Summary
Här beskrivs tillämpningen av CRISPR-interferens (CRISPRi) för specifik gensilencing i Leptospira arter. Leptospiraceller omvandlas genom konjugation med plasmider som uttrycker dCas9 (katalytiskt "döda" Cas9) och en enguide RNA (sgRNA), ansvarig för basparning till önskat genomiskt mål. Metoder för att validera gensilencing presenteras.
Abstract
Leptospiros är en global försummad zoonos, ansvarig för minst 1 miljon fall per år och nästan 60 tusen dödsfall. Sjukdomen orsakas av patogena och virulenta bakterier av släktet Leptospira, antingen genom direkt kontakt med bakterierna eller indirekt av exponering för förorenat vatten eller jord. Inhemska och vilda djur fungerar som reservoarvärdar för infektion, som fäller leptospirer från koloniserade njurslanguler i njuren, via urin, i miljön. Genereringen av mutanta stammar av Leptospira är avgörande för att utvärdera och förstå patogena mekanismer för infektion. CRISPR-interferens (CRISPRi) har visat sig vara ett enkelt, prisvärt och specifikt verktyg för gensilencing i patogen Leptospira. Därför kommer de metodologiska detaljerna för att erhålla plasmidkonstruktionerna som innehåller både dCas9 och guide RNA, leverans av plasmider till Leptospira genom konjugation med E. coli-stammen β2163 och transkonjugant återhämtning och utvärdering att beskrivas. Dessutom tillåter de nyligen beskrivna Hornsby-Alt-Nally (HAN) media relativt snabb isolering och urval av mutanta kolonier på agarplattor.
Introduction
Leptospiros är en försummad världsomspännande zoonos orsakad av patogena och virulenta arter av släktet Leptospira. Hos människor står sjukdomen för mer än en miljon fall och 60 000 dödsfall per år över hela världen1,2. Än så länge finns det inget långsiktigt och effektivt vaccin mot sjukdomen. Identifiering av virulens faktorer och patogena mekanismer är avgörande för utvecklingen av bättre terapeutiska och profylaktiska strategier. Därför är förmågan att generera genetiska mutationer och bedöma den resulterande fenotypen avgörande för funktionell genomisk analys3.
Konstruktionen av mutanter i patogena Leptospira ansågs hittills vara ineffektivt, mödosamt, kostsamt och svårt att genomföra. Detta scenario ändrades drastiskt med tillämpningen av den senaste CRISPR interferens (CRISPRi) till saprofytiska4 ochpatogena 5 leptospires.
Gensilencing uppnås genom uttryck av två komponenter: en variant av CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR somsociated) enzym Cas9 från Streptococcus pyogenes, kallad katalytiskt död Cas9 (dCas9) och en enda guide RNA (sgRNA), som kan redigeras enligt önskat mål6,7,8. dCas9-proteinet, när det är bundet till sgRNA, riktas till specifika DNA-mål av Watson och Crick basparning, vilket orsakar en sterisk blockering till RNA-polymerasförlängning, vilket resulterar i gensilencing på grund av den blockerade genutskriften7 (Figur 1).
Detta manuskript syftar till att beskriva konstruktionen av plasmid för att uttrycka både dCas9 och sgRNA, konjugation mellan givaren E. coli β2163 och mottagaren Leptospira celler, transconjugant återhämtning och slutligen validering av utvalda mutant kolonier.
Protocol
1. Protospacer definition och plasmid konstruktion
OBS: I det här avsnittet beskrivs det första steget att välja lämpliga protospacers för att konstruera sgRNA och ytterligare ligatur i pMaOri.dCas9 (Figur 1). Denna protospacer sekvens består av en 20 nukleotider sekvens mot önskat mål.
- Få nukleotidsekvensen av den gen som är av intresse för tystning vid GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Skicka in den till CHOPCHOP-webbservern (http://chopchop.cbu.uib.no/), med parametrar definierade för Streptococcus pyogenes Cas9 och protospacer intilliggande motiv NGG efter att ha valt "Fast Target". Definiera parametrarna till "CRISPR/Cas9" och PAM (protospacer intilliggande motiv) NGG.
- Baserat på de erhållna resultaten, välj protospacers med bästa möjliga poäng (grön pil), som ligger så nära som möjligt till 5'slutet av kodningsregionen och, viktigast av allt, finns i mallen (minus) strängen eftersom sgRNA måste para sig med genens kodningssträng för fullständig gensilencing.
OBS: NGG-motivet ingår inte i den slutliga sgRNA-sekvensen. - Använd lipL32-promotorn för att uttrycka RNA med en variabel 20 nukleotidsekvens i slutet av 5' och en bevarad dCas9 ställningssekvens. Sammanfoga 20-nt-sekvensen, som kallas protospacer, till lipL32-promotorn (i slutet av 5" och sgRNA-ställningen (3'end) (Figur 1B).
OBS: För en väldefinierad lipL32-promotor, använd promotorregionen som omfattar -334 till TSS (Transcription Start Site, baserat på Zhukova et al.9). Kontrollera tilläggsfilen för den slutliga sgRNA-kassetten. - Generera sgRNA-kassetten med sekventiell PCR5 eller få den syntetiserad av en kommersiell leverantör.
- Efter att ha fått kassetten, ligate den i pMaOri.dCas9 plasmid vid XmaI begränsningsplatsen i båda ändar (cccggg)4.
- Smält både sgRNA-kassetten och pMaOri.dCas9-plasmiden med XmaI-restriktionsenzym och fortsätt till ligatur (Figur 1B).
- Utför kloningsstegen i dT auxotrofisk E. coli-stammen π110, på grund av pMaOri11 (och i förlängningen pMaOri.dCas9) replikeringsursprung, R6K-gamma.
OBS: För ett detaljerat protokoll för ligatur och klonval, se tidigare publikationer av Fernandes och Nascimento12. sgRNA-guidad dCas9 kommer att binda till kodningssträngen i den valda genen av intresse och kommer därför att hindra RNA-polymerasförlängning (Figur 1C), vilket resulterar i gensilencing.
2. Leptospira omvandling genom konjugation
OBS: Ett grafiskt schema för detta steg presenteras i figur 2. För att göra HAN media och HAN-plattor, se Hornsby et al.13 och Fernandes et al.5.
- Odla patogena Leptospira-celler vid 29 eller 37 °C i HAN-media13 under agitation genom att späda ut en mättad kultur i färsk HAN kl. 13.100. vanligtvis tar L. interrogans serovar Copenhageni stam Fiocruz L1-130 4-6 dagar att nå lämplig celltäthet.
- Se till att kulturer når en O.D. på 0,2-0,4 vid 420 nm (2 till 5 x 108 celler/ml) innan du använder för konjugation.
OBS: Eftersom HAN-media ändrar färg när celltätheten ökar (på grund av fenolrött som finns i DMEM-media), centrifug (4 000 x g, 15 min, rumstemperatur) 1 ml av odlingsmedierna för att ta bort leptospirer och applicera supernatant som ett tomrum för att mäta O.D.
- Se till att kulturer når en O.D. på 0,2-0,4 vid 420 nm (2 till 5 x 108 celler/ml) innan du använder för konjugation.
- Omvandla den konjugativa E. coli-stammen β2163, auxotrofisk för diaminopimelsyra (DAP), med plasmidpMaOri.dCas9 som innehåller sgRNA-kassetten. För E. coli transformation, använd antingen värmechocksprotokoll eller elektroporering. Inkludera omvandling med plasmid pMaOri.dCas9 utan sgRNA-kassett som kontroll.
- För värmechocktransformation, blanda plasmid-DNA (100 ng) med kemiskt kompetenta E. coli-celler och inkubera på is i 30 minuter. Utför värmestöt vid 42 °C i 90 s och placera den igen på is i 5 min. Återställ cellerna genom att tillsätta 1 ml LB-media, inkubera vid 37 °C i 1 timme och fortsätt till pläteringen.
- För elektroporering, använd elektrokompetenta celler blandade med 100 ng plasmid-DNA. Använd följande parametrar för puls: 1,8 kV, 100 Ω och 25 μF. Återställ cellerna enligt ovan.
- Plätera den omvandlade givaren E. coli celler i LB agar medium kompletteras med Diaminopimelic syra (DAP) (0,3 mM) och spectinomycin (40 μg/mL) för att välja för plasmider.
- För konjugation, välj en koloni från varje tallrik en dag före konjugationsdagen (som bestäms genom övervakning av O.D. av kulturer av leptospirer).
- Välj en koloni av E. coli β2163 från den tomma pMaOri.dCas9 och en från pMaOri.dCas9sgRNA-plattor. Låt dem växa över natten i 10 ml LB plus DAP och spectinomycin vid 37 °C.
- Nästa dag späd ut de mättade kulturerna 1:100 i 10 ml färsk LB plus DAP (inkludera inte antibiotikumet här) förrän OD420nm på 0,2-0,4. Normalt tar det 2-3 h för E. coli att nå dessa densiteter.
- Montera en filtreringsapparat genom att placera ett membranfilter med diametern 25 mm, 0,1 μm porstorlek, membranfilter för blandade cellulosaestrar på toppen av glasbasen inuti en BSL2-biosäkerhetshuv. Placera en 15 ml glastratt på toppen och håll båda bitarna med fjäderklämmor. Anslut glaset till en vakuumpump och tillsätt kulturerna i tratten för filtrering.
- Tillsätt 5 ml Leptospira-kultur till tratten. Lägg till en volym E. coli för att utgöra 1:1-proportionen baserat på OD420nm-värdena för båda kulturerna. Slå på vakuumpumpen och koncentrera cellerna genom filtrering. Efter cellkoncentration i membranfiltret, hämta det försiktigt. Se till att mediet filtreras genom membranet.
OBS: Filtreringen tar 5 till 10 min. - Placera filtret på en kommersiellt tillgänglig EMJH-platta (se Materialförteckning)kompletterad med DAP (0,3 mM). Se till att bakteriesidan är uppe. Inkubera plattorna vid 29 °C i 24 timmar.
OBS: Om HAN eller kompletterade interna EMJH14-plattor används kan E. coli föröka sig och övervinna den avsedda 1:1-andelen, vilket i sin tur kan minska konjugationseffektiviteten5. - Efter 24 timmar, återställ filtren från plattorna och placera varje enskilt filter i ett 50 ml koniskt rör.
- Använd 1 ml flytande HAN-medium för att frigöra cellerna från filterytan genom omfattande pipetting och virvel.
- Visualisera de återvunna blandade bakterielösningarna med mörk fältmikroskopi för att kontrollera cellens livskraft och motilitet och Leptospira:E. coli-proportioner.
OBS: I detta skede kan motsvarande antal E. coli och Leptospira ses. - Sprid 100-200 μL av denna kultur på HAN-plattor som innehåller 0,4% inaktiverat kaninserum och 40 μg/mL spectinomycin. Inkubera plattor vid 37 °C i en 3% CO2-atmosfär.
OBS: Normalt bildar L. interrogans serovar Copenhageni stam Fiocruz L1-130 celler kolonier i 5-7 dagar på kontrollplattor och i 8-10 dagar på spectinomycinplattor. I detta skede kommer E. coli inte att växa eftersom de är auxotrofa för DAP. - Som en kontroll, späd kulturer vid 104 leptospires / mL och tillsätt 100 μL på tallrikar utan antibiotika, för övervakning av leptospiral tillväxt.
3. Urval av koloni och transkonjugant tillväxt och validering
OBS: Kolonier bör vara uppenbara dag 10. De är dock inte så lätta att visualisera. Normalt vid denna tidpunkt är HAN-plattor lite ogenomskinliga på grund av de torkade cellerna som spreds och Leptospira-kolonier kan visas som en transparent halo mot den vita bakgrunden. Det rekommenderas att se plattorna i olika vinklar för att uppnå olika ljusförekomst, vilket gör kolonierna tydligare. Vid längre inkubationstider kan kolonier få ett tätare utseende, och i det här fallet presenterar de som mjölkiga halos mot en mörk bakgrund.
- Tillsätt 100 μL flytande HAN-media till varje 1,5 ml mikrorör för att återställa mutanter. Ta minst 3 kolonier från varje tallrik.
- Med hjälp av en mikropipettespets "gräva" agaren för att hämta kolonierna från plattorna eftersom leptospirala kolonier kan vara under ytan.
OBS: Agar förväntas tas med i detta skede. Kolonier bör tas från kontrollplattor som innehåller tomma pMaOri.dCas9-plasmider och plattor med leptospirer som innehåller plasmider som uttrycker både dCas9 och RNA med enkel styrning, utformade för målgenen. - Dela ut den insamlade kolonin i 100 μL HAN-media i ett 1,5 ml mikrorör och homogenisera kraftigt. I detta skede, se till att agarintegriteten bryts maximalt för att frigöra celler. Virvel suspensionen i 10 s.
- Med hjälp av en mikropipettespets "gräva" agaren för att hämta kolonierna från plattorna eftersom leptospirala kolonier kan vara under ytan.
- Visualisera de återvunna cellerna genom mörk fältmikroskopi vid en förstoring på 200-400x genom att lägga till en 5 μL droppe på en glasrutschbana och täcka proverna omedelbart med ett täckglas.
- Bekräfta närvaron av levande och livskraftiga leptospirer som återfunnits från kolonierna.
- Efter visualisering och bekräftelse av livskraftiga leptospires, överför 100 μL celler till flytande HAN-media som innehåller 40 μg/mL spectinomycin.
- Efter tillväxt i flytande HAN-media, utvärdera kulturerna för närvaron av plasmid med primer pMaOri2 F (ACGCAATGTATCGATACCGAC) och R (ATAGGTGAAGAGGCCCACCC), som känner igen regionen som flankerar sgRNA-kassetten.
- Samla 200 μL kultur, centrifug (4 000 x g, 15 min), kassera supernatanten och återanvänd den resulterande pelleten i 20 μL vatten.
- Använd denna suspension som mall för ytterligare PCR, utan behov av DNA-extraktion12.
OBS: Celler med pMaOri.dCas9 kommer att göra en amplicon på 281 bp, jämfört med de som innehåller plasmiderna med sgRNA-kassetten som kommer att göra en amplicon på 723 bp.
- För bekräftelse av gensilencing, utför en immunoblot som använder cellextrakt från transkonjuganter som endast innehåller pMaOri.dCas9 (negativ kontroll) och pMaOri.dCas9sgRNA.
- Applicera motsvarande 5 x 107 celler per bana av natriumdcylsulfat (SDS) polyakrylamidgel.
- Elektrotransferproteiner till ett membran för inkubation med lämpliga antikroppar. Förutom antikroppen mot målgenen för tystning, använd en annan för lastningskontroll.
- Håll mutantkulturerna i HAN media plus spectinomycin för att upprätthålla plasmiden. Om inga antibiotika appliceras på media kan fullständig gensilencing observeras för minst tre passager5.
Representative Results
Även om CG-innehållet i Leptospira spp. genom vanligtvis är cirka 35%; Praktiskt taget varje gen kommer sannolikt att innehålla PAM 5'NGG 3'; Detta motiv måste beaktas i malldelen. Efter att ha matat in kodningssekvensen för en gen (från början till stoppkodon), baserat på CHOPCHOP-resultaten, måste protospacers väljas vid minussträngen (-, mall). Det är viktigt att inte inkludera NGG-motivet i 20-nt sgRNA protospacer.
Om konjugation utförs med en 1:1 givare: mottagarens cellproportion, för 24 timmar på ytan av EMJH-agarplattor plus DAP, och 200 μL av den återvunna bakteriesuspensionen sprids på HAN plus spectinomycin agarplattor, bör transkonjugantkolonier vara synliga vid cirka 8-10 dagar. Spridningen av denna volym resulterar normalt i 20-40 kolonier per platta (figur 3A). För att kontrollera cellens livskraft efter konjugation kan celler spridas på HAN-plattor utan antibiotikaval. I detta fall kan kolonier observeras så snart som 7 dagar. HAN-plattor blir blekgula i en 3% CO2 atmosfär.
Efter koloniplockning och tillväxt i flytande media plus spectinomycin kan PCR med hela celler och pMaOri2 primers användas för en första kvalitetskontroll av transkonjuganterna(figur 3B). Leptospirala celler som innehåller bekämpningen pMaOri.dCas9 plasmid bör resultera i en amplicon på 281 bp, medan de celler som innehåller plasmiden för tystning, det vill säga innehåller både dCas9 och sgRNA, bör resultera i en 723 bp amplicon. pMaOri2 F och R primers utformades för att flankera XmaI begränsning webbplats, som är den plats som används under sgRNA kassett ligatur.
Med bekräftelse av plasmid närvaro, celler kan skördas från media, tvättas två gånger med PBS och sedan användas för att förbereda en helcellig extrakt för immunoblotting. Om tystnad inträffade bör målproteinerna, i detta fall antingen LipL32 eller både LigA och LigB, endast observeras i de vilda typcellerna och i de som innehåller pMaOri.dCas9. Även med högre exponeringstider bör inga motsvarande proteiner vara synliga i cellerna som innehåller pMaOri.dCas9sgRNA (figur 3C).
Om experiment för att bedöma leptospiral virulens efter gensilencing planeras, bör kulturer som används för konjugation vara låg passage virulent Leptospira. Efter gen tystning bekräftas, flera aliquots kan frysas som en säkerhetskopia. Om den tystade genen har en mätbar fenotyp, t.ex. baserat på tidigare arbete med rekombinanta proteiner, kan kulturer användas för validering och i detta fall celler som endast innehåller pMaOri.dCas9, kan inkluderas som en negativ kontroll.
Figur 1: Utveckling av dCas9 och sgRNA som uttrycker plasmid. (A) A 20-nt lång protospacer, följt av S. pyogenes dCas9 PAM 5'-NGG-3', väljs inom malldelen av målgenen så att efterföljande sgRNA kan utföra Watson och Crick basparning till motsvarande kodningssträng, vilket resulterar i fullständig gensilencing. (B) SgRNA-kassetten består av lipL32-promotorn, 20-nt protospacer och dCas9-ställningen. PMaOri.dCas9-plasmiden används som ryggrad för sgRNA-kassettligation på XmaI-begränsningsplatsen. Den resulterande plasmiden, som kallas pMaOri.dCas9sgRNA levereras till leptospires, och uttrycket av både dCas9 och sgRNA är ansvarig för genen silencing. C)sgRNA-riktad dCas9 fungerar som ett fysiskt hinder för RNA-polymerasförlängning, vilket hämmar transkriptionen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Schematisk framställning av konjugationsprotokoll. Den önskade Leptospira-arten odlas i HAN-media, under agitation, fram till O.D. på 0,2-0,4 (mitten av stockfasen) vid 420 nm. En dag före konjugation plockas en koloni av rekombinant donator E. coli β2163 som innehåller plasmid av intresse från LB + DAP + Spc agarplattor, eftersom celler odlas över natten i flytande LB med samma tillskott. Nästa dag, mättad E. coli kulturer späds i LB plus DAP och odlas tills O.D. av 0,2-0,4 vid 420 nm. Både donatorn E. coli och mottagaren Leptospira blandas vid 1:1-cellens andel på ytan av ett filter på 0,1 μm med en filtreringsapparat under undertryck. Därefter placeras filter ovanpå EMJH-agarplattorna kompletterade med DAP, och inkubationsintäkterna för 24 timmar vid 29 °C. Användningen av EMJH begränsar E. coli-spridning, och den avsedda 1:1-andelen bibehålls. Bakterier återvinns från filter genom pipettning med 1 ml HAN-media, och suspensioner visualiseras under darkfieldmikroskopi. Slutligen sås 100-200 μL av varje suspension på HAN-agarplattor som innehåller 0,4% kaninserum och inkuberas vid 37 °C i 3% CO2. I detta skede utelämnas DAP, och som ett resultat kommer auxotrofisk E. coli inte att växa. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Representativa resultat för mutanternas utvärdering. (A) Kolonier från plattor som innehåller Leptospira omvandlade med tomma pMaOri.dCas9 (negativ kontroll för ytterligare experiment) och plasmider pMaOri.dCas9sgRNA (med riktad gen tystad) plockas, kraftigt homogeniseras i flytande HAN och odlas i flytande HAN som innehåller spectinomycin. Rekombinanta celler kan valideras av PCR med primers flankerande XmaI-platsen inom pMaOri.dCas9. (B) I detta fall resulterade celler som innehåller pMaOri.dCas9 endast i en amplicon på 281 bp, medan de celler som innehåller plasmid för tystning, innehållande både dCas9 och sgRNA, visade en 723 bp amplicon. Efter bekräftelse av förekomsten av plasmiderna validerades gensilencing av immunoblot analys. C)Inkubation med antikroppar mot både målprotein och ett lastkontrollprotein rekommenderas. i den representativa immunoblot, helcelliga extrakt från transkonjuganter som innehåller pMaOri.dCas9 ensam eller med sgRNA kassetter som riktar sig till lipL32 (pMaOri.dCas9sgRNAlipL32) och både LigA och LigB (pMaOri.dCas9sgRNAligAB) gener visas. Saminkubation med anti-LipL32, anti-LigAB och anti-LipL41 (icke-mål, lastkontroll) bekräftar att uttrycket av LipL32-protein avskaffas i celler som innehåller pMaOri.dCas9sgRNAlipL32 och både LigA och LigB i celler som innehåller pMaOri.dCas9sgRNAligAB. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande fil: Enkel guide RNA (sgRNA) kassett sekvens. SgRNA-transkriptionen styrs av den konstituerande lipL32-promotorn (djärva nukleotider). sgRNA består av 20 nukleotider som hänvisar till protospacern, ansvarig för basparning till målgenens kodningssträng, och dCas9 ställningssekvens (understrukna nukleotider). Xma (på))xma I begränsningsplatser (cccggg) ingår i båda ändarna för ligatur på pMaOri.dCas9 plasmid. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Efter tidig sekvensering avpatogena 15,16,17,18 och saprofytiska19Leptospira arter, data mining av genomet kasta ljus på flera aspekter av leptospiral patogenes. I de flesta fall undersöktes proteinfunktionen genom att använda den rekombinanta motsvarigheten till förmodade leptospirala ytexponerade proteiner och efterföljande spekulation av den inhemska proteinfunktionen20,21,22,23,24,25,26.
Generering av mutanter, och utvärdering av deras respektive fenotyp, är viktiga komponenter i funktionell genomisk analys. Initiala försök att generera mutanter i Leptospira spp. uppnåddes av slumpmässig transposon mutagenesis27,28,29,30; Men efter omfattande och mödosam analys för att härleda identiteten på störda gener noterades det att endast 15% av alla gener i L. interrogans serovar Manilae stördes27. Riktad gen knockout uppnåddes ytterligare genom homolog rekombination med hjälp av självmord plasmider för att leverera en antibiotikaresistens kassett flankerad av homologa armar inom det önskade målet31,32.
Genom att tillämpa dessa tekniker utforskades flera aspekter av leptospiral grundläggande biologi och virulens31,33,34,35,36,37. Utvecklingen av E. coli-Leptospira konjugativ skyttel vektor, pMaOri 11, tillät leverans av komponenter för episomal gen tystning.
Det visades tidigare att den Cas9-inducerade dubbelsträngsbrytningen är dödlig för Leptospira spp. och som ett alternativ kan den katalytiskt inaktiva varianten av enzymet, dCas9, användas för att uppnå gensilencing i både saprofytiska och patogena arter4,5. Genom att använda plasmid pMaOri.dCas9 som ryggrad för sgRNA kassett ligatur, specifika och stabila gen ljuddämpning kan erhållas på grund av uttryck av både dCas9 och sgRNA; dCas9-bundna sgRNA kommer att leda proteinet till önskat mål genom Watson-Crick basparning.
För fullständig gensilencing bör protospacern utformas baserat på mallsträngen i den önskade genen så att basparning av sgRNA sker med kodningssträngen. Baserat på ett genomsnittligt C+G-innehåll på 35% i Leptospira spp., kommer PAM 5 '-NGG-3' att inträffa minst 3 gånger var 100:e bp. Därför kommer praktiskt taget alla gener inom genomet av Leptospira att innehålla minst en PAM. Om motivet NGG inte hittas kan dock det alternativa NAG-motivet utvärderas.
Tidigare gensilencing tekniker, såsom zink fingrar och TALE (transkription activator-liknande effectors), förlitade sig på konstruktionen av ett annat protein till varje mål, vilket gör dessa tekniker mödosamma ochkostsamma 38. När det gäller CRISPRi är den variabla komponenten sgRNA, vilket gör det nödvändigt att endast ändra 20 bp vid 5' änden. Fullständig, stabil och riktad gensilencing har observerats inte bara i Leptospira spp.4,5, men också i andra bakterier8,39,40,41.
Utvecklingen av HAN media13 gynnade återhämtningen av mutanter genom att drastiskt minska inkubationstiden för kolonibildning och låta Leptospira växa vid 37 oC. Under konjugationssteget rekommenderas dock inte dess användning eftersom E. coli kraftigt kan spridas i detta medium och övervinna den avsedda 1:1-andelen mellan donator- och mottagarceller. I detta skede är EMJH plus DAP det bättre valet, eftersom E. coli replikerar dåligt i detta media. Det är värt att nämna att vissa laboratorier gör internt kompletterad EMJH, som kan innehålla ytterligare komponenter som också kan stödja tillväxten av E. coli-celler.
Konjugationsprotokollet som presenteras här optimerades för L. interrogans serovar Copenhageni stam Fiocruz L1-130, och det visade sig också vara effektivt vid omvandlingen av en nyligen isolerad patogen stam från jordprover5. Inledande försök med olika serovars av L. borgpetersenii arter indikerar lägre konjugation effektivitet med det beskrivna protokollet. När man arbetar med olika arter/serovaner av Leptospirabör optimala förutsättningar för konjugation fastställas empiriskt, med beaktande av givaren: mottagarcellsproportioner, initiala celltätheter, konjugationsmedier och tid (24 och 48 h). Det är rimligt att anta att olika Leptospira arter och serovars kommer att bete sig annorlunda med olika konjugation protokoll.
Även om saprofytiska Leptospira kolonier är relativt lätta att visualisera på plattor, kan patogena kolonier vara svårare att observera. Normalt, genom att använda HAN-media kompletterat med 0,4% kaninserum och spectinomycin, kan transkonjugantkolonier observeras dag 10. Enligt vår erfarenhet presenterar kolonier inledningsvis som en transparent halo vid medieytan. I videoprotokollet visas tätare kolonier, efter 14 dagars tillväxt, eftersom de transparenta var svåra att filma. I detta skede kan rotera plattan för att uppnå olika ljusförekomst och skifta mellan vita och mörka bakgrunder hjälpa till att identifiera kolonier.
För mutant validering erbjuder immunoblotting ett enkelt tillvägagångssätt; Men eftersom antikroppar inte alltid är tillgängliga mot målproteiner kan alternativa strategier för att validera gensilencing eftersträvas. Kvantitativ omvänd-transkriptase PCR (qRT-PCR) med primers för mål genen och en konstituerande kontroll är effektiv för att validera gen ljuddämpande eftersom sgRNA-guidad dCas9 ansvarar för blockering av gen transkription. Om målgenen kodar ett tydligt definierat proteinband i proteingeler kan SDS-PAGE demonstrera ljuddämpande och enligt lipL32-genen som tystar5. Om LPS biosyntesgener tystas kan LPS-färgning användas. När det gäller att tysta gener som kodar för enzymer med väldefinierade substrat är kinetiska analyser med kromogena substrat giltiga strategier. β-galactosidase-tystande i L. biflexa validerades genom användning av X-gal och ONPG (orto-Nitrophenyl-β-galactoside) substrat4.
Efter bekräftelse av gensilencing, experiment kan utformas för att ytterligare utvärdera fenotyp. Bindande analyser kan utföras vid tystning av bakteriella vidhäftningar; serum-utmaning analyser bekräftade rollen av LigA och LigB i serum överlevnad visas av patogena Leptospira5. Mutanter kan också användas för att inokulera djur för att bedöma dämpning av virulens; I detta fall bör djur som vaccineras med mutanten jämföras med de djur som är infekterade med celler som endast innehåller pMaOri.dCas9.
Sammanfattningsvis beskriver det nuvarande protokollet tillämpningen av CRISPRi för gensilencing hos patogena Leptospira arter med han media för att underlätta mutant återhämtning inom 10 dagar. Gensilencing i kombination med funktionell genomisk analys kommer att förbättra vår förståelse av patogena mekanismer i Leptospira, och i slutändan leda till utvecklingen av bättre profylaktiska strategier för sjukdomsbekämpning.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
USDA är en leverantör av lika möjligheter och arbetsgivare. Omnämnande av handelsnamn eller kommersiella produkter i denna publikation är endast i syfte att tillhandahålla specifik information och innebär inte rekommendation eller godkännande från U.S. Department of Agriculture. Det brasilianska organet FAPESP (grant 2014/50981-0) stödde detta arbete ekonomiskt. LGVF finansieras med ett stipendium från FAPESP (2017/06731-8 och 2019/20302-8). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om publicering eller manuskriptförberedelse. Författarna tackar också Hannah Hill och Alexander Grimes från USDA Visual Services för att de filmat och redigerat videoprotokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 µm pore size mixed cellulose esters membrane | Millipore | VCWP02500 | Filtration for bacterial conjugation |
| 2,6-Diaminopimelic acid (DAP) | Sigma | D1377 | Growth of auxotrophic E. coli β2163 |
| Agar Noble | BD & Company | 214230 | Used for preparation of solid EMJH and HAN plates |
| Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Used for preparation of solid LB plates |
| Clarity Western ECL substrate | Biorad | 170-5060 | Chemiluminescent substrate |
| dNTP set | Thermo Fisher | 10297-018 | dNTPs for PCR reaction |
| Glass Microanalysis Filter Holder | Millipore | XX1012530 | Filtration for bacterial conjugation |
| Imaging System | Biorad | ChemiDoc MP | Chemiluminescence detection |
| LB broth, Miller | BD & Company | 244620 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD & Company | 279510 | Supplementation of EMJH media |
| Leptospira Medium Base EMJH | BD & Company | 279410 | EMJH medium for Leptospira |
| Mini-PROTEAN TGX Gels 12% | Biorad | 4568043 | Used for polyacrylamide gel eletrophoresis |
| Optical density reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | For optical density measurements of bacterial cultures |
| Phosphate Buffered Saline 7.4 | Sigma | 806552 | Saline solution for washing bacterial pellets |
| Spectinomycin | Sigma | S0692 | Selection of pMaOri backbone plasmids |
| Taq DNA Polymerase | Thermo Fisher | EP0402 | Enyme, buffer and MgCl2 for PCR reaction |
| Thermocycler | Applied Biosystem | GeneAmp PCR System 9700 | Used for PCR reaction cycling |
| Thymidine (dT) | Sigma | T9250 | Growth of auxotrophic E. coli π1 |
| XmaI restriction enzyme | New Englan BioLabs | R0180L | Digestion of plasmids and inserts |
References
- Bharti, A. R., et al. Leptospirosis: A zoonotic disease of global importance. Lancet Infectious Disease. 3 (12), 757-771 (2003).
- Costa, F., et al. Global morbidity and mortality of Leptospirosis: A systematic review. PLoS Neglected Tropical Disease. 9 (9), 0003898 (2015).
- Shapiro, R. S., et al. A CRISPR-Cas9-based gene drive platform for genetic interaction analysis in Candida albicans. Nature Microbiology. 3 (1), 73-82 (2018).
- Fernandes, L. G. V., et al. Gene silencing based on RNA-guided catalytically inactive Cas9 (dCas9): a new tool for genetic engineering in Leptospira. Science Reports. 9 (1), 1839 (2019).
- Fernandes, L. G. V., Hornsby, R. L., Nascimento, A. L. T. O., Nally, J. E. Genetic manipulation of pathogenic Leptospira: CRISPR interference (CRISPRi)-mediated gene silencing and rapid mutant recovery at 37 C. Science Reports. 11 (1), 1768 (2021).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
- Choudhary, E., Thakur, P., Pareek, M., Agarwal, N. Gene silencing by CRISPR interference in mycobacteria. Nature Communication. 6, 6267 (2015).
- Zhukova, A., et al. Genome-wide transcriptional start site mapping and sRNA identification in the pathogen. Frontiers in Cell and Infectious Microbiology. 7, 10 (2017).
- Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPalpha) conjugative machineries, and their cognate Escherichia coli host strains. Research in Microbiology. 156 (2), 245-255 (2005).
- Pappas, C. J., Benaroudj, N., Picardeau, M. A replicative plasmid vector allows efficient complementation of pathogenic Leptospira strains. Applied Environmental Microbiology. 81 (9), 3176-3181 (2015).
- Fernandes, L. G. V., Nascimento, A. L. T. O. Specific gene silencing in Leptospira biflexa by RNA-guided catalytically inactive Cas9 (dCas9). Methods in Molecular Biology. 2134, 109-122 (2020).
- Hornsby, R. L., Alt, D. P., Nally, J. E. Isolation and propagation of leptospires at 37 °C directly from the mammalian host. Science Reports. 10 (1), 9620 (2020).
- Haake, D. A.
- Nascimento, A. L., et al. Comparative genomics of two Leptospira interrogans serovars reveals novel insights into physiology and pathogenesis. Journal of Bacteriology. 186 (7), 2164-2172 (2004).
- Nascimento, A. L., et al. Genome features of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Brazillian Journal of Medical Biology Research. 37 (4), 459-477 (2004).
- Ren, S. X., et al. Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing. Nature. 422 (6934), 888-893 (2003).
- Bulach, D. M., et al. Genome reduction in Leptospira borgpetersenii reflects limited transmission potential. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (39), 14560-14565 (2006).
- Picardeau, M., et al. Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis. PLoS One. 3 (2), 1607 (2008).
- Fernandes, L. G., et al. OmpL1 is an extracellular matrix- and plasminogen-interacting protein of Leptospira spp. Infections and Immunity. 80 (10), 3679-3692 (2012).
- Fernandes, L. G., et al. Leptospira spp.: Novel insights into host-pathogen interactions. Veterinary Immunology and Immunopathology. 176, 50-57 (2016).
- Castiblanco-Valencia, M. M., et al. Leptospiral immunoglobulin-like proteins interact with human complement regulators factor H, FHL-1, FHR-1, and C4BP. Journal of Infectious Diseases. 205 (6), 995-1004 (2012).
- Choy, H. A., et al. The multifunctional LigB adhesin binds homeostatic proteins with potential roles in cutaneous infection by pathogenic Leptospira interrogans. PLoS One. 6 (2), 16879 (2011).
- Siqueira, G. H., et al. The recombinant LIC10508 is a plasma fibronectin, plasminogen, fibrinogen and C4BP-binding protein of Leptospira interrogans. Pathogen and Diseases. 74 (2), (2016).
- Teixeira, A. F., et al. Features of two new proteins with OmpA-like domains identified in the genome sequences of Leptospira interrogans. PLoS One. 10 (4), 0122762 (2015).
- Kochi, L. T., et al. The interaction of two novel putative proteins of Leptospira interrogans with E-cadherin, plasminogen and complement components with potential role in bacterial infection. Virulence. 10 (1), 734-753 (2019).
- Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infections and Immunity. 77 (2), 810-816 (2009).
- Bourhy, P., Louvel, H., Saint Girons, I., Picardeau, M. Random insertional mutagenesis of Leptospira interrogans, the agent of leptospirosis, using a mariner transposon. Journal of Bacteriology. 187 (9), 3255-3258 (2005).
- Pětrošová, H., Picardeau, M. Screening of a Leptospira biflexa mutant library to identify genes involved in ethidium bromide tolerance. Applied Environmental Microbiology. 80 (19), 6091-6103 (2014).
- Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods in Molecular Biology. 859, 169-176 (2012).
- Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: Disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infections and Immunity. 76 (12), 5826-5833 (2008).
- Picardeau, M., Brenot, A., Saint Girons, I. First evidence for gene replacement in Leptospira spp. Inactivation of L. biflexa flaB results in non-motile mutants deficient in endoflagella. Molecular Microbiology. 40 (1), 189-199 (2001).
- King, A. M., et al. High-temperature protein G is an essential virulence factor of Leptospira interrogans. Infections and Immunity. 82 (3), 1123-1131 (2014).
- Lambert, A., et al. FlaA proteins in Leptospira interrogans are essential for motility and virulence but are not required for formation of the flagellum sheath. Infections and Immunity. 80 (6), 2019-2025 (2012).
- Murray, G. L., et al. Leptospira interrogans requires heme oxygenase for disease pathogenesis. Microbes and Infections. 11 (2), 311-314 (2009).
- Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathogens. 3 (7), 97 (2007).
- Sasaki, Y., et al. Leptospiral flagellar sheath protein FcpA interacts with FlaA2 and FlaB1 in Leptospira biflexa. PLoS One. 13 (4), 0194923 (2018).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Cress, B. F., et al. Rapid generation of CRISPR/dCas9-regulated, orthogonally repressible hybrid T7-lac promoters for modular, tuneable control of metabolic pathway fluxes in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (9), 4472-4485 (2016).
- Zhao, C., Shu, X., Sun, B. Construction of a gene knockdown system based on catalytically inactive ("dead") Cas9 (dCas9) in Staphylococcus aureus. Applied Environmental Microbiology. 83 (12), (2017).
- Zhao, Y., et al. CRISPR/dCas9-mediated multiplex gene repression in Streptomyces. Biotechnology Journal. , 1800121 (2018).
