ここでは、CD4プロモーター近傍の二本鎖切断修復に関連する変異を同定するために使用できるsgRNA/CAS9エンドヌクレアーゼおよび次世代シーケンシングプロトコルを紹介します。
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方法論記事
次世代シーケンシングを使用して、CD4プロモーター近傍のCAS9誘導二本鎖切断の修復に関連する変異を同定
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
DNA中の二本鎖切断(DSB)は、DNA損傷の最も細胞傷害性のあるタイプである。無数の侮辱がこれらの病変(例えば、複製ストレス、電離放射線、修復されていないUV損傷)をもたらす可能性があるため、DSBは毎日ほとんどの細胞で発生します。細胞死に加えて、修復されていないDSBはゲノムの完全性を低下させ、結果として生じる変異は腫瘍形成を促進する可能性がある。これらのリスクとDSBの有病率は、細胞がこれらの病変を修復するメカニズムの調査を動機付ける。次世代シーケンシングは、電離放射線によるDSBの誘導と組み合わせることができ、DSB修復欠陥に関連する変異を正確に定義するための強力なツールを提供します。しかし、このアプローチでは、電離放射線に関連するランダムに発生するDSBの修復を検出するために、計算上困難でコストのかかる全ゲノムシーケンシングが必要です。I-Sce1などの希少切断エンドヌクレアーゼは、単一のDSBを生成する能力を提供するが、それらの認識部位は目的のゲノムに挿入されなければならない。その結果、修復部位は本質的に人工的である。最近の進歩により、ガイドRNA(sgRNA)はCas9エンドヌクレアーゼを目的の任意のゲノム遺伝子座に誘導することができます。これは、Cas9誘導DSBに隣接するDNAに焦点を合わせることを可能にすることによって、次世代シーケンシングをより費用対効果の高いものにするDSB修復の研究に適用できる可能性がある。原稿の目標は、CD4遺伝子の上流のDSBの修復に由来する変異を定義できるプロトコルを提示することによって、このアプローチの実現可能性を実証することである。このプロトコルは、比較的限られた計算要件で、修復阻害剤、ウイルスタンパク質発現、突然変異、および環境曝露などの外因性因子に関連するDSBの変異原性電位の変化を決定するために適合させることができる。生物のゲノムが配列決定されると、この方法は理論的には、任意のゲノム遺伝子座およびトランスフェクト可能なその生物の任意の細胞培養モデルにおいて採用され得る。このアプローチの同様の適応は、同じ遺伝的背景にある異なる遺伝子座間の修復忠実度の比較を可能にする可能性がある。
概要
ゲノムの安定性を維持することは、すべての生物にとって非常に重要です。正確なDNA複製と堅牢なDNA損傷応答(DDR)は、遺伝物質を忠実に伝播するために必要である1,2。DNA損傷は、ほとんどの細胞で定期的に起こる2,3。これらの損傷が感知されると、細胞周期の進行が止まり、DNA修復機構が活性化される。DNAまたはDSBの二本鎖切断は、DNA損傷の中で最も有毒で変異原性のあるタイプである3,4。
いくつかのDDRシグナル伝達経路がこれらの病変を修復することができるが、最も徹底的に研究されたDSB修復経路は相同組換え(HR)および非相同末端結合(NHEJ)である。HRは、姉妹染色分体を相同テンプレートとして使用してDSBを修復する、ほとんどエラーのない経路です。これは、細胞周期5、6、7のS期およびG2期において起こる傾向がある。NHEJはよりエラ....
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プロトコル
1. セルプレーティング
- ヒトケラチノサイト増殖サプリメント(HKGS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むケラチノサイト培養培地(10mL/プレート)中の10cmプレートでHFK LXSNおよびHFK 8E6細胞を増殖させる。5%CO2を有するジャケットインキュベーター中で37°Cで約80%コンフルエントまで細胞を増殖させる。
- 培養培地を3mLのトリプシン-EDTA(0.05%、エチレンジアミン四酢酸)と交換する。37°Cで3分間インキュベートする。等量のウシ胎児血清(FBS)添加培地でトリプシンを中和し、細胞を15mL遠沈管に移す。300 x g で5分間遠心分離する。
- 細胞をHKGSで10mLのケラチノサイト培養培地で再懸濁する。血球計数器で細胞の濃度を決定する。
- HKGSおよび1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む4mLのケラチノサイト培養培地中のプレート4 x 105細胞/ 6cmプレート(HFK LXSN用のシード2プレートおよびHFK 8E6用の2つのプレート)をプレート4 x105 細胞/ 6cmプレート。5%CO2を有するジャケットインキュベーター中で37°Cで増殖させる。
注:HFK細胞の分析は、2つの理由でこのプロトコルのために選択された。第1に、HFKはトランスフェクトが困難な細胞株である。....
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結果
このプロトコルの 3 つの代表的な結果を示します。図1は、β-HPV 8E6(8E6)を発現するHFKコントロール(LXSN)およびHFKにおけるCAS9の発現を確認したイムノブロットである。トランスフェクションの48時間後、全細胞ライセートを回収し、続いて抗CAS9抗体(またはローディングコントロールとしてGAPDH)でプローブした。結果は、HFK LXSNおよびHFK 8E6が同量のCAS9を発現していることを示し、トランスフェクション効率が2つの細胞株間で類似していることを示している。図2は、DSBs24の標準マーカーであるpH2AX病巣を用いたCAS9誘導DSBsを示す免疫蛍光顕微鏡像である。これは、2つのDSBがCAS9/sgRNAによって誘導され、DSB誘導が期待どおりに起こっていることを裏付けるものである。図3は、8E6がCAS9誘導.......
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ディスカッション
提供される情報の深さに加えて、この方法にはいくつかの利点があります。第1に、DSB修復は、理論的には、目的の細胞のゲノムを改変することなく任意のゲノム遺伝子座で評価することができる。第二に、修理のNGS分析へのアクセスは、定義された領域をターゲットにした単一のDSBを作成して分析することによって得られるコストと計算労力の削減によって増加します。最後に、追加の生物のゲノムが日常的に利用可能になり、多様な哺乳動物および非哺乳動物細胞株のトランスフェクションの成功を実証する複数の出版物により、このアプローチの有用性は広くなると予想される10,23,24。
この原稿は、例示的な例としてヒト包皮ケラチノサイトにおけるDSB修復を分析した。トランスフェクション効率は、ケラチノサイトにおいて他の組織タイプよりも低くなる傾向がある。したがって、このプロトコルは、これらのトランスフェクトが困難な細胞に最適化されたト.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もありません。
謝辞
この原稿で報告された研究は、国立衛生研究所(P20GM130448)(NAWおよびRP)の国立一般医学研究所によって支援されました。国立衛生研究所の国立がん研究所 (NCI R15 CA242057 01A1);カンザス州立大学のジョンソンがん研究センター;米国国防総省(CMDRP PRCRP CA160224(NAW))です。KSU-CVM Confocal CoreとJoel Sannemanの免疫蛍光顕微鏡検査に感謝します。コンテンツは著者の責任であり、必ずしもこれらの資金提供機関の公式見解を表すものではありません。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 6ウェル組織培養プレート | セルトリート | 229106 | 細胞培養プレート |
| BCAキット | VWR | 89167-794 | BCAアッセイキット |
| 遠心分離機 5910 R | エッペンドルフ | 2231000772 | 卓上遠心分離 |
| CLC ゲノムワークベンチ | Qiagen | 832001 | ディープシーケンスデータ解析ソフトウェア/インデルコーラー/バリアントコーラー |
| デジタルマイクロプレートジーニーパルス | サイエンティフィックインダストリーズ | SI-400A | プレートシェーカー |
| DYKDDDDK タグ モノクローナル抗体 (FG4R) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | MA191878 | 抗FLAG抗体 |
| エピライフ CFキット | サーモフィッシャーサイエンティフィック | MEPICF500 | 細胞培養培地とサプリメント |
| シ胎児血清 (FBS) | VWR | 89510-194 | 細胞培養サプリメント |
| ヤギ 抗ウサギIgG | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A-11012 | 二次抗体 |
| HighPrep PCR クリーンアップシステム | MagBio | AC-60005 | ビーズベースPCRクリーンアップキット |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCRキット | KAPA Biosystems | KK2600 | PCRマスターミックス/PCRアッセイ |
| MagAttract HMW DNAキット | Qiagen | 67563 | 高分子量DNA抽出キット |
| マグネティックスタンド-96 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | AM10027 | 96ウェルマグネティックラック |
| MiniAmp サーマルサイクラー | Applied Biosystems | A37834 | サーマルサイクラー |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | シーケンサー |
| Miseq v2 300サイクル試薬キット | Illumina | MS-102-2002 | 300サイクルカートリッジ/シーケンシング試薬 |
| Nextera XT DNAライブラリ プレップキット | Illumina | FC-131-1024 | ライブラリ調製キット |
| Nextera XT キット v2 セット A | イルミナ | 20027215 | インデックス |
| Nunc 96 ウェル ポリプロピレン ディープウェル ストロージ プレート | サーモフィッシャー サイエンティフィック | 260251 | ディープ ウェル 96 ウェル |
| プレート ペニシリン-ストレプトマイシン 溶液 (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | 細胞培養用抗生物質 |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | バイオベーシック | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 プラスミド 5'- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel アドバンストシステム | Qiagen | 9001941 | キャピラリー電気ファーシス装置 |
| QIAxcel DNA スクリーニングキット | Qiagen | 929004 | DNA バッファー/キャピラリー電気ファーシスチューブ |
| Qubit 1x ds HS アッセイキット | ThermoFisherScientific | Q23851 | 蛍光光度計試薬/1x dsDNA 溶液 |
| Qubit 4 蛍光光度計 | ThermoFisher Scientific | Q33238 | 蛍光光度計 |
| Qubit アッセイチューブ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | Q32856 | 蛍光光度計アッセイチューブ |
| RIPA 溶解バッファー | VWR | VWRVN653-100ML | タンパク質抽出用溶解バッファー |
| トリプシン-EDTA (0.05%)、フェノールレッド | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 25300054 | トリプシン |
| Vortex-Genie 2 | サイエンティフィック・インダストリー | SI-0236 | Vortex |
| Xfect トランスフェクション試薬 | タカラバイオ | 631318 | トランスフェクション試薬 |
| ゲノムデータ解析ソフトウェア | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | データ分析ソフトウェア |
参考文献
- Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).
- Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. DNA damage response. Cold Spring Harbor Perspectives in Bio....
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