Summary
Dette manuskriptet beskriver en detaljert protokoll for differensiering av humane embryonale stamceller (hESCer) i funksjonelle hepatocyttlignende celler (HLCer) ved kontinuerlig å supplere Activin A og CHIR99021 under hESC-differensiering til definitiv endoderm (DE).
Abstract
De potensielle funksjonene til hepatocyttlignende celler (HLCer) avledet fra humane embryonale stamceller (hESC) har et stort løfte om sykdomsmodellering og narkotikascreening. Gitt her er en effektiv og reproduserbar metode for differensiering av hESCs i funksjonelle HLCer. Etableringen av en endoderm avledning er et viktig skritt i differensiering til HLCer. Ved vår metode regulerer vi de viktigste signalveiene ved å kontinuerlig supplere Activin A og CHIR99021 under hESC-differensiering til definitiv endoderm (DE), etterfulgt av generering av levergenitorceller, og til slutt HLCer med typisk hepatocyttmorfologi i en trinnvis metode med helt definerte reagenser. HESC-avledede HLCer produsert av denne metoden uttrykker scenespesifikke markører (inkludert albumin, HNF4α nukleærreseptor, og natrium taurocholat kotransporterende polypeptid (NTCP)), og viser spesielle egenskaper knyttet til modne og funksjonelle hepatocytter (inkludert indocyanin grønn farging, glykogenlagring, hematoksylin-eosinfarging og CYP3-aktivitet), og kan gi en plattform for utvikling av HLC-baserte applikasjoner i studiet av leversykdommer.
Introduction
Leveren er et svært metabolsk organ som spiller flere roller, inkludert deoksidasjon, lagring av glykogen og sekresjon og syntese av proteiner1. Ulike patogener, narkotika og arvelighet kan forårsake patologiske endringer i leveren og påvirke dens funksjoner2,3. Hepatocytter, som den viktigste funksjonelle enheten i leveren, spiller en viktig rolle i kunstige leverstøttesystemer og eliminering av legemiddeltoksisitet. Imidlertid er ressursen til primære menneskelige hepatocytter begrenset i cellebasert terapi, så vel som i leversykdomsforskning. Derfor er utvikling av nye kilder til funksjonelle menneskelige hepatocytter en viktig forskningsretning innen regenerativ medisin. Siden 1998 når hESCs har blitt etablert4, hESCs har blitt mye vurdert av forskere på grunn av deres overlegne differensieringspotensial (de kan skille seg ut i ulike vev i et passende miljø) og høy grad av selvfornyelse, og dermed gi ideelle kildeceller for bioartificial lever, hepatocyttransplantasjon og til og med levervevsteknikk5.
For tiden kan leverdifferensieringseffektiviteten økes kraftig ved å berike endoderm6. I avstamningsdifferensiering av stamceller til endoderm er nivåer av den transformerende vekstfaktoren β (TGF-β) signalisering og WNT-signalveier nøkkelfaktorene i noden av endodermformasjonsstadiet. Aktivering av et høyt nivå av TGF-β og WNT-signalering kan fremme utviklingen av endoderm7,8. Activin A er en cytokin som tilhører TGF-β superfamilien. Derfor er Activin A mye brukt i endoderm induksjon av menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCer) og hESCs9,10. GSK3 er en serin-threonine protein kinase. Forskere har funnet ut at CHIR99021, en spesifikk hemmer av GSK3β, kan stimulere typiske WNT-signaler, og kan fremme stamcelledifferensiering under visse forhold, noe som tyder på at CHIR99021 har potensial for å indusere stamcelledifferensiering til endoderm 11,12,13.
Her rapporterer vi en effektiv og reproduserbar metode for effektivt å indusere differensiering av hESCer til funksjonelle HLCer. Det sekvensielle tilskuddet av Activin A og CHIR99021 produserte omtrent 89,7 ±0,8% SOX17 (DE-markør)-positive celler. Etter å ha blitt ytterligere modnet in vitro, uttrykte disse cellene leverspesifikke markører og utøvde hepatocyttlignende morfologi (basert på hematoksylin-eosinfarging (H &E)) og funksjoner, for eksempel opptak av indocyaningrønn (ICG), glykogenlagring og CYP3-aktivitet. Resultatene viser at hESC-er kan differensieres til modne funksjonelle HLCer ved denne metoden og kan gi grunnlag for leversykdomsrelatert forskning og in vitro-legemiddelscreening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vedlikehold av stamceller
MERK: Cellevedlikeholdsprotokollen som er beskrevet nedenfor, gjelder for hES03-cellelinjen som vedlikeholdes i en tilhenger monolayer. For alle følgende protokoller i dette manuskriptet bør celler håndteres under et biologisk sikkerhetsskap.
- Forbered 1x mTesR stamcellekulturmedium ved å fortynne 5x supplerende medium til mTesR grunnleggende medium.
- Forbered 30x hESC-kvalifisert Matrigel medium ved å fortynne 5 ml hESC-kvalifisert matrigel med 5 ml DMEM/F12 på isen. Oppbevars ved -20 °C.
- Forbered 1x hESC-kvalifisert matrigellmedium ved å fortynne 33,3 μL 30x hESC-kvalifisert matrigel med 1 ml DMEM/F12.
- Frakk steril 6 brønn, vev kulturbehandlede plater med 1 ml 1x hESC-kvalifisert Matrigel i hver i god tid og lagre ved 4 °C over natten. La det stå ved romtemperatur (RT) i minst 30 minutter før bruk.
- Tine kryopreserverte hESCer i et 37 °C vannbad i 3 minutter uten å riste. Overfør deretter cellene umiddelbart ved å pipettere inn i et 15 ml sentrifugerør som inneholder 4 ml forhåndsvarslet 37 °C mTesR-medium, pipet forsiktig opp og ned 2 ganger.
- Sentrifuger hESC-ene på 200 x g i 2 minutter ved RT.
- Aspirer de supernatante og forsiktig resuspend cellene i 1 ml mTesR medium.
- Aspirer DMEM/F12-mediet fra platen og frø cellene i en brønn på 6 brønnplate med en tetthet på 1 x 105 celler i 2 ml mTesR.
- Inkuber i en 5% CO2 inkubator og vedlikehold cellene ved å erstatte med forvarmet mTesR medium daglig. Passer cellene ved omtrent 70-80% samløp eller når cellekoloniene begynner å ta kontakt.
2. Stamcellepassasje og differensiering
- For passaging celler, aspirere mediet og inkubere cellene med 1 ml per brønn av enzymoppløsning (f.eks. Accutase i 5 min ved 37 °C. Overfør deretter cellene ved pipettering til et 15 ml sentrifugerør som inneholder 4 ml DMEM/F12 forhåndsvarslet til 37 °C.
- Sentrifuger cellene ved 200 x g ved RT i 2 minutter.
- Aspirer mediet og resuspender forsiktig cellepelleten i 1 ml mTesR medium.
- Forbered 24-brønnsplater ved belegg med 250 μL 1x hESC-kvalifisert Matrigel medium på forhånd. Frø hESCs som beskrevet ovenfor med en tetthet på 1 - 1,5 x 105 celler per brønn i 500 μL mTesR medium.
- La cellene inkubere i 24 timer ved 37 °C i en CO 2-inkubator.
3. DE-formasjon
- Forbered lagerløsninger på 100 μg/ml Activin A med DPBS som inneholder 0,2 % BSA og 3 mM CHIR99021 med DMSO.
- Forbered trinn I differensiering grunnleggende medium ved å supplere RPMI medium med 1x B27.
- Legg Activin A til en endelig konsentrasjon på 100 ng/ml og CHIR99021 i en endelig konsentrasjon på 3 μM i et passende volum av forvarmet trinn I differensieringsmedium.
- Aspirate mTesR medium fra cellene og erstatt med stage I differensieringsmedier som inneholder ekstra differensieringsfaktorer (f.eks. 0,5 ml per brønn av en 24-brønns plate).
- La cellene inkubere i 3 dager ved 37 °C i en CO 2-inkubator, og erstatt Stage I-medier daglig med nytilsatte differensieringsfaktorer (dag 0-2).
MERK: Etter 3 dager med differensiering skal differensierte celler uttrykke markører av DE-celler, for eksempel FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 og FOXA1 (minimum 80% av SOX17 som trengs for å fortsette).
4. Differensiering av leverforfederceller
- Forbered trinn II differensiering grunnleggende medier ved å oppløse knockout serum erstatning (KOSR) til en endelig konsentrasjon på 20% i Knock Out DMEM.
- Klargjør trinn II differensieringsmedium som inneholder 1% DMSO, 1x GlutaMAX, 1x ikke-essensiell aminosyre (NEAA) løsning, 100 μM 2-mercaptoetanol og 1x penicillin/streptomycin (P/S) til riktig volum KOSR/knockout DMEM.
- På dag 3 av differensiering aspirerer du mediet og erstatter det med stage II medium (f.eks. 0,5 ml per brønn av en 24 brønnplate). Deretter inkuberes i 24 timer.
- På dag 4 av differensiering aspirerer du mediet og erstatter det med stage II medium (f.eks. 1 ml per brønn på en 24 brønnplate).
- Endre mediet annenhver dag (erstatt medium på dag 6).
MERK: Etter 8 dager med differensiering, bør differensierte celler uttrykke passende markører av levergenitorceller, for eksempel HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA (minimum 80% av HNF4α som trengs for å fortsette).
5. Hepatocyte differensiering
- Forbered 10 μg/ml hepatocytt vekstfaktor (HGF), 20 μg/ml Oncostatin (OSM)-lagerløsninger med DBPS (som inneholder 0,2 % BSA) og filtrer med en 0,22 μm filtermembran.
- Klargjør trinn III differensieringsmedium (HepatoZYME-SFM (HZM) medium supplert med 10 μM hydrokortison-21-hemisuccinat og 1x P / S).
- Legg HGF til en endelig konsentrasjon på 10 ng/ml og OSM i en endelig konsentrasjon på 20 ng/ml til riktig volum av forvarmet trinn III differensieringsmedium.
- På dag 8 av differensiering aspirerer du trinn II-medium fra celler og erstatter med trinn III-medium (f.eks. 1 ml per brønn av en 24 brønnplate).
- La cellene inkubere i 10 dager ved 37 °C i en CO 2-inkubator, endre Stage III-medier annenhver dag med nytilsatte differensieringsfaktorer (dag 8-18).
MERK: Etter 18 dager med differensiering skal differensierte celler uttrykke karakteristiske markører av hepatocytter, for eksempel AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Prosentandelen av Albumin-positive celler er vanligvis mer enn 90%.
6. RNA-isolasjon, cDNA-syntese og RT-qPCR-analyse
- Aspirer medium fra celler og tilsett riktig mengde RNAiso Plus-reagens (f.eks. 0,3 ml per brønn av en 24-brønnsplate). Samle supernatanten i et 1,5 ml rør og la stå på RT i 5 minutter.
- Tilsett 60 μL kloroformreagens og la det stå på RT i 5 min. Sentrifuger deretter på 12.000 x g i 15 min.
- Samle 125 μL supernatant og overfør den til et annet sentrifugerør. Tilsett 160 μL isopropanol, bland godt og stå på RT i 10 minutter.
- Sentrifuge ved 12.000 x g i 10 min.
- Fjern supernatanten, tilsett 75% etanol til de utfelte, og sentrifuger ved 7500 x g i 5 minutter.
- Etter tørking ved RT, tilsett 40 μL DEPC-behandlet vann for å oppløses. For qPCR, omvendt transkribering 2 μg total RNA med et omvendt transkripsjonssett i henhold til produsentens protokoll.
- Utfør RT-qPCR ved hjelp av et kommersielt sett i henhold til produsentens protokoll.
- Normaliser genuttrykk i forhold til ikke-induserte stamceller og bestem foldvariasjon etter normalisering til GAPDH.
7. Immunfluorescence Validering av differensiering
- Forbered 1x PBST vaskebuffer ved å legge 0,1% Tween-20 til PBS.
- Aspirer medium fra adherentceller og vask kort med PBS på RT på en shaker.
- Aspirer PBS og inkuber celler med 500 μL iskald metanol per brønn av en 24-brønns plate for å fikse cellene ved -20 °C over natten.
- Fjern metanol og vask cellene 3 ganger med PBS på en shaker i 10 minutter hver gang på RT.
- Blokker celler med 500 μL 5% BSA fremstilt i PBS i 1-2 timer ved RT på en shaker.
- Fortynn det primære antistoffet ved 1: 200 i samme løsning som brukes til blokkering.
- Inkuber de faste cellene i 300 μL primær antistoffoppløsning over natten ved 4 °C på en shaker.
- Etter overnatting inkubasjon, vask celler 3 ganger med PBST i 10 min hver gang på RT på en shaker.
- Forbered sekundær antistoffløsning i blokkeringsløsning ved 1:1000.
- Inkuber i 300 μL sekundær antistoffløsning beskyttet mot lys i 1 time ved RT på en shaker.
- Aspirer sekundær antistoffløsning og vask celler 3 ganger med PBST i 10 minutter hver gang ved RT på en shaker.
- Inkuber celler med 300 μL 1 μg/ml DAPI i 3-5 min, og vask deretter to ganger med PBST.
- Etter aspirerende PBST, legg til en passende mengde PBS for å ta bilder under et fluorescensmikroskop.
8. Vestlig blotanalyse
- Forbered 1x TBST vaskebuffer ved å legge til 0,1% Tween-20 til Tris-bufret saltvann (TBS).
- Klargjør SDS-PAGE elektroforesebuffer og vestlig overføringsbuffer ved å bruke et kommersielt sett i henhold til produsentens protokoll.
- Løs totalt celleprotein (40 μg) på en 10% natrium dodecyl sulfatpolyakrylamidgel og kjør i SDS-PAGE elektroforesebuffer ved 15 mA konstant strøm i ca. 2 timer.
- Overfør gelen til en polyvinylliddifluoridmembran (PVDF) ved 300 mA konstant strøm i 2 timer ved lav temperatur.
MERK: Kjøretiden og overføringstiden kan variere avhengig av utstyret som brukes og typen og prosentandelen av gelen. - Blokker membranen med 3% BSA fremstilt i TBST i 1 time ved RT på en shaker.
- Inkuber i primær antistoffoppløsning (1:1000 fortynning) over natten ved 4 °C på en shaker.
- Etter overnatting inkubasjon, vask blotting membran 3 ganger med TBST i 15 min per gang på RT på en shaker.
- Inkuber i sekundær antistoffoppløsning (1:2000 fortynning) i 2 timer ved RT på en shaker.
- Kast sekundær antistoffoppløsning og vask membranen 3 ganger med TBST, i 15 minutter hver gang, ved RT på en shaker.
- Visualiser immunoreaktive bånd ved hjelp av et chemiluminescensreagens etterfulgt av autoradiografi. Bruk β-aktin som lastekontroll.
9. Indocyanine grønt opptak
- Forbered 200 mg/ml indocyanin grønn lagerløsning i DMSO.
- Forbered en arbeidsløsning ved å supplere trinn III differensieringsmedium med indocyanin grønn løsning til en endelig konsentrasjon på 1 mg / ml.
- Inkuber i en 37 °C, 5 % CO 2-inkubator i 1–2 timer.
- Aspirer medium og vask cellene 3 ganger med PBS.
- Fotografi under et mikroskop.
10. Periodisk syre-Schiff (PAS) farging og Hematoxylin-Eosin (H&E) farging
- Aspirer medium fra adherentceller og vask kort to ganger med PBS.
- For cellefiksering, aspirerer PBS og inkuberer celler med iskald metanol ved -20 °C over natten.
- Visualiser glykogenlagring ved å PAS-farging og observere binuserte celler ved hjelp av H &E-farging ved hjelp av et sett i henhold til produsentens instruksjoner.
- Ta bilder med et fluorescensmikroskop.
11. Analyse for CYP-aktivitet
- Mål CYP450-aktivitet ved hjelp av kommersielt tilgjengelige cellebaserte analyser (P450-Glo Assays) i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bruk tre uavhengige gjentakelser for testing. Data representeres som gjennomsnittlig ± SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det skjematiske diagrammet over HLC-induksjon fra hESCer og representative lysfeltbilder av hvert differensieringsstadium vises i figur 1. I trinn I ble Activin A og CHIR99021 lagt til i 3 dager for å indusere stamceller til å danne endodermceller. I trinn II differensieres endodermcellene i leverforfederceller etter å ha blitt behandlet med differensieringsmedium i 5 dager. I trinn III hadde tidlige hepatocytter modnet og differensiert til HLCer etter 10 dager i HGF og OSM (figur 1A). I den siste fasen av differensiering viste cellene en typisk hepatocyttfenotype (Cellene er polygone og fordelt jevnt og regelmessig) (Figur 1B).
For ytterligere å bekrefte leverdifferensiering ble RT-qPCR, immunfluorescensfarging og vestlig blotting brukt til å oppdage markører av endodermceller, leverforfederceller og modne hepatocytter (figur 2). De differensierte cellene viste høye uttrykksnivåer av differensieringsrelaterte gener og proteiner i hvert trinn, for eksempel endodermmarkører SOX17 (89,7± 0,8%) ved dag 3, hepatisk stamcellemarkør HNF4α (81,3±2,9 %) ved dag 8, AFP (86,6±0,3 %) på dag 14 og moden hepatocyttmarkør ALB (94,5±1,1 %) på dag 18. Disse resultatene indikerer at hepatocyttlignende celler genereres av denne protokollen.
For å oppdage om HLCer har hepatocyttfunksjoner, oppdaget vi ICG-opptak, glykogenlagring og CYP-aktivitet av HLCer, samt utført H&E-farging. Som det fremgår av HLCene utvist grønn farging (Figur 3A) og omfattende cytoplasmatisk periodisk syre-Schiff farging (rosa til lilla) ble observert (Figur 3B), som er i samsvar med glykogen lagring. I tillegg kan vi se den representative morfologien til en typisk binucleated hepatocyte (Figur 3C). Til slutt ble den enzymatiske aktiviteten til CYP3A4, den viktigste metabolske CYP i leveren, bekreftet av enzymatisk aktivitetsanalyse (Figur 3D).
| Navn på reagens | Firma | Katalognummer | Lagerkonsentrasjon | Endelig konsentrasjon |
| 2-Mercaptoetanol | Sigma | M7522 | 50 mM | 100 μM |
| 488 merket geit mot mus IgG | ZSGB-BIO | ÅF-0512 | - | HVIS: 1:1000 |
| 488 merket geit mot kanin IgG | ZSGB-BIO | ÅF-0516 | - | HVIS: 1:1000 |
| Akkreditering | Stamcelleteknologier | 7920 | 1 x | 1 x |
| Aktivin A | pepro-tekniker | 120-14E | 100 μg/ml | 100 ng/ml |
| Anti - Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | - | HVIS: 1:200; WB:1:1000 |
| Anti - Menneskelig Okt4 | Abcam | Ab19587 | - | HVIS: 1:200 |
| Anti - α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | - | HVIS: 1:200; WB:1:1000 |
| Anti-SOX17 | Abcam | ab224637 | - | HVIS: 1:200 |
| Anti-hepatocyt kjernefysisk faktor 4 alfa (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | - | HVIS: 1:200 |
| B-27 Tillegg | Gibco | 17504-044 | 50 x | 1 x |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | - | 5.00% |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | 3 mM | 3 μM |
| DAPI | Beyotime | C1006 | - | - |
| DEPC-vann | Beyotime | R0021 | - | - |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | 500 μM | 250 nM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | 1 x | 1 x |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | 1 x | 1 x |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | 1 x | 1 x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 x | 1 x |
| H&E fargesett | Beyotime | C0105S | - | - |
| Hepatocytt vekstfaktor (HGF) | pepro-tekniker | 100-39 | 10 μg/ml | 10 ng/ml |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | - | - |
| Hydrokortison-21-hemisuccinat | Sigma-Aldrich | H4881 | 1 mM | 10 μM |
| Indocyanin | Sangon Biotech | A606326 | 200 mg/ml | 1 mg/ml |
| Utstans DMEM | Gibco | 10829-018 | 1 x | 1 x |
| Slå ut SR multi-arter | Gibco | A31815-02 | - | 20% |
| Matrigel hESC-kvalifisert | Corning | 354277 | 60 x | 1 x |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | 100 x | 1 x |
| mTesR 5X Tillegg | Stamcelleteknologier | 85852 | 5 x | 1 x |
| mTesR Basal Medium | Stamcelleteknologier | 85851 | 1 x | 1 x |
| Oncostatin (OSM) | pepro-tekniker | 300-10 | 20 μg/ml | 20 ng/ml |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega | V8901 | - | - |
| PAS fargesett | Solbio | G1281 | - | - |
| Penn/strep | Gibco | 15140-122 | 100 x | 1 x |
| Peroksidase-konjugert geit antimus IgG | ZSGB-BIO | ÅB-2305 | - | WB: 1:2000 |
| Primær antistofffortynningsbuffer for vestlig blot | Beyotime | P0256 | - | - |
| ReverTraAce qPCR RT-sett | TOYOBO | FSQ-101 | - | - |
| RNAiso Pluss | TaKaRa | 9109 | - | - |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | 1 x | 1 x |
| Skummet melk | Sangon Biotech | A600669 | - | 5.00% |
| SYBR Grønn Master Mix | Termofisker vitenskapelig | A25742 | - | - |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | 15 μM | 15 nM |
| Mellom | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | - | 0.10% |
Tabell 1: Komponenter i cellekultur og differensieringsbasemedier.
| Navn på gen | Forkortelser | primersekvenser(F) | primersekvenser (R) |
| POU Klasse 5 Homeobox 1 | OKT. | AGCGAACCAG TATCGAGAAC |
TTACAGAACC ACACTCGGAC |
| Forgreningshode boks A2 | FOXA2 | GCATTCCCAATC TTGACACGGTGA |
GCCCTTGCAGC CAGAATACACATT |
| SRY-boks transkripsjonsfaktor 17 | SOX17 | TATTTTGTCTGC KAKTUS |
TTGGGACACAT TCAAAGCTAGTTA |
| Frizzled Klasse Reseptor 8 | FZD8 | ATCGGCTACAA CTACACCTACA |
GTACATGCTGC ACAGGAAGAA |
| C-X-C Motiv Kjemokinreseptor 4 | CXCR4 | CACCGCATCT GGAGAACCA |
GCCCATTTCCT CGGTGTAGTT |
| Forgreningshode boks A1 | FOXA1 | AAGGCATACGA ACAGGCACTG |
TACACACCTTG GTAGTACGCC |
| Msh Homeobox 1 | MSX1 | CGCCAAGGCA AAGAGACTAC |
GCCATCTTCAG CTTCTCCAG |
| Mesogenin 1 | MSGN1 | GCTGGAATCCTA TTCTTCTTCTCC |
TGGAAAGCTAACA TATTGTAGTCCAC |
| Caudal Type Homeobox 1 | CDX1 | AAGGAGTTTCAT TACAGCCGTTAC |
TGCTGTTTCTTCT TGTTCACTTTG |
| Hjemmeboks med partallshopp 1 | EVX1 | GCTGTCTCTG AACAAAATGCT |
CATCTCTCACTCT CTCCTCCAAA |
| Mesoderm Posterior BHLH Transkripsjon Faktor 2 | MESP2 | AGCTTGGGTG CCTCCTTATT |
TGCTTCCCTGAA AGACATCA |
| NK2 Homeobox 5 | NKX2.5 | CAAGTGTGCG TCTGCCTTT |
CAGCTCTTTCTT TTCGGCTCTA |
| ISL LIM-boks 1 | ISL1 | AGATTATATCAGGT TGTACGGGATCA |
ACACAGCGGA AACACTCGAT |
| Hepatocytt kjernefysisk faktor 4 Alfa | HNF4α | ACATGGACATG GCCGACTAC |
CGTTGAGGTTG GTGCCTTCT |
| Alfa Fetoprotein | AFP | ACTGAATCCAG AACACTGCA |
TGCAGTCAATG CATCTTTCA |
| T-boks transkripsjonsfaktor 3 | TBX3 | TTATGTCCCAG CGAGGGTGA |
ACGTGGTGGTG GAGATCTTG |
| Transthyretin | TTR | AGAAAGGCTG CTGATGAC |
GTGCCTTCCA GTAAGATTTG |
| Albumin | ALB | CCCCAAGTGT CAACTCCA |
GTTCAGGACCA CGGATAG |
| Natrium taurocholat kotransporterende polypeptid | NTCP | KATAGGGATCGT CCTCAAATCCA |
GCCACACTGCAC AAGAGAATG |
| CCAAT Enhancer Binding Protein Alfa | CEBPA | AGGAGGATGAA GCCAAGCAGCT |
AGTGCGCGATC TGGAACTGCAG |
| Serpin Familie Et Medlem 1 | AAT | AAATGAACTCA CCCACGAT |
TILTRÅDT CCCAGT |
| Asialoglykoproteinreseptor 1 | ASGR1 | CAGACCCTGAGA CCCTGAGCAA |
TCCTGCAGCTGG GAGTCTTTTCT |
| Cytokrom P450 Familie 3 Underfamilie A Medlem 4 | CYP3A4 | TTGTAATCACTG TTGGCGTGGG |
AATGGGCAAAGT CACAGTGGA |
Tabell 2: Primersekvenser for q-PCR-analyse.
Figur 1: Skjematisk protokolldiagram for spesifikasjon av DE- og HLCer. (A) Skjematisk presentasjon av 3-trinns differensieringsstrategien som brukes i denne studien. (B) Morfologi for de differensierte cellene i dag 0, 3, 8, 14 og 18. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Scenespesifikk markøruttrykk under hESC-differensiering i HLCer. (A) mRNA-uttrykk for scenespesifikke gener. (B-C) Proteinuttrykk av scenespesifikke gener. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Funksjoner av hESC-avledede HLCer. (A) HLC-er behandlet i 1 time med 1 mg/ml indocyaningrønn viser opptak som vurdert ved fasemikroskopi. (B) Representative PAS farging bilder som indikerer glykogen lagring. (C) Representant HE flekker bilder som viser binucleates celler. (D) Basal nivå aktivitet av store cytokrom P450 enzymer. Alle verdier presenteres som gjennomsnittlig ± SD. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en trinnvis metode som induserer HLCer fra HESC-er i tre trinn. I første fase ble Activin A og CHIR99021 brukt til å differensiere hESCer i DE. I andre fase ble KO-DMEM og DMSO brukt til å skille DE inn i levergenitorceller. I tredje fase ble HZM pluss HGF, OSM og hydrokortison 21-hemisuccinat natriumsalt brukt til å fortsette å skille leverforfederceller i HLCer.
Følgende kritiske trinn må tas i betraktning når du bruker protokollen. Den første differensieringstettheten til celler og nøyaktig tidspunkt for middels endringer er viktige faktorer for vellykket differensiering. Når vi begynner å skille, må vi sørge for at den første såddtettheten er hensiktsmessig, med en sammenløp på ca 30-40%, når celler bare begynner å komme i kontakt med hverandre, og at de intercellulære rommene er jevnt ordnet i et nettverk under synsfeltet. Under differensiering må det tilsvarende differensieringsmediet endres nøyaktig på det angitte tidspunktet, spesielt i første fase og det viktigste øyeblikket i hvert erstatningsstadium, for å sikre at celler skiller seg ut i modus og stadium etterligner prosessen med embryonal utvikling.
Den første fasen av differensiering av HESCs til DE er spesielt viktig. Det er vanligvis et stort antall celler som løsner og flyter opp under trinn I av differensiering, noe som er et kritisk stadium for celle skjebnen, men på dette tidspunktet beholder cellene fortsatt evnen til å spre seg. Derfor kan sammenløpet av celler nå ca 90-100% på slutten av trinn I. I tillegg bør det bemerkes at i begynnelsen av trinn III av differensiering (dvs. dag 8) begynner cellenes cytoplasma å kondensere, noe som resulterer i at cellene gradvis får en slank morfologi. Men på dag 10 gjenoppretter cytoplasma gradvis, og på dag 14 begynner cellene å vise den åpenbare polyhedral morfologien til hepatocytter.
I denne studien er HLCene som er oppnådd faktisk nærmere fosterhpopatocytter, da AFP er høyere uttrykt enn ALB på dag 18. Selv om de genererte HLCene utøver hepatocyttegenskaper og -funksjoner, er det fortsatt et gap mellom HLCer og primære menneskelige hepatocytter, noe som indikerer at våre differensierte celler fortsatt ikke er funksjonelt modne. Derfor må fremtidig arbeid fokusere på å optimalisere differensieringsmetoden ytterligere.
For tiden brukes vekstfaktorer og små molekylære forbindelser som Activin A9,10,14, Wnt3a15, CHIR16, Torin217 og IDE118,19 ofte til å indusere DE-differensiering i ulike differensieringssystemer. Song-gruppen brukte Activin A til å differensiere stamceller i DE, og brukte FGF4 (Fibroblast Growth Factor 4), BMP2(Bone morphogenetic protein 2), HGF, KGF (Keratinocyte growth factor), OSM og Dex for leverspesifikasjon og HLCs modning20. Sullivan-gruppen induserte DE av Activin A og Wnt 3a, og induserte HLCer av β-ME (2-mercaptoethanol), DMSO, Insulin, HGF, OSM21. Siller-teamet brukte CHIR99021 for DE-differensiering, DMSO, Dihexa (Hepatocyte vekstfaktorreseptoragonist N-heksanoic-Tyr) og Dex for HLC-differensiering for å oppnå HLC med leverfunksjonsegenskaper16. Noen av disse metodene bruker imidlertid mange rekombinante vekstfaktorer for å generere DE med høye kostnader, og noen av dem bruker bare små molekyler for å generere DE med lavere effektivitet. Activin A er kritisk faktor for DE-generering. Vi har prøvd å erstatte Activin A med andre små molekyler, men får vanligvis lavere effektivitet. Derfor vedtar vi metoden for å legge til Activin A og CHIR99021 som induserende faktorer for DE, og oppdage differensieringsrelaterte gener i hvert trinn av q-PCR, immunfluorescens og vestlig blotting.
I de senere år er etableringen av et eksperimentelt system for rettet HLC-induksjon fra hESCs et viktig grunnlag for modellering av hepatocyttutvikling og screening av legemidler for leverrelaterte sykdommer. Samtidig kan det også gi en effektiv kilde til celler for hepatocyttransplantasjon, levervevsteknikk, bioartificial lever og annen forskning. Det har blitt rapportert at HLCer avledet fra stamceller har blitt brukt til å gjennomføre ulike studier på virusinfeksjon som en legemiddelscreeningsmodell for å forutsi hepatotoksiske legemiddelinduserte responser og for å studere den medfødte immunveien og signalveiene til celle10,22,23,24,25. Generelt introduserer denne metoden i detalj en effektiv hepatocyttlignende celledifferensieringsteknikk fra HESCer som med hell kan skille HESCer til modne funksjonelle hepatocytter. Resultatene gir en plattform for utvikling av HLC-baserte applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Nr. 81870432 og 81570567 til X.L.Z.), (Nr. 81571994 til P.N.S.); Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (nr. 2020A1515010054 til P.N.S.), Li Ka Shing Shantou University Foundation (Nei. L1111 2008 til P.N.S.). Vi vil takke prof. Stanley Lin fra Shantou University Medical College for nyttige råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti - Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti - Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti - α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
References
- Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
- Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19. Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).
- Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B.
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Li, Z., et al. Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Cell Death & Disease. 10, 763 (2019).
- Rassouli, H., et al. Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems. Cell Journal. 21, 290-299 (2019).
- Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Mukherjee, S., et al. Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network. Elife. 9, (2020).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).
- Gomez, G. A., et al. Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation. Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).
- Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells. Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).
- Matsuno, K., et al. Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells. Differentiation. 92, 281-290 (2016).
- Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).
- Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).
- Yu, J. S., et al. PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation. Nature Communications. 6, 7212 (2015).
- Borowiak, M., et al. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).
- Tahamtani, Y., et al. Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm. Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).
- Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 329-335 (2010).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Li, S., et al. Derivation and applications of human hepatocyte-like cells. World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, 1-9 (2017).
