Summary
Her beskriver vi en protokol for pseudovirusemballage og måling af antistofneutraliserende aktivitet.
Abstract
Siden 1996 har A/gås/Guangdong/1/96-afstamning højpatogen aviær influenza (HPAI) H5-vira forårsaget influenzaudbrud hos fjerkræ og vilde fugle. Lejlighedsvis bliver mennesker også ofre for det, hvilket resulterer i høj dødelighed. Ikke desto mindre hindres HPAI-virusforskning ofte, da den skal håndteres inden for laboratorier med biosikkerhedsniveau 3. For at løse dette problem vedtages pseudovirus som et alternativ til vildtypevirus i nogle eksperimenter med H5 HPAI-undersøgelser. Pseudovirus viser sig at være de ideelle værktøjer til at studere neutraliserende antistoffer mod H5 HPAI-vira. Denne protokol beskriver procedurer og kritiske trin i H5 HPAI-pseudoviruspræparater og pseudovirusneutraliseringsassays. Det diskuterer også fejlfinding, begrænsning og ændringer af disse assays.
Introduction
Siden 1996 har A/gås/Guangdong/1/96-afstamning højpatogen aviær influenza (HPAI) H5-vira forårsaget kontinuerlige influenzaudbrud hos fjerkræ og vilde fugle, hvilket tegner sig for enorme socioøkonomiske tab i den globale fjerkræindustri. Nogle gange bliver mennesker også smittet med det, der står over for en høj dødelighed 1,2. HPAI-virusforskning hindres imidlertid ofte, da den ikke kan håndteres uden for laboratorier med biosikkerhedsniveau 3. For at løse dette problem vedtages pseudovirus som et alternativ til vildtypevirus i nogle eksperimenter med H5 HPAI-undersøgelser. Pseudovirus er sikre nok til at praktisere i laboratorier med biosikkerhedsniveau 2.
H5 HPAI-pseudovira tilhører kimære vira, der består af surrogatviruskerner, lipidhylstre med overfladeglycoproteiner fra influenzavirus og reportergener. Pseudoviruskerner er normalt afledt af lentiviral human immundefektvirus (HIV), retrovirus såsom murine leukæmivirus (MLV) og vesikulær stomatitisvirus (VSV)3. Specifikt anvendes HIV-1-emballagesystemet i vid udstrækning til at producere influenzapseudovirus, hvor de primære gener, der leveres, er gag og pol. HIV gag genet udtrykker kerneproteiner. Pol-genet udtrykker integrasen og revers transkriptase, som begge er nødvendige for ekspressionen af reportergenet i transducerede celler. Ved at efterligne surrogatvirusets genom omfavnes reportergenet i pseudoviruskernen i RNA-form. Reportergenet vil udtrykke proteinet i værtsceller. Genekspressionsniveauerne for reportergener kan bruges til at måle pseudovirusinfektionseffektivitet 3,4. Den primære reporter er firefly luciferase til måling af de relative luminescensenheder (RLU) eller relativ luciferase aktivitet (RLA) i transducerede celler. Andre journalister som lacZ, Gaussia og Renilla luciferase bruges også, kun i mindre grad5.
Pseudovirus er ideelle værktøjer til at studere neutraliserende antistoffer mod H5 HAPI-vira. For at måle den neutraliserende antistofstyrke anvendes pseudovirusneutraliseringsassays (PN) 6. Hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) er glycoproteiner på overfladen af influenza A-virus 7,8. HA består af et kugleformet hoveddomæne til receptorbinding og et stamdomæne til membranfusion. NA-proteinet har sialidaseaktiviteten til at lette virusfrigivelsen 7,8. Et PN-assay kan måle neutraliserende antistoffer rettet mod HA-proteiner. Neutraliserende antistoffer rettet mod hoved- og stammeregionen af HA kan også påvises ved viral vedhæftning og indgangsassays. Sammenlignet med vildtypevirus har pseudovirusneutraliseringseksperimenter mere følsomme detektionsværdier, kan håndteres sikkert i et niveau 2-biosikkerhedslaboratorium og er generelt lettere at betjene i praksis.
Denne protokol præsenterer detaljeret procedurerne og de kritiske trin i H5 HPAI-pseudoviruspræparater og PN-assays. Det diskuterer også fejlfinding, begrænsning og ændringer af disse assays. I denne undersøgelse blev A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH)-stammen fra H5N1 HPAI-vira anvendt som eksempel. For at opnå immunsera, der anvendes i assays, valgte denne protokol HA-proteinet, der stammer fra TH-stammen, som immunogen til immunisering af mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle pseudovirusrelaterede eksperimentelle operationer blev udført under ABSL2-tilstand i Institut Pasteur of Shanghai Chinese Academy of Sciences (IPS, CAS). Dyreforsøg blev udført baseret på Institutional Animal Care and Use Committee-godkendte dyreprotokoller for IPS, CAS.
1. Pseudovirusemballage med calciumphosphattransfektion
- Der fremstilles enkeltcellesuspensioner af HEK293FT celler (9 x 105 pr. ml) i komplet DMEM-medium (tabel 1). Der tilsættes 10 ml enkeltcellesuspensioner til en T75-kolbe, og cellerne inkuberes i en 5 % kuldioxidinkubator (CO2) ved 37 °C i 20 timer før transfektionen.
BEMÆRK: HEK293FT lav passage (<20 passager) anbefales. Sørg for, at cellemonolaget er 80-90% sammenflydende. - Substratet erstattes med 10 ml frisk, komplet substrat indeholdende chloroquin (100 μM) 2 timer før transfektion.
- Reagenserne og plasmid-DNA'et blandes som vist i tabel 2 og figur 1:ddH2O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8,9, 2,5 MCaCl2 og 2x HEPES-buffer. Pipetten pipetteres forsigtigt op og ned 5 gange, og blandingen inkuberes ved stuetemperatur (RT) i 20 min.
- Overfør blandingen til mediet over cellerne, og rock kolben forsigtigt. Inkuber cellerne i celleinkubatoren i 15 timer.
- Udskift mediet med 15 ml frisk, komplet DMEM-medium. Cellerne inkuberes i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 65 timer.
BEMÆRK: Mediets farve vil være lys orange eller lidt gul, og mindst 80% af cellen skal vise den cytopatiske effekt (CPE) under det inverterede lysmikroskop. - Supernatanten høstes, og den centrifugeres ved 2095 x g i 20 minutter ved 4 °C. Supernatanten opsamles, prøves og opbevares ved -80 °C.
2. Påvisning af proteinekspression af influenzapseudovirus HA, NA og HIV-1 p24
- Detekter HA-proteinekspressionen ved hæmagglutinin (HA) assay.
- Der tilsættes 50 μL PBS i kolonne 2-12, række A, B og C i en 96-brønds rundbundet plade.
BEMÆRK: Række A, B og C tilhører 3 uafhængige replikationstest, og kolonne 12 bruges som negativ kontrol. - Der tilsættes 100 μL pseudovirus i hullerne i kolonne 1. 50 μL overføres fra kolonne 1 til kolonne 2, blandes godt ved pipettering op og ned 5 gange, de dobbelte fortyndinger udføres indtil sidste kolonne 11, og de ekstra 50 μL kasseres fra kolonne 11.
- Tilsæt 50 μL 0,5% erytrocyt i hvert hul, pipette det forsigtigt op og ned to gange. Inkuber pladen i 30-60 minutter ved RT, eller indtil erytrocytterne i den negative kontrol danner de regelmæssige pletter i bunden af brønden.
- Observere og registrere HA-titere af pseudovirus.
BEMÆRK: HA-enhed af pseudovirus er den højeste fortyndingsfaktor for virussen, der kan forårsage 100% hæmagglutination af de røde blodlegemer.
- Der tilsættes 50 μL PBS i kolonne 2-12, række A, B og C i en 96-brønds rundbundet plade.
- Detekter HA- og NA-proteinekspression ved hjælp af western-blot-assayet.
BEMÆRK: Alle western-blot-trin udføres i henhold til manualen for molekylær kloning (4. udgave). - Registrer HIV-1 p24-proteinekspressionen ved hjælp af HIV-1 p24 ELISA-sættet (materialetabel).
- Der tilsættes 50 μL af lysisbufferen i 450 μL pseudovirusprøve. Bland det grundigt.
- Der tilsættes 300 μL vaskebuffer til hvert hul på mikropladen. Slå pladen omvendt for at fjerne vaskebufferen helt. Gentag vasken 5 gange.
- Der tilsættes 200 μL af standarden og prøver til hvert hul separat. De inkuberes ved 37 °C natten over eller i 2 timer.
- Opsug pladens indhold, og vask pladen som beskrevet i trin 2.3.2.
BEMÆRK: Lad et hul på analysepladen være tomt til brug som substratemne. - Der tilsættes 200 μL af p24-detektorantistofferne til hvert hul. De inkuberes ved 37 °C i 1 time. Pladen suges og vaskes som beskrevet i trin 2.3.2.
- Der tilsættes 100 μL af streptavidin-peroxidase-arbejdsløsningen til hvert hul, og de inkuberes ved 37 °C i 30 minutter. Pladen suges og vaskes som beskrevet i trin 2.3.2.
- Der tilsættes 100 μL af den substate arbejdsløsning til hvert hul, herunder substratblindprøvebrønden, og de inkuberes ved 37 °C i 30 minutter.
BEMÆRK: Blå farve vil udvikle sig i brøndene. - Der tilsættes 100 μL stopbuffer til hvert hul.
BEMÆRK: Den blå farve ændres straks til gul. - Den optiske tæthed ved 450 nm aflæses inden for 15 min. Optag pseudovirusets p24-titere
3. Pseudovirustitrering
- Lav enkeltcellesuspensioner af MDCK-celler (5 x 104 pr. ml) i komplet DMEM-medium, tilsæt 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 og 40000 celler til forskellige brønde i en 96-brønds fladbundet plade. Cellerne inkuberes i en 37 °C, 5% CO2 -inkubator i 20 timer.
- Tag pseudovirussen ud af -80 °C-køleskabet, tø den op på isen, og hvirvl pseudovirussen op.
- Der tilsættes 6 HAU (6x HA-enheder) pseudovirus til hver brønd med 96 brønds rundbundsplade, og hver brønd fyldes op med komplet DMEM op til 120 μL.
- Pipetten op og ned ad blandingen 5 gange for at blande grundigt. Blandingspladen inkuberes i en 5 % CO2 -inkubator ved 37 °C i 1 time.
- Der overføres 100 μL af blandingen til cellerne i 96-brøndpladen. Sæt cellekulturpladen tilbage i inkubatoren i 48 timer, 60 timer og 72 timer efter virusinfektion.
- Tag pladen ud af inkubatoren og udfør luciferaseanalysen (Materialetabel).
- Fjern mediet forsigtigt fra pladens brønde. Skyl cellerne med 200 μL PBS og fjern PBS så meget som muligt.
BEMÆRK: Vend tallerkenen og kassér supernatanten ved at slå den omvendt på absorberende papir. Hvis testcellelinjen ikke kunne fastgøres fast til bunden, skal du forsigtigt fjerne mediumaspirationen. - Tilsæt 50 μL af lysisbufferen til hvert hul, og rock kulturpladen flere gange. Opbevar pladen ved -80 °C natten over.
BEMÆRK: Bland 1 volumen 5x lysisbuffer med 4 volumener vand for at lave 1x lysisbufferen. Ligevægt af 1x lysisbufferen til RT før brug. Rock pladen for at sikre, at cellerne er dækket af lysisbufferen fuldstændigt. Den enkelte fryse-optøningsproces kan hjælpe cellen med at blive lyseret fuldstændigt. - Tag pladen ud, ekvilibrer ved RT i 2 timer.
BEMÆRK: Cellen skal lyseres fuldstændigt. - Rock pladen flere gange forsigtigt, og overfør alle cellelysaterne til uigennemsigtige plader med 96 brønde.
- Tilsæt 50 μL af substratet til hvert hul, ryst pladen flere gange forsigtigt, og bland substrat og lysisbuffer grundigt.
- Mål det producerede lys inden for 5 minutter ved hjælp af et luminometer. Optag pseudovirusets luciferase-titere.
BEMÆRK: Når et korrekt substrat tilsættes, udsendes lys som et biprodukt via en kemisk reaktion, hvor luciferin omdannes til oxyluciferin af luciferaseenzymet. Mængden af produceret lys er proportional med mængden af luciferase enzymet.
4. Immun sera forberedelse
BEMÆRK: Immunserummet vil blive anvendt til cellerelaterede forsøg, og den eksperimentelle operation bør udføres under aseptiske forhold.
- Forbered 12 otte uger gamle kvindelige BALB / c-mus. Opdel musene ligeligt i to grupper.
BEMÆRK: Den ene gruppe var DDV-gruppen, og den anden var den negative kontrolgruppe. - DDV-gruppeimmunisering: Prime to gange intramuskulært med 100 μg af et codonoptimeret DNA-plasmid, der koder for A/Thailand/(KAN-1)/2004 (TH) HA-protein i uge 0 og uge 3 og boost en gang intraperitonealt med 512 HAU TH-viruslignende partikler (VLP) i uge 6.
- Kontrolgruppeimmunisering: Prime to gange intramuskulært med 100 μg tomt vektorplasmid-DNA i uge 0 og uge 3 og boost en gang intraperitonealt med HIV-1 gag VLP i uge 6.
- Saml museblodet 2 uger efter den sidste immunisering.
BEMÆRK: Her blev musene bedøvet med pentobarbitalnatrium (65 mg / kg) på tidspunktet for blodindsamling. Efter blodindsamling fra den submandibulære vene blev musene straks aflivet med CO2. - Hold blodet ved RT i 2 timer, derefter 4 °C natten over. Der centrifugeres ved 900 x g i 10 minutter ved 4 °C, og supernatanten opsamles. Inaktiver sera ved at placere den ved 56 °C i 30 minutter.
- Immunsera opbevares i køleskab med -80 °C til brug.
BEMÆRK: Se supplerende figur 1 for rutediagrammet, der beskriver de vigtigste procedurer for museimmunisering.
5. Pseudovirus neutralisering (PN) assay
- Der fremstilles enkeltcellesuspensioner af MDCK-celler (5 x 104 pr. ml) i komplet DMEM-medium, og der tilsættes 100 μL af cellesuspensionen til hvert hul i en 96-brønds fladbundet plade. Cellerne inkuberes i en 37 °C, 5% CO2 -inkubator i 20 timer.
- Tag pseudovirus og sera ud af -80 °C køleskabet, tø det op på isen og hvirvel grundigt.
- Sera fortyndes i hele mediet 20 gange, og der tilsættes 100 μL komplet DMEM-substrat til hullerne i en 96-brønds rundbundet plade fra kolonne 2-10.
- Der tilsættes 200 μL af de fortyndede sera i hullerne i kolonne 2, der overføres 100 μL fra kolonne 2 til kolonne 3, og sera fortyndes som 1:20, 1:40, 1:80 osv. til 1:10240 successivt fra kolonne 2 til kolonne 10, og de 100 μL kasseres fra kolonne 10.
- Der tilsættes 100 μL DMEM-sødsubstrat til hullerne i kolonne 11 som negativ kontrol.
- Der tilsættes 100 μL pseudovirus til hvert hul, der pipetteres op og ned i blandingen 5 gange grundigt, og blandingspladen inkuberes i en 37 °C, 5% CO2 i 1 time.
- Der overføres 100 μL af blandingen fra 96-brøndens rundbundsplade til den tilsvarende brønd i 96-brøndens cellekulturplade. Pladen sættes tilbage i inkubatoren (37 °C, 5% CO2) i 60 timer.
- Tag pladen ud af inkubatoren. Udfør luciferase-analysen som beskrevet i trin 3.7-3.12.
6. Pseudovirus vedhæftningsanalyse
- Lav enkeltcellesuspensioner af MDCK-celler (4 x 104 pr. ml) i komplet DMEM-medium, og tilsæt 100 μL cellesuspensioner til hver brønd i en 96-brønds fladbundet plade. Cellerne inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i 20 timer.
- Pseudovirus inkuberes med sera i DMEM indeholdende 1 % BSA ved 4 °C natten over.
BEMÆRK: Volumenet af blandingen er 100 μL. - MDCK-cellerne blokeres med 100 μL pr. hul DMEM indeholdende 1 % BSA ved 4 °C i 1 time.
- Pseudovirus- og serumblandingen (100 μL) podes på MDCK-monolaget og inkuberes ved 4 °C i 2 timer.
- Cellepladen vaskes 4 gange med PBS indeholdende 1 % BSA for at fjerne ubundet virus.
- Lys cellerne med 100 μL luciferase lysisbuffer ved RT i 30 min.
- Mængden af bundet virus på cellerne kvantificeres med et HIV-1 p24 ELISA-sæt som beskrevet ovenfor (pkt. 2.3).
7. Vurdering af viral indgang
- Der fremstilles enkeltcellesuspensioner af MDCK-celler (5 x 104 pr. ml) i komplet DMEM-medium, og der tilsættes 100 μL af cellesuspensionen til hvert hul i en 96-brønds fladbundet plade. Cellerne inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i 20 timer før analysen.
- Pseudoviruset (100 μL) podes på et MDCK-monolag i en plade med 96 huller ved 4 °C i 6 timer.
- Cellepladen vaskes 4 gange med PBS indeholdende 1 % BSA for at fjerne ubundne pseudovira.
- Der tilsættes 100 μL serielt fortyndet immunsera eller sera fra skinvaccinationsmus i DMEM indeholdende 1 % BSA til monolaget, og cellerne inkuberes ved 4 °C i 2 timer.
- Cellesupernatanten fjernes, og cellekulturpladen vaskes 4 gange med PBS indeholdende 1 % BSA.
- Tilsæt frisk DMEM til cellerne og inkuber i 60 timer i en 37 °C, 5% CO2 -inkubator.
- Cellernes relative luciferaseaktivitet (RLA) måles som beskrevet i trin 3.7-3.12.
BEMÆRK: Viral indgang, som angivet af RLA, blev udtrykt som en procentdel af aflæsningen opnået i fravær af sera, som blev sat til 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HA, NA og HIV-1 p24 proteinekspression af influenza pseudovirus
For at identificere virusemballagens effektivitet blev influenzapseudovirusbestandene først påvist ved HA-assay (figur 2A). HA-enheder pr. milliliter influenzapseudovirus er 643 (tabel 3). Western-blot-assay og sandwich-ELISA-assays blev brugt til at teste HA-, NA- og HIV-1 p24-proteinekspression. Derefter blev forholdet mellem HA-enhed og mængden af gag p24 for pseudovirus beregnet. Resultaterne af western-blot-analysen viste, at der var 4 proteintyper: HA0-, HA1-, HA2- og NA-proteiner (supplerende figur 2). Dette indikerer, at omsluttende proteiner af influenza pseudovirus ligner dem af vildtypevirus. Forholdet mellem HA og Gag p24 lå inden for et normalt interval som rapporteret (tabel 3)9.
| Pseudovirus stammer | HAU/ml | 1.00E + 05 pg/ml | Forhold mellem HAU/1,00E+05 pg* |
| P A/Thailand/(KAN-1)/2004 | 642,52 ± 30,26 | 4.20 ± 0.17 | 152.98 |
| *Forholdet mellem HA-enhederne og mængden af HIV-1 Gag p24 i pseudovirus blev beregnet som følger: HA-enheder/mængden af Gag p24. | |||
Tabel 3: Kvantificering af H5-pseudovirus.
Pseudovirustitrering
For at måle koncentrationen af funktionelle virale partikler blev relativ luciferaseaktivitet (RLA) af pseudovirus detekteret. RLA-aflæsninger er afhængige af mange variabler. For at identificere effekten af transduceret cellemængde på RLA-aflæsninger såede vi cellerne på 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 og 40000 pr. brønd med 96-brøndplade (figur 2). Resultaterne viste, at RLA-aflæsninger af pseudovirus er de højeste, og standardfejlen for middelværdien er den laveste, når 5000 celler podes i en brønd med 96-brøndplade (figur 4A). For at identificere effekten af inkubationstid detekteres RLA-aflæsninger 48 timer, 60 timer og 72 timer efter virusinfektion. Resultaterne viste, at når de inkuberes i 60 timer, er RLA-aflæsningerne af pseudovirus højere i værdier og bedre i repeterbarhed med lav standardfejl i gennemsnittet (figur 4B). Resultaterne viser, at det er egnet til at frø 5000 celler i en brønd på en 96-brøndplade og detektere RLA-aflæsninger 60 timer efter virusinfektion.
PN-analyser
Neutralisationstitre af immunsera fra kontrolgruppen og DDV-gruppen blev målt ved PN-assays (figur 5). Som vist i figur 5A udviste immunsera fra DDV-gruppen høje neutraliseringstitere mod pseudovirus A/Thailand/1(KAN)-1/04-stamme. I modsætning hertil udviste sera fra kontrolgruppen ingen neutraliseringsaktivitet (figur 5B). Sammenlignet med traditionelle serologiske assays (HI- og MN-assays) er PN-assays mere følsomme (Data vises ikke).
Analyse til neutralisering af vedhæftede filer
Nogle neutraliseringsantistoffer kan hindre virus' binding til sialinsyrereceptorerne. Disse antistoffer er rettet mod HA-hovedet og er fremherskende efter immunisering med kommerciel vaccine eller infektion af influenzavirus. For at identificere den neutraliserende aktivitet af disse antistoffer udføres tilknytningsneutraliseringsassays (figur 3). Sammenlignet med kontrolsera er den neutraliserende aktivitet af immunsera potent, hvilket indikerer, at der er mange antistoffer rettet mod HA-hovedet i immunsera (figur 6A).
Vurdering af viral indgang
Dette assay bruges til at identificere antistoffer, der forhindrer fusionen af virusindhylling og endosomale membraner under influenzavirusinfektion. Disse antistoffer er rettet mod HA-stilkdomænet og er almindeligvis mindre potente. For at måle neutraliseringstiterne af disse antistoffer udføres post-attachment assays (figur 3). Der er signifikante forskelle mellem immunsera og kontrolsera, hvilket indikerer, at der er antistoffer rettet mod HA-stamområdet i immunsera (figur 6B).
Figur 1: Rutediagram af calciummedieret transfektion. Dette rutediagram bruges til at beskrive vigtige procedurer for calciummedieret transfektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kvantificering og titrering af pseudovirus. (A) Rutediagram over pseudovirus HA-assay, der beskriver de vigtigste trin i pseudovirus HA-assay. (B) Rutediagram over pseudovirus P24-assay, der beskriver de vigtigste trin i pseudovirus P24-assayet. (C) Rutediagram over pseudovirustitreringsassay, der beskriver de vigtigste trin i pseudovirustitreringsassayet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Pseudovirusbaserede neutraliseringsassays. (A) Rutediagram over PN-assay, der beskriver de vigtigste trin i PN-assay. (B) Rutediagram over pseudovirusbindingsassay, der beskriver de vigtigste trin i tilknytningsassayet. (C) Rutediagram over vurdering af viral indgangsassay, der beskriver de vigtigste trin i viral indgangsassay. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Pseudovirustitrering. (A) Forskellige cellemængder pr. brønd i en 96-brønds pladepåvirkning RLA-aflæsninger. 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 og 40000 celler blev podet i en 96-brøndplade. (B) Forskellige høsttider påvirker RLA-aflæsninger. RLA-aflæsninger detekteres 48 timer, 60 timer og 72 timer efter virusinfektion. Data indsamlet fra tre uafhængige eksperimenter præsenteres som gennemsnit ± SEM; fejlbjælker repræsenterer standardfejlen for middelværdien (SEM). Envejs ANOVA med Tukey test blev udført. P < 0,0001; ns, ikke signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: H5 neutraliserende antistofresponser påvist med pseudovirus. (A) Titrering af neutraliserende antistofrespons af immunsera fra DDV-gruppen. (B) Titrering af neutraliserende antistofrespons af immunsera fra kontrolgruppen. IC50 defineres som de gensidige fortyndinger af det neutraliserende antistof, der kan hæmme 50% af pseudoviruset. Data indsamlet fra tre uafhængige eksperimenter præsenteres som gennemsnit ± SEM; fejlbjælker repræsenterer standardfejlen for middelværdien (SEM). VSVG pseudovirus blev anvendt som en negativ kontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Påvisning af neutraliseringsantistofstyrke ved bindings- og virusindgangsassays . (A) Immunsera fra DDV-gruppen, ikke fra kontrolgruppen, hæmmer viral binding til celler. (B) Immunsera fra DDV-gruppen, ikke fra kontrolgruppen, hæmmer delvist viral infektion efter binding. Data indsamlet fra tre uafhængige eksperimenter præsenteres som gennemsnit ± SEM; fejlbjælker repræsenterer standardfejlen for middelværdien (SEM). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Komplet DMEM-medium sammensætning | Koncentration |
| Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) | 1x |
| Føtalt bovin serum | 10% |
| Penicillin(1 E/ml)/streptomycin | 1 μg/ ml |
Tabel 1: Komplet DMEM-mediesammensætning.
| Materialer | Koncentration | Lydstyrke |
| 2x HEPES (pH 7,1) | -- | 675,0 μL |
| CaCl 2 (2,5 m) | -- | 67,5 μL |
| ddH2O | -- | 529,2 μL |
| pCMV Δ 8.9 | 1000 ng/μL | 18,9 μL |
| pCMV/R-HA | 100 ng/μL | 27,0 μL |
| pCMV/R-NA | 50 ng/μL | 13,5 μL |
| pHR-Luc | 1000 ng/μL | 18,9 μL |
Tabel 2: Pseudovirus emballeringssystem.
Supplerende figur 1: Rutediagram over museimmunisering. Dette rutediagram beskriver de vigtigste procedurer for museimmunisering. Immunsera blev anvendt som prøver. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: HA, NA og HIV-1 p24 proteinekspression af influenza pseudovirus. Western-blottelse af pseudovirusproteiner. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HEK293FT celler bruges normalt som emballageceller til fremstilling af pseudovirus. Regelmæssig mycoplasma-detektion er afgørende under cellekulturen. Mycoplasma-kontaminering kan drastisk reducere pseudovirusudbyttet og nogle gange tæt på nul. Sammenlignet med andre kontamineringer fører mycoplasmakontamineringer ikke til ændringer i pH-værdien eller turbiditet af cellekulturmediet. Selv en høj koncentration af mycoplasma er ikke synlig med blotte øjne eller under et mikroskop. Tre populære metoder til mycoplasmadetektion er mycoplasmakultur, DNA-farvning med fluorescerende DAPI eller Hoechst 33258 og polymerasekædereaktion (PCR). PCR-forstærkning af mycoplasma-DNA'et i dyrkningsprøver anvendes i vid udstrækning til hurtig, nem og pålidelig mycoplasma-test10.
Calciumphosphatmedieret transfektion er blevet brugt til influenzapseudovirusemballage i mange år på grund af dets høje effektivitet, lave omkostninger og nemme betjening11. Denne metode er imidlertid meget følsom over for pH-værdien af en HEPES-bufret opløsning, det HEK293FT cellekulturmedium og den dobbeltdestilleredeH2O. pH-værdi påvirkede dannelsen af bundfald og varigheden af bundfaldets ophold på HEK293FT celler. Således kan det bestemme den DNA-mængde, der optages af HEK293FT celler. PH-værdien for en HEPES-bufret opløsning er ekstremt snæver begrænset, idet den spænder fra 7,05-7,1212,13,14, i hvilken tilstand et bundfald indeholdende calciumphosphat og DNA langsomt dannes i HEPES-bufret opløsning. Hvis pH-værdien er for høj, bliver bundfaldet så stort, at det endda kan dræbe de HEK293T celler. Tværtimod, hvis pH er for lav, kan bundfaldet ikke dannes, eller bundfaldet vil være for lille til at slå sig ned til celleoverfladen. Desuden spiller pH i det HEK293FT cellekulturmedium også en rolle i transfektionseffektiviteten. Under transfektionen skal cellemediet opretholdes mellem en pH på 7,2-7,4. Både hypersure og alkaliske medier vil ændre bundfaldets størrelse og adsorptionstiden for DNA-blandingen på celleoverfladen. Derudover kan dobbeltdestilleret H2O med forskellig oprindelse anvendt i DNA-blandingen ændre pH i en HEPES-bufret opløsning. Det er således afgørende at holde en stabil pH-værdi af transfektionsopløsning og kulturmedium for at garantere høj transfektionseffektivitet. Derudover påvirkes transfektionseffektiviteten også af 2,5 MCaCl2-opløsning og koncentrationen af kuldioxid (CO2) i celleinkubatoren. Under transfektionsprocessen er det afgørende at opbevareCaCl2-opløsningen korrekt og stabilisere CO2 -koncentrationen i inkubatoren.
Det mest populære emballagesystem af influenza pseudovirus involverer en multipel plasmider co-transfektion tilgang. HA-, NA-, reporter- og lentivirale gag - og pol-gener klones separat til plasmidekspressionsvektorer, og derefter transfekteres de ind i cellerne samtidigt. For at øge proteinekspressionen tilføjes ofte en Kozak-konsensussekvens før transkriptionsstartstedet.
Det er nødvendigt at fremstille rent, supercoiling og endotoksinfrit plasmid-DNA15. Da plasmidforholdet direkte påvirker pseudovirusudbyttet. Denne protokol optimerede plasmidforholdet mellem "kerne: reporter: HA: NA" til 28: 28: 4: 1 og sammenlignede det med andre transfektionsmetoder. Det kræves, at mængden af plasmid-DNA i calciumphosphattransfektion skal nå op til 30,5 μg pr. 100 mm skål.
Pseudovirustitere detekteres ved kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR), enzymbundet immunosorbentassay (ELISA), hæmagglutinationsanalyse og RLA-detektionsassays. qRT-PCR-assay bruges til at estimere kopiantal af RNA-gener af pseudovirusinteriør5. ELISA-analyse bruges til at detektere indholdet af p24-protein, som er hovedkomponenten i HIV-kernen. Hemagglutinationsanalyse måler HA-spidsmængde på overfladen af pseudoviruspartiklerne. Disse tre assays anvendes til at kvantificere ufunktionelle virale partikler. RLA-detektionsanalyse er den vigtigste metode til måling af koncentrationen af funktionelle virale partikler, som kan inficere transducerede celler og frigive reportergener i pseudovirusbestand. MDCK-celler anvendes almindeligvis som transducerede celler. Transducerede celler podes i 96-brønds kulturplader, inficeret med pseudovirus, lyseres af lysisbuffer og overføres derefter til 96-brønds luminometerplader for at læse værdier. Forskellige cellemængder og inkubationstider påvirker RLA-værdier. Baseret på resultaterne er reportergenekspressionen høj, når 5000 celler podes pr. Brønd på en 96-brøndplade, og RLA detekteres 60 timer efter virusinfektion.
H5 HPAI pseudovirusneutraliseringsassays (PN) er blevet anvendt i vid udstrækning til antistofdetektion på grund af deres sikkerhed, højere følsomhed, nøjagtighed og egnethed til screening med høj kapacitet. En generel protokol for PN-assay omfatter følgende fire trin: pseudovirusmængder, serumfortynding, pseudovirus-antistofinkubation og detektion af luciferaseaktivitet. Mængderne af pseudovirus normaliseres baseret på RLA-aflæsninger. RLA-værdier på10,6 pr. brønd i en 96-brøndplade anvendes til at opnå reproducerbare eksperimentresultater. Startpunktet for serumprøvefortynding skal være over 40. Serumprøvekomponenten vil naturligvis øge luciferaseværdierne for pseudovirus, når serumprøvens fortyndingsfaktor er mindre end 40. Pseudovirus-antistofblandingen inkuberes i 1 time ved 37 °C og overføres derefter til MDCK-celler efterfulgt af påvisning af RLA-aflæsninger i 60 timer. Luciferase niveauer er generelt taget som et redskab til at bestemme pseudovirus infektion effektivitet.
I PN-analyse er der fire vigtige elementer: luciferase reporterproteinet, analysekemien, et luminometer og mikroplader16. For det første er luciferase-genet codonoptimeret til at forbedre proteinekspressionsniveauerne i transducerede celler. Konstruktion af reporter- og vektorrygradsgener reducerer antallet af konsensustranskriptionsfaktorbindingssteder for at reducere den uregelmæssige transkriptionsrisiko. For det andet vælges korrekte detektionsreagenser i henhold til eksperimentets mål. PN-assays anvendes generelt som metoder med høj kapacitet til at detektere neutraliserende reaktioner af serum- eller antistofprøver. Denne protokol brugte bright-Glo luciferase assay-systemet, som tilbyder det lyseste signal, bredt dynamisk område og høj følsomhed. Endnu vigtigere er signalets halveringstid ca. 10 min, og cellerne testes straks, efter at substratet er tilsat. Et luminometer bruges til at detektere luciferasekoncentration. Der fremstilles mange forskellige typer luminometre. Det grundlæggende princip er, at den anvendte maskine præcist kan identificere forskelle i luciferaseaktivitet mellem forskellige prøver. Sorte eller hvide polystyrenmikroplader skal bruges til opacitet og lavt selvlysende baggrunde. Hvide mikroplader kan forbedre selvlysende signaler og have lav baggrundsluminescens, mens sorte mikroplader kan minimere lysspredning for at reducere godt til godt krydstale17.
PN-assays er i overensstemmelse med traditionelle metoder til påvisning af neutraliserende antistofresponser. Men hvis man kun inkluderer HA- og NA-proteiner fra influenza-vildtypevirus, er pseudovirus langt fra vildtypevirus. HA kan binde sig til sialinsyrereceptoren i modtagercellen for at initiere infektion. Derefter udløser HA-konformationsændringerne i endosomet fusionen af de virale og endosomale membraner og frigiver de virale ribonukleoproteiner (vRNP'er) i cytoplasmaet. Influenza pseudovirus kan kun efterligne disse processer og anvendes i relaterede undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra Innovation Capacity Building Project of Jiangsu-provinsen (BM2020019), Shenzhen Scientific and Technological Project (nr. JSGG20200225150702770), strategisk prioriteret forskningsprogram fra det kinesiske videnskabsakademi (XDB29030103), Guangdong videnskabelige og teknologiske projekt (nr. 2020B1111340076) og Shenzhen Bay Laboratory Open Research Program (nr. SZBL202002271003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | -- | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | -- | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).
- Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311 (2020).
- Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
- Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
- Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
- Krammer, F., et al.
- Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
- Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
- Michael, R. G., Joseph, S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2012).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R.
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
- Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).
- Luciferase assay system. , Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021).
- Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates. , Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021).
