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Immunology and Infection

कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक विधि और एंटीबॉडी न्यूट्रलाइजिंग गतिविधि के माप के साथ स्यूडो-टाइप किए गए एच 5 एवियन इन्फ्लूएंजा वायरस की तैयारी

Published: November 22, 2021 doi: 10.3791/62626
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3, 2, 3, 4, 1
1Nanjing Advanced Academy of Life and Health, 2Institute of Animal Bio-technology, Jilin Academy of Agricultural Sciences, 3National Clinical Research Center for Infectious Diseases, Shenzhen Third People’s Hospital, Southern University of Science and Technology, 4CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम स्यूडोवायरस पैकेजिंग और एंटीबॉडी न्यूट्रलाइजिंग गतिविधि के माप के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Abstract

1996 के बाद से, ए / हंस / गुआंग्डोंग / 1/96-वंश अत्यधिक रोगजनक एवियन इन्फ्लूएंजा (एचपीएआई) एच 5 वायरस पोल्ट्री और जंगली पक्षियों में फ्लू के प्रकोप का कारण बन रहे हैं। कभी-कभी इंसान भी इसका शिकार हो जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप उच्च मृत्यु दर होती है। बहरहाल, एचपीएआई वायरस अनुसंधान अक्सर बाधित होता है, यह देखते हुए कि इसे जैव सुरक्षा स्तर 3 प्रयोगशालाओं के भीतर नियंत्रित किया जाना चाहिए। इस मुद्दे को हल करने के लिए, एच 5 एचपीएआई अध्ययनों के कुछ प्रयोगों में जंगली प्रकार के वायरस के विकल्प के रूप में स्यूडोवायरस को अपनाया जाता है। स्यूडोवायरस एच 5 एचपीएआई वायरस के खिलाफ एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने का अध्ययन करने के लिए आदर्श उपकरण साबित होते हैं। यह प्रोटोकॉल एच 5 एचपीएआई स्यूडोवायरस तैयारी और स्यूडोवायरस न्यूट्रलाइजेशन परख की प्रक्रियाओं और महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन करता है। इसके अलावा, यह इन परखों के समस्या निवारण, सीमा और संशोधनों पर चर्चा करता है।

Introduction

1996 के बाद से, ए / हंस / गुआंग्डोंग / 1/96-वंश अत्यधिक रोगजनक एवियन इन्फ्लूएंजा (एचपीएआई) एच 5 वायरस पोल्ट्री और जंगली पक्षियों में लगातार फ्लू का प्रकोप पैदा कर रहे हैं, जो वैश्विक पोल्ट्री उद्योग में भारी सामाजिक-आर्थिक नुकसान के लिए जिम्मेदार हैं। कभी-कभी, मनुष्य भी इससे संक्रमित हो जाते हैं, उच्च मृत्यु दर 1,2 का सामना करना पड़ता है। हालांकि, एचपीएआई वायरस अनुसंधान अक्सर बाधित होता है, यह देखते हुए कि इसे जैव सुरक्षा स्तर 3 प्रयोगशालाओं के बाहर नहीं संभाला जा सकता है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, एच 5 एचपीएआई अध्ययनों के कुछ प्रयोगों में जंगली प्रकार के वायरस के विकल्प के रूप में स्यूडोवायरस को अपनाया जाता है। स्यूडोवायरस जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रयोगशालाओं में अभ्यास करने के लिए पर्याप्त सुरक्षित हैं।

एच 5 एचपीएआई स्यूडोवायरस चिमेरिक वायरस से संबंधित हैं जिसमें सरोगेट वायरस कोर, इन्फ्लूएंजा वायरस से सतह ग्लाइकोप्रोटीन के साथ लिपिड लिफाफे और रिपोर्टर जीन शामिल हैं। स्यूडोवायरस कोर आमतौर पर लेंटिवायरल ह्यूमन इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी), रेट्रोवायरस जैसे म्यूरिन ल्यूकेमिया वायरस (एमएलवी), और वेसिकुलर स्टोमाटाइटिस वायरस (वीएसवी) 3 से प्राप्त होते हैं। विशेष रूप से, एचआईवी -1 पैकेजिंग प्रणाली का व्यापक रूप से इन्फ्लूएंजा स्यूडोवायरस का उत्पादन करने के लिए उपयोग किया जाता है, जहां प्रदान किए गए प्राथमिक जीन गैग और पोल हैं। एचआईवी गैग जीन कोर प्रोटीन व्यक्त करता है। पोल जीन इंटीग्रेज और रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस को व्यक्त करता है, जो दोनों ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं में रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक हैं। सरोगेट वायरस के जीनोम की नकल करते हुए, रिपोर्टर जीन को आरएनए रूप में स्यूडोवायरस कोर में गले लगाया जाता है। रिपोर्टर जीन मेजबान कोशिकाओं में प्रोटीन को व्यक्त करेगा। रिपोर्टर जीन के जीन अभिव्यक्ति स्तर का उपयोग स्यूडोवायरस संक्रमण दक्षता 3,4 को मापने के लिए किया जा सकता है। प्राथमिक रिपोर्टर ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं में सापेक्ष ल्यूमिनेसेंस इकाइयों (आरएलयू) या सापेक्ष ल्यूसिफेरस गतिविधि (आरएलए) को मापने के लिए जुगनू लूसिफेरस है। अन्य संवाददाताओं जैसे कि lacZ, गॉसिया और रेनिला लूसिफेरस का भी उपयोग किया जाता है, केवल कुछ हद तक5।

स्यूडोवायरस एच 5 एचएपीआई वायरस के खिलाफ एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने का अध्ययन करने के लिए आदर्श उपकरण हैं। न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी क्षमता को मापने के लिए, स्यूडोवायरस न्यूट्रलाइजेशन (पीएन) परख6 का उपयोग किया जाता है। हेमग्लूटिनिन (एचए) और न्यूरामिनिडेस (एनए) इन्फ्लूएंजा ए वायरस 7,8 की सतह पर ग्लाइकोप्रोटीन हैं। एचए रिसेप्टर बाइंडिंग के लिए एक गोलाकार सिर डोमेन और झिल्ली संलयन के लिए एक स्टेम डोमेन से बना है। एनए प्रोटीन में वायरस रिलीज 7,8 की सुविधा के लिए सियालिडेज़ गतिविधि होती है। एक पीएन परख एचए प्रोटीन को निर्देशित एंटीबॉडी को बेअसर करने को माप सकता है। एचए के सिर और स्टेम क्षेत्र को निर्देशित एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने से वायरल अटैचमेंट और एंट्री परख द्वारा भी पता लगाया जा सकता है। जंगली प्रकार के वायरस की तुलना में, स्यूडोवायरस न्यूट्रलाइजेशन प्रयोगों में अधिक संवेदनशील पहचान मूल्य होते हैं, जिन्हें स्तर 2 जैव सुरक्षा प्रयोगशाला में सुरक्षित रूप से संभाला जा सकता है, और आमतौर पर अभ्यास में संचालित करना आसान होता है।

यह प्रोटोकॉल एच 5 एचपीएआई स्यूडोवायरस तैयारी और पीएन परख की प्रक्रियाओं और महत्वपूर्ण चरणों को विस्तार से प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, यह इन परखों के समस्या निवारण, सीमा और संशोधनों पर चर्चा करता है। इस अध्ययन में, H5N1 HPAI वायरस से A/Thailand/1(KAN)-1/2004 (TH) स्ट्रेन को एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। परख में उपयोग किए जाने वाले प्रतिरक्षा सेरा को प्राप्त करने के लिए, इस प्रोटोकॉल ने चूहों को प्रतिरक्षित करने के लिए इम्यूनोजेन के रूप में टीएच स्ट्रेन से उत्पन्न एचए प्रोटीन का चयन किया।

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Protocol

सभी स्यूडोवायरस से संबंधित प्रयोगात्मक ऑपरेशन शंघाई चीनी विज्ञान अकादमी (आईपीएस, सीएएस) के इंस्टीट्यूट पाश्चर में एबीएसएल 2 स्थिति के तहत किए गए थे। आईपीएस, सीएएस के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के आधार पर पशु प्रयोग किए गए थे।

1. कैल्शियम-फॉस्फेट अभिकर्मक के साथ स्यूडोवायरस पैकेजिंग

  1. पूर्ण डीएमईएम माध्यम (तालिका 1) में HEK293FT कोशिकाओं (9 x 105 प्रति एमएल) के एकल-सेल निलंबन बनाएं। टी 75 फ्लास्क में एकल-कोशिका निलंबन के 10 एमएल जोड़ें, अभिकर्मक से पहले 20 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2) इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: HEK293FT कम मार्ग (<20 अंश) की सिफारिश की जाती है। सुनिश्चित करें कि सेल मोनोलेयर 80-90% कंफ्लुएंट है।
  2. अभिकर्मक से 2 घंटे पहले माध्यम को क्लोरोक्विन (100 μM) युक्त 10 मिलीलीटर ताजा पूर्ण माध्यम से बदलें।
  3. अभिकर्मकों और प्लास्मिड डीएनए को मिलाएं जैसा कि तालिका 2 और चित्र 1 में दिखाया गया है: डीडीएच 2 ओ, पीसीएमवी / आर-एचए, पीसीएमवी / आर-एनए, पीएचआर-ल्यूक, पीएमवी 8.9, 2.5 एम सीएसीएल 2, और2एक्स एचईपीईएस बफर। 5 बार धीरे से ऊपर और नीचे पिपेट करें, मिश्रण को 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर इनक्यूबेट करें।
  4. मिश्रण को कोशिकाओं के ऊपर माध्यम में स्थानांतरित करें, और फ्लास्क को धीरे से हिलाएं। सेल इनक्यूबेटर में 15 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  5. माध्यम को 15 एमएल ताजा पूर्ण डीएमईएम माध्यम से बदलें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 65 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: माध्यम का रंग हल्का नारंगी या थोड़ा पीला होगा, और सेल के कम से कम 80% को उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) दिखाना चाहिए।
  6. सतह पर तैरने वाले को काट लें, और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 2095 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाला इकट्ठा करें, इसे एलिकोट करें, और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. इन्फ्लूएंजा स्यूडोवायरस के एचए, एनए और एचआईवी -1 पी 24 प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाना

  1. हेमग्लूटिनिन (एचए) परख द्वारा एचए प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाएं।
    1. पीबीएस के 50 μL को कॉलम 2-12 में जोड़ें, 96-अच्छी तरह से गोल-नीचे प्लेट की पंक्तियों A, B और C में।
      नोट: पंक्ति ए, बी, और सी 3 स्वतंत्र प्रतिकृति परीक्षणों से संबंधित हैं, और कॉलम 12 का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है।
    2. कॉलम 1 के कुओं में स्यूडोवायरस के 100 μL जोड़ें। कॉलम 1 से कॉलम 2 में 50 μL स्थानांतरित करें, 5 बार ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह मिलाएं, अंतिम कॉलम 11 तक दो गुना कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें, और कॉलम 11 से अतिरिक्त 50 μL को छोड़ दें।
    3. प्रत्येक कुएं में 0.5% एरिथ्रोसाइट के 50 μL जोड़ें, इसे दो बार धीरे से ऊपर और नीचे करें। प्लेट को आरटी पर 30-60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें या जब तक कि नकारात्मक नियंत्रण के एरिथ्रोसाइट्स कुएं के तल पर नियमित धब्बे न बना लें।
    4. स्यूडोवायरस के एचए टिटर्स का निरीक्षण और रिकॉर्ड करें।
      नोट: स्यूडोवायरस की एचए इकाई वायरस का उच्चतम कमजोर पड़ने वाला कारक है जो लाल रक्त कोशिकाओं के 100% हेमग्लूटिनेशन का कारण बन सकता है।
  2. पश्चिमी-धब्बा परख द्वारा एचए और एनए प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाएं।
    नोट: सभी पश्चिमी-धब्बा चरण आणविक क्लोनिंग (4वें संस्करण) के मैनुअल के अनुसार किए जाते हैं।
  3. एचआईवी -1 पी 24 एलिसा किट (सामग्री की तालिका) द्वारा एचआईवी -1 पी 24 प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाएं।
    1. स्यूडोवायरस नमूने के 450 μL में लाइसिस बफर के 50 μL जोड़ें। इसे अच्छी तरह से मिलाएं।
    2. माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुएं में वॉश बफर के 300 μL जोड़ें। वॉश बफर को पूरी तरह से हटाने के लिए प्लेट को उल्टा दबाएं। धोने को 5 बार दोहराएं।
    3. मानक के 200 μL और नमूने प्रत्येक कुएं में अलग से जोड़ें। उन्हें रात भर या 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. प्लेट की सामग्री को एस्पिरेट करें और चरण 2.3.2 में वर्णित प्लेट को धो लें।
      नोट: सब्सट्रेट खाली के रूप में उपयोग करने के लिए परख प्लेट के एक कुएं को खाली छोड़ दें।
    5. प्रत्येक कुएं में पी 24 डिटेक्टर एंटीबॉडी के 200 μL जोड़ें। उन्हें 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। चरण 2.3.2 में वर्णित के रूप में प्लेट को एस्पिरेट करें और धो लें।
    6. प्रत्येक कुएं में स्ट्रेप्टाविडिन-पेरोक्सीडेज वर्किंग सॉल्यूशन के 100 μL जोड़ें, और उन्हें 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। चरण 2.3.2 में वर्णित के रूप में प्लेट को एस्पिरेट करें और धो लें।
    7. सब्सट्रेट रिक्त कुएं सहित प्रत्येक कुएं में 100 μL सबस्टेट वर्किंग सॉल्यूशन जोड़ें, और उन्हें 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: कुओं में नीला रंग विकसित होगा।
    8. प्रत्येक कुएं में स्टॉप बफर के 100 μL जोड़ें।
      नोट: नीला रंग तुरंत पीले रंग में बदल जाएगा।
    9. 15 मिनट के भीतर 450 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व पढ़ें। स्यूडोवायरस के p24 टिटर्स रिकॉर्ड करें

3. स्यूडोवायरस अनुमापन

  1. पूर्ण डीएमईएम माध्यम में एमडीसीके कोशिकाओं (5 x 104 प्रति एमएल) के एकल-सेल निलंबन बनाएं, 96-अच्छी तरह से फ्लैट-बॉटम प्लेट के विभिन्न कुओं में 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 और 40000 कोशिकाओं को जोड़ें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 20 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. -80 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर से स्यूडोवायरस को बाहर निकालें, इसे बर्फ पर पिघलाएं, और स्यूडोवायरस को भंवर करें।
  3. 96-अच्छी तरह से गोल-नीचे प्लेट के प्रत्येक कुएं में 6 एचएयू (6 x एचए इकाइयां) स्यूडोवायरस जोड़ें और प्रत्येक को 120 μL तक पूर्ण डीएमईएम के साथ अच्छी तरह से भरें।
  4. अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए मिश्रण को 5 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। मिश्रण प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. मिश्रण के 100 μL को 96-वेल प्लेट में कोशिकाओं में स्थानांतरित करें। वायरस संक्रमण के बाद सेल कल्चर प्लेट को 48 घंटे, 60 घंटे और 72 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  6. प्लेट को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और ल्यूसिफेरस परख (सामग्री की तालिका) करें।
  7. प्लेट के कुओं से माध्यम को सावधानी से निकालें। पीबीएस के 200 μL के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें और जितना संभव हो पीबीएस को हटा दें।
    नोट: प्लेट को पलटें और सुपरनैटेंट को शोषक कागज पर रिवर्स थप्पड़ मारकर फेंक दें। यदि परीक्षण सेल लाइन मजबूती से नीचे से संलग्न नहीं हो सकती है, तो मध्यम आकांक्षा को सावधानीसे हटा दें।
  8. प्रत्येक कुएं में लाइसिस बफर के 50 μL जोड़ें, और संस्कृति प्लेट को कई बार हिलाएं। प्लेट को रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: 1x लाइसिस बफर बनाने के लिए 5x लाइसिस बफर की 1 मात्रा को 4 वॉल्यूम पानी के साथ मिलाएं। उपयोग से पहले आरटी के लिए 1x लाइसिस बफर को बराबर करें। प्लेट को यह सुनिश्चित करने के लिए हिलाएं कि कोशिकाएं पूरी तरह से लाइसिस बफर के साथ कवर की गई हैं। एकल फ्रीज-पिघलने की प्रक्रिया सेल को पूरी तरह से व्यवस्थित करने में मदद कर सकती है।
  9. प्लेट को बाहर निकालें, 2 घंटे के लिए आरटी पर बराबर करें।
    नोट: सेल को पूरी तरह से व्यवस्थित किया जाना चाहिए।
  10. प्लेट को कई बार धीरे से हिलाएं, और सभी सेल लाइसेट को अपारदर्शी 96-वेल प्लेटों में स्थानांतरित करें।
  11. प्रत्येक कुएं में सब्सट्रेट के 50 μL जोड़ें, प्लेट को कई बार धीरे से हिलाएं, और सब्सट्रेट और लाइसिस बफर को अच्छी तरह से मिलाएं।
  12. ल्यूमिनोमीटर का उपयोग करके 5 मिनट के भीतर उत्पादित प्रकाश को मापें। स्यूडोवायरस के ल्यूसिफेरस टिटर्स को रिकॉर्ड करें।
    नोट: जब एक उचित सब्सट्रेट जोड़ा जाता है, तो प्रकाश एक रासायनिक प्रतिक्रिया के माध्यम से उप-उत्पाद के रूप में उत्सर्जित होता है जिसमें लूसिफेरिन को ल्यूसिफेरस एंजाइम द्वारा ऑक्सीलुसिफेरिन में परिवर्तित किया जाता है। उत्पादित प्रकाश की मात्रा ल्यूसिफेरस एंजाइम की मात्रा के समानुपाती होती है।

4. प्रतिरक्षा सेरा तैयारी

नोट: प्रतिरक्षा सीरम का उपयोग सेल से संबंधित प्रयोगों के लिए किया जाएगा, और प्रयोगात्मक ऑपरेशन सड़न रोकनेवाला परिस्थितियों में किया जाना चाहिए।

  1. 12 आठ सप्ताह की मादा बीएएलबी / सी चूहों को तैयार करें। चूहों को दो समूहों में समान रूप से विभाजित करें।
    नोट: एक समूह डीडीवी समूह था और दूसरा नकारात्मक नियंत्रण समूह था।
  2. डीडीवी समूह टीकाकरण: सप्ताह 0 और सप्ताह 3 में कोडन-अनुकूलित डीएनए प्लास्मिड एन्कोडिंग ए / थाईलैंड / (केएएन -1)/2004 (टीएच) एचए प्रोटीन के 100 μg के साथ दो बार इंट्रामस्क्युलर रूप से प्राइम करें और सप्ताह 6 में 512 एचएयू टीएच वायरस जैसे कणों (वीएलपी) के साथ इंट्रापरिटोनियल रूप से बढ़ावा दें।
  3. नियंत्रण समूह टीकाकरण: सप्ताह 0 और सप्ताह 3 में 100 μg खाली वेक्टर प्लास्मिड डीएनए के साथ दो बार इंट्रामस्क्युलर रूप से प्राइम करें और सप्ताह 6 में एचआईवी -1 गैग वीएलपी के साथ इंट्रापरिटोनियल रूप से बढ़ावा दें।
  4. अंतिम टीकाकरण के 2 सप्ताह बाद माउस रक्त एकत्र करें।
    नोट: यहां, रक्त संग्रह के समय चूहों को पेंटोबार्बिटल सोडियम (65 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ एनेस्थेटाइज्ड किया गया था। सबमैंडिबुलर नस से रक्त संग्रह के बाद, चूहों को सीओ2 के साथ तुरंत इच्छामृत्यु दी गई।
  5. रक्त को आरटी पर 2 घंटे के लिए रखें, फिर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 900 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाला इकट्ठा करें। सेरा को 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर रखकर निष्क्रिय करें।
  6. उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में प्रतिरक्षा सेरा स्टोर करें।
    नोट: फ़्लोचार्ट के लिए पूरक चित्र 1 देखें जो माउस टीकाकरण की प्रमुख प्रक्रियाओं का वर्णन करता है।

5. स्यूडोवायरस न्यूट्रलाइजेशन (पीएन) परख

  1. पूर्ण डीएमईएम माध्यम में एमडीसीके कोशिकाओं (5 x 104 प्रति एमएल) के एकल-सेल निलंबन बनाएं, और 96-अच्छी तरह से फ्लैट-बॉटम प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल सस्पेंशन के 100 μL जोड़ें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 20 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. -80 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर से स्यूडोवायरस और सेरा को बाहर निकालें, इसे बर्फ पर पिघलाएं, और भंवर को अच्छी तरह से।
  3. सेरा को पूर्ण माध्यम में 20 बार पतला करें, और कॉलम 2-10 से 96-अच्छी तरह से गोल-नीचे प्लेट के कुओं में पूर्ण डीएमईएम माध्यम के 100 μL जोड़ें।
  4. स्तंभ 2 के कुओं में पतला सेरा के 200 μL जोड़ें, स्तंभ 2 से स्तंभ 3 में 100 μL स्थानांतरित करें, सेरा को 1:20, 1:40, 1:80, आदि के रूप में पतला करें, स्तंभ 2 से कॉलम 10 तक क्रमिक रूप से 1:10240 तक, और कॉलम 10 से 100 μL को छोड़ दें।
  5. नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कॉलम 11 के कुओं में डीएमईएम पूर्ण माध्यम के 100 μL जोड़ें।
  6. प्रत्येक कुएं में स्यूडोवायरस के 100 μL जोड़ें, मिश्रण को 5 बार अच्छी तरह से ऊपर और नीचे पिपेट करें, और मिश्रण प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस में सेने दें, 1 घंटे के लिए 5% सीओ2 ।
  7. मिश्रण के 100 μL को 96-अच्छी तरह से गोल-नीचे प्लेट से 96-वेल सेल कल्चर प्लेट के संबंधित कुएं में स्थानांतरित करें। प्लेट को 60 घंटे के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में वापस रखें।
  8. प्लेट को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें। चरण 3.7-3.12 में वर्णित के रूप में ल्यूसिफेरस परख करें।

6. स्यूडोवायरस अटैचमेंट परख

  1. पूर्ण डीएमईएम माध्यम में एमडीसीके कोशिकाओं (4 x 104 प्रति एमएल) के एकल-सेल निलंबन बनाएं, और 96-अच्छी तरह से फ्लैट-बॉटम प्लेट में प्रत्येक कुएं में 100 μL सेल निलंबन जोड़ें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 20 घंटे के लिए 5% सीओ2 ।
  2. डीएमईएम में सेरा के साथ स्यूडोवायरस को इनक्यूबेट करें जिसमें रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1% बीएसए होता है।
    नोट: मिश्रण की मात्रा 100 μL है।
  3. एमडीसीके कोशिकाओं को डीएमईएम के प्रति कुएं 100 μL के साथ ब्लॉक करें जिसमें 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1% बीएसए होता है।
  4. एमडीसीके मोनोलेयर पर स्यूडोवायरस और सीरम मिश्रण (100 μL) को टीका लगाएं और इसे 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. किसी भी अनबाउंड वायरस को हटाने के लिए 1% बीएसए युक्त पीबीएस के साथ सेल प्लेट को 4 बार धोएं।
  6. 30 मिनट के लिए आरटी पर 100 μL ल्यूसिफेरस लाइसिस बफर के साथ कोशिकाओं को लाइज़ करें।
  7. ऊपर वर्णित एचआईवी -1 पी 24 एलिसा किट के साथ कोशिकाओं पर बाध्य वायरस की मात्रा निर्धारित करें (धारा 2.3)।

7. वायरल प्रविष्टि का आकलन

  1. पूर्ण डीएमईएम माध्यम में एमडीसीके कोशिकाओं (5 x 104 प्रति एमएल) के एकल-सेल निलंबन बनाएं, और 96-अच्छी तरह से फ्लैट-बॉटम प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल सस्पेंशन के 100 μL जोड़ें। परख से पहले 20 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  2. स्यूडोवायरस (100 μL) को 6 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 96-वेल प्लेट में एक एमडीसीके मोनोलेयर पर टीका लगाएं।
  3. अनबाउंड स्यूडोवायरस को हटाने के लिए 1% बीएसए युक्त पीबीएस के साथ सेल प्लेट को 4 बार धोएं।
  4. डीएमईएम में शाम टीकाकरण चूहों से क्रमिक रूप से पतला प्रतिरक्षा सेरा या सेरा के 100 μL जोड़ें जिसमें मोनोलेयर में 1% बीएसए होता है, और 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल को इनक्यूबेट करें।
  5. सेल सुपरनैटेंट को हटा दें, और सेल कल्चर प्लेट को 1% बीएसए युक्त पीबीएस के साथ 4 बार धोएं।
  6. कोशिकाओं में ताजा डीएमईएम जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 60 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. चरण 3.7-3.12 में वर्णित कोशिकाओं की सापेक्ष ल्यूसिफेरस गतिविधि (आरएलए) को मापें।
    नोट: वायरल प्रविष्टि, जैसा कि आरएलए द्वारा इंगित किया गया है, को सेरा की अनुपस्थिति में प्राप्त रीडिंग के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था, जिसे 100% के रूप में सेट किया गया था।

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Representative Results

इन्फ्लूएंजा स्यूडोवायरस की एचए, एनए और एचआईवी -1 पी 24 प्रोटीन अभिव्यक्ति।
वायरल पैकेजिंग दक्षता की पहचान करने के लिए, इन्फ्लूएंजा स्यूडोवायरस स्टॉक का पता पहली बार एचए परख (चित्रा 2 ए) द्वारा लगाया गया था। इन्फ्लूएंजा स्यूडोवायरस के प्रति मिलीलीटर एचए इकाइयां 643 हैं (तालिका 3)। पश्चिमी-धब्बा परख और सैंडविच एलिसा परख का उपयोग एचए, एनए और एचआईवी -1 पी 24 प्रोटीन अभिव्यक्ति का परीक्षण करने के लिए किया गया था। फिर स्यूडोवायरस के लिए एचए इकाई और गैग पी 24 की मात्रा के अनुपात की गणना की गई। पश्चिमी-धब्बा परख के परिणामों से पता चला है कि 4 प्रोटीन प्रकार थे: एचए0, एचए 1, एचए 2, और एनए प्रोटीन (पूरक चित्रा 2)। यह इंगित करता है कि इन्फ्लूएंजा स्यूडोवायरस के आवरण प्रोटीन जंगली प्रकार के वायरस के समान हैं। एचए और गैग पी 24 का अनुपात एक सामान्य सीमा के भीतर था जैसा कि रिपोर्ट किया गया था (तालिका 3)9।

स्यूडोवायरस उपभेद एचएयू / एमएल 1.00E + 05 pg/mL HAU/1.00E+05 pg* का अनुपात
पी ए / थाईलैंड / (केएएन -1)/2004 642.52 ± 30.26 4.20 ± 0.17 152.98
* एचए इकाइयों के अनुपात और स्यूडोवायरस में एचआईवी -1 गैग पी 24 की मात्रा की गणना निम्नानुसार की गई थी: एचए इकाइयां / गैग पी 24 की मात्रा।

तालिका 3: एच 5 स्यूडोवायरस का परिमाणीकरण।

स्यूडोवायरस अनुमापन
कार्यात्मक वायरल कणों की एकाग्रता को मापने के लिए, स्यूडोवायरस की सापेक्ष ल्यूसिफेरस गतिविधि (आरएलए) का पता लगाया गया था। आरएलए रीडिंग कई चर पर निर्भर हैं। आरएलए रीडिंग पर ट्रांसड्यूस्ड सेल राशि के प्रभाव की पहचान करने के लिए, हमने 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 और 40000 की कोशिकाओं को 96-वेल प्लेट (चित्रा 2) के प्रति कुएं में बीज दिया। परिणामों से पता चला है कि स्यूडोवायरस की आरएलए रीडिंग सबसे अधिक है, और माध्य की मानक त्रुटि सबसे कम है जब 5000 कोशिकाओं को 96-वेल प्लेट (चित्रा 4 ए) के कुएं में बीज दिया जाता है। इनक्यूबेशन समय के प्रभाव की पहचान करने के लिए, वायरस संक्रमण के बाद 48 घंटे, 60 घंटे और 72 घंटे में आरएलए रीडिंग का पता लगाया जाता है। परिणामों से पता चला है कि जब 60 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया जाता है, तो स्यूडोवायरस की आरएलए रीडिंग मूल्यों में अधिक होती है और औसत की कम मानक त्रुटि के साथ पुनरावृत्ति में बेहतर होती है (चित्रा 4 बी)। परिणाम बताते हैं कि यह 96-वेल प्लेट के कुएं में 5000 कोशिकाओं को बीज देने और वायरस संक्रमण के 60 घंटे बाद आरएलए रीडिंग का पता लगाने के लिए उपयुक्त है।

पीएन ने कहा।
नियंत्रण समूह और डीडीवी समूह से प्रतिरक्षा सेरा के न्यूट्रलाइजेशन टिटर्स को पीएन परख (चित्रा 5) द्वारा मापा गया था। जैसा कि चित्रा 5 ए में दिखाया गया है, डीडीवी समूह से प्रतिरक्षा सेरा ने स्यूडोवायरस ए / थाईलैंड / 1 (केएएन) -1/04 तनाव के खिलाफ उच्च न्यूट्रलाइजेशन टिटर्स का प्रदर्शन किया। इसके विपरीत, नियंत्रण समूह से सेरा ने किसी भी न्यूट्रलाइजेशन गतिविधि का प्रदर्शन नहीं किया (चित्रा 5 बी)। पारंपरिक सीरोलॉजिकल परख (एचआई और एमएन परख) की तुलना में, पीएन परख अधिक संवेदनशील हैं (डेटा नहीं दिखाया गया है)।

अनुलग्नक न्यूट्रलाइजेशन परख
कुछ न्यूट्रलाइजेशन एंटीबॉडी वायरस के साइलिक एसिड रिसेप्टर्स के लगाव में बाधा डाल सकते हैं। ये एंटीबॉडी एचए सिर पर निर्देशित होते हैं और वाणिज्यिक वैक्सीन या इन्फ्लूएंजा वायरस के संक्रमण द्वारा टीकाकरण के बाद प्रमुख होते हैं। इन एंटीबॉडी की निष्क्रिय गतिविधि की पहचान करने के लिए, अनुलग्नक न्यूट्रलाइजेशन परख किया जाता है (चित्रा 3)। नियंत्रण सेरा की तुलना में, प्रतिरक्षा सेरा की निष्क्रिय गतिविधि शक्तिशाली है जो इंगित करती है कि प्रतिरक्षा सेरा में एचए सिर को निर्देशित बहुत सारे एंटीबॉडी हैं (चित्रा 6 ए)।

वायरल प्रविष्टि का आकलन
इस परख का उपयोग एंटीबॉडी की पहचान करने के लिए किया जाता है जो इन्फ्लूएंजा वायरस संक्रमण के दौरान वायरस के आवरण और एंडोसोमल झिल्ली के संलयन में बाधा डालते हैं। ये एंटीबॉडी एचए डंठल डोमेन के लिए निर्देशित होते हैं और आमतौर पर कम शक्तिशाली होते हैं। इन एंटीबॉडी के न्यूट्रलाइजेशन टिटर्स को मापने के लिए, पोस्ट-अटैचमेंट परख किए जाते हैं (चित्रा 3)। प्रतिरक्षा सेरा और नियंत्रण सेरा के बीच महत्वपूर्ण अंतर हैं, जो इंगित करता है कि प्रतिरक्षा सेरा (चित्रा 6 बी) में एचए स्टेम क्षेत्र के लिए निर्देशित एंटीबॉडी हैं।

Figure 1
चित्रा 1: कैल्शियम मध्यस्थता अभिकर्मक का फ्लोचार्ट। इस फ़्लोचार्ट का उपयोग कैल्शियम मध्यस्थता अभिकर्मक की प्रमुख प्रक्रियाओं का वर्णन करने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: स्यूडोवायरस का परिमाणीकरण और अनुमापन। (ए) स्यूडोवायरस एचए परख के प्रमुख चरणों का वर्णन करने वाले स्यूडोवायरस एचए परख का फ्लोचार्ट। (बी) स्यूडोवायरस पी 24 परख का फ्लोचार्ट स्यूडोवायरस पी 24 परख के प्रमुख चरणों का वर्णन करता है। (सी) स्यूडोवायरस अनुमापन परख के प्रमुख चरणों का वर्णन करते हुए स्यूडोवायरस अनुमापन परख का फ्लोचार्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: स्यूडोवायरस-आधारित न्यूट्रलाइजेशन परख। (ए) पीएन परख के प्रमुख चरणों का वर्णन करने वाले पीएन परख का फ्लोचार्ट। (बी) अनुलग्नक परख के प्रमुख चरणों का वर्णन करने वाले स्यूडोवायरस अनुलग्नक परख का फ्लोचार्ट। (ग) वायरल एंट्री परख के प्रमुख चरणों का वर्णन करते हुए वायरल एंट्री परख के मूल्यांकन का फ्लोचार्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: स्यूडोवायरस अनुमापन। (ए) 96-वेल प्लेट में प्रति कुएं अलग-अलग सेल मात्रा आरएलए रीडिंग को प्रभावित करती है। 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 और 40000 कोशिकाओं को 96-वेल प्लेट में बीज दिया गया था। (बी) अलग-अलग फसल का समय आरएलए रीडिंग को प्रभावित करता है। वायरस संक्रमण के बाद 48 घंटे, 60 घंटे और 72 घंटे में आरएलए रीडिंग का पता लगाया जाता है। तीन स्वतंत्र प्रयोगों से एकत्र किए गए डेटा को एसईएम ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है; त्रुटि पट्टियाँ माध्य (SEM) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. टुकी परीक्षण के साथ वन-वे एनोवा का प्रदर्शन किया गया था। पी < 0.0001; नहीं, महत्वपूर्ण नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एच 5 स्यूडोवायरस के साथ पाए गए एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को निष्क्रिय करना। (ए) डीडीवी समूह से प्रतिरक्षा सेरा की एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को बेअसर करने का अनुमापन। (बी) नियंत्रण समूह से प्रतिरक्षा सेरा की एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को बेअसर करने का अनुमापन। आईसी50 को न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी के पारस्परिक कमजोर पड़ने के रूप में परिभाषित किया गया है जो स्यूडोवायरस के 50% को रोक सकता है। तीन स्वतंत्र प्रयोगों से एकत्र किए गए डेटा को एसईएम ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है; त्रुटि पट्टियाँ माध्य (SEM) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. वीएसवीजी स्यूडोवायरस का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: बाध्यकारी और वायरल प्रविष्टि परख द्वारा न्यूट्रलाइजेशन एंटीबॉडी शक्ति का पता लगाना । (ए) डीडीवी समूह से प्रतिरक्षा सेरा, न कि नियंत्रण समूह से, कोशिकाओं के लिए वायरल लगाव को रोकता है। (बी) डीडीवी समूह से प्रतिरक्षा सेरा, न कि नियंत्रण समूह से, आंशिक रूप से वायरल पोस्ट-अटैचमेंट संक्रमण को रोकता है। तीन स्वतंत्र प्रयोगों से एकत्र किए गए डेटा को एसईएम ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है; त्रुटि पट्टियाँ माध्य (SEM) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूर्ण डीएमईएम मध्यम संरचना एकाग्रता
डलबेकको का संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) 1x
भ्रूण गोजातीय सीरम 10%
पेनिसिलिन (1 U/mL)/स्ट्रेप्टोमाइसिन 1 μg/ mL

तालिका 1: पूर्ण डीएमईएम मध्यम संरचना।

सामग्री एकाग्रता आयतन
2x HEPES (pH 7.1) -- 675.0 μL
CaCl 2 (2.5 M) -- 67.5 μL
ddH2O -- 529.2 μL
pCMV त्रिभुज 8.9 1000 ng/μL 18.9 μL
pCMV/R-HA 100 ng/μL 27.0 μL
pCMV/R-NA 50 ng/μL 13.5 μL
pHR-Luc 1000 ng/μL 18.9 μL

तालिका 2: स्यूडोवायरस पैकेजिंग सिस्टम।

पूरक चित्र 1: माउस टीकाकरण का फ़्लोचार्ट। यह फ़्लोचार्ट माउस टीकाकरण की प्रमुख प्रक्रियाओं का वर्णन करता है। प्रतिरक्षा सेरा का उपयोग नमूने के रूप में किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: इन्फ्लूएंजा स्यूडोवायरस की एचए, एनए और एचआईवी -1 पी 24 प्रोटीन अभिव्यक्ति। स्यूडोवायरस प्रोटीन का पश्चिमी-धब्बा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

HEK293FT कोशिकाओं को आमतौर पर स्यूडोवायरस का उत्पादन करने के लिए पैकेजिंग कोशिकाओं के रूप में उपयोग किया जाता है। सेल कल्चर के दौरान नियमित रूप से माइकोप्लाज्मा का पता लगाना आवश्यक है। माइकोप्लाज्मा संदूषण स्यूडोवायरस पैदावार को काफी कम कर सकता है और कभी-कभी शून्य के करीब होता है। अन्य संदूषणों की तुलना में, माइकोप्लाज्मा संदूषण से पीएच मान परिवर्तन या सेल कल्चर माध्यम का टर्बिडिटी नहीं होता है। यहां तक कि माइकोप्लाज्मा की उच्च सांद्रता नग्न आंखों से या माइक्रोस्कोप के नीचे दिखाई नहीं देती है। माइकोप्लाज्मा का पता लगाने के तीन लोकप्रिय तरीके माइकोप्लाज्मा कल्चर, फ्लोरोसेंट डीएपीआई या होचस्ट 33258 के साथ डीएनए धुंधला होना और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) हैं। कल्चर नमूनों में माइकोप्लाज्मा डीएनए को बढ़ाने वाले पीसीआर का व्यापक रूप से तेज, आसान और विश्वसनीय माइकोप्लाज्मापरीक्षण के लिए उपयोग किया जाता है।

कैल्शियम फॉस्फेट-मध्यस्थता अभिकर्मक का उपयोग इन्फ्लूएंजा स्यूडोवायरस पैकेजिंग के लिए कई वर्षों से इसकी उच्च दक्षता, कम लागत और आसान संचालन11 के कारण किया गया है। हालांकि, यह विधि एचईपीईएस-बफर्ड समाधान, HEK293FT सेल कल्चर माध्यम और डबल-डिस्टिल्ड एच2ओ के पीएच HEK293FT मान के प्रति बहुत संवेदनशील है। इस प्रकार, यह डीएनए की मात्रा निर्धारित कर सकता है जो HEK293FT कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है। एचईपीईएस-बफरसमाधान के लिए पीएच बेहद संकीर्ण प्रतिबंधित है, जो 7.05-7.12 12,13,14 तक होता है, इस स्थिति में, कैल्शियम फॉस्फेट और डीएनए युक्त एक अवक्षेप धीरे-धीरे एचईपीईएस-बफर्ड समाधान में बनता है। यदि पीएच बहुत अधिक है, तो अवक्षेप का आकार इतना बड़ा हो जाएगा कि यह HEK293T कोशिकाओं को भी मार सकता है। इसके विपरीत, यदि पीएच बहुत कम है, तो अवक्षेप का गठन नहीं किया जा सकता है, या अवक्षेप सेल की सतह पर बसने के लिए बहुत छोटा होगा। इसके अलावा, HEK293FT सेल कल्चर माध्यम का पीएच भी अभिकर्मक दक्षता में भूमिका निभाता है। अभिकर्मक के दौरान, सेल माध्यम को 7.2-7.4 के पीएच के बीच बनाए रखा जाना चाहिए। हाइपर अम्लीय और क्षारीय मीडिया दोनों अवक्षेप के आकार और कोशिका की सतह पर डीएनए मिश्रण के सोखने के समय को बदल देंगे। इसके अतिरिक्त, डीएनए मिश्रण में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न मूल के साथ डबल-डिस्टिल्ड एच2ओ एचईपीईएस-बफर समाधान के पीएच को बदल सकता है। इस प्रकार, उच्च अभिकर्मक दक्षता की गारंटी के लिए अभिकर्मक समाधान और संस्कृति माध्यम का एक स्थिर पीएच मान रखना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, अभिकर्मक दक्षता 2.5 एम सीएसीएल 2 समाधान और सेल इनक्यूबेटर में कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2) की एकाग्रता से भी प्रभावित होती है। अभिकर्मक प्रक्रिया के दौरान, सीएसीएल 2 समाधान को ठीक से स्टोर करना और इनक्यूबेटर में सीओ2 एकाग्रता को स्थिर करना महत्वपूर्ण है।

इन्फ्लूएंजा स्यूडोवायरस की सबसे लोकप्रिय पैकेजिंग प्रणाली में कई प्लास्मिड सह-अभिकर्मक दृष्टिकोण शामिल हैं। एचए, एनए, रिपोर्टर, और लेंटिवायरल गैग और पोल जीन को प्लास्मिड अभिव्यक्ति वैक्टर में अलग से क्लोन किया जाता है, और फिर उन्हें एक साथ कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जाता है। प्रोटीन अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए, प्रतिलेखन प्रारंभ साइट से पहले एक कोज़ाक सर्वसम्मति अनुक्रम अक्सर जोड़ा जाता है।

शुद्ध, सुपरकोइलिंग और एंडोटॉक्सिन मुक्त प्लास्मिड डीएनए15 तैयार करना आवश्यक है। चूंकि प्लास्मिड अनुपात सीधे स्यूडोवायरस पैदावार को प्रभावित करता है। इस प्रोटोकॉल ने "कोर: रिपोर्टर: एचए: एनए" के प्लास्मिड अनुपात को 28: 28: 4: 1 तक अनुकूलित किया और इसकी तुलना अन्य अभिकर्मक विधियों से की। यह आवश्यक है कि कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक में प्लास्मिड डीएनए की मात्रा प्रति 100 मिमी डिश में 30.5 μg तक पहुंचनी चाहिए।

स्यूडोवायरस टिटर्स का पता मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर), एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा), हेमग्लूटिनेशन परख और आरएलए डिटेक्शन परख द्वारा लगाया जाता है। क्यूआरटी-पीसीआर परख का उपयोग स्यूडोवायरस इंटीरियर5 के आरएनए जीन की प्रतिलिपि संख्या का अनुमान लगाने के लिए किया जाता है। एलिसा परख का उपयोग पी 24 प्रोटीन की सामग्री का पता लगाने के लिए किया जाता है, जो एचआईवी कोर का प्रमुख घटक है। हेमग्लूटिनेशन परख स्यूडोवायरस कणों की सतह पर एचए स्पाइक मात्रा को मापता है। इन तीन परखों को अक्रियाशील वायरल कणों की मात्रा निर्धारित करने के लिए नियोजित किया जाता है। आरएलए डिटेक्शन परख कार्यात्मक वायरल कणों की एकाग्रता को मापने के लिए प्रमुख विधि है जो ट्रांसड्यूस कोशिकाओं को संक्रमित कर सकती है और स्यूडोवायरस स्टॉक में रिपोर्टर जीन जारी कर सकती है। एमडीसीके कोशिकाओं को आमतौर पर ट्रांसड्यूस कोशिकाओं के रूप में उपयोग किया जाता है। ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं को 96-वेल कल्चर प्लेटों में बीज ति किया जाता है, जो स्यूडोवायरस से संक्रमित होते हैं, लाइसिस बफर द्वारा संक्रमित होते हैं, और फिर मूल्यों को पढ़ने के लिए 96-वेल ल्यूमिनोमीटर प्लेटों में स्थानांतरित होते हैं। विभिन्न सेल मात्रा और इनक्यूबेशन समय आरएलए मूल्यों को प्रभावित करते हैं। परिणामों के आधार पर, रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति तब अधिक होती है जब 5000 कोशिकाओं को 96-वेल प्लेट पर प्रति अच्छी तरह से बीज दिया जाता है, और वायरस संक्रमण के बाद 60 घंटे में आरएलए का पता लगाया जाता है।

एच 5 एचपीएआई स्यूडोवायरस न्यूट्रलाइजेशन (पीएन) परख को उनकी सुरक्षा, उच्च संवेदनशीलता, सटीकता और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्तता के कारण एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए व्यापक रूप से लागू किया गया है। पीएन परख के एक सामान्य प्रोटोकॉल में निम्नलिखित चार चरण शामिल हैं: स्यूडोवायरस मात्रा, सीरम कमजोर पड़ना, स्यूडोवायरस-एंटीबॉडी इनक्यूबेशन और ल्यूसिफेरस गतिविधि का पता लगाना। स्यूडोवायरस की मात्रा आरएलए रीडिंग के आधार पर सामान्यीकृत की जाती है। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोग परिणाम प्राप्त करने के लिए 96-वेल प्लेट में 106 प्रति कुएं के आरएलए मूल्यों का उपयोग किया जाता है। सीरम नमूना कमजोर पड़ने का शुरुआती बिंदु 40 से अधिक होना चाहिए। सीरम नमूना घटक स्पष्ट रूप से स्यूडोवायरस के ल्यूसिफेरस मूल्यों में वृद्धि करेगा जब सीरम नमूने का कमजोर पड़ने वाला कारक 40 से कम है। स्यूडोवायरस-एंटीबॉडी मिश्रण को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया जाता है और फिर एमडीसीके कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जाता है, इसके बाद 60 घंटे में आरएलए रीडिंग का पता लगाया जाता है। लूसिफेरस स्तर आमतौर पर स्यूडोवायरस संक्रमण दक्षता निर्धारित करने के लिए एक उपकरण के रूप में लिया जाता है।

पीएन परख में, चार महत्वपूर्ण तत्व हैं: ल्यूसिफेरस रिपोर्टर प्रोटीन, परख रसायन विज्ञान, एक लुमिनोमीटर और माइक्रोप्लेट16। सबसे पहले, ल्यूसिफेरस जीन को ट्रांसड्यूस कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर में सुधार के लिए कोडन-अनुकूलित किया जाता है। रिपोर्टर और वेक्टर बैकबोन जीन इंजीनियरिंग असंगत प्रतिलेखन जोखिम को कम करने के लिए आम सहमति प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी साइटों की संख्या को कम करता है। दूसरे, प्रयोग के उद्देश्य के अनुसार उचित पहचान अभिकर्मकों का चयन किया जाता है। पीएन परख आमतौर पर सीरम या एंटीबॉडी नमूनों की बेअसर प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए उच्च-थ्रूपुट विधियों के रूप में उपयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल ने उज्ज्वल-ग्लो लूसिफेरस परख प्रणाली का उपयोग किया, जो सबसे उज्ज्वल संकेत, व्यापक गतिशील सीमा और उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, सिग्नल का आधा जीवन लगभग 10 मिनट है, और सब्सट्रेट जोड़े जाने के तुरंत बाद कोशिकाओं का परीक्षण किया जाता है। ल्यूमिनोमीटर का उपयोग ल्यूसिफेरस एकाग्रता का पता लगाने के लिए किया जाता है। कई अलग-अलग प्रकार के लुमिनोमीटर का निर्माण किया जाता है। मूल सिद्धांत यह है कि उपयोग की जाने वाली मशीन विभिन्न नमूनों के बीच ल्यूसिफेरस गतिविधि में अंतर की सटीक पहचान कर सकती है। काले या सफेद पॉलीस्टाइनिन माइक्रोप्लेट्स का उपयोग अस्पष्टता और कम ल्यूमिनेसेंट पृष्ठभूमि के लिए किया जाना चाहिए। सफेद माइक्रोप्लेट्स ल्यूमिनेसेंट संकेतों को बढ़ा सकते हैं और कम पृष्ठभूमि ल्यूमिनेसेंस रख सकते हैं, जबकि ब्लैक माइक्रोप्लेट्स अच्छी तरह से क्रॉस-टॉक17 को कम करने के लिए प्रकाश प्रकीर्णन को कम कर सकते हैं।

पीएन परख एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को निष्क्रिय करने का पता लगाने के लिए पारंपरिक तरीकों के अनुरूप हैं। हालांकि, इन्फ्लूएंजा वाइल्ड-टाइप वायरस से केवल एचए और एनए प्रोटीन सहित, स्यूडोवायरस वाइल्ड-टाइप किए गए वायरस से बहुत दूर हैं। एचए संक्रमण शुरू करने के लिए प्राप्तकर्ता कोशिका के साइलिक एसिड रिसेप्टर से बंध सकता है। फिर एंडोसोम में एचए विरूपण परिवर्तन वायरल और एंडोसोमल झिल्ली के संलयन को ट्रिगर करते हैं, जिससे वायरल राइबोन्यूक्लिओप्रोटीन (वीआरएनपी) साइटोप्लाज्म में जारी होते हैं। इन्फ्लुएंजा स्यूडोवायरस केवल इन प्रक्रियाओं की नकल कर सकते हैं और संबंधित शोधों में लागू होते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को जियांग्सू प्रांत (BM2020019), शेन्ज़ेन वैज्ञानिक और तकनीकी परियोजना (सं। JSGG20200225150702770), चीनी विज्ञान अकादमी (XDB29030103), गुआंग्डोंग वैज्ञानिक और तकनीकी परियोजना (संख्या 2020B1111340076) और शेन्ज़ेन बे प्रयोगशाला ओपन रिसर्च प्रोग्राम (सं। SZBL202002271003)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Chiken Erythrocyte Bio-channel BC-RBC-C001 Reagent
96-well cell culture plates (flat-bottom) Thermo fisher scientific 167008 consumable material
96-well cell culture plates (round-bottom) Thermo fisher scientific 163320 consumable material
Allegra X-15R Beckman coulter -- Equipment/Centrifuge
BD Insulin Syringes BD 324910 consumable material
Calcium Chloride Anhydrous AMRESCO 1B1110-500G Reagent
chloroquine diphosphate Selleck S4157 Reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 12100-046 Reagent
Fetal Bovine Serum Gibco 16000-044 Reagent
HEK293FT Gibco R700-07 Cell line
HEPES FREE ACID AMRESCO 0511-250G Reagent
HIV-1 p24 Antigen ELISA ZeptoMetrix 801111 Reagent kit
Luciferase Assay System Freezer Pack Promega E4530 Reagent kit
MDCK.1 ATCC CRL-2935 Cell line
Microcentrifuge Tubes 1.5 mL Thermo fisher scientific 509-GRD-Q consumable material
Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL Thermo fisher scientific 339650 consumable material
Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL Thermo fisher scientific 339652 consumable material
Nunc EasYFlask 75 cm2 Thermo fisher scientific 156499 consumable material
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 Reagent
Pipette Tips (10 μL) Thermo fisher scientific TF102-10-Q consumable material
Pipette Tips (100 μL) Thermo fisher scientific TF113-100-Q consumable material
Pipette Tips (1000 μL) Thermo fisher scientific TF112-1000-Q consumable material
Serological pipets (5 mL) Thermo fisher scientific 170355N consumable material
Serological pipets (10 mL) Thermo fisher scientific 170356N consumable material
Trypsin/EDTA Gibco 25200-072 Reagent
Varioskan Flash Thermo fisher scientific -- Equipment/Microplate reader
Water Jacket Incubator Thermo fisher scientific 3111 Equipment/Cell incubator
Pentobarbital sodium salt Sigma 57-33-0 Reagent

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References

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  16. Luciferase assay system. , Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021).
  17. Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates. , Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021).

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इस महीने जोव में अंक 177 एच 5 इन्फ्लूएंजा स्यूडोवायरस स्यूडोवायरस पैकेजिंग स्यूडोवायरस अनुमापन स्यूडोवायरस-आधारित न्यूट्रलाइजेशन परख।
कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक विधि और एंटीबॉडी न्यूट्रलाइजिंग गतिविधि के माप के साथ स्यूडो-टाइप किए गए एच 5 एवियन इन्फ्लूएंजा वायरस की तैयारी
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Chang, X., Zhou, K., Liu, Y., Duan,… More

Chang, X., Zhou, K., Liu, Y., Duan, L., Zhang, L., Zhang, G., Wang, H., Wang, G. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (177), e62626, doi:10.3791/62626 (2021).

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