Summary
Здесь мы описываем протокол упаковки псевдовирусов и измерения нейтрализующей активности антител.
Abstract
С 1996 года высокопатогенные вирусы птичьего гриппа (ВППГ) H5 линии A/goose/Guangdong/1/96 вызывают вспышки гриппа среди домашней и дикой птиц. Иногда люди также становятся его жертвами, что приводит к высокой смертности. Тем не менее, исследования вируса ВППГ часто затруднены, учитывая, что они должны проводиться в лабораториях уровня биобезопасности 3. Чтобы решить эту проблему, псевдовирусы используются в качестве альтернативы вирусам дикого типа в некоторых экспериментах исследований H5 HPAI. Псевдовирусы оказываются идеальными инструментами для изучения нейтрализующих антител против вирусов H5 HPAI. В этом протоколе описываются процедуры и критические этапы псевдовирусных препаратов H5 HPAI и анализов псевдовирусной нейтрализации. Кроме того, в нем обсуждаются устранение неполадок, ограничения и модификации этих анализов.
Introduction
С 1996 года высокопатогенные вирусы птичьего гриппа (ВППГ) H5 линии A/goose/Guangdong/1/96 вызывают постоянные вспышки гриппа среди домашней птицы и диких птиц, что приводит к огромным социально-экономическим потерям в мировой птицеводческой промышленности. Иногда им заражаются и люди, сталкиваясь с высокой летальностью 1,2. Тем не менее, исследования вируса ВППГ часто затруднены, учитывая, что им нельзя заниматься за пределами лабораторий уровня биобезопасности 3. Чтобы решить эту проблему, псевдовирусы используются в качестве альтернативы вирусам дикого типа в некоторых экспериментах исследований H5 HPAI. Псевдовирусы достаточно безопасны для применения в лабораториях 2-го уровня биобезопасности.
Псевдовирусы H5 HPAI относятся к химерным вирусам, состоящим из ядер суррогатных вирусов, липидных оболочек с поверхностными гликопротеинами вирусов гриппа и репортерных генов. Ядра псевдовирусов обычно получают из лентивирусного вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), ретровирусов, таких как вирус мышиного лейкоза (MLV) и вирус везикулярного стоматита (VSV)3. В частности, система упаковки ВИЧ-1 широко используется для производства псевдовируса гриппа, где основными предоставленными генами являются gag и pol. Ген кляпа ВИЧ экспрессирует основные белки. Ген pol экспрессирует интегразу и обратную транскриптазу, обе из которых необходимы для экспрессии репортерного гена в трансдуцированных клетках. Имитируя геном суррогатного вируса, репортерный ген включается в ядро псевдовируса в форме РНК. Репортерный ген будет экспрессировать белок в клетках-хозяевах. Уровни экспрессии генов-репортеров могут быть использованы для измерения эффективности псевдовирусной инфекции 3,4. Основным репортером является люцифераза светлячка для измерения относительных единиц люминесценции (RLU) или относительной активности люциферазы (RLA) в трансдуцируемых клетках. Другие репортеры, такие как lacZ, Gaussia и люцифераза Renilla, также используются, только в меньшей степени5.
Псевдовирусы являются идеальными инструментами для изучения нейтрализующих антител против вирусов H5 Hapi. Для измерения активности нейтрализующих антител используются анализы псевдовирусной нейтрализации (ПН)6. Гемагглютинин (ГК) и нейраминидаза (НА) являются гликопротеинами на поверхности вируса гриппа А 7,8. Гиалуроновая кислота состоит из домена глобулярной головки для связывания рецепторов и стволового домена для слияния мембран. Белок NA обладает сиалидазной активностью, облегчающей высвобождение вируса 7,8. Анализ ПН может измерять нейтрализующие антитела, направленные на белки ГК. Нейтрализующие антитела, направленные на головную и стволовую область ГК, также могут быть обнаружены с помощью анализов прикрепления и проникновения вируса. По сравнению с вирусами дикого типа эксперименты по нейтрализации псевдовирусов имеют более чувствительные значения обнаружения, могут безопасно обрабатываться в лаборатории биобезопасности уровня 2 и, как правило, легче работать на практике.
В этом протоколе подробно представлены процедуры и критические этапы псевдовирусных препаратов H5 HPAI и анализов PN. Кроме того, в нем обсуждаются устранение неполадок, ограничения и модификации этих анализов. В этом исследовании в качестве примера использовался штамм A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) из вирусов H5N1 HPAI. Для получения иммунных сывороток, используемых в анализах, в этом протоколе был выбран белок HA, происходящий из штамма TH, в качестве иммуногена для иммунизации мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные операции, связанные с псевдовирусом, проводились в условиях ABSL2 в Институте Пастера Шанхайской китайской академии наук (IPS, CAS). Эксперименты на животных проводились на основе протоколов IPS, CAS, одобренных Комитетом по уходу за животными и их использованию.
1. Упаковка псевдовируса с кальций-фосфатной трансфекцией
- Делают одноклеточные суспензии из HEK293FT клеток (9 х10,5 на мл) в полной среде DMEM (табл. 1). Добавьте 10 мл одноклеточной суспензии в колбу T75, инкубируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% углекислым газом (CO2) в течение 20 ч перед трансфекцией.
ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется HEK293FT низкий проход (<20 проходов). Убедитесь, что монослой ячейки сливается на 80-90%. - Замените среду 10 мл свежей полной среды, содержащей хлорохин (100 мкМ), за 2 ч до трансфекции.
- Смешайте реагенты и плазмидную ДНК, как показано в таблице 2 и на рисунке 1: ddH 2 O, pCMV / R-HA, pCMV / R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8,9, 2,5 M CaCl2и 2x буфер HEPES. Пипеткой вверх и вниз 5 раз аккуратно, инкубируйте смесь при комнатной температуре (RT) в течение 20 минут.
- Перелейте смесь в среду над ячейками и аккуратно встряхните колбу. Инкубируют клетки в клеточном инкубаторе в течение 15 ч.
- Замените среду 15 мл свежей полной среды DMEM. Инкубируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2 в течение 65 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет среды будет светло-оранжевым или слегка желтым, и, по крайней мере, 80% клетки должны проявлять цитопатический эффект (CPE) под микроскопом с инвертированным светом. - Соберите надосадочную жидкость и центрифугируйте ее при 2095 x g в течение 20 мин при 4 ° C. Соберите надосадочную жидкость, аликвотируйте ее и храните при температуре -80 °C.
2. Обнаружение экспрессии белка HA, NA и р24 ВИЧ-1 псевдовируса гриппа
- Определите экспрессию белка HA с помощью анализа гемагглютинина (HA).
- Добавьте 50 мкл PBS в столбцы 2-12, ряды A, B и C 96-луночной пластины с круглым дном.
ПРИМЕЧАНИЕ: Строки A, B и C относятся к 3 независимым тестам репликации, а столбец 12 используется в качестве отрицательного контроля. - Добавьте 100 мкл псевдовируса в лунки колонки 1. Перенесите 50 мкл из колонки 1 в колонку 2, хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз 5 раз, выполните двукратное разведение до последней колонки 11 и выбросьте лишние 50 мкл из колонки 11.
- Добавьте по 50 мкл 0,5% эритроцита в каждую лунку, аккуратно проведите пипеткой вверх и вниз дважды. Инкубируйте планшет в течение 30-60 мин при RT или до тех пор, пока эритроциты отрицательного контроля не образуют обычные пятна на дне лунки.
- Наблюдайте и записывайте титры ГК псевдовируса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Единица ГК псевдовирусов является самым высоким коэффициентом разбавления вируса, который может вызвать 100% гемагглютинацию эритроцитов.
- Добавьте 50 мкл PBS в столбцы 2-12, ряды A, B и C 96-луночной пластины с круглым дном.
- Обнаружение экспрессии белков HA и NA с помощью вестерн-блоттинга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы вестерн-блоттинга выполняются в соответствии с руководством по молекулярному клонированию (4-е издание). - Определите экспрессию белка ВИЧ-1 р24 с помощью набора ИФА ВИЧ-1 р24 (таблица материалов).
- Добавьте 50 мкл буфера для лизиса в 450 мкл образца псевдовируса. Тщательно перемешайте.
- Добавьте 300 мкл буфера для промывки в каждую лунку микропланшета. Ударьте по перевернутой пластине, чтобы полностью удалить буфер для стирки. Повторите стирку 5 раз.
- Добавьте 200 мкл стандарта и образцов в каждую лунку отдельно. Инкубируйте их при температуре 37 °C в течение ночи или в течение 2 часов.
- Аспирируйте содержимое пластины и вымойте пластину, как описано в шаге 2.3.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте одну лунку пробирной пластины пустой, чтобы использовать ее в качестве заготовки подложки. - Добавьте 200 мкл антител детектора p24 в каждую лунку. Инкубируйте их при температуре 37 °C в течение 1 часа. Аспирируйте и вымойте пластину, как описано в шаге 2.3.2.
- Добавьте в каждую лунку по 100 мкл рабочего раствора стрептавидин-пероксидазы и инкубируйте их при 37 °C в течение 30 мин. Аспирируйте и вымойте пластину, как описано в шаге 2.3.2.
- Добавьте по 100 мкл рабочего раствора субстата в каждую лунку, включая заготовку субстрата, и инкубируйте их при 37 °C в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Синий цвет будет развиваться в скважинах. - Добавьте 100 мкл стоп-буфера в каждую лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Синий цвет сразу же изменится на желтый. - Считывание оптической плотности при длине волны 450 нм в течение 15 минут. Запишите титры р24 псевдовируса
3. Титрование псевдовирусов
- Сделайте одноклеточные суспензии клеток MDCK (5 x 104 на мл) в полной среде DMEM, добавьте 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 и 40000 клеток в разные лунки 96-луночной плоскодонной пластины. Инкубируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2 в течение 20 часов.
- Достаньте псевдовирус из холодильника с температурой -80 °C, разморозьте его на льду и встряхните псевдовирус.
- Добавьте 6 псевдовирусов HAU (6x единиц HA) в каждую лунку 96-луночной круглодонной пластины и пополните каждую лунку полным DMEM до 120 мкл.
- Пипеткой вверх и вниз по смеси 5 раз, чтобы тщательно перемешать. Инкубируйте смесь в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2 в течение 1 часа.
- Перенесите 100 мкл смеси в ячейки 96-луночного планшета. Поместите планшет для клеточных культур обратно в инкубатор на 48, 60 и 72 часа после заражения вирусом.
- Достаньте тарелку из инкубатора и проведите анализ люциферазы (Таблица материалов).
- Осторожно извлеките средство из лунок тарелки. Промойте клетки 200 мкл PBS и удалите PBS как можно больше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Переверните пластину и выбросьте надосадочную жидкость, нанеся ее на впитывающую бумагу. Если тестовая клеточная линия не может прочно прикрепиться к дну, осторожно удалите аспирацию среды. - Добавьте 50 мкл лизисного буфера в каждую лунку и несколько раз встряхните культуральную пластину. Храните тарелку при температуре -80 °C в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смешайте 1 объем 5-кратного буфера для лизиса с 4 объемами воды, чтобы получился 1-кратный буфер для лизиса. Перед использованием уравновесьте 1x буфер лизиса до RT. Качните пластину, чтобы убедиться, что клетки полностью покрыты буфером лизиса. Один процесс замораживания-оттаивания может помочь полностью лизировать клетку. - Выньте тарелку, уравновесьте при РТ в течение 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетка должна быть полностью лизирована. - Осторожно покачайте пластину несколько раз и перенесите все лизаты клеток на непрозрачные 96-луночные пластины.
- Добавьте 50 мкл субстрата в каждую лунку, аккуратно встряхните пластину несколько раз и тщательно перемешайте субстрат и буфер для лизиса.
- Измерьте свет, производимый в течение 5 минут, с помощью люминометра. Запишите титры люциферазы псевдовируса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда добавляется надлежащий субстрат, свет излучается как побочный продукт в результате химической реакции, в которой люциферин превращается в оксилюциферин ферментом люциферазой. Количество производимого света пропорционально количеству фермента люциферазы.
4. Подготовка иммунных сывороток
ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунная сыворотка будет использоваться для экспериментов, связанных с клетками, и экспериментальная операция должна проводиться в асептических условиях.
- Подготовьте 12 восьминедельных самок мышей BALB/c. Разделите мышей поровну на две группы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одна группа была группой DDV, а другая - отрицательной контрольной группой. - Групповая иммунизация DDV: дважды внутримышечно вводят 100 мкг кодон-оптимизированной плазмиды ДНК, кодирующей белок HA A/Thailand/(KAN-1)/2004 (TH) на 0-й и 3-й неделях, и однократно внутрибрюшинно усиливают 512 вирусоподобных частиц HAU TH (VLP) на 6-й неделе.
- Иммунизация контрольной группы: дважды внутримышечно вводят 100 мкг пустой векторной плазмидной ДНК на 0-й и 3-й неделе и однократно интраперитонельно повышают ВИЧ-1 на 6-й неделе.
- Соберите кровь мыши через 2 недели после последней иммунизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мышей анестезировали пентобарбиталом натрия (65 мг / кг) во время сбора крови. После забора крови из подчелюстной вены мышей немедленно усыпляли CO2. - Держите кровь в режиме ЛТ в течение 2 ч, затем 4 ° C в течение ночи. Центрифугу при 900 x g в течение 10 мин при 4 °C и собирают надосадочную жидкость. Инактивируйте сыворотку, поместив ее при 56 ° C на 30 мин.
- Храните иммунные сыворотки в холодильнике при температуре -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: На дополнительном рисунке 1 приведена блок-схема, описывающая основные процедуры иммунизации мышей.
5. Анализ псевдовирусной нейтрализации (ПН)
- Сделайте одноклеточные суспензии клеток MDCK (5 x 104 на мл) в полной среде DMEM и добавьте 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночной пластины с плоским дном. Инкубируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2 в течение 20 часов.
- Достаньте псевдовирус и сыворотки из холодильника с температурой -80 °C, разморозьте их на льду и тщательно перемешайте.
- Разбавьте сыворотки в полной среде 20 раз и добавьте 100 мкл полной среды DMEM в лунки 96-луночной круглодонной пластины из колонок 2-10.
- Добавьте 200 мкл разбавленной сыворотки в лунки колонки 2, перенесите 100 мкл из колонки 2 в колонку 3, разбавьте сыворотку до 1:20, 1:40, 1:80 и т.д. до 1:10240 последовательно из колонки 2 в колонку 10 и отбросьте 100 мкл из колонки 10.
- Добавьте 100 мкл полной среды DMEM в лунки колонны 11 в качестве отрицательного контроля.
- Добавьте по 100 мкл псевдовирусов в каждую лунку, тщательно проведите пипеткой вверх и вниз по смеси 5 раз и инкубируйте пластину смеси при температуре 37 °C, 5% CO2 в течение 1 часа.
- Перенесите 100 мкл смеси из 96-луночной пластины с круглым дном в соответствующую лунку 96-луночной пластины для культивирования клеток. Поместите пластину обратно в инкубатор (37 °C, 5% CO2) на 60 часов.
- Выньте тарелку из инкубатора. Выполните анализ люциферазы, как описано в шагах 3.7-3.12.
6. Анализ прикрепления псевдовирусов
- Сделайте одноклеточные суспензии клеток MDCK (4 x 104 на мл) в полной среде DMEM и добавьте суспензии клеток 100 мкл в каждую лунку в 96-луночной пластине с плоским дном. Инкубировать клетки при 37 °C, 5%CO2 в течение 20 ч.
- Инкубируйте псевдовирус с сыворотками в DMEM, содержащем 1% BSA, при 4 ° C в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем смеси составляет 100 мкл. - Блокируйте ячейки MDCK 100 мкл на лунку DMEM, содержащую 1% BSA, при 4 ° C в течение 1 часа.
- Инокулируют смесь псевдовируса и сыворотки (100 мкл) на монослой MDCK и инкубируют при 4 °C в течение 2 часов.
- Промойте клеточную пластину 4 раза PBS, содержащим 1% BSA, чтобы удалить любой несвязанный вирус.
- Лизируйте клетки 100 мкл буфера для лизиса люциферазы при RT в течение 30 мин.
- Количественно определите количество связанного вируса на клетках с помощью набора ИФА ВИЧ-1 p24, как описано выше (раздел 2.3).
7. Оценка проникновения вируса
- Сделайте одноклеточные суспензии клеток MDCK (5 x 104 на мл) в полной среде DMEM и добавьте 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночной пластины с плоским дном. Инкубируют клетки при 37 °C, 5%CO2 в течение 20 ч перед анализом.
- Инокулируйте псевдовирус (100 мкл) на монослой MDCK в 96-луночном планшете при 4 ° C в течение 6 часов.
- Промойте клеточную пластину 4 раза PBS, содержащим 1% BSA, чтобы удалить несвязанные псевдовирусы.
- Добавьте 100 мкл серийно разбавленной иммунной сыворотки или сыворотки от фиктивных вакцинированных мышей в DMEM, содержащих 1% BSA, в монослой и инкубируйте клетку при 4 ° C в течение 2 ч.
- Удалите надосадочную жидкость клетки и промойте клеточную культуральную пластину 4 раза PBS, содержащим 1% BSA.
- Добавьте свежий DMEM в клетки и инкубируйте в течение 60 часов в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2 .
- Измерьте относительную активность люциферазы (RLA) клеток, как описано в шагах 3.7-3.12.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусная запись, как указано RLA, была выражена в процентах от показаний, полученных в отсутствие сывороток, которые были установлены как 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Экспрессия белка HA, NA и ВИЧ-1 p24 псевдовируса гриппа
Чтобы определить эффективность упаковки вируса, запасы псевдовируса гриппа были впервые обнаружены с помощью анализа HA (рис. 2A). Единицы ГК на миллилитр псевдовирусов гриппа составляют 643 (табл. 3). Вестерн-блоттинг и сэндвич-анализы ИФА использовались для проверки экспрессии белка HA, NA и ВИЧ-1 p24. Затем были рассчитаны соотношения единицы ГК и количества gag p24 для псевдовирусов. Результаты вестерн-блоттинга показали, что существует 4 типа белков: белки HA0, HA1, HA2 и NA (дополнительный рисунок 2). Это указывает на то, что обволакивающие белки псевдовирусов гриппа сходны с белками вирусов дикого типа. Соотношения HA и Gag p24 находились в пределах нормы, как сообщалось (таблица 3)9.
| Штаммы псевдовирусов | HAU/мл | 1,00E + 05 пг/мл | Соотношение HAU/1,00E+05 пг* |
| P A/Thailand/(KAN-1)/2004 | 642,52 ± 30,26 | 4.20 ± 0.17 | 152.98 |
| *Соотношения единиц ГК и количества ВИЧ-1 Gag p24 в псевдовирусах рассчитывали следующим образом: единицы HA/количество Gag p24. | |||
Таблица 3: Количественная оценка псевдовируса H5.
Титрование псевдовирусов
Для измерения концентрации функциональных вирусных частиц определяли относительную активность люциферазы (РЛА) псевдовируса. Показания RLA зависят от многих переменных. Чтобы определить влияние количества трансдуцированных клеток на показания RLA, мы засеяли ячейки 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 и 40000 на лунку 96-луночного планшета (рис. 2). Результаты показали, что показания RLA псевдовируса являются самыми высокими, а стандартная ошибка среднего значения является самой низкой при посеве 5000 клеток в лунку с 96-луночным планшетом (рис. 4A). Чтобы определить влияние инкубационного времени, показания RLA обнаруживают через 48 ч, 60 ч и 72 ч после заражения вирусом. Результаты показали, что при инкубации в течение 60 ч показания РЛА псевдовируса выше по значениям и лучше по повторяемости с низкой стандартной погрешностью среднего значения (рис. 4B). Результаты показывают, что можно засеять 5000 клеток в лунку с 96-луночным планшетом и обнаружить показания RLA через 60 часов после заражения вирусом.
Анализы ПН
Титры нейтрализации иммунных сывороток контрольной группы и группы DDV измеряли с помощью ПН-анализов (рис. 5). Как показано на рисунке 5A, иммунные сыворотки из группы DDV показали высокие титры нейтрализации против штамма псевдовируса A/Thailand/1(KAN)-1/04. Напротив, сыворотки из контрольной группы не проявляли никакой нейтрализующей активности (рис. 5B). По сравнению с традиционными серологическими анализами (анализы HI и MN), анализы PN более чувствительны (данные не показаны).
Анализ нейтрализации насадки
Некоторые нейтрализующие антитела могут препятствовать прикреплению вирусов к рецепторам сиаловой кислоты. Эти антитела направляются к головке ГК и преобладают после иммунизации коммерческой вакциной или заражения вирусом гриппа. Для выявления нейтрализующей активности этих антител проводятся анализы нейтрализации прикрепления (рис. 3). По сравнению с контрольными сыворотками нейтрализующая активность иммунных сывороток является мощной, что указывает на наличие в иммунных сыворотках большого количества антител, направленных на головку ГК (рис. 6А).
Оценка проникновения вируса
Этот анализ используется для выявления антител, которые препятствуют слиянию оболочки вируса и эндосомальных мембран во время вирусной инфекции гриппа. Эти антитела направлены на домен стебля HA и обычно менее эффективны. Для измерения титров нейтрализации этих антител проводятся анализы после прикрепления (рис. 3). Существуют значительные различия между иммунными сыворотками и контрольными сыворотками, что указывает на наличие антител, направленных на стволовую область HA в иммунных сыворотках (рис. 6B).
Рисунок 1: Блок-схема трансфекции, опосредованной кальцием. Эта блок-схема используется для описания основных процедур трансфекции, опосредованной кальцием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Количественная оценка и титрование псевдовируса . (A) Блок-схема анализа псевдовирусной гиалуроновой кислоты, описывающая основные этапы анализа псевдовирусной гиалуроновой кислоты. (B) Блок-схема анализа псевдовируса Р24, описывающая основные этапы анализа псевдовируса Р24. (C) Блок-схема анализа титрования псевдовирусов, описывающая основные этапы анализа титрования псевдовирусов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Анализы нейтрализации на основе псевдовирусов. (A) Блок-схема анализа PN, описывающая основные этапы анализа PN. (B) Блок-схема анализа прикрепления псевдовируса, описывающая основные этапы анализа прикрепления. (C) Блок-схема оценки анализа вирусного проникновения, описывающая основные этапы анализа вирусного входа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Титрование псевдовирусов. (A) Различное количество ячеек на лунку в 96-луночном планшете влияет на показания RLA. 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 и 40000 клеток были засеяны в 96-луночную пластину. (B) Различное время сбора урожая влияет на показания RLA. Показания RLA обнаруживаются через 48 ч, 60 ч и 72 ч после заражения вирусом. Данные, собранные в результате трех независимых экспериментов, представлены в виде среднего значения ± SEM; Столбцы погрешности представляют собой стандартную погрешность среднего значения (SEM). Был проведен односторонний тест ANOVA с тестом Тьюки. P < 0,0001; нс, не существенно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Ответы нейтрализующих антител H5, обнаруженные с помощью псевдовируса. (A) Титрование ответов нейтрализующих антител иммунных сывороток из группы DDV. (B) Титрование ответов нейтрализующих антител иммунных сывороток контрольной группы. IC50 определяется как взаимные разведения нейтрализующего антитела, которое может ингибировать 50% псевдовируса. Данные, собранные в результате трех независимых экспериментов, представлены в виде среднего значения ± SEM; Столбцы погрешности представляют собой стандартную погрешность среднего значения (SEM). В качестве негативного контроля использовался псевдовирус VSVG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Определение активности нейтрализующих антител с помощью анализов связывания и проникновения вируса. (A) Иммунные сыворотки из группы DDV, а не из контрольной группы, ингибируют прикрепление вируса к клеткам. (B) Иммунные сыворотки из группы DDV, а не из контрольной группы, частично ингибируют вирусную инфекцию после прикрепления. Данные, собранные в результате трех независимых экспериментов, представлены в виде среднего значения ± SEM; Столбцы погрешности представляют собой стандартную погрешность среднего значения (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Полный состав среды DMEM | Концентрация |
| Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM) | 1x |
| Фетальная бычья сыворотка | 10% |
| Пенициллин (1 ЕД / мл) / стрептомицин | 1 мкг/мл |
Таблица 1: Полный состав среды DMEM.
| Материалы | Концентрация | Том |
| 2x HEPES (рН 7,1) | -- | 675.0 мкл |
| CaCl 2 (2,5 м) | -- | 67,5 мкл |
| ddH2O | -- | 529,2 мкл |
| пЦМВ Δ 8,9 | 1000 нг/мкл | 18,9 мкл |
| пЦМВ/Р-ГК | 100 нг/мкл | 27,0 мкл |
| pCMV/R-NA | 50 нг/мкл | 13,5 мкл |
| pHR-Luc | 1000 нг/мкл | 18,9 мкл |
Таблица 2: Система упаковки псевдовирусов.
Дополнительный рисунок 1: Блок-схема иммунизации мышей. На этой блок-схеме описаны основные процедуры иммунизации мышей. В качестве образцов использовали иммунные сыворотки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Экспрессия белка HA, NA и ВИЧ-1 p24 псевдовируса гриппа. Вестерн-блоттинг псевдовирусных белков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HEK293FT клетки обычно используются в качестве упаковочных клеток для производства псевдовирусов. Регулярное обнаружение микоплазмы имеет важное значение во время культивирования клеток. Заражение микоплазмой может резко снизить выход псевдовируса, а иногда и близко к нулю. По сравнению с другими загрязнениями, микоплазменные загрязнения не приводят к изменению значения рН или помутнению питательной среды клеток. Даже высокая концентрация микоплазмы не видна невооруженным глазом или под микроскопом. Тремя популярными методами обнаружения микоплазм являются культура микоплазмы, окрашивание ДНК флуоресцентным DAPI или Hoechst 33258 и полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР-амплификация ДНК микоплазмы в культуральных образцах широко используется для быстрого, простого и надежного тестирования микоплазмы10.
Трансфекция, опосредованная фосфатом кальция, уже много лет используется для упаковки псевдовирусов гриппа из-за ее высокой эффективности, низкой стоимости и простоты эксплуатации11. Однако этот метод очень чувствителен к значению рН раствора, буферного раствора HEPES, среды для культивирования клеток HEK293FT и двойной дистилляции H2O. Значение рН влияло на образование осадка и продолжительность пребывания осадка на HEK293FT клетках. Таким образом, он может определить количество ДНК, которое поглощается HEK293FT клетками. рН для буферного раствора HEPES чрезвычайно узкий и колеблется от 7,05-7,12до 12,13,14, в этом состоянии в растворе, буферизованном для HEPES, медленно образуется осадок, содержащий фосфат кальция и ДНК. Если рН будет слишком высоким, размер осадка станет настолько большим, что он может даже убить HEK293T клетки. Напротив, если рН слишком низкий, осадок не может образоваться, или осадок будет слишком мал, чтобы осесть на поверхность клетки. Кроме того, рН HEK293FT среды для культивирования клеток также играет роль в эффективности трансфекции. Во время трансфекции клеточная среда должна поддерживаться в пределах рН 7,2-7,4. Как гиперкислые, так и щелочные среды изменяют размер осадка и время адсорбции смеси ДНК на поверхности клетки. Кроме того, двойная дистилляция H2O различного происхождения, используемая в смеси ДНК, может изменять рН буферного раствора HEPES. Таким образом, поддержание стабильного значения рН раствора для трансфекции и питательной среды имеет решающее значение для обеспечения высокой эффективности трансфекции. Кроме того, на эффективность трансфекции также влияют раствор CaCl2 2,5 М и концентрация углекислого газа (CO2) в клеточном инкубаторе. В процессе трансфекции крайне важно правильно хранить раствор CaCl 2 и стабилизировать концентрацию CO2 в инкубаторе.
Самая популярная система упаковки псевдовируса гриппа включает в себя множественную плазмидную котрансфекцию. Гены HA, NA, репортерного и лентивирусного gag и pol клонируются в векторы экспрессии плазмид отдельно, а затем одновременно трансфицируются в клетки. Чтобы увеличить экспрессию белка, последовательность консенсуса Козака часто добавляется перед начальным сайтом транскрипции.
Необходимо получить чистую, суперспиральную и не содержащую эндотоксинов плазмидную ДНК15. Так как плазмидное соотношение напрямую влияет на выход псевдовируса. Этот протокол оптимизировал соотношение плазмид «ядро: репортер: HA: NA» до 28:28:4:1 и сравнил его с другими методами трансфекции. Требуется, чтобы количество плазмидной ДНК при трансфекции фосфата кальция доходило до 30,5 мкг на 100 мм чашку.
Титры псевдовируса выявляются с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR), иммуноферментного анализа (ИФА), анализа гемагглютинации и анализа обнаружения RLA. Анализ qRT-PCR используется для оценки количества копий генов РНК внутренней части псевдовируса5. Анализ ИФА используется для определения содержания белка р24, который является основным компонентом ядра ВИЧ. Анализ гемагглютинации измеряет количество шипов ГК на поверхности псевдовирусных частиц. Эти три анализа используются для количественной оценки нефункциональных вирусных частиц. Анализ обнаружения RLA является основным методом измерения концентрации функциональных вирусных частиц, которые могут инфицировать трансдуцированные клетки и высвобождать репортерные гены в псевдовирусном запасе. Клетки MDCK обычно используются в качестве трансдуцированных клеток. Трансдуцированные клетки высевают в 96-луночные культуральные планшеты, инфицируют псевдовирусом, лизируют лизисным буфером, а затем переносят на 96-луночные пластины люминометра для считывания значений. Различное количество клеток и время инкубации влияют на значения RLA. Основываясь на результатах, экспрессия репортерного гена высока при посеве 5000 клеток в лунку на 96-луночную пластину, а RLA обнаруживается через 60 ч после вирусной инфекции.
Анализы нейтрализации псевдовирусов (PN) H5 HPAI широко применяются для обнаружения антител из-за их безопасности, более высокой чувствительности, точности и пригодности для высокопроизводительного скрининга. Общий протокол анализа ПН включает следующие четыре этапа: количество псевдовируса, разведение сыворотки, инкубация псевдовируса-антитела и обнаружение активности люциферазы. Количество псевдовируса нормализуется на основании показаний RLA. Для получения воспроизводимых результатов эксперимента используются значения RLA 106 на скважину в 96-луночном планшете. Начальная точка разведения образца сыворотки должна быть более 40. Компонент образца сыворотки, очевидно, увеличивает значения люциферазы псевдовируса, когда коэффициент разбавления образца сыворотки составляет менее 40. Смесь псевдовирус-антитело инкубируют в течение 1 ч при 37 °С, а затем переносят в клетки MDCK с последующим определением показаний RLA через 60 ч. Уровни люциферазы обычно используются в качестве инструмента для определения эффективности псевдовирусной инфекции.
В анализе PN есть четыре важных элемента: репортерный белок люциферазы, химический анализ, люминометр и микропланшеты16. Во-первых, ген люциферазы оптимизирован для снижения уровня экспрессии белка в трансдуцированных клетках. Разработка репортерных и векторных основных генов уменьшает количество сайтов связывания факторов транскрипции консенсуса, чтобы снизить риск аномальной транскрипции. Во-вторых, соответствующие реагенты для обнаружения подбираются в соответствии с целью эксперимента. Анализы PN обычно используются в качестве высокопроизводительных методов для обнаружения нейтрализующих реакций образцов сыворотки или антител. В этом протоколе использовалась система анализа люциферазы bright-Glo, которая обеспечивает самый яркий сигнал, широкий динамический диапазон и высокую чувствительность. Что еще более важно, период полураспада сигнала составляет примерно 10 минут, и ячейки тестируются сразу после добавления субстрата. Люминометр используется для определения концентрации люциферазы. Производится множество различных типов люминометров. Основной принцип заключается в том, что используемая машина может точно идентифицировать различия в активности люциферазы между разными образцами. Для непрозрачности и низкого люминесцентного фона следует использовать черные или белые полистирольные микропластины. Белые микропластины могут усиливать люминесцентные сигналы и иметь низкую фоновую люминесценцию, в то время как черные микропластины могут минимизировать рассеяние света, чтобы уменьшить перекрестные помехи17.
Анализы ПН соответствуют традиционным методам выявления ответов нейтрализующих антител. Однако, включая только белки HA и NA вирусов гриппа дикого типа, псевдовирусы далеки от вируса дикого типа. Гиалуроновая кислота может связываться с рецептором сиаловой кислоты клетки-реципиента, инициируя инфекцию. Затем конформационные изменения ГК в эндосоме вызывают слияние вирусной и эндосомальной мембран, высвобождая вирусные рибонуклеопротеины (vRNP) в цитоплазму. Псевдовирусы гриппа могут только имитировать эти процессы и применяются в смежных исследованиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана исследовательскими грантами Проекта по наращиванию инновационного потенциала провинции Цзянсу (BM2020019), Шэньчжэньского научно-технического проекта (No. JSGG20200225150702770), Стратегическая приоритетная исследовательская программа Китайской академии наук (XDB29030103), Гуандунский научно-технический проект (No 2020B1111340076) и Программа открытых исследований лаборатории Шэньчжэньского залива (No 2020B111340076) и Программа открытых исследований лаборатории Шэньчжэньского залива (No 2020B1111340076) и Программа открытых исследований лаборатории Шэньчжэньского залива (No 2020B1111340076). SZBL202002271003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | -- | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | -- | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).
- Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311 (2020).
- Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
- Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
- Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
- Krammer, F., et al.
- Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
- Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
- Michael, R. G., Joseph, S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2012).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R.
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
- Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).
- Luciferase assay system. , Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021).
- Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates. , Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021).
