Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vurdering af respiratoriske immunresponser på Haemophilus influenzae

Published: June 29, 2021 doi: 10.3791/62572
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 2,4, 5, 1,2
1Monash Lung and Sleep, Monash Medical Centre, 2Monash University Department of Medicine, Monash Medical Centre, 3Flow Cytometry Science Technology Platform, Francis Crick Institute, 4Clinical Immunology, Monash Medical Centre, 5Department of Biochemistry and Molecular Biology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University

Summary

Haemophilus influenzae inducerer betændelse i luftvejene. Denne artikel vil fokusere på brugen af flowcytometri og konfokal mikroskopi til at definere immunrespons af fagocytter og lymfocytter som reaktion på denne bakterie.

Abstract

Haemophilus influenzae (Hi) er en udbredt bakterie, der findes i en række luftvejssygdomme. En række forskellige assays / teknikker kan anvendes til at vurdere respiratorisk immun / inflammatorisk respons på denne bakterie. Flowcytometri og konfokal mikroskopi er fluorescensbaserede teknologier, der muliggør detaljeret karakterisering af biologiske reaktioner. Forskellige former for Hi-antigen kan anvendes, herunder cellevægskomponenter, dræbte / inaktiverede præparater og levende bakterier. Hej er en kræsen bakterie, der kræver berigede medier, men er generelt let at dyrke i standard laboratorieindstillinger. Vævsprøver til stimulering med Hi kan fås fra perifert blod, bronkoskopi eller resekteret lunge (f.eks. Hos patienter, der gennemgår kirurgi til behandling af lungekræft). Makrofag og neutrofilfunktion kan vurderes grundigt ved hjælp af flowcytometri med en række parametre målt, herunder fagocytose, reaktive iltarter og intracellulær cytokinproduktion. Lymfocytfunktion (f.eks. T-celle- og NK-cellefunktion) kan vurderes specifikt ved hjælp af flowcytometri, hovedsageligt til intracellulær cytokinproduktion. Hi-infektion er en potent inducer af ekstracellulær fældeproduktion, både af neutrofiler (NET'er) og makrofager (MET'er). Konfokal mikroskopi er uden tvivl den mest optimale måde at vurdere NET- og MET-ekspression på, som også kan bruges til at vurdere proteaseaktivitet. Lungeimmunitet over for Haemophilus influenzae kan vurderes ved hjælp af flowcytometri og konfokal mikroskopi.

Introduction

Haemophilus influenzae (Hi) er en normal kommensal bakterie til stede i svælget hos de fleste raske voksne. Hej kan have en polysaccharidkapsel (type A-F, f.eks. type B eller HiB) eller mangle en kapsel og være ikke-typebar (NTHi)1. Kolonisering af slimhinden med denne bakterie begynder i den tidlige barndom, og der er en omsætning af forskellige koloniserende stammer2. Denne bakterie er også i stand til invasion af både øvre og nedre luftveje; I denne sammenhæng kan det fremkalde aktivering af immunresponset og inflammation 3,4. Denne inflammatoriske respons kan forårsage klinisk sygdom og bidrage til en række vigtige respiratoriske tilstande, herunder bihulebetændelse, otitis media, bronkitis, cystisk fibrose, lungebetændelse og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL). De fleste af disse forhold skyldes NTHi-stammer2. Denne artikel vil beskrive metoder til vurdering af respiratoriske immunresponser på Hi ved hjælp af flowcytometri og konfokal mikroskopi.

Metoderne beskrevet nedenfor er blevet tilpasset fra veletablerede teknikker, der er blevet modificeret til at vurdere den inflammatoriske reaktion på Hi. Udvælgelsen af en passende antigenform af Hi er en vigtig del af denne vurdering. Antigene præparater spænder fra cellevægskomponenter til levende bakterier. For at etablere og standardisere assays kan brugen af perifere blodprøver være meget nyttigt i starten.

Flowcytometri muliggør måling af en række parametre og funktionelle assays fra en prøve på celleniveau. Denne teknik har den fordel, at specifikke cellulære reaktioner (f.eks. produktion af reaktive iltarter (ROS) eller intracellulær cytokinproduktion) kan vurderes sammenlignet med andre mere generelle metoder såsom enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) eller ELISspot.

Ekstracellulære fælder udtrykkes af neutrofiler (NET'er)5,6,7 og af andre celler såsom makrofager (MET'er)8. De anerkendes i stigende grad som en vigtig inflammatorisk reaktion, især ved infektion i lungen9. De kan vurderes ved konfokal fluorescensmikroskopi. Denne teknik muliggør endelig identifikation af NET'er/MET'er og adskiller deres ekspression fra andre former for celledød6.

Både flowcytometri og konfokal mikroskopi er fluorescensbaserede assays. Deres succes er afhængig af optimale belastningsprotokoller for biologiske prøver. Disse metoder tager lidt tid at lære og kræver passende tilsynsekspertise. De involverede instrumenter er også dyre både at købe og køre. Den optimale ramme for deres anvendelse omfatter større universiteter og tertiære henvisningshospitaler.

De metoder, der anvendes i denne protokol, kan overføres til undersøgelse af andre lignende organismer, der er involveret i luftvejssygdomme (f.eks. Moxarella catarrhalis og Streptococcus pneumoniae). NTHi interagerer også med andre almindelige åndedrætsbakterier10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dette arbejde blev godkendt af den humane videnskabsetiske komité for Monash Health. Protokollen følger retningslinjerne fra den humane videnskabsetiske komité.

1. Antigenpræparat

BEMÆRK: Tre forskellige antigene præparater kan bruges til at vurdere immunresponset på Hi. Disse er 1) en subcellulær komponent (typisk fra bakteriecellevæggen); 2) dræbte og inaktiverede bakterier; og 3) levende bakterier. Bestem brugen af hvert antigenpræparat inden indledningen af eventuelle forsøg.

  1. Subcellulære komponenter
    1. Få subcellulære komponenter fra kilder, herunder kommercielle præparater, internt udviklede komponenter og/eller fra andre efterforskere.
      BEMÆRK: Subcellulære komponenter, normalt fra bakteriecellevæggen, kan anvendes og omfatte ydre membranproteiner såsom P6 og lipooligosaccharid (LOS)11,12. Disse subcellulære komponenter er normalt afledt i specialiserede centre. Beskrivelsen af, hvordan de er lavet, ligger uden for denne artikels anvendelsesområde. Direkte kontakt med eksperter på dette område anbefales for at opnå disse komponenter.
  2. Dræbte/inaktiverede bakterier
    1. Få bakterierne fra den relevante prøve (f.eks. Sputum eller bronkoskopi). Bekræft stammen som H. influenzae ved hjælp af et passende mikrobiologisk laboratorium. Udfør typning af H. influenzae-prøverne for at bekræfte, at de ikke kan skrives (af et specialiseret mikrobiologisk laboratorium).
    2. For at opnå et repræsentativt antigen skal du bruge flere NTHi-stammer (mindst 5, hver af omtrent samme mængde) til at fremstille et samlet antigen. Stammerne opbevares ved -70 °C i glycerolbouillon i mikrocentrifugerør.
      BEMÆRK: I dette eksperiment blev der anvendt ti forskellige stammer.
    3. Tø stammerne (et mikrocentrifugerør ad gangen) op på chokoladeagarplader og dyrk natten over i en 37 °C inkubator med 5% CO2. Tilsæt bakterierne til 500 μL fosfatbufferet saltvand (PBS) og vask dem to gange (drej ved 300 x g i 5 min). Brug en MacFarland-standard 10 eller et spektrofotometer13 til at justere NTHi til en koncentration på10 8 ml (ved hjælp af en 5 ml beholder eller tilsvarende).
    4. Varme inaktiverer bakterierne ved at placere dem i et vandbad ved en temperatur på 56 °C i 10 min.
    5. Sonikere bakterierne ved hjælp af en kontinuerlig sonikeringsindstilling ved en lav til mellemhastighed i 30 s.
    6. Aliquot den passende mængde prøver i mikrocentrifugerør. For en prøve på 108 ml anvendes alikvoter på 50 μL (dvs. 20 prøver pr. ml), fryses ved -70 °C, indtil det kræves14.
  3. Levende bakterier
    1. Først skal du karakterisere levende bakterier som nævnt i trin 1.2.1. Brug en velkarakteriseret stamme. Sørg for, at stammen også opbevares i glycerol bouillon ved -70 ° C som reserve.
    2. Dyrk bakterierne på berigede medier såsom chokoladeagarplader eller i bouillon.
      1. For at bruge chokoladeagarplader spredes bakterierne mindst hver 3-4 dage med sterile spredere.
      2. Alternativt kan du bruge Brain Heart Infusion (BHI) bouillon beriget med faktorer X (hemin) og V (β-nicotinamid-adenin-dinukleotid) til at dyrke bakterierne. Der podes NTHi fra natplader i 5-10 ml BHI-bouillon suppleret med både hemin og β-nicotinamid-adenin-dinukleotid (begge 10 μg/ml) og dyrkning natten over ved 37 °C i en 5 % CO2 inkubator.
        BEMÆRK: Dette har den fordel, at reproducerbarhed, højere kolonidannende enheder (CFU) tæller, og alle bakterier er i en lignende fase af logvækst (på plader kan bakteriel levedygtighed være større afhængigt af placeringen i kulturen)13,15.
    3. Brug en mangfoldighed af infektion (MOI) på 100 bakterier til en celle for at fremkalde et stærkt immunrespons, samtidig med at cellulær levedygtighed opretholdes. Brug MacFarland Standard10 eller spektrofotometer13 til at vurdere antallet af bakterier.
    4. Sørg for, at medierne, der bruges til levende NTHi-assays, er fri for ethvert menneskeligt serum, da dette vil dræbe bakterierne16. Serumprøver fra dyr (f.eks. føtalt kalveserum) giver generelt ikke anledning til problemer.
      BEMÆRK: Brug metoderne beskrevet nedenfor til at analysere standardvævsprøver såsom perifert blod, bronkoskopiprøver (især bronchoalveolær skylning (BAL)) og resekteret lungevæv. Inkuber prøverne med Hi-antigen fra 10 min til 24 timer eller mere.

2. Vurdering af fagocytisk funktion ved flowcytometri

BEMÆRK: Dette assay kræver celler i opløsning og udføres typisk i fuldblod eller ved hjælp af BAL-væske. Dette assay er modificeret fra en tidligere offentliggjort protokol baseret på brugen af inaktiveret Staphylococcus aureus præparat og Pansorbin17. Inaktiveret fuldblod og fast H. influenzae erstattes af Pansorbin17.

  1. Blanding af dræbt, inaktiveret NTHi (1.2) med propidiumiodid (PI) ved 100 μg/ml i fosfatbufferet saltvand (PBS) i forholdet 1:1 i 30 minutter ved stuetemperatur. Centrifuge ved 450 x g i 5 min, og vask derefter i 500 μL PBS. Drej ned ved 450 x g i 5 minutter og suspender pelleten i 500 μL PBS.
  2. Inkubere 450 μL perifert blod (fra venepunktur af et menneske) med 50 μL inaktiveret PI mærket H. influenzae i 20 minutter i et vandbad ved 37 °C i et 5 ml rør.
  3. Prøverne fjernes fra vandbadet, og der tilsættes 5 μL dihydrorhodamin-1,2,3 (DHR). Vortex i 10 s, og læg den derefter tilbage i vandbadet i yderligere 10 minutter.
  4. Prøverne fjernes fra vandbadet, og erythrocytterne (500 μL rumfang som anført ovenfor i trin 2.2) fjernes med 10:1 (dvs. 5 ml) 0,8 % ammoniumchlorid (150 mM NH4Cl, 1 mM NaHCO3 og 0,1 mM EDTA) opløsning.
    BEMÆRK: Alternativt kan et automatiseret system som Q-prep bruges.
  5. Analyser prøverne på et flowcytometer inden for en time. Analyser mindst 3.000-5.000 celler (fra hver delmængde af interesse) fra hver prøve for at opnå repræsentative resultater (figur 1).
    1. For at analysere prøverne for fagocytose skal du bestemme andelen af celler, der har indtaget mærkede bakterier (mål andelen af celler, der har fluorescerende plet).
    2. Kvantificer ROS ved oxidation af DHR, hvilket resulterer i et fluorescerende signal (skiftet i median fluorescens sammenlignes mellem baseline og stimulerede prøver).
      BEMÆRK: Neutrofiler er mere granulære og har mere sidespredning, mens makrofager er større og har mere fremadrettet spredning.
    3. Skelne neutrofiler og makrofager morfologisk fra hinanden ved deres størrelse (makrofager er større) og granularitet (neutrofiler er mere granulære).
      BEMÆRK: Specifikke markører for neutrofiler og makrofager anvendes generelt ikke, selvom CD14 kan bruges til at mærke blodmonocytter. Flowcytometri kan potentielt bruges til at skelne mellem forskellige funktionelle former for monocytter og makrofager (f.eks. M1- og M2-delmængder)18.
  6. Rediger analysen efter behov (brug f.eks. levende umærket NTHi til at stimulere fagocytter og måle ROS-ekspressionen ved DHR-spaltning).
    1. Isoler mononukleære celler i perifert blod ved densitetsgradientcentrifugering. Læg blodet over den udpegede polymer til densitetsgradientcentrifugering og drej ved 2300 x g i 30 min. Det mononukleære lag fjernes med en pipette, det vaskes to gange med PBS, og cellerne i PBS resuspenderes ved 106 celler pr. ml.
    2. Som et alternativ skal du bruge BAL-makrofager.
    3. Monocytterne/makrofagerne suspenderes i en koncentration på 106 celler/ml i dyrkningsmediet (RPMI). Inficere dem med levende NTHi ved en MOI på 100: 1 i 1 time som beskrevet i trin 1.3.
    4. Tilføj DHR til suspensionen som beskrevet i trin 2.3 i 10 minutter. Udfør analysen for ROS ved hjælp af flowcytometri.

3. Vurdering af lymfocytfunktion i perifert blod

  1. Brug fuldblods- eller mononukleære cellepræparater til flowcytometriassays14.
  2. Få prøver fra hvert emne ved venepunktur. Saml 4 ml blod fra en perifer vene i et lithiumheparinrør og opdel prøverne i alikvoter til kontrol og antigenstimulering.
  3. Tilsæt costimulatoriske antistoffer (anti-CD28 og CD49d, 1 μL / ml) til begge prøverne. Der tilsættes NTHi til antigenprøven, og der inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 i 1 time. Til det dræbte NTHi-præparat tilsættes 200 μL antigen til 2 ml blod. For levende NTHi tilsættes levende NTHi-celler ved en MOI på 100:1 til de hvide celler (målt med hæmocytometer).
  4. Tilsæt Golgi-blokerende middel Brefeldin A (10 μL/ml) til prøverne og inkuber dem i yderligere 5 timer.
    BEMÆRK: Blokering af Golgi-apparatet forhindrer cytokinerne i at blive eksporteret uden for cellen.
  5. Hvis der anvendes fuldblod, skal erythrocytterne lyses med 0,8% ammoniumchlorid (trin 2.4) for kun at efterlade leukocytter i opløsning. Fix leukocytterne ved hjælp af 500 μL 1% -2% paraformaldehyd i 1 time.
  6. Tæl cellerne med hæmocytometer, gennemtræng 106 celler med 100 μL 0,1% saponin i 15 minutter og inkuber cellerne med fluorescerende mærkede antistoffer. Vask cellerne og analyser dem ved hjælp af et flowcytometer.
    BEMÆRK: Mængden af fluorescerende mærkede antistoffer vil være specifik for hvert cytokin. Følg producentens anvisninger. Typisk vil 106 celler i 100 μL opløsning blive farvet i 1 time. De fleste kommercielt opnåede antistoffer vil være nok til at udføre 25-100 tests.
  7. Andelen af antigenresponsceller bestemmes ved at gating den relevante lymfocytpopulation (celler er gated on af CD45, derefter af CD3 og senere af CD4- eller CD8-ekspression) som vist i figur 2. Udfør baggrundsfarvning på ikke-stimulerede celler for alle cytokiner, der skal analyseres. Screen 100.000 celler for at analysere hvert cytokin for både stimulerede celler og kontrol.

4. Vurdering af lymfocytfunktion/inflammatoriske mediatorer i lungevæv

  1. Det er normalt ikke muligt at opnå nok lymfocytter fra bronkoskopi; Brug derfor lungevævet fra lobectomiprøver. Optimering af lungevævsprøver kræver tæt kontakt med anatomisk patologitjeneste. Sørg for, at vævet har en margen på mindst 3 cm fra tumoren og er det cellulære væv uden signifikant emfysem (som bestemt af patologen).
  2. Bryd lungevævet i en cellulær suspension, før det kan bruges til flowcytometriassays. Fordøje lungevævet kemisk (f.eks. med collagenase) eller opdele det mekanisk.
    BEMÆRK: Den mekaniske opdeling af væv kan foretrækkes, da dette er forbundet med bedre overfladefarvning af celler (f.eks. CD3/4-mærkning)19.
    1. Få lobectomy prøver fra en patolog (normalt opnået fra patienter, der gennemgår behandling af lungekræft). Skær ca. 20-40 g af prøven i 3-5 mm3 sektioner. Anbring dem i et sterilt 50 μL kammer, før de fragmenteres mekanisk ved hjælp af en passende disaggtor.
    2. Efter vævsopdeling lyser de røde blodlegemer med 0,8%NH4Cl som nævnt i trin 2.4.
    3. Resuspender cellerne i steril RPMI (volumenet afhænger af cellenumrene og er generelt 10-20 ml), og filtrer dem derefter gennem et 100 μm sterilt nylonnet. Tæl antallet af levedygtige celler ved hjælp af trypan blå udelukkelsesmetode.
  3. NTHi infektion assay
    1. Resuspender lungecellerne til en endelig cellekoncentration på 4 x 106 celler / ml pr. Rør (kontrol og stimulerede prøver).
    2. Brug en suspension på 4 x 10 6-6 x 106 celler i 1 ml RPMI til det (negative) kontrolrør. Brug den samme mængde til NTHi-røret (enhver yderligere prøve kan bruges som en positiv kontrol med SEB). Inficere cellerne i NTHi-røret ved en MOI på 100 bakterier pr. Celle. Løsn hætten en halv rotation for at tillade gasoverførsel i rørene.
    3. Placer cellerne i en rørrotator, og inkuber dem ved 37 °C, mens de roterer ved 12 o / min.
    4. For at forhindre ekstracellulær eksport af cytokiner tilsættes en Golgi-blokker (Brefeldin A) til cellesuspensionerne 1 time efter stimulering til en endelig koncentration på 10 μg/ml. Cellesuspensionerne returneres til yderligere 16-22 timers inkubation ved rotation (trin 4.3.3).
    5. Cellesuspensionen vaskes med 500 μL PBS indeholdende 1% bovin serumalbumin (BSA) og 0,01% NaN3. Fix og gennemtrængelig cellerne som beskrevet i henholdsvis trin 3.5 og trin 3.6.
    6. Tilsæt antistofferne til intracellulær cytokinfarvning (valget af antistoffer bestemmes af investigator, som anført i NOTE i trin 3.6). Plet cellesuspensionen for specifikke humane lymfocytcelleoverflademarkører (f.eks. CD45, CD3 osv.) i 1 time. Cellerne vaskes med PBS, fikser og gennemtrænger dem som beskrevet i trin 3.5-3.6.
    7. Inkubere cellerne med intracellulære cytokinfarvningsantistoffer (f.eks. IFN-γ og TNF-α eller IL-13 og IL-17A) i 1 time.
      BEMÆRK: Det anbefales at plette overflademarkører først og derefter intracellulært, da fiksering kan forårsage konformationsændringer i overfladeproteinerne, som antistoffer binder til.
    8. Cellerne vaskes med 500 μL PBS, og 100 μL PBS resuspenderes før dataindsamling på et flowcytometer.
  4. Et perlearray-assay kan bruges sammen til at analysere supernatanten beskrevet i trin 3.2 (Udfør dette uden Brefeldin A). Dette muliggør analyse af en lang række forskellige inflammatoriske mediatorer (potentielt op til 40-50 mediatorer). Supernatanten opsamles i 100 μL aliquoter og opbevares ved -70 °C, indtil den er klar til analyse. Alternativt kan man bruge multiplex kemiluminescerende assays20.
    1. Brug multiplex perlearrays til at analysere de optøede prøver. Brug det lagrede supernatant til at analysere cytokinproduktionen efter producentens anvisninger.
    2. Udfør erhvervelsen af multiplexperlearrayet på et flowcytometer. Brug relevant software til at udføre downstream-dataanalysen.
      BEMÆRK: Dette perlearray-assay kan også udføres på supernatant fra perifert blod og / eller BAL-prøver.

5. Vurdering af lungeproteolyse ved konfokal mikroskopi

BEMÆRK: Fluorescerende konfokal mikroskopi er gratis for flowcytometri og kan bruges til at vurdere protease og ROS inflammatoriske reaktioner. Ekstracellulære fælder såsom NET'er og MET'er består af ekstracellulær kromatin (DNA) med andre inflammatoriske mediatorer, især proteaser såsom neutrofil elastase (NE) og matrixmetalloproteinaser (MMP). De kan vurderes i BAL og lungevæv ved hjælp af konfokal mikroskopi, og dette er tidligere blevet beskrevet af Sharma, R. et al.21.

  1. Vurder direkte proteaseekspression i lungevæv (som beskrevet i trin 4.2.1) ved hjælp af konfokal mikroskopi og in situ zymografi15,17.
    1. Brug enten frisk eller frosset ikke-fikseret lungevæv. Monter sektionerne skåret til en tykkelse på 4 μm på superfrost / vedhæftningsdias. Forvarm sektionerne i 1x reaktionsbuffer i 5 min.
    2. Tilsæt fluorescein-mærket gelatinesubstrat (30 μg / ml pr. Sektion) direkte på individuelle dias for at måle proteolyse via virkningen af metalloproteinaser.
    3. Gliderne anbringes vandret, og der inkuberes i et lysbeskyttet, befugtet kammer ved 37 °C i 1 time.
    4. Skyl sektionerne i 1x reaktionsbuffer, inden de monteres.
    5. Som en negativ kontrol tilsættes kun reaktionsbufferen uden fluorescerende gelatine til sektionerne.
    6. Brug et konfokalmikroskop til at analysere diffusionen af substratet ved undersøgelse. Brug ImageJ til at bestemme lungeområdet med tegn på proteolyse. Til dette måles lungeområdet, der har farvning over baggrunden for den slukkede prøve. Som en anden kontrol skal du bruge lungevævet uden fluorescerende gelatine tilsat15.
      BEMÆRK: Udfør dette på mindst 10 synsfelter med høj effekt (FOV) for hver prøve.
  2. Mål det ekstracellulære ROS-udtryk i lungevæv ved immunreaktivitet for 3-nitrotyrosin (et giftigt oxidativt stressprodukt)13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De repræsentative resultater viser, hvordan inflammatoriske immunresponser på NTHi kan vurderes / kvantificeres ved flowcytometri og konfokal mikroskopi. En vigtig del af fortolkningen af resultaterne er sammenligningen i fluorescens mellem kontrolprøver og stimulerede prøver. En række indledende eksperimenter er normalt nødvendige for at optimere farvningen af prøver. Hvor mange forskellige farver, der kan undersøges samtidigt, afhænger af antallet af kanaler, der er tilgængelige på flowcytometeret/konfokalmikroskopet. Resultaterne er vist til vurdering af 1) ROS-produktion, 2) intracellulær cytokinfarvning af humant lungevæv og 3) in situ-zymografi til måling af lungeproteolyse.

Figur 1 viser repræsentationen af ROS-produktion af monocytter. Målingen af ROS sker ved oxidation af DHR123 for at producere fluorescens. Celler er gated on, og deres median fluorescens vurderes ved flowcytometri. Medianfluorescensen af den stimulerede prøve sammenlignes med kontrollen.

Figur 2 viser den intracellulære produktion af cytokiner af lymfocytter afledt af humant lungevæv. Lungevævet skal nedbrydes til enkeltcellesuspension, før flowcytometriassays kan udføres for at vurdere inflammatorisk mediatorproduktion, f.eks. cytokinproduktion af lymfocytter. Lungevæv kan nedbrydes mekanisk eller fordøjes kemisk, f.eks. ved kollagenase. De mekaniske nedbrydningsmetoder kan give overlegne resultater, især med hensyn til fastholdelse af celleoverfladefarvning (f.eks. CD3 og CD4). Filtrering af prøverne er vigtig for at udelukke affald, der kan forstyrre analysen.

Figur 3 viser ekspressionen af proteaseaktivitet målt ved in situ zymografi. Unfixed væv bruges til at vurdere protease aktivitet. Disse prøver fryses typisk ved -70 °C indtil analyse. Arealet af vævet, der har proteasefluorescens, måles, og resultaterne sammenlignes mellem kontrolprøver og stimulerede prøver.

Figure 1
Figur 1: ROS-produktion efter monocytter. (A) Panelet viser gatingstrategien for mononukleære celler i perifert blod (PBMC), hvor fremadrettet spredning og sidespredning anvendes til at definere fagocytpopulationen. I panel (B) defineres fagocytpopulationen yderligere ved CD14-ekspression for at mærke monocytterne. Denne monocytpopulation analyseres for DHR-fluorescens i kontrol (C) og stimulerede prøver (D). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Cytokinproduktion i lungevæv. Celler analyseres først for deres ekspression af leukocytmarkøren CD45 (A) ved hjælp af flowcytometri. Denne population analyseres derefter yderligere for CD3-ekspression (B) og CD4/CD8-ekspression (C). CD3/CD4+ celler vurderes til intracellulær cytokinproduktion i kontrol (D) og NTHi-stimulerede prøver (E). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Lunge in situ zymografi. Panel (A) viser ekspressionen af kromatin/DAPI i dele af lungevæv. Panel (B) viser fluorescerende farvning, hvilket indikerer tilstedeværelsen af MMP-aktivitet. Panel (C) viser det flettede billede, der angiver, at MMP-aktiviteten også er co-lokaliseret med udtrykket af kromatin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De metoder, der er anført her, bruger fluorescensbaseret flowcytometri og konfokal mikroskopiteknikker, der kan bruges sammen for at få detaljerede oplysninger om det inflammatoriske lungerespons på Hi.

Etablering af den passende antigene formulering af Hi, der skal anvendes, er kritisk, og det er tilrådeligt at have specifikke input fra en mikrobiolog i denne henseende. Live Hi inducerer et stærkere svar, mens dræbte Hi-præparater og Hi-komponenter er mere standardiserede og er lettere at opbevare. PI vil kun mærke døde bakterier22; andre farvestoffer såsom carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) kan bruges til at mærke levende bakterier til fagocytoseassays23. Der bør udføres en række indledende forsøg for at optimere det passende antigen. Til brug af live NTHi er en MOI på 100: 1 optimal; en lavere MOI inducerer muligvis ikke et klart immunrespons, mens en højere MOI kan være giftig for cellerne. En dosis-respons-kurve kan dog give nyttige oplysninger og kan være meget værdifuld, især med den indledende optimering af teknikken24. Som en positiv kontrol kan der anvendes en kommercielt opnået form for inaktiveret Staphylococcus aureus-antigen, som også er mærket med PI som ovenfor for ROS / fagocytose-assayet. For T-celleassays kan stimulering med Staphylococcal superantigen E (SEB) anvendes som en positiv kontrol19,25.

Protokollerne for udtagning af BAL- og/eller lungevævsprøver skal fastlægges klart. BAL-prøverne kan være ret variable mellem forskellige operatører. En håndholdt sprøjte til højre midterste lobe skylning giver gode resultater26. Indhentning af lungevævsprøven fra lobectomiprøver kræver etablering af et samarbejde med en patolog. Lungevævsprøven skal have en vis margen fra tumoren (ideelt mindst 3-4 cm). Større prøver (f.eks. mindst 25-50 g) vil give flere celler samt prøver, der er mere proksimale uden åbenlyst emfysem. Den mekaniske opdeling af lungevævet er tidskrævende og vil generelt tage mindst 2-3 timer for hver prøve19,27.

Foreløbige eksperimenter skal udføres for at optimere farvningen af forskellige fluorophorer til både flowcytometri og konfokal mikroskopi. Områder, der skal koncentreres om, omfatter identifikation af det bedste farvningspanel, farvning / koncentration og behandling af celler / væv for at maksimere levedygtigheden28. Brugen af lungevæv kan være forbundet med mere vævsaffald end andre væskeprøver såsom blod eller BAL, og dette kan have en vis effekt på differentieringen af forskellige cellulære populationer ved flowcytometri. Det passende valg af antistoffer skal bestemmes og optimeres i indledende forsøg. Til overflademærkning af lymfocytter kan anti-CD3 og CD4 anvendes til T-hjælperceller, anti-CD3 og CD8 til cytotoksiske T-celler og anti-CD3 og CD56 til NK-celler. Valget af intracellulære cytokiner, der skal undersøges, afhænger af mediatorerne af interesse og antallet af parametre / farver, der kan analyseres på flowcytometeret29. En særlig udfordring ved at arbejde med makrofager i lungevæv er deres høje niveau af autofluorescens30; Dette problem kan løses ved at sammenligne stimulerede celler med baggrundskontrol og tilføjelse af specifikke markører for betændelse såsom proteaser og histoner.

En begrænsning af disse teknikker er kravet om passende uddannet og kvalificeret personale til at udføre eksperimenterne. Veletablerede flowcytometri- og mikroskopifaciliteter er også påkrævet. Brugen af humane vævsprøver er forbundet med betydelig variation, især ved anvendelse af lungevæv; Dette kan kræve en række foreløbige eksperimenter for at optimere assays (især med spørgsmål om baggrundsfarvning).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke personalet i klinisk immunologi hos Monash Health for deres hjælp med dette arbejde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium chloride Sigma Aldrich 213330
Brefeldin Sigma Aldrich B6542
CD28 Thermofisher 16-0289-81
CD49d Thermofisher 534048
DAPI prolong gold Thermofisher P36931
DHR123 Sigma Aldrich 109244-58-8
Filcon sterile nylon mesh Becton Dickinson 340606
Gelatin substrate, Enzchek Molecular probes E12055
MACS mix tube rotater Miltenyi Biotec 130-090-753
Medimachine Becton Dickinson Catalogue number not available
Medicons 50 µm Becton Dickinson 340592
Pansorbin Sigma Aldrich 507858
Propidium iodide Sigma Aldrich P4170
Saponin Sigma Aldrich 8047152
Superfrost slides Thermofisher 11562203

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
  2. Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).
  3. King, P. T., Sharma, R. The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi). Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).
  4. Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease. Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).
  5. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  6. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).
  7. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).
  8. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).
  9. Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).
  10. Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).
  11. Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles. The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).
  12. Barenkamp, S. J. Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae. The Journal of Infectious Diseases. 165, Suppl 1 181-184 (1992).
  13. Johnston, J. W. Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 6, Unit 6D (2010).
  14. King, P. T., et al. Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).
  15. Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains. Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).
  16. King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae. Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).
  17. King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PLoS One. 10, 0120371 (2015).
  18. Aaron, S. D., et al. Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).
  19. King, P. T., et al. Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).
  20. Tsujikawa, T., et al. Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity. Cytometry A. 95, 389-398 (2019).
  21. Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).
  22. Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
  23. Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury. Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).
  24. Essilfie, A. T., et al. Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma. Thorax. 67, 588-599 (2012).
  25. Huvenne, W., et al. Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice. Respiratory Research. 12, 69 (2011).
  26. Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage. Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).
  27. Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells. Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).
  28. Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).
  29. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11, 0150606 (2016).
  30. Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).

Tags

Immunologi og infektion udgave 172 bakterier lunge betændelse flowcytometri konfokal mikroskopi
Vurdering af respiratoriske immunresponser på <em>Haemophilus influenzae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dousha, L., Sharma, R., Lim, S.,… More

Dousha, L., Sharma, R., Lim, S., Ngui, J., Buckle, A. M., King, P. T. Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae. J. Vis. Exp. (172), e62572, doi:10.3791/62572 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter