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Genetics

CD4 प्रमोटर के पास CAS9-प्रेरित डबल स्ट्रैंड ब्रेक की मरम्मत से जुड़े उत्परिवर्तनों की पहचान करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग करना

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/62583
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 2,3
1Division of Biology, Kansas State University, 2Kansas State Veterinary Diagnostic Laboratory, Kansas State University, 3Department of Diagnostic Medicine/Pathobiology, Kansas State University
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत किया गया है एसजीआरएनए / सीएएस 9 एंडोन्यूक्लिएज और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रोटोकॉल जिसका उपयोग सीडी 4 प्रमोटर के पास डबल स्ट्रैंड ब्रेक मरम्मत से जुड़े उत्परिवर्तनों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

डीएनए में डबल स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) डीएनए क्षति का सबसे साइटोटोक्सिक प्रकार है। क्योंकि अपमान के असंख्य इन घावों में परिणाम कर सकते हैं (उदाहरण के लिए, प्रतिकृति तनाव, ionizing विकिरण, unrepaired यूवी क्षति), DSBs प्रत्येक दिन अधिकांश कोशिकाओं में होते हैं। सेल की मृत्यु के अलावा, बिना मरम्मत वाले डीएसबी जीनोम अखंडता को कम करते हैं और परिणामस्वरूप उत्परिवर्तन ों को कम कर सकते हैं। ये जोखिम और डीएसबी की व्यापकता उन तंत्रों में जांच को प्रेरित करती है जिनके द्वारा कोशिकाएं इन घावों की मरम्मत करती हैं। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण को आयनीकरण विकिरण द्वारा डीएसबी के प्रेरण के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि डीएसबी मरम्मत दोषों से जुड़े उत्परिवर्तनों को ठीक से परिभाषित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान किया जा सके। हालांकि, इस दृष्टिकोण के लिए आयनीकरण विकिरण से जुड़े बेतरतीब ढंग से होने वाले डीएसबी की मरम्मत का पता लगाने के लिए कम्प्यूटेशनल रूप से चुनौतीपूर्ण और लागत निषेधात्मक पूरे जीनोम अनुक्रमण की आवश्यकता होती है। दुर्लभ काटने वाले एंडोन्यूक्लिएज, जैसे कि I-Sce1, एक एकल DSB उत्पन्न करने की क्षमता प्रदान करते हैं, लेकिन उनकी मान्यता साइटों को ब्याज के जीनोम में डाला जाना चाहिए। नतीजतन, मरम्मत की साइट स्वाभाविक रूप से कृत्रिम है। हाल की प्रगति गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) को किसी भी जीनोम लोकस के लिए कैस 9 एंडोन्यूक्लिएज को निर्देशित करने की अनुमति देती है। यह DSB मरम्मत के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है जो अगली पीढ़ी के अनुक्रमण को अधिक लागत प्रभावी बनाता है, जिससे इसे Cas9-प्रेरित DSB के डीएनए फ्लैंकिंग पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति मिलती है। पांडुलिपि का लक्ष्य एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करके इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता का प्रदर्शन करना है जो उत्परिवर्तन को परिभाषित कर सकता है जो सीडी 4 जीन के ऊपर डीएसबी की मरम्मत से स्टेम करता है। प्रोटोकॉल को बहिर्जात कारकों से जुड़े डीएसबी की म्यूटाजेनिक क्षमता में परिवर्तन ों को निर्धारित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि मरम्मत अवरोधक, वायरल प्रोटीन अभिव्यक्ति, उत्परिवर्तन, और अपेक्षाकृत सीमित गणना आवश्यकताओं के साथ पर्यावरणीय एक्सपोजर। एक बार जब किसी जीव के जीनोम को अनुक्रमित किया जाता है, तो इस विधि को सैद्धांतिक रूप से किसी भी जीनोमिक लोकस पर और उस जीव के किसी भी सेल संस्कृति मॉडल में नियोजित किया जा सकता है जिसे ट्रांसफेक्ट किया जा सकता है। दृष्टिकोण के समान अनुकूलन एक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि में विभिन्न लोकी के बीच मरम्मत निष्ठा की तुलना की अनुमति दे सकते हैं।

Introduction

जीनोमिक स्थिरता बनाए रखना सभी जीवित जीवों के लिए महत्वपूर्ण है। सटीक डीएनए प्रतिकृति और एक मजबूत डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) आनुवंशिक सामग्री 1,2 को ईमानदारी से प्रचारित करने के लिए आवश्यक है। डीएनए क्षति अधिकांश कोशिकाओं में नियमित रूप सेहोती है 2,3। जब इन नुकसानों को महसूस किया जाता है, तो सेल चक्र प्रगति को रोक दिया जाता है, और डीएनए मरम्मत तंत्र सक्रिय हो जाते हैं। डीएनए या डीएसबी में डबल स्ट्रैंड ब्रेक डीएनए क्षति 3,4 के सबसे जहरीले और उत्परिवर्ती प्रकार हैं।

जबकि कई डीडीआर सिग्नलिंग मार्ग इन घावों की मरम्मत कर सकते हैं, सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किए गए डीएसबी मरम्मत मार्ग होमोलोगस पुनर्संयोजन (एचआर) और गैर-होमोलोगस एंड जॉइनिंग (एनएचईजे) हैं। एचआर एक काफी हद तक त्रुटि मुक्त मार्ग है जो एक सजातीय टेम्पलेट के रूप में एक बहन क्रोमैटिड का उपयोग करके एक डीएसबी की मरम्मत करता है। यह एक सेल चक्र 5,6,7 के एस चरण और जी 2 चरण में होता है। एनएचईजे अधिक त्रुटि-प्रवण है, लेकिन यह सेल चक्र 8,9 में हो सकता है। विशिष्ट मरम्मत तंत्र10,11,12 की दक्षता को मापने के लिए विभिन्न रिपोर्टर assays विकसित किए गए हैं। ये assays एक रीडआउट11,13 के रूप में GFP या mCherry का उपयोग कर DSB मरम्मत मार्ग गतिविधि के एक उच्च थ्रूपुट माप के लिए प्रवाह cytometry पर भरोसा करते हैं। जबकि अत्यधिक कुशल, वे कृत्रिम रूप से पेश किए गए डीएसबी में होने वाली विहित मरम्मत पर भरोसा करते हैं।

डीएसबी मरम्मत का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न अन्य तरीकों का उपयोग किया जाता है। इनमें से कई इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) माइक्रोस्कोपी1,14 पर भरोसा करते हैं। IF माइक्रोस्कोपी मरम्मत परिसरों के असतत परमाणु foci प्रतिनिधि का पता लगाता है के बाद DSBs genotoxic रसायनों या ionizing विकिरण15,16 के संपर्क में आने से प्रेरित कर रहे हैं. इन फोकी के गठन और संकल्प को ट्रैक करना क्रमशः14,17 मरम्मत दीक्षा और पूरा होने का संकेत प्रदान करता है। हालांकि, डीएसबी प्रेरण के इन तरीकों (यानी, रसायनों या आयनीकरण विकिरण) जीनोम में परिभाषित स्थानों पर डीएसबी का कारण नहीं बनते हैं। डीएसबी की केवल एक छोटी संख्या (जैसे, 2-4) को लगातार प्रेरित करने के लिए उनका उपयोग करना भी कार्यात्मक रूप से असंभव है। नतीजतन, डीएसबी को प्रेरित करने के सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले तरीके जीनोम18 में बेतरतीब ढंग से वितरित घावों की एक भीड़ का कारण बनते हैं। एक दुर्लभ काटने वाले एंडोन्यूक्लिएज के लिए मान्यता साइट को सम्मिलित करके और प्रासंगिक एंडोन्यूक्लिएज को व्यक्त करके डीएसबी की एक छोटी संख्या पेश की जा सकती है, जैसे कि I-Sce119। दुर्भाग्य से, एक लक्ष्य साइट का आवश्यक एकीकरण अंतर्जात जीनोमिक लोकी पर डीएसबी की परीक्षा को रोकता है।

यह पांडुलिपि उपयोगकर्ता-परिभाषित लोकस पर उत्पन्न डीएसबी की मरम्मत से जुड़े उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक विधि का वर्णन करती है। हम एक डीएसबी से जुड़े उत्परिवर्तन की संख्या बढ़ाने के लिए एक वायरल प्रोटीन की क्षमता का आकलन करने के लिए लागू दृष्टिकोण का एक प्रतिनिधि उदाहरण प्रदान करते हैं। विशेष रूप से, यह पांडुलिपि एक एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) के उपयोग का वर्णन करती है ताकि एक कैस 9 एंडोन्यूक्लिएज को निर्देशित किया जा सके ताकि मानव सीडी 4 में एक डीएसबी को प्रेरित किया जा सके, जो वेक्टर नियंत्रण (एचएफके एलएक्सएसएन) और एचएफके को व्यक्त करता है जो मानव पैपिलोमा वायरस टाइप 8 (एचएफके 8ई 6) के ई 6 प्रोटीन को व्यक्त करता है। ब्रेक के आसपास के क्षेत्र के लक्षित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) घाव की मरम्मत से जुड़े उत्परिवर्तन को सख्ती से परिभाषित करने की अनुमति देता है। इन आंकड़ों से पता चलता है कि वायरल प्रोटीन डीएसबी मरम्मत के दौरान उत्परिवर्तन में लगभग 20 गुना वृद्धि का कारण बनता है। यह पूरे जीनोम अनुक्रमण की आवश्यकता के बिना एक ही स्थान पर डीएसबी के म्यूटाजेनिक परिणामों का एक निष्पक्ष लक्षण वर्णन भी प्रदान करता है। सिद्धांत रूप में, प्रोटोकॉल को जीनोम लोकी या सेल लाइनों के बीच उत्परिवर्तन के सापेक्ष जोखिम की तुलना करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

1. सेल चढ़ाना

  1. मानव केराटिनोसाइट वृद्धि पूरक (एचकेजीएस) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ केराटिनोसाइट संस्कृति मीडिया (10 एमएल / प्लेट) में 10 सेमी प्लेटों में एचएफके एलएक्सएसएन और एचएफके 8ई 6 कोशिकाओं को बढ़ाएं। 5% सीओ2 के साथ एक जैकेट इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 80% संगम पर कोशिकाओं को बढ़ाएं।
  2. ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 3 एमएल (0.05%, एथिलीनडामाइन टेट्राएसिटिक एसिड) के साथ संस्कृति मीडिया को बदलें। 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) की समान मात्रा के साथ ट्रिप्सिन को बेअसर करें और पूरक मीडिया और कोशिकाओं को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  3. HKGS के साथ केराटिनोसाइट संस्कृति मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को पुन: निलंबित कर दिया। हेमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की सांद्रता निर्धारित करें।
  4. प्लेट 4 x 105 कोशिकाओं / 6 सेमी प्लेटों (HFK LXSN के लिए दो प्लेटों और HFK 8E6 के लिए दो प्लेटों) HKGS और 1% पेनिसिलिन और streptomycin के साथ केराटिनोसाइट संस्कृति मीडिया के 4mL में। 5% सीओ2 के साथ एक जैकेट इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ो।
    नोट:: HFK कक्षों का विश्लेषण दो कारणों से इस प्रोटोकॉल के लिए चुना गया था। सबसे पहले, एचएफके सेल लाइन को ट्रांसफेक्ट करना एक मुश्किल है। इस प्रकार, यह प्रदर्शित करके कि प्रोटोकॉल इस सेल लाइन में काम करता है, सबूत प्रदान किए जाते हैं कि यह संभवतः अधिक आमतौर पर उपयोग की जाने वाली और अधिक आसानी से ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं में काम करेगा। दूसरे, पहले प्रकाशित डेटा से पता चलता है कि एक वायरल प्रोटीन (8E6) डीएनए20,21,22 में डबल स्ट्रैंड ब्रेक की मरम्मत में बाधा डालता है। इस प्रकार, HFK LXSN और HFK 8E6 की तुलना हमें सेलुलर मरम्मत क्षमता में कमी के साथ जुड़े उत्परिवर्तन में वृद्धि का पता लगाने के लिए परख की क्षमता का प्रदर्शन करने की अनुमति देता है।

2. अभिकर्मक

  1. अभिकर्मक के दिन (चढ़ाना के बाद 24 घंटे), एंटीबायोटिक मुक्त पूरक मीडिया के 3 मिलीलीटर के साथ मीडिया को बदलें। एक जैकेट इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार उपयुक्त लिपिड-आधारित अभिकर्मक अभिकर्मकों के साथ कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करें।
    1. कमरे के तापमान और उपयोग करने से पहले धीरे से पिपेट के लिए गर्म अभिकर्मक अभिकर्मक।
    2. प्रत्येक सेल लाइन (HFK LXSN और HFK 8E6) के लिए, एक बाँझ 1.5 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (ट्यूब 1) में अभिकर्मक बफर (निर्माता द्वारा निर्देशित) की उचित मात्रा रखें। अभिकर्मक बफर (मॉक अभिकर्मक या ट्यूब 2) की समान मात्रा के साथ एक और ट्यूब शामिल करें।
    3. प्लाज्मिड डीएनए के 2 μg को व्यक्त करने के लिए CAS9 / sgRNA मानव CD4 (px330-CD4, 5'- GGCGTATGTGTGAGGACT) को चरण 2.2.2 से ट्यूब 1 को लक्षित करना जोड़ें। पिपेट धीरे से पूरी तरह से मिश्रण करने के लिए। ट्यूब 2 में बाँझ पानी की समान मात्रा जोड़ें।
    4. प्रत्येक सेल लाइन के लिए अकेले अभिकर्मक अभिकर्मकों (कोई प्लास्मिड नहीं) के साथ एक नियंत्रण प्लेट शामिल करें।
      नोट: दूसरी प्लेट प्रयोग में एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करती है, जिससे उपयोगकर्ता को यह पुष्टि करने की अनुमति मिलती है कि CAS9/ sgRNA के साथ अभिकर्मक किसी भी उत्परिवर्तन के लिए जिम्मेदार नहीं है।
    5. चरण 2.2.3 से डीएनए मिश्रण (ट्यूब 1) और चरण 2.2.2 से मॉक अभिकर्मक (ट्यूब 2) के साथ ट्यूब में अभिकर्मक अभिकर्मक (जैसा कि निर्माता द्वारा निर्देशित किया गया है) की उचित मात्रा जोड़ें। पिपेट धीरे से पूरी तरह से मिश्रण करने के लिए। परिसरों को बनाने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देने के लिए 15-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    6. प्लेट में ड्रॉप-वार अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें। धीरे से 1 मिनट के लिए संस्कृति रॉक समान रूप से अभिकर्मक मिश्रण वितरित करने के लिए।
  3. CAS9 अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए अभिकर्मक के बाद 48 ज के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा कोशिकाओं की कटाई।
    1. ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 1 एमएल (0.05%, एथिलीनडायमिन टेट्राएसिटिक एसिड) के साथ संस्कृति मीडिया को बदलें। 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। FBS पूरक मीडिया की समान मात्रा के साथ ट्रिप्सिन बेअसर.
    2. कोशिकाओं की प्रत्येक प्लेट के लिए, सेल निलंबन को समान एलीकोट के साथ दो माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    3. चरण 2.4.2 में एक ट्यूब से सेल गोली को अनुक्रमण के लिए फॉस्फेट बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के 1 मिलीलीटर में पुन: निलंबित करें। immunoblot के लिए बर्फ ठंडा PBS के साथ चरण 2.4.2 से अन्य ट्यूब resuspend.
  5. immunoblot के लिए पूरे सेल lysates फसल.
    1. 5 मिनट के लिए 300 x g पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant को छोड़ दें।
    2. 100 μL radioimmunoprecipitation परख बफर (RIPA lysis बफर) 1% प्रोटीज अवरोधक और ट्यूब में 1% फॉस्फेट अवरोधक के साथ मिश्रित जोड़ें, एक पिपेट के साथ अच्छी तरह से मिश्रण और बर्फ पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
      नोट: RIPA lysis बफर शामिल हैं 10 mM Tris-HCl, पीएच 8.0; 1 mM EDTA; 0.5 mM EGTA; 1% ट्राइटन एक्स -100; 0.1% सोडियम Deoxycholate; 0.1% एसडीएस; 140 mM NaCl, और विआयनीकृत पानी।
    3. सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट के लिए 13,000 x g पर lysates। Immunoblot के लिए supernatants ले लीजिए.

3. immunoblot के माध्यम से CAS9 अभिव्यक्ति को मापने

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक bicinchoninic एसिड (BCA) परख के साथ प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें।
  2. 150 मिनट के लिए 3% -8% ट्राइस-एसीटेट जेल के कुओं में प्रत्येक नमूने के प्रोटीन के 20 μg चलाएं और semidry हस्तांतरण (30 मिनट के लिए 10 V और फिर 12 मिनट के लिए 25 V) polyvinylidene difluoride झिल्ली के लिए।
  3. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 0.1% ट्विन (PBST) के साथ PBS में 5% nonfat सूखे दूध में झिल्ली को अवरुद्ध करने के बाद, एंटी-CAS9 (1: 1000) और एंटी-GAPDH (1: 1000) एंटीबॉडी जोड़ें। रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. PBST के साथ झिल्ली को धोने के बाद, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए PBST में 5% nonfat सूखे दूध में माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
  5. धब्बा छवि और densitometry23 द्वारा CAS9 स्तर निर्धारित करें. एक प्रतिनिधि धब्बा के लिए चित्र 1 देखें।
    नोट: immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा फॉस्फोराइलेटेड H2AX (S139) foci गठन का पता लगाने CAS9 गतिविधि14 को मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सेल चक्र की स्थिति के आधार पर अलग-अलग फोकी (आमतौर पर 1-4 फोकी) की कम संख्या की उम्मीद की जाती है, क्या CAS9 लक्ष्य साइट में उत्परिवर्तन आगे काटने से रोकते हैं, और CAS9 काटने वाली साइट की कितनी प्रतियां ब्याज के जीनोम में मौजूद हैं। एक प्रतिनिधि छवि चित्र 2 में दिखाया गया है।

4. न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और amplicon पीढ़ी

  1. एक उच्च आणविक वजन डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके चरण 2.4.3 से सेल नमूनों से डीएनए निकालें, जैसा कि निर्माता द्वारा निर्दिष्ट किया गया है।
  2. डेटाशीट के अनुसार इंगित विलायक के साथ प्राइमरों को फिर से निलंबित करें। संकेतित पूल में 20 μM और पूल 20 μM प्राइमरों के लिए एक ही अभिकर्मक के साथ पतला।
    नोट:: प्राइमर पूल पूरक तालिका 1 में सूचीबद्ध है।
  3. तालिका 1 में निर्दिष्ट के रूप में प्रत्येक 20 μM प्राइमर पूल के लिए एक लंबे प्रवर्धन Taq पोलीमरेज़ का उपयोग कर एक पीसीआर मास्टर मिश्रण बनाएँ।
    1. पीसीआर ट्यूबों को अलग करने के लिए मास्टरमिक्स के 21 μL जोड़ें।
  4. लक्ष्य नमूने के 4 μL जोड़ें (100 ng / प्रत्येक प्राइमर पूल के लिए अलग-अलग प्रतिक्रियाएं सुनिश्चित करें।
    1. भंवर पीसीआर परख ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज (त्वरित स्पिन) मिश्रण करने के लिए ट्यूब ढक्कन से बूंदों को हटाने के लिए.
    2. पीसीआर ट्यूबों को एक पारंपरिक थर्मल साइकिलर मशीन पर रखें।
    3. प्रोग्राम PCR मशीन के रूप में तालिका 2 में निर्दिष्ट है.
    4. एक थर्मल cycler पर प्रोग्राम चलाएँ।

5. पीसीआर सफाई

  1. एक मनका-आधारित पीसीआर क्लीनअप सिस्टम का उपयोग करके पीसीआर प्रतिक्रियाओं से प्राइमरों को निकालें।
    1. उपयोग करने से 30 मिनट पहले रेफ्रिजरेटर से साफ-सुथरे मोतियों को हटा दें।
    2. भंवर मोतियों का उपयोग करने से पहले अच्छी तरह से और सुनिश्चित करें कि सभी मोतियों को फिर से निलंबित कर दिया गया है।
    3. एक गहरी अच्छी तरह से 96-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए resuspended मोतियों के 30 μL (1.2x) जोड़ें।
    4. मोतियों वाले कुओं में पीसीआर प्रतिक्रिया के 25 μL जोड़ें।
    5. प्लेट को 2 मिनट के लिए 2000 आरपीएम पर प्लेट शेकर पर रखें।
    6. हिलाने के बाद प्लेट को 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रहने दें।
    7. एक 96-अच्छी तरह से प्लेट चुंबक पर गहरी अच्छी तरह से प्लेट रखें और 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    8. निकालें और परेशान मोतियों के बिना supernatant त्याग.
    9. जबकि प्लेट चुंबक पर बनी हुई है, 80% इथेनॉल के 180 μL जोड़ें और 30 s के लिए इनक्यूबेट करें। निकालें और supernatant छोड़ दें।
    10. चरण 5.1.9 दोहराएँ।
    11. एक 10 μL पिपेट का उपयोग करके, कुओं से किसी भी शेष तरल को हटा दें और छोड़ दें।
    12. मोतियों को 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सूखने दें।
    13. मोतियों वाले कुओं में न्यूक्लिएज मुक्त पानी के 20 μL जोड़ें और चुंबक से प्लेट को हटा दें।
    14. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 2000 आरपीएम पर प्लेट को हिलाएं।
    15. प्लेट को 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    16. प्लेट को एक चुंबक स्टैंड पर रखें और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    17. supernatant को एक दूसरे में निकालें, पीसीआर प्लेट लेबल। इसमें साफ-सुथरा डीएनए होता है।
  2. फ्लोरोमीटर के साथ प्रत्येक प्रतिक्रिया की एकाग्रता को मापें।
    1. सुनिश्चित करें कि dsDNA फ्लोरोमीटर अभिकर्मक कमरे के तापमान पर हैं।
    2. फ्लोरोमेट्रिक परख ट्यूबों प्लस मानकों के लिए दो अतिरिक्त ट्यूबों की स्थापना.
    3. सभी लेकिन दो ट्यूबों के लिए 1x dsDNA काम समाधान के 199 μL जोड़ें। पिछले दो ट्यूबों के लिए काम कर रहे समाधान के 190 μL जोड़ें।
    4. परख ट्यूबों को अलग करने के लिए दो मानकों ( सामग्री की तालिका में शामिल) के 10 μL जोड़ें।
    5. फ्लोरोमीटर मास्टरमिक्स ट्यूबों के लिए प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया का 1 μL जोड़ें।
    6. भंवर ट्यूबों मिश्रण और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ऊष्मायन करने के लिए।
    7. फ्लोरोमीटर के घर स्क्रीन पर, परख kitin उपयोग (1x dsDNA) के साथ बटन का चयन करें तो पढ़ें मानकों का चयन करें और नमूने चलाएँ.
    8. मानक 1 ट्यूब डालें, पढ़ें बटन का चयन करें और फिर मानक 2 के लिए दोहराएँ।
    9. चरण 5.2.6 के बाद, एक नमूने के लिए दोहराएँ, 1 μL की एक नमूना मात्रा का चयन करें और परिणामस्वरूप एकाग्रता प्रदान की जाएगी।
    10. शेष नमूनों के लिए चरण 5.2.7 दोहराएँ।
  3. नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करके सभी प्रतिक्रियाओं की अनुमानित दाढ़ता की गणना करें और प्रत्येक व्यक्तिगत नमूने से प्रतिक्रियाओं की समान सांद्रता को अलग से पूल करें (प्रति नमूना एक अंतिम पूल)।
    Equation 1
    1. अंतिम पूल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए चरण 5.2.1 से 5.2.7 को दोहराएँ।
  4. एक केशिका वैद्युतकणसंचलन मशीन / agarose जेल पर amplicon पूल की जाँच के रूप में निर्माता द्वारा निर्दिष्ट.
    1. नमूनों की उचित संख्या के लिए केशिका वैद्युतकणसंचलन ट्यूब तैयार करें। निर्माता द्वारा निर्दिष्ट के रूप में डीएनए बफर के 7 μL जोड़ें।
    2. डीएनए बफर युक्त ट्यूब के लिए amplicon पूल के 4 μL जोड़ें.
    3. वैद्युतकणसंचलन मशीन पर ट्यूब रखें और dsDNA के लिए निर्माता द्वारा निर्दिष्ट के रूप में मशीन चलाएँ।
    4. वैद्युतकणसंचलन जेल चित्रों को देखें जो बैंड को ~ 5 केबी (एम्प्लिकॉन का आकार) के लिए स्थानीयकृत करने के लिए सुनिश्चित करते हैं।
  5. नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करके सभी प्रतिक्रियाओं की अनुमानित दाढ़ता की गणना करें और प्रत्येक व्यक्तिगत नमूने से प्रतिक्रियाओं की समान सांद्रता को अलग से पूल करें (प्रति नमूना एक अंतिम पूल)।
    Equation 2

6. पुस्तकालय की तैयारी

  1. पुस्तकालय की तैयारी के लिए चरण 5.3.1 से 0.2 ng/μL तक नमूना पूल को पतला करें।
    1. लघु अनुक्रमों (300bp) के साथ संगत एक कम-इनपुट लायब्रेरी तैयारी किट का उपयोग करके निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए चरण 5.3 में बनाए गए प्रत्येक नमूना पूल के लिए अद्वितीय अनुक्रमणिका संयोजनों का उपयोग करके लायब्रेरी तैयार करें.
      नोट:: अनुक्रमणिका अनुक्रमों का चयन करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें। सभी अनुक्रमणिका पुस्तकालय तैयारी किट के लिए amenable नमूनों के लिए काम करेंगे.
    2. पुस्तकालय की तैयारी के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार सभी नमूनों को पूल करें।
      नोट:: लायब्रेरी पूल बनाने से पहले, अपने लक्ष्य अनुक्रम के 250x कवरेज के लिए आवश्यक पठन की संख्या की गणना करें और सुनिश्चित करें कि चयनित अनुक्रमण कारतूस प्रत्येक शामिल नमूने के लिए पर्याप्त कवरेज प्रदान कर सकते हैं। 0.5Mb कुल के लिए, यह 1M पढ़ने के बराबर होगा।
  2. अनुक्रमण के लिए लायब्रेरी पूल तैयार करें.
    1. Thaw और एक 300 चक्र कारतूस और अनुक्रमण अभिकर्मकों तैयार करते हैं।
    2. Denature और sequencer के निर्माता के निर्देशों के अनुसार चरण 5.1.1 में बनाए गए अनुक्रमण पूल पतला।
    3. अनुक्रमण अभिकर्मकों के लिए विकृत और पतला लाइब्रेरी पूल जोड़ें और निर्माता द्वारा निर्दिष्ट के रूप में अनुक्रमण मशीन चलाएँ ।
      नोट:: समस्या शूटिंग के लिए अनुलग्न तालिका 3 देखें।

7. डेटा विश्लेषण

नोट:: सभी डेटा चरण जीनोमिक डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में किए जाते हैं। कोष्ठक उपयोगकर्ता इनपुट को इंगित करते हैं। चिह्न से बड़ा किसी भी दिए गए चरण के लिए माउस क्लिक के क्रम को इंगित करता है (उदाहरण के लिए, 1st माउस क्लिक>2nd माउस क्लिक)

  1. Open Software पर क्लिक करके पढ़ता है आयात करें > Illumina आयात > करें > फ़ाइलों का चयन करें > अगला > सहेजें > समाप्त करने के लिए स्थान का चयन करें. पढ़ता है अब सॉफ्टवेयर में दिखाई देगा.
  2. ट्रिम और पढ़ता है फ़िल्टर.
    1. गहरे अनुक्रम डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में, कच्चे रीड्स डिफ़ॉल्ट पैरामीटर ट्रिम करें।
    2. पठन हाइलाइट करें और क्लिक करें टूलबॉक्स > अनुक्रमण डेटा तैयार करें > ट्रिम करें > अगला > अगला > > अगला > अगला > > सहेजें अगला > (सहेजने के लिए स्थान का चयन करें) > समाप्त करें
  3. संदर्भ के लिए छंटनी की गई पढ़ता है मैप करें।
    1. मानचित्र छंटनी 2 के मिलान स्कोर, 3 की बेमेल लागत और 2 की सम्मिलन/ विलोपन लागत का उपयोग करके चरण 4.1 में उपयोग किए गए संदर्भ अनुक्रम को पढ़ता है। सुनिश्चित करें कि लंबाई अंश 0.7 से ऊपर है और समानता अंश 0.8 पर या उससे ऊपर है।
    2. छंटनी की गई पठन फ़ाइल को हाइलाइट करें और > पुन: अनुक्रमण विश्लेषण > मानचित्र संदर्भ > अगले > (संदर्भ अनुक्रम का चयन करें) > अगला > (सुनिश्चित करें कि पैरामीटर ऊपर के रूप में इंगित किए गए हैं) > अगला > सहेजें > सहेजें (सहेजने के लिए स्थान का चयन करें) > समाप्त करें के लिए डिज़ाइन करें क्लिक करें.
  4. प्रकार और indels निकालें.
    1. एक उपयुक्त इंडेल कॉलर का उपयोग करते हुए, 0.005 या उससे कम की पी-मान थ्रेशोल्ड और 3 के बेमेल की अधिकतम संख्या का उपयोग करके इंडेल निकालें।
    2. मैप की गई पठन फ़ाइल हाइलाइट करें और अगले > > > Indels और संरचनात्मक वेरिएंट > वैरिएंट डिटेक्शन > Resequencing Analysis > Resequencing Analysis > Toolbox पर क्लिक करें (सुनिश्चित करें कि आवश्यक महत्व इनपुट > इनपुट है अगला > सहेजें > (सहेजने के लिए स्थान का चयन करें) > समाप्त करें।
    3. एक उपयुक्त संस्करण कॉलर का उपयोग करके, 5% के महत्व का उपयोग करके पठन मैपिंग से वेरिएंट को कॉल करें।
    4. मैप की गई पठन फ़ाइल को हाइलाइट करें और > पुन: अनुक्रमण विश्लेषण > वैरिएंट डिटेक्शन > कम आवृत्ति वेरिएंट डिटेक्शन > अगले > (सुनिश्चित करें कि आवश्यक महत्व इनपुट है > अगला > अगला > अगला > सहेजें > (सहेजने के लिए स्थान का चयन करें) > समाप्त करें।
      नोट: indel और संस्करण कॉलर में मेजबान जीनोम के अगुणित के लिए खाते के लिए सुनिश्चित करें। 5% से नीचे म्यूटेंट न निकालें। यह दहलीज पीसीआर और अनुक्रमण परख के साथ जुड़े त्रुटियों के लिए खातों. सामान्यीकरण (CAS9 के immunoblot का पता लगाने के आधार पर) अनुक्रमण कवरेज को समायोजित करके किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, यदि नमूना ए में नमूना बी की अभिकर्मक दक्षता से दोगुना है, तो नमूना ए से 50% पढ़ने का उपयोग विश्लेषण के लिए किया जाना चाहिए। यह यादृच्छिक नमूनाकरण द्वारा किया जाना चाहिए और 100x से नीचे किसी भी नमूने के लिए कवरेज को कम नहीं करना चाहिए।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल के लिए तीन प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत किए गए हैं। चित्रा 1 एक immunoblot HFK नियंत्रण (LXSN) और HFK बीटा-HPV 8E6 (8E6) व्यक्त में CAS9 की अभिव्यक्ति की पुष्टि अभिव्यक्ति है। अभिकर्मक के बाद 48 घंटे, पूरे सेल लिसेट को काटा गया और बाद में एक एंटी-कैस 9 एंटीबॉडी (या लोडिंग नियंत्रण के रूप में जीएपीडीएच) के साथ जांच की गई। परिणाम से पता चलता है कि HFK LXSN और HFK 8E6 CAS9 की समान मात्रा में व्यक्त कर रहे हैं जो यह दर्शाता है कि अभिकर्मक दक्षता दो सेल लाइनों के बीच समान है। चित्रा 2 एक immunofluorescence माइक्रोस्कोपी छवि CAS9 प्रेरित DSBs pH2AX foci, DSBs24 के लिए एक मानक मार्कर का उपयोग कर दिखा रहा है. यह इंगित करता है कि दो डीएसबी CAS9 / sgRNA द्वारा प्रेरित हैं और इस प्रकार पुष्टि करता है कि DSB प्रेरण अपेक्षित रूप से हो रहा है। चित्रा 3 से पता चलता है कि 8E6 CAS9 प्रेरित DSB 22 के आसपास200 Kb के भीतर जीनोमिक विविधताओं को बढ़ाता है। यह परिकल्पना के अनुरूप है कि HPV8 E6 DSB मरम्मत को विनियमित करता है और जीनोमिक अस्थिरता को बढ़ाता है। यह आंकड़ा एक तरीका दिखाता है जिसमें इस दृष्टिकोण से प्राप्त डेटा को प्रदर्शित किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: untransfected और transfected HFK कोशिकाओं में CAS9 अभिव्यक्ति की तुलना में immunoblot की प्रतिनिधि छवि sgRNA / CAS9 plasmids HFK कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किया गया था। कैस 9 प्रोटीन का पता लगाने के लिए एंटी-कैस 9 एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। GAPDH का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: SGRNA / CAS9 transfected सेल और untransfected नियंत्रण में फॉस्फोराइलेटेड हिस्टोन H2AX (S139) की प्रतिनिधि immunofluorescence छवि। DAPI का उपयोग DNA (Blue) को दागने के लिए किया जाता था। pH2AX (लाल) CAS9-प्रेरित DSB के लिए एक मार्कर है। यह दर्शाता है कि इष्टतम CAS9 अभिव्यक्ति ऑफ-टारगेट क्लीवेज की अनुपस्थिति से प्राप्त की गई है। लक्षित जीनोम लोकी की संख्या के आधार पर (सेल के अगुणित, लक्ष्य साइट कॉपी संख्या भिन्नताओं, या सेल चक्र की स्थिति में परिवर्तन से परिवर्तित), फोकी की संख्या अधिक हो सकती है। हालांकि, किसी भी वृद्धि का विश्लेषण किए गए सेल प्रकार और लक्ष्य साइट के आधार पर अनुमानित होना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: बीटा-एचपीवी 8ई 6 डीएसबी मरम्मत के दौरान जीनोमिक अस्थिरता को बढ़ाता है। (ए) जीनोम के अनुक्रमित भाग के साथ सीएएस 9 प्रेरित डीएसबी के प्लेसमेंट की योजनाबद्ध। (बी) एचएफके एलएक्सएसएन और एचएफके 8ई 6 में उत्परिवर्तनीय घटनाओं के प्रकारों द्वारा समूहीकृत जीनोमिक विविधताएं। जीनोमिक विविधताओं के प्रत्येक समूह और विविधताओं की कुल संख्या की तुलना HFK LXSN और HFK 8E6 के बीच की गई थी। (C) HFK LXSN (दाईं ओर) और HFK 8E6 कोशिकाओं (बाईं ओर) में डीएनए उत्परिवर्तन का सिर्कोस प्लॉट। काले तीर CAS9 काटने साइटों का संकेत देते हैं। सबसे भीतरी सर्कल समान जीनोमिक पुनर्व्यवस्था के बीच कनेक्शन प्रदर्शित करता है। जीनोमिक विविधताओं के प्रकारों द्वारा रंगीन जीनोमिक पुनर्व्यवस्था का स्थान पांच संकेंद्रित हलकों में दिखाया गया है (नीला एसएनपी का प्रतिनिधित्व करता है, हरा सम्मिलन का प्रतिनिधित्व करता है, लाल विलोपन का प्रतिनिधित्व करता है, बैंगनी एमएनवी का प्रतिनिधित्व करता है, और काला प्रतिस्थापन का प्रतिनिधित्व करता है)। सबसे बाहरी सर्कल में स्कैटर प्लॉट ब्रेकपॉइंट्स (ब्लैक), टैंडेम डुप्लिकेशन (लाल), और पॉइंट इंडल्स (ग्रे) प्रदर्शित करता है, जिसमें बाहरी किनारे की निकटता उच्च संस्करण अनुपात का प्रतिनिधित्व करती है। एसएनपी, एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता। MNV, बहु-न्यूक्लियोटाइड भिन्नता। सेल लाइनों के बीच सांख्यिकीय अंतर को छात्रों के टी-टेस्ट का उपयोग करके मापा गया था। p < 0.001 को इंगित करता है". यह अनुमति22 के साथ पहले से प्रकाशित संदर्भ से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: पीसीआर मास्टर मिश्रण घटकों. इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: PCR प्रोग्राम सेटिंग्स। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3: परेशानी शूटिंग. इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: पीसीआर के लिए प्राइमर पूल की सूची। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रदान की गई जानकारी की गहराई के अलावा, इस विधि के कई फायदे हैं। सबसे पहले, सिद्धांत रूप में, डीएसबी की मरम्मत, ब्याज की कोशिका के जीनोम को संशोधित किए बिना किसी भी जीनोमिक लोकी पर मूल्यांकन किया जा सकता है। दूसरा, मरम्मत के एनजीएस विश्लेषण तक पहुंच एक परिभाषित क्षेत्र के लिए लक्षित एकल डीएसबी बनाने और विश्लेषण करने के द्वारा प्रदान की गई कम लागत और कम्प्यूटेशनल प्रयास से बढ़ जाती है। अंत में, अतिरिक्त जीवों के जीनोम नियमित रूप से उपलब्ध होने और विविध स्तनधारी और गैर-स्तनधारी सेल लाइनों के सफल अभिकर्मक का प्रदर्शन करने वाले कई प्रकाशनों के साथ, इस दृष्टिकोण की उपयोगिताव्यापक 10,23,24 होने की उम्मीद है।

इस पांडुलिपि ने एक उदाहरण के रूप में मानव चमड़ी केराटिनोसाइट्स में डीएसबी मरम्मत का विश्लेषण किया। अभिकर्मक दक्षता अन्य ऊतक प्रकारों की तुलना में केराटिनोसाइट्स में कम होती है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल ने इन हार्ड-टू-ट्रांसफेक्ट कोशिकाओं के लिए ऑप्टिमाइज़ किए गए एक अभिकर्मक दृष्टिकोण का उपयोग किया। अभिकर्मक दृष्टिकोण का विश्लेषण किए गए सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले CAS9-प्रेरित DSB की क्षमता की पुष्टि osteosarcoma, बृहदान्त्र कैंसर, फेफड़ों के कैंसर, फाइब्रोब्लास्ट, भ्रूण गुर्दे और मानव केराटिनोसाइट कोशिकाओं 10,23 में की गई है। हालांकि, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण करने से पहले, यह अनुशंसा की जाती है कि CAS9 अभिव्यक्ति और गतिविधि की पुष्टि की जाती है।

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम यह है कि जब CAS9 अभिकर्मक दक्षता में अंतर के लिए खाते में विश्लेषण को सामान्य करने के लिए विभिन्न नमूनों के बीच या उनके बीच तुलना की जाती है। ऐसा करने के लिए, सापेक्ष CAS9 प्रोटीन स्तर को immunoblotting और densitometry (चित्रा 1) द्वारा मापा जाना चाहिए। CAS9 दरार की विशिष्टता सुनिश्चित करना भी महत्वपूर्ण है जैसा कि अलग-अलग pH2AX (S139) foci गठन द्वारा इंगित किया गया है, IF माइक्रोस्कोपी14 (चित्रा 3) द्वारा पता लगाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, T7 एंडोन्यूक्लिएज परख CRISPR / Cas9 गतिविधि और sgRNA दक्षता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इस दृष्टिकोण की एक उल्लेखनीय सीमा यह है कि CAS9-प्रेरित DSB विकिरण या इसी तरह के शारीरिक क्षति के कारण DSB की तुलना में "क्लीनर" होते हैं। इसलिए, यहां वर्णित विधि स्वाभाविक रूप से होने वाले घावों की मरम्मत से जुड़े उत्परिवर्तनों की संख्या या गंभीरता को कम कर सकती है। अन्य अनुक्रम विशिष्ट न्यूक्लिएज का उपयोग जो लंबे समय तक ओवरहैंग के साथ डीएसबी को प्रेरित करता है, इस सीमा को दूर करने में मदद कर सकताहै। इसके अलावा, यह पूरी तरह से समझा नहीं गया है कि क्रोमैटिन क्षेत्र (जैसे, हेटरोक्रोमैटिन और यूक्रोमैटिन) कैस 9 गतिविधि को प्रभावित करता है या नहीं। इस प्रकार, उपयोगकर्ता को विभिन्न साइटों पर उत्परिवर्तन की तुलना करते समय समकक्ष CAS9 गतिविधि की पुष्टि करने के लिए सावधान रहना चाहिए।

यहां वर्णित विधि का उपयोग विभिन्न संदर्भों में डीएसबी की मरम्मत के सापेक्ष म्यूटाजेनिक परिणामों को परिभाषित करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यह उपन्यास छोटे अणु डीएनए मरम्मत अवरोधकों की परीक्षा की सुविधा प्रदान कर सकता है। यह अवरोधकों को अनुमति देगा जो रूपांतरित (अपरिवर्तित की तुलना में) कोशिकाओं में अधिक उत्परिवर्ती हैं, उन्हें कीमोथेरेपी एजेंटों के रूप में विकास के लिए प्राथमिकता दी जाएगी। यह दृष्टिकोण एक ही जीनोमिक पृष्ठभूमि के भीतर तुलना करने के लिए भी उपयोगी हो सकता है ताकि विभिन्न जीन संदर्भों (जैसे, एक प्रमोटर, बढ़ाने या दमनकर्ता के पास) पर डीएसबी मरम्मत से जुड़े उत्परिवर्तनों की आवृत्ति को निर्धारित किया जा सके, विभिन्न उत्परिवर्तनों वाली कोशिकाओं के बीच (उदाहरण के लिए, सिग्नलिंग जीन जो संरचनात्मक रूप से सक्रिय या मिससेंस म्यूटेशन हैं), या अन्य समान क्रमपरिवर्तन। दृष्टिकोण का लचीलापन और सामर्थ्य भविष्य के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस पांडुलिपि में रिपोर्ट किए गए शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (P20GM130448) (NAW और RP) के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था; राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (NCI R15 CA242057 01A1); कैनसस स्टेट यूनिवर्सिटी में जॉनसन कैंसर रिसर्च सेंटर; और अमेरिकी रक्षा विभाग (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW))। हम हमारे immunofluorescence माइक्रोस्कोपी के लिए KSU-CVM Confocal कोर और जोएल Sanneman की सराहना करते हैं। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि इन फंडिंग एजेंसियों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 Well Tissue Culture Plate Celltreat 229106 Cell culture plate
BCA Kit VWR 89167-794 BCA assay kit
Centrifuge 5910 R Eppendorf 2231000772 Tabletop Centrifuge
CLC Genomic Workbench Qiagen 832001 deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller
Digital Microplate Genie pulse Scientific industries SI-400A Plate shaker
DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) ThermoFisher Scientific MA191878 Anti-FLAG antibody
Epilife CF Kit ThermoFisher Scientific MEPICF500 Cell cultrue media and supplements
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 89510-194 Cell culture supplement
Goat anti-Rabbit IgG ThermoFisher Scientific A-11012 Secondary antibody
HighPrep PCR Clean-up system MagBio AC-60005 Bead-based PCR cleanup kit
KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit KAPA Biosystems KK2600 PCR mastermix/PCR assay
MagAttract HMW DNA kit Qiagen 67563 High Molecular Weight DNA extraction kit
Magnetic Stand-96 Thermo Fisher Scientific AM10027 96-Well Magnetic Rack
MiniAmp Thermal Cycler Applied Biosystems A37834 Thermal Cycler
Miseq Illumina SY-410-1003 Sequencer
Miseq v2 300 cycle reagent kit Illumina MS-102-2002 300-cycle cartridge/sequencing reagents
Nextera XT DNA Library Prep kit Illumina FC-131-1024 Library preparation kit
Nextera XT Kit v2 Set A Illumina 20027215 Indexes
Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates Thermo Fisher Scientific 260251 deep well 96-well plates
Penicillin-Streptomycin Solution (100X) Calsson Labs PSL02-6X100ML Antibiotics for cell culture
Phosphate Buffered Saline (PBS) Bio Basic PD8117 PBS
px330-CD4 Addgen 136938 SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT
QIAxcel Advanced System Qiagen 9001941 capillary electrophersis machine
QIAxcel DNA screening kit Qiagen 929004 DNA buffer/ capillary electrophersis tubes
Qubit 1x ds HS Assay Kit ThermoFisher Scientific Q23851 Fluorometer reagents/1x dsDNA solution
Qubit 4 Fluorometer ThermoFisher Scientific Q33238 Fluorometer
Qubit Assay Tubes Thermo Fisher Scientific Q32856 Fluorometer assay tubes
RIPA Lysis Buffer VWR VWRVN653-100ML Lysis buffer for protein extraction
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300054 Trypsin
Vortex-Genie 2 Scientific industries SI-0236 Vortex
Xfect Transfection Reagent Takara Bio 631318 Transfection reagent
genomic data analysis software QIAGEN CLC Workbench v21.0. Data analysis software

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References

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आनुवांशिकी मुद्दा 181 डीएनए क्षति प्रतिक्रिया DSB DSB मरम्मत CAS9 प्रेरित DSB अगली पीढ़ी के अनुक्रमण जीनोमिक्स
CD4 प्रमोटर के पास CAS9-प्रेरित डबल स्ट्रैंड ब्रेक की मरम्मत से जुड़े उत्परिवर्तनों की पहचान करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग करना
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Hu, C., Doerksen, T., Bugbee, T.,… More

Hu, C., Doerksen, T., Bugbee, T., Wallace, N. A., Palinski, R. Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter. J. Vis. Exp. (181), e62583, doi:10.3791/62583 (2022).

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