז ו-ROS. מלכודות חוץ-תאיות כגון NETs ו-METs מורכבות מכרומטין חוץ-תאי (DNA) עם מתווכי דלקת אחרים, במיוחד פרוטאזות כגון אלסטאז נויטרופילים (NE) ומטריצה מטאלופרוטאינאזות (MMP). ניתן להעריך אותם ברקמת BAL ובריאות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, וזה תואר בעבר על ידי שארמה, ר 'ואחרים.

  1. להעריך ביטוי ישיר של פרוטאז ברקמת הריאה (כמתואר בשלב 4.2.1) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וזימוגרפיה באתרה 15,17.
    1. יש להשתמש ברקמת ריאה טרייה או קפואה. הרכיבו את החלקים החתוכים לעובי של 4 מיקרומטר על מגלשות סופרפרוסט/הידבקות. מחממים מראש את החלקים במאגר תגובה 1x למשך 5 דקות.
    2. הוסיפו מצע ג'לטין עם תווית פלואורסצין (30 מיקרוגרם/מ"ל למקטע) ישירות על שקופיות בודדות כדי למדוד פרוטאוליזה באמצעות פעולה של מטאלופרוטאינאזות.
    3. מקם את המגלשות במצב אופקי ודגירה בתא מוגן אור ולחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
    4. שטפו את החלקים במאגר תגובה של פי 1 לפני ההרכבה.
    5. כבקרה שלילית, הוסף רק את מאגר התגובה ללא ג'לטין פלואורסצנטי למקטעים.
    6. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לבחון את התזה של המצע על ידי בדיקה. השתמש ב- ImageJ כדי לקבוע את אזור הריאה עם עדות לפרוטאוליזה. לשם כך, מדוד את אזור הריאה שיש בו כתמים מעל הרקע של הדגימה המרווה. כבקרה נוספת, השתמש ברקמת הריאה ללא ג'לטין פלואורסצנטי נוסף15.
      הערה: בצע זאת בלפחות 10 שדות ראייה בהספק גבוה (FOV) עבור כל דגימה.
  2. מדוד את ביטוי ה-ROS החוץ-תאי ברקמת הריאה על-ידי פעילות חיסונית עבור 3-ניטרוטירוזין (מוצר עקה חמצונית רעיל)13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות המייצגות מראות כיצד ניתן להעריך/לכמת תגובות חיסוניות דלקתיות ל-NTHi על-ידי ציטומטריה של זרימה ומיקרוסקופיה קונפוקלית. חלק מרכזי בפרשנות התוצאות הוא ההשוואה בפלואורסצנטיות בין בקרה לדגימות מגורות. מספר ניסויים ראשוניים נדרשים בדרך כלל כדי לייעל את צביעת הדגימות. כמה צבעים שונים ניתן לבחון בו זמנית יהיה תלוי במספר הערוצים הזמינים בציטומטר הזרימה/מיקרוסקופ הקונפוקלי. התוצאות מוצגות להערכה של 1) ייצור ROS, 2) צביעת ציטוקינים תוך תאית של רקמת ריאה אנושית, ו-3) זימוגרפיה באתרה למדידת פרוטאוליזה של הריאות.

איור 1 מראה את הייצוג של ייצור ROS על ידי מונוציטים. המדידה של ROS היא על ידי חמצון של DHR123 כדי לייצר פלואורסצנציה. התאים מגודרים, והפלואורסצנטיות החציונית שלהם מוערכת על ידי ציטומטריה של זרימה. הפלואורסצנציה החציונית של המדגם המגורה מושווית לבקרה.

איור 2 מראה את הייצור התוך-תאי של ציטוקינים על-ידי לימפוציטים שמקורם ברקמת ריאה אנושית. יש לפרק את רקמת הריאה לתרחיף חד-תאי לפני שניתן יהיה לבצע בדיקות ציטומטריה של זרימה כדי להעריך את ייצור המתווך הדלקתי, למשל, ייצור ציטוקינים על ידי לימפוציטים. רקמת הריאה יכולה להתפרק באופן מכני או להתעכל כימית, למשל על ידי קולגן. שיטות הפירוק המכניות עשויות להניב תוצאות מעולות, במיוחד במונחים של שמירה על צביעת פני השטח של התא (למשל, CD3 ו- CD4). סינון הדגימות חשוב כדי לא לכלול פסולת שעלולה להפריע לניתוח.

איור 3 מראה את הביטוי של פעילות פרוטאזות כפי שהיא נמדדת על-ידי זימוגרפיה באתרה . רקמה לא קבועה משמשת להערכת פעילות פרוטאזות. דגימות אלה מוקפאות בדרך כלל בטמפרטורה של -70 מעלות צלזיוס עד לניתוח. האזור ברקמה שיש בו פרוטאז פלואורסצנטי נמדד, והתוצאות מושוות בין דגימות בקרה לדגימות מגורות.

Figure 1
איור 1: ייצור ROS על-ידי מונוציטים. (A) הפאנל מציג את אסטרטגיית הגידור של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMC), כאשר פיזור קדימה ופיזור צדדי משמשים להגדרת אוכלוסיית הפאגוציטים. בלוח (B), אוכלוסיית הפאגוציטים מוגדרת עוד יותר על ידי ביטוי CD14 כדי לסמן את המונוציטים. אוכלוסיית מונוציטים זו מנותחת עבור פלואורסצנציה של DHR בבקרה (C) ודגימות מגורות (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: ייצור ציטוקינים ברקמת הריאה. תאים מנותחים לראשונה לביטוי שלהם של סמן לויקוציטים CD45 (A) באמצעות ציטומטריה של זרימה. אוכלוסייה זו מנותחת לאחר מכן עוד יותר עבור ביטוי CD3 (B) וביטוי CD4/CD8 (C). תאי CD3/CD4+ מוערכים לייצור ציטוקינים תוך-תאיים בדגימות בקרה (D) ו-NTHi מגורות NTHi (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: זימוגרפיה של ריאות באתרה . פאנל (A) מראה את הביטוי של כרומטין/DAPI במקטעים של רקמת הריאה. לוח (B) מראה כתמים פלואורסצנטיים, המעידים על נוכחות של פעילות MMP. חלונית (C) מציגה את התמונה הממוזגת ומציינת שגם פעילות ה-MMP מתורגמת יחד עם הביטוי של כרומטין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטות המפורטות כאן משתמשות בציטומטריית זרימה מבוססת פלואורסצנציה ובטכניקות מיקרוסקופיה קונפוקלית שניתן להשתמש בהן בשילוב כדי לקבל מידע מפורט על תגובת הריאות הדלקתית ל-Hi.

קביעת הנוסחה האנטיגנית המתאימה של Hi לשימוש היא קריטית, ורצוי לקבל קלט ספציפי ממיקרוביולוג בהקשר זה. Live Hi משרה תגובה חזקה יותר, בעוד שההכנות של Hi שנהרגו ורכיבי Hi מתוקננים יותר וקלים יותר לאחסון. PI יתייג רק חיידקים מתים22; צבעים אחרים כגון carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) יכולים לשמש לתיוג חיידקים חיים עבור מבחני פאגוציטוזה23. יש לבצע סדרה של ניסויים ראשוניים כדי לייעל את האנטיגן המתאים. לשימוש ב- NTHi חי, MOI של 100:1 הוא אופטימלי; MOI נמוך יותר עשוי שלא לגרום לתגובה חיסונית ברורה, בעוד ש-MOI גבוה יותר עלול להיות רעיל לתאים. עם זאת, עקומת מינון-תגובה עשויה לתת מידע שימושי ועשויה להיות בעלת ערך רב, במיוחד עם האופטימיזציה הראשונית של הטכניקה24. כבקרה חיובית, ניתן להשתמש בצורה מסחרית של אנטיגן סטפילוקוקוס אאורוס מושתק, אשר מסומן גם עם PI כנ"ל עבור בדיקת ROS / phagocytosis. עבור מבחני תאי T, גירוי עם סטפילוקוקל סופר-אנטיגן E (SEB) עשוי לשמש כבקרה חיובית19,25.

הפרוטוקולים לקבלת דגימות BAL ו / או רקמת ריאה צריכים להיות ברורים בבירור. דגימות BAL יכולות להיות משתנות למדי בין אופרטורים שונים. מזרק ידני לשטיפת האונה האמצעית הימנית מניב תוצאות טובות26. קבלת דגימת רקמת הריאה מדגימות lobectomy דורשת הקמת שיתוף פעולה עם פתולוג. דגימת רקמת הריאה צריכה להיות בעלת שוליים מסוימים מהגידול (באופן אידיאלי לפחות 3-4 ס"מ). דגימות גדולות יותר (למשל, לפחות 25-50 גרם) יניבו יותר תאים, כמו גם דגימות פרוקסימליות יותר ללא אמפיזמה ברורה. הפירוק המכני של רקמת הריאה גוזל זמן רב ובדרך כלל ייקח לפחות 2-3 שעות עבור כלדגימה 19,27.

יש לבצע ניסויים ראשוניים כדי לייעל את הצביעה של פלואורופורים שונים הן עבור ציטומטריית זרימה והן עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית. אזורים שיש להתרכז בהם כוללים זיהוי לוח הצביעה הטוב ביותר, צביעה/ריכוז וטיפול בתאים/רקמות כדי למקסם את הכדאיות28. השימוש ברקמת ריאה עשוי להיות קשור עם יותר פסולת רקמות מאשר דגימות נוזלים אחרות כגון דם או BAL, וזה עשוי להיות בעל השפעה מסוימת על ההבחנה של אוכלוסיות תאים שונות על ידי ציטומטריה זרימה. הבחירה המתאימה של נוגדנים צריכה להיקבע ולהיטיב בניסויים ראשוניים. לתיוג פני השטח של לימפוציטים, ניתן להשתמש באנטי-CD3 ו-CD4 עבור תאי T, אנטי-CD3 ו-CD8 עבור תאי T ציטוטוקסיים, ואנטי-CD3 ו-CD56 עבור תאי NK. בחירת הציטוקינים התוך-תאיים שייחקרו תלויה במתווכים בעלי העניין ובמספר הפרמטרים/צבעים שניתן לנתח בציטומטר הזרימה29. אתגר ספציפי בעבודה עם מקרופאגים ברקמת הריאה הוא הרמה הגבוהה של אוטופלואורסצנציה30; ניתן לטפל בבעיה זו על ידי השוואת תאים מגורה עם בקרת רקע והוספת סמנים ספציפיים לדלקת כגון פרוטאזות והיסטונים.

מגבלה של טכניקות אלה היא הדרישה לצוות מיומן ומיומן כראוי לביצוע הניסויים. נדרשים גם מתקני ציטומטריה ומיקרוסקופיה מבוססים היטב. השימוש בדגימות רקמה אנושית קשור לשונות משמעותית במיוחד בעת שימוש ברקמת ריאה; זה עשוי לדרוש סדרה של ניסויים ראשוניים כדי לייעל את המבחנים (במיוחד עם בעיות של צביעת רקע).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לצוות של אימונולוגיה קלינית ב- Monash Health על עזרתם בעבודה זו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium chloride Sigma Aldrich 213330
Brefeldin Sigma Aldrich B6542
CD28 Thermofisher 16-0289-81
CD49d Thermofisher 534048
DAPI prolong gold Thermofisher P36931
DHR123 Sigma Aldrich 109244-58-8
Filcon sterile nylon mesh Becton Dickinson 340606
Gelatin substrate, Enzchek Molecular probes E12055
MACS mix tube rotater Miltenyi Biotec 130-090-753
Medimachine Becton Dickinson Catalogue number not available
Medicons 50 µm Becton Dickinson 340592
Pansorbin Sigma Aldrich 507858
Propidium iodide Sigma Aldrich P4170
Saponin Sigma Aldrich 8047152
Superfrost slides Thermofisher 11562203

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
  2. Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).
  3. King, P. T., Sharma, R. The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi). Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).
  4. Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease. Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).
  5. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  6. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).
  7. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).
  8. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).
  9. Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).
  10. Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).
  11. Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles. The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).
  12. Barenkamp, S. J. Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae. The Journal of Infectious Diseases. 165, Suppl 1 181-184 (1992).
  13. Johnston, J. W. Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 6, Unit 6D (2010).
  14. King, P. T., et al. Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).
  15. Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains. Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).
  16. King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae. Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).
  17. King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PLoS One. 10, 0120371 (2015).
  18. Aaron, S. D., et al. Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).
  19. King, P. T., et al. Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).
  20. Tsujikawa, T., et al. Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity. Cytometry A. 95, 389-398 (2019).
  21. Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).
  22. Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
  23. Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury. Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).
  24. Essilfie, A. T., et al. Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma. Thorax. 67, 588-599 (2012).
  25. Huvenne, W., et al. Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice. Respiratory Research. 12, 69 (2011).
  26. Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage. Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).
  27. Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells. Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).
  28. Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).
  29. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11, 0150606 (2016).
  30. Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 172 חיידקים ריאות דלקת ציטומטריה של זרימה מיקרוסקופיה קונפוקלית
הערכת תגובות חיסוניות נשימתיות <em>לשפעת המופילוס</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dousha, L., Sharma, R., Lim, S.,… More

Dousha, L., Sharma, R., Lim, S., Ngui, J., Buckle, A. M., King, P. T. Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae. J. Vis. Exp. (172), e62572, doi:10.3791/62572 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter