Summary
Burada psödovirüs paketlemesi ve antikor nötralize edici aktivitenin ölçümü için bir protokol açıklanmaktadır.
Abstract
1996 yılından bu yana, A / kaz / Guangdong / 1 / 96 soyundan gelen yüksek derecede patojenik kuş gribi (HPAI) H5 virüsleri kümes hayvanlarında ve yabani kuşlarda grip salgınlarına neden olmaktadır. Bazen, insanlar da buna kurban gider ve bu da yüksek ölüm oranıyla sonuçlanır. Bununla birlikte, HPAI virüsü araştırması, biyogüvenlik seviye 3 laboratuvarlarında ele alınması gerektiği düşünülerek sıklıkla engellenmektedir. Bu sorunu ele almak için, H5 HPAI çalışmalarının bazı deneylerinde psödovirüsler vahşi tip virüslere alternatif olarak benimsenmiştir. Psödovirüsler, H5 HPAI virüslerine karşı nötralize edici antikorları incelemek için ideal araçlar olduğunu kanıtlamıştır. Bu protokol, H5 HPAI psödovirüs preparatlarının ve psödovirüs nötralizasyon testlerinin prosedürlerini ve kritik adımlarını açıklamaktadır. Ayrıca, bu testlerin sorun giderme, sınırlama ve modifikasyonları da ele alınmaktadır.
Introduction
1996 yılından bu yana, A / kaz / Guangdong / 1 / 96 soyundan gelen yüksek derecede patojenik kuş gribi (HPAI) H5 virüsleri, kümes hayvanlarında ve yabani kuşlarda sürekli grip salgınlarına neden olmakta ve küresel kanatlı hayvan endüstrisinde muazzam sosyo-ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Bazen, insanlar da onunla enfekte olurlar, yüksek bir ölüm oranıile karşı karşıya kalırlar 1,2. Bununla birlikte, HPAI virüsü araştırması, biyogüvenlik seviye 3 laboratuvarlarının dışında ele alınamayacağı için sıklıkla engellenmektedir. Bu sorunu ele almak için, H5 HPAI çalışmalarının bazı deneylerinde psödovirüsler vahşi tip virüslere alternatif olarak benimsenmiştir. Psödovirüsler biyogüvenlik seviye 2 laboratuvarlarında uygulanabilecek kadar güvenlidir.
H5 HPAI psödovirüsleri, vekil virüs çekirdekleri, influenza virüslerinden yüzey glikoproteinleri içeren lipit zarfları ve muhabir genlerinden oluşan kimerik virüslere aittir. Psödovirüs çekirdekleri genellikle lentiviral insan immün yetmezlik virüsü (HIV), murin lösemi virüsü (MLV) gibi retrovirüsler ve veziküler stomatit virüsü (VSV)3 türevlerinden türetilir. Spesifik olarak, HIV-1 paketleme sistemi, sağlanan birincil genlerin tıkaç ve pol olduğu influenza psödovirüs üretmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. HIV gag geni çekirdek proteinleri eksprese eder. Pol geni, her ikisi de transdübe hücrelerde muhabir genin ekspresyonu için gerekli olan integraz ve ters transkriptazı eksprese eder. Vekil virüsün genomunu taklit eden muhabir gen, RNA formunda psödovirüs çekirdeğine sarılır. Muhabir gen, konakçı hücrelerdeki proteini eksprese edecektir. Muhabir genlerin gen ekspresyon seviyeleri, psödovirüs enfeksiyonu etkinliğini ölçmek için kullanılabilir 3,4. Birincil raporlayıcı, dönüştürülmüş hücrelerdeki bağıl lüminesans birimlerini (RLU) veya göreceli lusiferaz aktivitesini (RLA) ölçmek için ateşböceği lusiferazdır. LacZ, Gaussia ve Renilla lusiferaz gibi diğer muhabirler de kullanılır, sadece daha az ölçüde5.
Psödovirüsler, H5 HAPI virüslerine karşı nötralize edici antikorları incelemek için ideal araçlardır. Nötralize edici antikor gücünü ölçmek için, psödovirüs nötralizasyonu (PN) testleri6 kullanılır. Hemaglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA), influenza A virüsü 7,8'in yüzeyindeki glikoproteinlerdir. HA, reseptör bağlanması için küresel bir kafa alanı ve membran füzyonu için bir kök alanından oluşur. NA proteini, virüs salınımını kolaylaştırmak için sialidaz aktivitesine sahiptir 7,8. Bir PN testi, HA proteinlerine yönelik nötralize edici antikorları ölçebilir. HA'nın baş ve kök bölgesine yönelik nötralize edici antikorlar viral bağlanma ve giriş testleri ile de tespit edilebilir. Vahşi tip virüslerle karşılaştırıldığında, psödovirüs nötralizasyon deneyleri daha hassas tespit değerlerine sahiptir, Seviye 2 biyogüvenlik laboratuvarında güvenli bir şekilde ele alınabilir ve pratikte genellikle kullanımı daha kolaydır.
Bu protokol, H5 HPAI psödovirüs preparatlarının ve PN tahlillerinin prosedürlerini ve kritik adımlarını ayrıntılı olarak sunmaktadır. Ayrıca, bu testlerin sorun giderme, sınırlama ve modifikasyonları da ele alınmaktadır. Bu çalışmada, H5N1 HPAI virüslerinden A/Tayland/1(KAN)-1/2004(TH) suşu örnek olarak kullanılmıştır. Tahlillerde kullanılan immün serumları elde etmek için, bu protokol TH suşundan kaynaklanan HA proteinini fareleri immünojen olarak seçti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Psödovirüs ile ilgili tüm deneysel operasyonlar Şangay Çin Bilimler Akademisi Pasteur Enstitüsü'nde (IPS, CAS) ABSL2 koşulu altında gerçekleştirildi. Hayvan deneyleri, IPS, CAS'ın Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onaylı hayvan protokollerine dayanarak gerçekleştirilmiştir.
1. Kalsiyum-fosfat transfeksiyonu ile psödovirüs ambalajı
- Tam DMEM ortamında HEK293FT hücrelerin tek hücreli süspansiyonlarını (mL başına 9 x 105) yapın (Tablo 1). Tek hücreli süspansiyonların 10 mL'sini bir T75 şişesine ekleyin, hücreleri transfeksiyondan önce 20 saat boyunca 37 ° C,% 5 karbondioksit (CO2) inkübatörde inkübe edin.
NOT: Düşük HEK293FT pasaj (<20 pasaj) önerilir. Hücre tek katmanının% 80-90 oranında akıcı olduğundan emin olun. - Transfeksiyondan 2 saat önce ortamı klorokin (100 μM) içeren 10 mL taze komple ortam ile değiştirin.
- Reaktifleri ve plazmid DNA'sını Tablo 2 ve Şekil 1'de gösterildiği gibi karıştırın: ddH 2 O, pCMV / R-HA, pCMV / R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8.9, 2.5 M CaCl2ve 2x HEPES tamponu. Pipetleri yavaşça 5 kez yukarı ve aşağı kaydırın, karışımı oda sıcaklığında (RT) 20 dakika boyunca inkübe edin.
- Karışımı hücrelerin üzerindeki ortama aktarın ve şişeyi yavaşça sallayın. Hücre inkübatöründeki hücreleri 15 saat boyunca inkübe edin.
- Ortamı 15 mL taze tam DMEM ortamı ile değiştirin. Hücreleri 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde 65 saat boyunca inkübe edin.
NOT: Ortamın rengi açık turuncu veya hafif sarı olacaktır ve hücrenin en az% 80'i ters ışık mikroskobu altında sitopatik etkiyi (CPE) göstermelidir. - Süpernatanı hasat edin ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca 2095 x g'de santrifüj edin. Süpernatanı toplayın, aliquot edin ve -80 ° C'de saklayın.
2. İnfluenza psödovirüsünün HA, NA ve HIV-1 p24 protein ekspresyonunun tespiti
- Hemaglutinin (HA) testi ile HA protein ekspresyonunu tespit edin.
- 2-12 sütunlarına, 96 delikli yuvarlak tabanlı bir plakanın A, B ve C satırlarına 50 μL PBS ekleyin.
NOT: Satır A, B ve C 3 bağımsız çoğaltma testine aittir ve sütun 12 negatif denetim olarak kullanılır. - Sütun 1'in kuyucuklarına 100 μL psödovirüs ekleyin. Sütun 1'den Sütun 2'ye 50 μL aktarın, 5 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak iyice karıştırın, son sütun 11'e kadar iki katlı seyreltmeleri gerçekleştirin ve fazladan 50 μL'yi sütun 11'den atın.
- Her bir oyuğa 50 μL% 0.5 eritrosit ekleyin, hafifçe iki kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Plakayı RT'de 30-60 dakika boyunca veya negatif kontrolün eritrositleri kuyunun dibindeki normal lekeleri oluşturana kadar inkübe edin.
- Psödovirüsün HA titrelerini gözlemleyin ve kaydedin.
NOT: Psödovirüslerin HA ünitesi, kırmızı kan hücrelerinin% 100 hemaglutinasyonuna neden olabilen virüsün en yüksek seyreltme faktörüdür.
- 2-12 sütunlarına, 96 delikli yuvarlak tabanlı bir plakanın A, B ve C satırlarına 50 μL PBS ekleyin.
- Batı lekesi testi ile HA ve NA protein ekspresyonunu tespit edin.
NOT: Tüm batı lekesi adımları Moleküler klonlama el kitabına (4. baskı) göre gerçekleştirilir. - HIV-1 p24 protein ekspresyonunu HIV-1 p24 ELISA kiti ile tespit edin (Malzeme Tablosu).
- 450 μL psödovirüs örneğine 50 μL lizis tamponu ekleyin. İyice karıştırın.
- Mikroplakanın her bir kuyucuğuna 300 μL yıkama tamponu ekleyin. Yıkama tamponunu tamamen çıkarmak için plakayı ters çevirin. Yıkamayı 5 kez tekrarlayın.
- Standarttan 200 μL ekleyin ve her bir kuyucuğa ayrı ayrı numune alın. Onları gece boyunca 37 ° C'de veya 2 saat boyunca inkübe edin.
- Plakanın içeriğini aspire edin ve plakayı adım 2.3.2'de açıklandığı gibi yıkayın.
NOT: Alt tabaka olarak kullanmak için tahlil plakasının bir kuyucuğunu boş bırakın. - Her bir kuyucuğa 200 μL p24 dedektör antikorları ekleyin. Onları 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Plakayı adım 2.3.2'de açıklandığı gibi aspire edin ve yıkayın.
- Her bir oyuğa 100 μL streptavidin-Peroksidaz çalışma çözeltisi ekleyin ve bunları 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Plakayı adım 2.3.2'de açıklandığı gibi aspire edin ve yıkayın.
- Substrat boş kuyusu da dahil olmak üzere her bir kuyucuğa 100 μL alt durum çalışma çözeltisi ekleyin ve bunları 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
NOT: Kuyularda mavi renk gelişecektir. - Her bir kuyucuğa 100 μL durdurma tamponu ekleyin.
NOT: Mavi renk hemen sarıya dönüşecektir. - Optik yoğunluğu 15 dakika içinde 450 nm'de okuyun. Psödovirüsün p24 titrelerini kaydedin
3. Psödovirüs titrasyonu
- MDCK hücrelerinin tek hücreli süspansiyonlarını (mL başına 5 x 104 ) tam DMEM ortamında yapın, 96 delikli düz tabanlı bir plakanın farklı kuyucuklarına 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 ve 40000 hücre ekleyin. Hücreleri 20 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin.
- Psödovirüsü -80 ° C buzdolabından çıkarın, buzun üzerinde çözün ve psödovirüsü vorteks.
- 96 delikli yuvarlak tabanlı plakanın her bir kuyucuğuna 6 HAU (6x HA birimi) psödovirüs ekleyin ve her bir kuyucuğu 120 μL'ye kadar tam DMEM ile doldurun.
- İyice karıştırmak için karışımı 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Karışım plakasını 37 °C, % 5 CO2 inkübatörde 1 saat boyunca inkübe edin.
- Karışımın 100 μL'sini 96 delikli plakadaki hücrelere aktarın. Hücre kültürü plakasını virüs enfeksiyonundan sonra 48 saat, 60 saat ve 72 saat boyunca inkübatöre geri koyun.
- Plakayı inkübatörden çıkarın ve lusiferaz tahlilini yapın (Malzeme Tablosu).
- Ortamı plakanın kuyucuklarından dikkatlice çıkarın. Hücreleri 200 μL PBS ile durulayın ve PBS'yi mümkün olduğunca çıkarın.
NOT: Plakayı çevirin ve süpernatantı emici kağıda ters tokat atarak atın. Test hücresi hattı tabana sıkıca yapışamazsa, orta aspirasyonu dikkatlice çıkarın. - Her bir kuyucuğa 50 μL lizis tamponu ekleyin ve kültür plakasını birkaç kez sallayın. Plakayı gece boyunca -80 ° C'de saklayın.
NOT: 1x lizis tamponunu yapmak için 1 hacim 5x lizis tamponunu 4 hacim su ile karıştırın. Kullanmadan önce 1x lizis tamponunu RT ile dengeleyin. Hücrelerin lizis tamponu ile tamamen kaplandığından emin olmak için plakayı sallayın. Tek donma-çözme işlemi, hücrenin tamamen lize edilmesine yardımcı olabilir. - Plakayı çıkarın, RT'de 2 saat dengeleyin.
NOT: Hücre tamamen lize edilmelidir. - Plakayı birkaç kez yavaşça sallayın ve tüm hücre lizatlarını opak 96 delikli plakalara aktarın.
- Her bir kuyucuğa 50 μL substrat ekleyin, plakayı birkaç kez hafifçe sallayın ve substrat ile lizis tamponunu iyice karıştırın.
- Bir luminometre kullanarak 5 dakika içinde üretilen ışığı ölçün. Psödovirüsün lusiferaz titrelerini kaydedin.
NOT: Uygun bir substrat eklendiğinde, lusiferinin lusiferaz enzimi tarafından oksilusiferine dönüştürüldüğü kimyasal bir reaksiyon yoluyla ışık bir yan ürün olarak yayılır. Üretilen ışık miktarı, lusiferaz enziminin miktarı ile orantılıdır.
4. İmmün serumlar hazırlığı
NOT: İmmün serum, hücre ile ilgili deneyler için kullanılacaktır ve deneysel operasyon aseptik koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
- 12 sekiz haftalık dişi BALB / c faresi hazırlayın. Fareleri eşit olarak iki gruba ayırın.
NOT: Bir grup DDV grubu, diğeri negatif kontrol grubuydu. - DDV grubu immünizasyonu: 0. ve 3. haftalarda A / Tayland / (KAN-1) / 2004 (TH) HA proteinini kodlayan 100 μg kodon için optimize edilmiş bir DNA plazmidi ile kas içinden iki kez primer ve 6. haftada 512 HAU TH virüs benzeri partiküller (VLP) ile bir kez intraperitoneal olarak artırın.
- Kontrol grubu immünizasyonu: 0. ve 3. haftalarda 100 μg boş vektör plazmid DNA'sı ile kas içinden iki kez primer ve 6. haftada HIV-1 gag VLP ile intraperitoneal olarak bir kez artar.
- Son aşılamadan 2 hafta sonra fare kanını toplayın.
NOT: Burada, fareler kan toplama sırasında pentobarbital sodyum (65 mg / kg) ile uyuşturuldu. Submandibuler damardan kan alındıktan sonra, fareler hemen CO2 ile ötenazi yapıldı. - Kanı RT'de 2 saat, ardından gece boyunca 4 ° C'de tutun. 4 °C'de 10 dakika boyunca 900 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı toplayın. Serumu 30 dakika boyunca 56 ° C'ye yerleştirerek devre dışı bırakın.
- İmmün serumları kullanım için -80 ° C'lik bir buzdolabında saklayın.
NOT: Fare bağışıklamasının başlıca prosedürlerini açıklayan akış şeması için Ek Şekil 1'e bakın.
5. Psödovirüs nötralizasyonu (PN) testi
- Tam DMEM ortamında MDCK hücrelerinin tek hücreli süspansiyonlarını (mL başına 5 x 104 ) yapın ve 96 delikli düz tabanlı bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Hücreleri 20 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin.
- Psödovirüs ve serumu -80 ° C buzdolabından çıkarın, buzun üzerinde çözün ve iyice girdap yapın.
- Serumu tam ortamda 20 kez seyreltin ve 2-10 sütunlarından 96 delikli yuvarlak tabanlı bir plakanın kuyucuklarına 100 μL tam DMEM ortamı ekleyin.
- Seyreltilmiş serumların 200 μL'sini sütun 2'nin kuyucuklarına ekleyin, 100 μL'yi sütun 2'den sütun 3'e aktarın, serumu sütun 2'den sütun 10'a art arda 1:20, 1:40, 1:80 vb. olarak seyreltin ve 100 μL'yi sütun 10'dan atın.
- Negatif kontrol olarak sütun 11'in kuyucuklarına 100 μL DMEM tam ortamı ekleyin.
- Her bir oyuğa 100 μL psödovirüs ekleyin, karışımı 5 kez iyice yukarı ve aşağı pipetleyin ve karışım plakasını 1 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO2 içinde inkübe edin.
- Karışımın 100 μL'sini 96 delikli yuvarlak tabanlı plakadan 96 delikli hücre kültürü plakasının karşılık gelen kuyucuğuna aktarın. Plakayı 60 saat boyunca inkübatöre (37 ° C,% 5 CO2) geri koyun.
- Plakayı inkübatörden çıkarın. Lusiferaz testini 3.7-3.12 adımlarında açıklandığı gibi gerçekleştirin.
6. Psödovirüs bağlanma testi
- Tam DMEM ortamında MDCK hücrelerinin tek hücreli süspansiyonlarını (mL başına 4 x 104 ) yapın ve 96 delikli düz tabanlı bir plakada her bir kuyucuğa 100 μL hücre süspansiyonları ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO2'de 20 saat boyunca inkübe edin.
- Psödovirüsü DMEM'de serumla inkübe edin ve gece boyunca 4 ° C'de% 1 BSA içerir.
NOT: Karışımın hacmi 100 μL'dir. - MDCK hücrelerini, 1 saat boyunca 4 °C'de %1 BSA içeren DMEM kuyucuğu başına 100 μL ile bloke edin.
- Psödovirüs ve serum karışımını (100 μL) MDCK tek katmanına aşılayın ve 2 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Bağlanmamış virüsleri temizlemek için hücre plakasını% 1 BSA içeren PBS ile 4 kez yıkayın.
- RT'de 100 μL lusiferaz lizis tamponu ile hücreleri 30 dakika boyunca lize edin.
- Yukarıda açıklandığı gibi bir HIV-1 p24 ELISA kiti ile hücrelerdeki bağlı virüs miktarını ölçün (bölüm 2.3).
7. Viral girişin değerlendirilmesi
- Tam DMEM ortamında MDCK hücrelerinin tek hücreli süspansiyonlarını (mL başına 5 x 104 ) yapın ve 96 delikli düz tabanlı bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Tahlilden önce hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO2'de 20 saat boyunca inkübe edin.
- Psödovirüsü (100 μL) 6 saat boyunca 4 °C'de 96 delikli bir plakada bir MDCK tek katmanlı üzerine aşılayın.
- Bağlanmamış psödovirüsleri çıkarmak için hücre plakasını% 1 BSA içeren PBS ile 4 kez yıkayın.
- Tek katmana% 1 BSA içeren DMEM'deki sahte aşılama farelerinden seri olarak seyreltilmiş immün serumların veya serumların 100 μL'sini ekleyin ve hücreyi 2 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Hücre süpernatanını çıkarın ve hücre kültürü plakasını% 1 BSA içeren PBS ile 4 kez yıkayın.
- Hücrelere taze DMEM ekleyin ve 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde 60 saat inkübe edin.
- Hücrelerin bağıl lusiferaz aktivitesini (RLA) 3.7-3.12 adımlarında açıklandığı gibi ölçün.
NOT: RLA ile belirtildiği gibi viral giriş, serumların yokluğunda elde edilen okumanın yüzdesi olarak ifade edildi ve bu% 100 olarak ayarlandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnfluenza psödovirüsünün HA, NA ve HIV-1 p24 protein ekspresyonu
Viral paketleme etkinliğini belirlemek için, influenza psödovirüs stokları ilk olarak HA testi ile tespit edildi (Şekil 2A). İnfluenza psödovirüslerinin mililitresi başına HA birimi 643'tür (Tablo 3). Ha, NA ve HIV-1 p24 protein ekspresyonunu test etmek için Western-blot testi ve sandviç ELISA testleri kullanıldı. Daha sonra HA biriminin oranları ve psödovirüsler için gag p24 miktarı hesaplandı. Batı-leke testinin sonuçları 4 protein tipi olduğunu göstermiştir: HA0, HA1, HA2 ve NA proteinleri (Ek Şekil 2). Bu, influenza psödovirüslerin zarf proteinlerinin vahşi tip virüslerinkine benzer olduğunu gösterir. HA ve Gag p24 oranları bildirildiği gibi normal bir aralıktaydı (Tablo 3)9.
| Psödovirüs Suşları | HAU/mL | 1,00E + 05 pg/mL | HAU/1.00E+05 pg oranı* |
| P A/Tayland/(KAN-1)/2004 | 642,52 ± 30,26 | 4,20 ± 0,17 | 152.98 |
| *Psödovirüslerde HA birimlerinin oranları ve HIV-1 Gag p24 miktarı aşağıdaki gibi hesaplanmıştır: HA birimleri/Gag p24 miktarı. | |||
Tablo 3: H5 psödovirüsün miktarı.
Psödovirüs titrasyonu
Fonksiyonel viral parçacıkların konsantrasyonunu ölçmek için, psödovirüsün göreceli lusiferaz aktivitesi (RLA) tespit edildi. RLA okumaları birçok değişkene bağlıdır. Transdübe hücre miktarının RLA okumaları üzerindeki etkisini belirlemek için, 96 delikli plakanın kuyusu başına 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 ve 40000 hücrelerini tohumladık (Şekil 2). Sonuçlar, psödovirüsün RLA okumalarının en yüksek olduğunu ve 5000 hücre 96 delikli bir plaka kuyusuna tohumlandığında standart ortalama hatasının en düşük olduğunu göstermiştir (Şekil 4A). Kuluçka süresinin etkisini belirlemek için, RLA okumaları virüs enfeksiyonundan sonra 48 saat, 60 saat ve 72 saatte tespit edilir. Sonuçlar, 60 saat boyunca inkübe edildiğinde, psödovirüsün RLA okumalarının değerlerde daha yüksek olduğunu ve ortalamanın düşük standart hatası ile tekrarlanabilirlikte daha iyi olduğunu göstermiştir (Şekil 4B). Sonuçlar, 96 delikli bir plakanın kuyucuğunda 5000 hücrenin tohumlanmasının ve virüs enfeksiyonundan 60 saat sonra RLA okumalarının tespit edilmesinin uygun olduğunu göstermektedir.
PN tahlilleri
Kontrol grubundan ve DDV grubundan immün serumların nötralizasyon titreleri PN testleri ile ölçüldü (Şekil 5). Şekil 5A'da gösterildiği gibi, DDV grubundan immün serumlar, psödovirüs A / Tayland / 1 (KAN) -1/04 suşuna karşı yüksek nötralizasyon titreleri sergiledi. Buna karşılık, kontrol grubundaki serumlar herhangi bir nötralizasyon aktivitesi göstermedi (Şekil 5B). Geleneksel serolojik testlerle (HI ve MN testleri) karşılaştırıldığında, PN testleri daha hassastır (Veriler gösterilmemiştir).
Ataşman nötralizasyon testi
Bazı nötralizasyon antikorları, virüslerin sialik asit reseptörlerine bağlanmasını engelleyebilir. Bu antikorlar HA kafasına yönlendirilir ve ticari aşı veya influenza virüsünün enfeksiyonu ile bağışıklamadan sonra baskındır. Bu antikorların nötralize edici aktivitesini belirlemek için, ataşman nötralizasyon testleri yapılır (Şekil 3). Kontrol serumları ile karşılaştırıldığında, immün serumların nötralize edici aktivitesi güçlüdür, bu da immün serumlarda HA kafasına yönlendirilmiş çok sayıda antikor olduğunu gösterir (Şekil 6A).
Viral girişin değerlendirilmesi
Bu tahlil, influenza virüsü enfeksiyonu sırasında virüs zarfı ve endozomal membranların füzyonunu engelleyen antikorları tanımlamak için kullanılır. Bu antikorlar HA sap alanına yönlendirilir ve genellikle daha az etkilidir. Bu antikorların nötralizasyon titrelerini ölçmek için bağlanma sonrası testler yapılır (Şekil 3). İmmün serumlar ile kontrol serumları arasında önemli farklılıklar vardır, bu da immün serumlarda HA kök bölgesine yönelik antikorlar olduğunu gösterir (Şekil 6B).
Şekil 1: Kalsiyum aracılı transfeksiyonun akış şeması. Bu akış şeması, Kalsiyum aracılı transfeksiyonun ana prosedürlerini tanımlamak için kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Psödovirüsün miktarının belirlenmesi ve titrasyonunun yapılması . (A) Psödovirüs HA testinin ana adımlarını açıklayan psödovirüs HA testinin akış şeması. (B) Pseudovirus P24 testinin ana adımlarını açıklayan Pseudovirus P24 testinin akış şeması. (C) Psödovirüs titrasyon testinin başlıca adımlarını açıklayan Psödovirüs titrasyon testinin akış şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Psödovirüs tabanlı nötralizasyon testleri. (A) PN testinin ana adımlarını açıklayan PN testinin akış şeması. (B) Bağlanma testinin ana adımlarını açıklayan psödovirüs bağlanma testinin akış şeması. (C) Viral giriş testinin ana adımlarını açıklayan viral giriş testinin değerlendirilmesi akış şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Psödovirüs titrasyon. (A) 96 delikli bir plakadaki kuyu başına farklı hücre miktarları RLA okumalarını etkiler. 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 ve 40000 hücre 96 delikli bir plakaya tohumlandı. (B) Farklı hasat zamanı RLA okumalarını etkiler. RLA okumaları, virüs enfeksiyonundan 48 saat, 60 saat ve 72 saat sonra tespit edilir. Üç bağımsız deneyden toplanan veriler SEM ± ortalama olarak sunulmuştur; hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını temsil eder. Tukey testi ile tek yönlü ANOVA testi yapıldı. P < 0.0001; ns, önemli değil. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Psödovirüs ile saptanan H5 nötralize edici antikor yanıtları. (A) DDV grubundan immün serumların nötralize edici antikor yanıtlarının titrasyon. (B) Kontrol grubundan immün serumların nötralize edici antikor yanıtlarının titrasyonu. IC50 , psödovirüsün %50'sini inhibe edebilen nötralize edici antikorun karşılıklı seyreltilmesi olarak tanımlanır. Üç bağımsız deneyden toplanan veriler SEM ± ortalama olarak sunulmuştur; hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını temsil eder. VSVG psödovirüsü negatif kontrol olarak kullanıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Bağlanma ve viral giriş testleri ile nötralizasyon antikoru potensinin saptanması . (A) DDV grubundan gelen immün serumlar, kontrol grubundan değil, hücrelere viral bağlanmayı inhibe eder. (B) DDV grubundan gelen immün serumlar, kontrol grubundan değil, viral bağlanma sonrası enfeksiyonu kısmen inhibe eder. Üç bağımsız deneyden toplanan veriler SEM ± ortalama olarak sunulmuştur; hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Komple DMEM Ortam Kompozisyonu | Konsantrasyon |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) | 1 adet |
| Fetal sığır serumu | 10% |
| Penisilin (1 U / mL) / Streptomisin | 1 μg/ mL |
Tablo 1: Tam DMEM ortam bileşimi.
| Malzeme | Konsantrasyon | Hacim |
| 2x HEPES (pH 7,1) | -- | 675,0 μL |
| CaCl 2 (2,5 M) | -- | 67,5 μL |
| ddH2O | -- | 529,2 μL |
| pCMV Δ 8.9 | 1000 ng/μL | 18,9 μL |
| pCMV/R-HA | 100 ng/μL | 27,0 μL |
| pCMV/R-NA | 50 ng/μL | 13,5 μL |
| pHR-Luc | 1000 ng/μL | 18,9 μL |
Tablo 2: Psödovirüs paketleme sistemi.
Ek Şekil 1: Fare bağışıklamasının akış şeması. Bu akış şeması, fare bağışıklamasının başlıca prosedürlerini açıklamaktadır. İmmün serumlar örnek olarak kullanıldı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: İnfluenza psödovirüsünün HA, NA ve HIV-1 p24 protein ekspresyonu. Psödovirüs proteinlerinin batı lekesi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HEK293FT hücreler genellikle psödovirüs üretmek için paketleme hücreleri olarak kullanılır. Hücre kültürü sırasında düzenli mikoplazma tespiti esastır. Mikoplazma kontaminasyonu, psödovirüs verimini büyük ölçüde azaltabilir ve bazen sıfıra yakın olabilir. Diğer kontaminasyonlarla karşılaştırıldığında, mikoplazma kontaminasyonları pH değeri değişikliklerine veya hücre kültürü ortamının bulanıklığına yol açmaz. Yüksek konsantrasyonda mikoplazma bile çıplak gözle veya mikroskop altında görülemez. Mikoplazma tespitinin üç popüler yöntemi mikoplazma kültürü, floresan DAPI veya Hoechst 33258 ile DNA boyama ve polimeraz zincir reaksiyonudur (PCR). Kültür örneklerinde mikoplazma DNA'sını güçlendiren PCR, hızlı, kolay ve güvenilir mikoplazma testi için yaygın olarak kullanılmaktadır10.
Kalsiyum fosfat aracılı transfeksiyon, yüksek verimliliği, düşük maliyeti ve kolay kullanımı nedeniyle influenza psödovirüs ambalajlarında uzun yıllardır kullanılmaktadır11. Bununla birlikte, bu yöntem, HEPS tamponlu bir çözeltinin pH değerine, HEK293FT hücre kültürü ortamına ve çift damıtılmışH2O. pH değeri, çökelti oluşumunu ve çökeltinin HEK293FT hücrelerde kalma süresini etkilemiştir. Böylece, HEK293FT hücreler tarafından alınan DNA miktarını belirleyebilir. HEPES tamponlu bir çözeltinin pH'ı, 7.05-7.1212,13,14 arasında değişen son derece dar bir kısıtlamaya sahiptir; bu durumda, HEPS tamponlu çözeltide kalsiyum fosfat ve DNA içeren bir çökelti yavaşça oluşur. PH çok yüksekse, çökeltinin boyutu o kadar büyük olur ki, HEK293T hücrelerini bile öldürebilir. Aksine, pH çok düşükse, çökelti oluşamaz veya çökelti hücre yüzeyine yerleşmek için çok küçük olacaktır. Ayrıca, HEK293FT hücre kültürü ortamının pH'ı da transfeksiyon verimliliğinde rol oynar. Transfeksiyon sırasında, hücre ortamı 7.2-7.4 pH arasında tutulmalıdır. Hem hiper asidik hem de alkali ortamlar, çökeltinin boyutunu ve DNA karışımının hücre yüzeyindeki adsorpsiyon süresini değiştirecektir. Ek olarak, DNA karışımında kullanılan farklı kökenlere sahip çift damıtılmışH2O, HEPS tamponlu bir çözeltinin pH'ını değiştirebilir. Bu nedenle, transfeksiyon çözeltisinin ve kültür ortamının sabit bir pH değerinin korunması, yüksek transfeksiyon verimliliğini garanti etmek için çok önemlidir. Ek olarak, transfeksiyon verimliliği ayrıca 2.5 M CaCl 2 çözeltisinden ve hücre inkübatöründeki karbondioksit konsantrasyonundan (CO2) etkilenir. Transfeksiyon işlemi sırasında, CaCl 2 çözeltisini uygun şekilde saklamak ve inkübatördeki CO2 konsantrasyonunu stabilize etmek çok önemlidir.
İnfluenza psödovirüsünün en popüler paketleme sistemi, çoklu plazmidlerin ko-transfeksiyon yaklaşımını içerir. HA, NA, reporter ve lentiviral gag ve pol genleri ayrı ayrı plazmid ekspresyon vektörlerine klonlanır ve daha sonra aynı anda hücrelere transfekte edilir. Protein ekspresyonunu arttırmak için, transkripsiyon başlangıç bölgesinden önce genellikle bir Kozak konsensüs dizisi eklenir.
Saf, süper sarmal ve endotoksin içermeyen plazmid DNA15'in hazırlanması gereklidir. Çünkü plazmid oranı psödovirüs verimini doğrudan etkilemektedir. Bu protokol, "çekirdek: muhabir: HA: NA" nın plazmid oranını 28: 28: 4: 1'e optimize etti ve diğer transfeksiyon yöntemleriyle karşılaştırdı. Kalsiyum fosfat transfeksiyonundaki plazmid DNA miktarının 100 mm'lik çanak başına 30.5 μg'ye kadar ulaşması gerekir.
Psödovirüs titreleri, kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR), enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA), hemaglutinasyon testi ve RLA tespit testleri ile tespit edilir. qRT-PCR testi, psödovirüs iç5'in RNA genlerinin kopya sayılarını tahmin etmek için kullanılır. ELISA testi, HIV çekirdeğinin ana bileşeni olan p24 proteininin içeriğini tespit etmek için kullanılır. Hemaglutinasyon testi, psödovirüs parçacıklarının yüzeyindeki HA spike miktarını ölçer. Bu üç tahlil, fonksiyonel olmayan viral parçacıkları ölçmek için kullanılır. RLA tespit testi, transdübe hücreleri enfekte edebilen ve psödovirüs stoğundaki muhabir genleri serbest bırakabilen fonksiyonel viral parçacıkların konsantrasyonunu ölçmek için ana yöntemdir. MDCK hücreleri genellikle dönüştürülmüş hücreler olarak kullanılır. Transdübe edilmiş hücreler 96 delikli kültür plakalarına ekilir, psödovirüs ile enfekte edilir, lizis tamponu ile lize edilir ve daha sonra değerleri okumak için 96 delikli luminometre plakalarına aktarılır. Farklı hücre miktarları ve inkübasyon süreleri RLA değerlerini etkiler. Sonuçlara dayanarak, 96 delikli bir plakada kuyu başına 5000 hücre tohumlandığında muhabir gen ekspresyonu yüksektir ve RLA, virüs enfeksiyonundan 60 saat sonra tespit edilir.
H5 HPAI psödovirüs nötralizasyonu (PN) testleri, güvenlikleri, daha yüksek hassasiyetleri, doğrulukları ve yüksek verimli taramaya uygunlukları nedeniyle antikor tespiti için yaygın olarak uygulanmaktadır. PN testinin genel bir protokolü aşağıdaki dört adımı içerir: psödovirüs miktarları, serum seyreltmesi, psödovirüs-antikor inkübasyonu ve lusiferaz aktivite tespiti. Psödovirüs miktarları RLA okumalarına göre normalleştirilir. 96 delikli bir plakada kuyu başına 106'lık RLA değerleri, tekrarlanabilir deney sonuçları elde etmek için kullanılır. Serum numune seyreltmesinin başlangıç noktası 40'ın üzerinde olmalıdır. Serum numune bileşeni, serum numunesinin seyreltme faktörü 40'tan az olduğunda psödovirüsün lusiferaz değerlerini açıkça artıracaktır. Psödovirüs-antikor karışımı 37 ° C'de 1 saat inkübe edilir ve daha sonra MDCK hücrelerine aktarılır, ardından 60 saat içinde RLA okumaları tespiti yapılır. Luciferaz seviyeleri genellikle psödovirüs enfeksiyonunun etkinliğini belirlemek için bir araç olarak alınır.
PN testinde dört önemli element vardır: lusiferaz muhabir proteini, tahlil kimyası, bir luminometre ve mikroplakalar16. İlk olarak, lusiferaz geni, dönüştürülmüş hücrelerdeki protein ekspresyon seviyelerini iyileştirmek için kodon için optimize edilmiştir. Raportör ve vektör omurga genlerinin mühendisliği, anormal transkripsiyon riskini azaltmak için konsensüs transkripsiyon faktörü bağlanma bölgelerinin sayısını azaltır. İkincisi, uygun tespit reaktifleri deneyin amacına göre seçilir. PN testleri genellikle serum veya antikor örneklerinin nötralize edici yanıtlarını tespit etmek için yüksek verimli yöntemler olarak kullanılır. Bu protokol, en parlak sinyali, geniş dinamik aralığı ve yüksek hassasiyeti sunan parlak-Glo lusiferaz tahlil sistemini kullandı. Daha da önemlisi, sinyalin yarı ömrü yaklaşık 10 dakikadır ve substrat eklendikten hemen sonra hücreler test edilir. Lusiferaz konsantrasyonunu tespit etmek için bir luminometre kullanılır. Birçok farklı tipte luminometre üretilmektedir. Temel prensip, kullanılan makinenin farklı numuneler arasındaki lusiferaz aktivitesindeki farklılıkları tam olarak tanımlayabilmesidir. Opaklık ve düşük ışıldayan arka planlar için siyah veya beyaz polistiren mikroplakalar kullanılmalıdır. Beyaz mikroplakalar ışıldayan sinyalleri artırabilir ve düşük arka plan parlaklığına sahip olabilirken, siyah mikroplakalar iyiden iyiye çapraz konuşmayı azaltmak için ışık saçılımını en aza indirebilir17.
PN testleri, nötralize edici antikor yanıtlarını tespit etmek için geleneksel yöntemlerle uyumludur. Bununla birlikte, influenza vahşi tip virüslerden sadece HA ve NA proteinleri de dahil olmak üzere, psödovirüsler vahşi tipli virüsten uzaktır. HA, enfeksiyonu başlatmak için alıcı hücrenin sialik asit reseptörüne bağlanabilir. Daha sonra endozomdaki HA konformasyonel değişiklikleri, viral ve endozomal membranların füzyonunu tetikler ve viral ribonükleoproteinleri (vRNP'ler) sitoplazmaya salgılar. İnfluenza psödovirüsleri sadece bu süreçleri taklit edebilir ve ilgili araştırmalarda uygulanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Jiangsu eyaleti İnovasyon Kapasite Geliştirme Projesi (BM2020019), Shenzhen Bilimsel ve Teknolojik Projesi (No. JSGG20200225150702770), Çin Bilimler Akademisi Stratejik Öncelikli Araştırma Programı (XDB29030103), Guangdong Bilimsel ve Teknolojik Projesi (No. 2020B1111340076) ve Shenzhen Körfezi Laboratuvarı Açık Araştırma Programı (No. SZBL202002271003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | -- | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | -- | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).
- Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311 (2020).
- Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
- Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
- Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
- Krammer, F., et al.
- Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
- Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
- Michael, R. G., Joseph, S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2012).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R.
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
- Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).
- Luciferase assay system. , Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021).
- Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates. , Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021).
