Summary
Este manuscrito describe un protocolo detallado para la diferenciación de células madres embrionarias humanas (hESCs) en hepatocito-como las células funcionales (HLCs) complementando continuamente Activin A y CHIR99021 durante la diferenciación del hESC en el endodermo definitivo (DE).
Abstract
Las funciones potenciales de las células similares a hepatocitos (HLCs) derivadas de células madre embrionarias humanas (hESCs) son muy prometedoras para el modelado de enfermedades y las aplicaciones de detección de fármacos. Aquí se proporciona un método eficiente y reproducible para la diferenciación de hESCs en HLCs funcionales. El establecimiento de un linaje de endodermo es un paso clave en la diferenciación a hlcs. Por nuestro método, regulamos las vías de señalización clave mediante la suplementación continua de Activin A y CHIR99021 durante la diferenciación de hESC en endodermo definitivo (DE), seguido de la generación de células progenitoras hepáticas, y finalmente HLCs con morfología de hepatocitos típicos en un método stagewise con reactivos completamente definidos. Los HLCs derivados de hESC producidos por este método expresan marcadores específicos de la etapa (incluyendo albúmina, receptor nuclear HNF4α y polipéptido cotransportante de taurocolato de sodio (NTCP)), y muestran características especiales relacionadas con hepatocitos maduros y funcionales (incluyendo tinción verde de indocianina, almacenamiento de glucógeno, tinción de hematoxilina-eosina y actividad cyp3), y pueden proporcionar una plataforma para el desarrollo de aplicaciones basadas en HLC en el estudio de enfermedades hepáticas.
Introduction
El hígado es un órgano altamente metabólico que desempeña varias funciones, incluyendo la desoxidación, el almacenamiento de glucógeno, y la secreción y síntesis de proteínas1. Diversos patógenos, fármacos y herencia pueden causar cambios patológicos en el hígado y afectar sus funciones2,3. Los hepatocitos, como la unidad funcional principal del hígado, desempeñan un papel importante en sistemas artificiales de la ayuda del hígado y la eliminación de la toxicidad de la droga. Sin embargo, el recurso de hepatocitos humanos primarios es limitado en terapia basada en células, así como en la investigación de la enfermedad del higado. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas fuentes de hepatocitos humanos funcionales es una dirección de investigación importante en el campo de la medicina regenerativa. Desde 1998, cuando se han establecido las hESC4,las hESCs han sido ampliamente consideradas por los investigadores debido a su potencial de diferenciación superior (pueden diferenciarse en varios tejidos en un ambiente adecuado) y su alto grado de autorrerenovabilidad, y por lo tanto proporcionan células fuente ideales para hígados bioartificiales, trasplante de hepatocitos e incluso ingeniería de tejido hepático5.
Actualmente, la eficiencia de la diferenciación hepática puede incrementarse en gran medida enriqueciendo el endodermo6. En la diferenciación del linaje de las células madre en endodermo, los niveles del factor de crecimiento transformador β (TGF-β) señalización y WNT vías de señalización son los factores clave en el nodo de la etapa de formación de endodermo. La activación de un alto nivel de señalización de TGF-β y WNT puede promover el desarrollo de endodermo7,8. La activina A es una citoquina perteneciente a la superfamilia TGF-β. Por lo tanto, la activina A es ampliamente utilizada en la inducción de endodermo de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs) y hESCs9,10. GSK3 es una proteína quinasa de serina-treonina. Los investigadores han encontrado que CHIR99021, un inhibidor específico de GSK3β, puede estimular las señales típicas de WNT, y puede promover la diferenciación de células madre bajo ciertas condiciones, lo que sugiere que CHIR99021 tiene potencial para inducir la diferenciación de células madre en endodermo 11,12,13.
Aquí divulgamos un método eficiente y reproducible para inducir con eficacia la diferenciación de hESCs en HLCs funcionales. La adición secuencial de Activin A y CHIR99021 produjo cerca de 89,7±0,8% SOX17 (marcador de DE) - células positivas. Después de ser maduradas más a fondo in vitro,estas células expresaron marcadores específicos hepáticos y ejercieron hepatocito-como la morfología (basada en la coloración de la hematoxylin-eosina (H . E)) y las funciones, tales como absorción del verde del indocyanine (ICG), almacenamiento del glicógeno y actividad CYP3. Los resultados muestran que los hESCs se pueden distinguir con éxito en HLCs funcionales maduros por este método y pueden proporcionar una base para la investigación enfermedad-relacionada del higado y la investigación in vitro de la droga.
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Protocol
1. Mantenimiento de células madre
NOTA: El protocolo de mantenimiento celular descrito a continuación se aplica a la línea celular hES03 mantenida en una monocapa adherente. Para todos los siguientes protocolos en este manuscrito, las células deben manejarse bajo un gabinete de seguridad biológica.
- Prepare 1x mTesR stem cell culture medium diluyendo 5x supplementary medium to mTesR basic medium.
- Prepare 30x medio Matrigel calificado por hESC diluyendo 5 mL de Matrigel calificado para hESC con 5 mL de DMEM/F12 en el hielo. Conservar a -20 °C.
- Prepare 1x medio Matrigel calificado para hESC diluyendo 33.3 μL de Matrigel calificado para hESC de 30x con 1 mL de DMEM/F12.
- Recubre estériles 6 placas tratadas con cultivo de tejidos con 1 mL de Matrigel calificado para hESC en cada pozo con anticipación y guárdelo a 4 ° C durante la noche. Dejar a temperatura ambiente (RT) durante al menos 30 min antes de su uso.
- Descongelar los hESCs criopreservados en un baño de agua de 37 °C durante 3 min sin agitar. A continuación, transferir inmediatamente las células mediante pipeteo en un tubo de centrífuga de 15 mL que contiene 4 mL precalentados 37 °C mTesR medio, pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente 2 veces.
- Centrifugar los hESCs a 200 x g durante 2 min en RT.
- Aspirar el sobrenadante y resuspensar suavemente las células en 1 mL de medio mTesR.
- Aspirar el medio DMEM/F12 de la placa y sembrar las células en un pozo de placa de 6 pozos a una densidad de 1 x 105 células en 2 mL de mTesR.
- Incubar en una incubadora al 5% deCO2 y mantener las células reemplazando diariamente con medio mTesR precalentado. Pase las células en aproximadamente 70-80% de confluencia o cuando las colonias celulares comienzan a hacer contacto.
2. Paso y diferenciación de células madre
- Para las células de paso, aspirar el medio e incubar las células con 1 mL por pozo de solución enzimática (por ejemplo, Accutase durante 5 min a 37 °C. A continuación, transfiera las células mediante pipeteo a un tubo centrífugo de 15 mL que contenga 4 mL de DMEM/F12 precalentado a 37 °C.
- Centrifugar las células a 200 x g en RT durante 2 min.
- Aspirar el medio y resuspensar suavemente el pellet celular en 1 mL de medio mTesR.
- Prepare placas de 24 pozos recubriendo con 250 μL de 1x medio Matrigel calificado por hESC de antemano. Semillas hESCs como se describió anteriormente a una densidad de 1 - 1,5 x 105 células por pozo en 500 μL de medio mTesR.
- Deje que las células se incuban durante 24 h a 37 °C en una incubadora de CO2.
3. Formación de DE
- Preparar soluciones de stock de 100 μg/mL de Activina A con DPBS que contengan 0,2% de BSA y 3 mM de CHIR99021 con DMSO.
- Prepare el medio básico de diferenciación de la Etapa I complementando el medio RPMI con 1x B27.
- Añadir Activina A a una concentración final de 100 ng/mL y CHIR99021 a una concentración final de 3 μM en un volumen apropiado de medio básico de diferenciación en estadio I precalentado.
- Aspirar el medio mTesR de las células y reemplazarlo por medios de diferenciación en estadio I que contengan factores de diferenciación añadidos (por ejemplo, 0,5 mL por pozo de una placa de 24 pozos).
- Permita que las células se incuban durante 3 días a 37 °C en una incubadora de CO2, reemplazando diariamente los medios de estadio I con factores de diferenciación recién agregados (días 0-2).
NOTA: Después de 3 días de diferenciación, las células diferenciadas deben expresar marcadores de células DE, como FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 y FOXA1 (mínimo 80% de SOX17 necesario para continuar).
4. Diferenciación de las células progenitoras hepáticas
- Prepare los medios básicos de diferenciación de la etapa II disolviendo el reemplazo del suero del knockout (KOSR) a una concentración final del 20% en knock out DMEM.
- Prepare el medio de diferenciación de la etapa II que contenga el 1% DMSO, 1x GlutaMAX, 1x solución del aminoácido no esencial (NEAA), 100 μM 2-mercaptoetanol y 1x penicilina/estreptomicina (P/S) al volumen apropiado de KOSR/knockout DMEM.
- En el día 3 de diferenciación, aspire el medio y reemplácelo con el medio de etapa II (por ejemplo, 0,5 mL por pozo de una placa de 24 pozos). A continuación, incubar durante 24 h.
- En el día 4 de diferenciación, aspire el medio y reemplácelo con el medio de etapa II (por ejemplo, 1 mL por pozo de una placa de 24 pozos).
- Cambie el medio cada dos días (reemplace el medio el día 6).
NOTA: Después de 8 días de diferenciación, las células diferenciadas deben expresar marcadores apropiados de células progenitoras hepáticas, tales como HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA (mínimo 80% de HNF4α necesario para proceder).
5. Diferenciación de hepatocitos
- Preparar 10 μg/mL de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), 20 μg/mL de oncostatina (OSM) soluciones de stock con DBPS (que contiene 0,2% de BSA) y filtrar con una membrana de filtro de 0,22 μm.
- Preparar el medio básico de diferenciación en estadio III (medio Hepatozyme-SFM (HZM) suplementado con hidrocortisona-21-hemisuccinato de 10 μM y 1x P/S).
- Añadir HGF a una concentración final de 10 ng/mL y OSM a una concentración final de 20 ng/mL al volumen apropiado de medio de diferenciación precalentado en etapa III.
- En el día 8 de diferenciación, aspire el medio de etapa II de las células y reemplácelo con el medio de etapa III (por ejemplo, 1 mL por pozo de una placa de 24 pozos).
- Permita que las células se incuban durante 10 días a 37 °C en una incubadora de CO2, cambiando los medios de etapa III cada dos días con factores de diferenciación recién agregados (días 8-18).
NOTA: Después de 18 días de diferenciación, las células diferenciadas deben expresar marcadores característicos de hepatocitos, tales como AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4. El porcentaje de células albúmina-positivas es generalmente más el de 90%.
6. Aislamiento de ARN, síntesis de ADNc y análisis rt-qPCR
- Aspirar el medio de las células y añadir la cantidad adecuada de reactivo RNAiso Plus, (por ejemplo, 0,3 mL por pozo de una placa de 24 pozos). Recoger el sobrenadante en un tubo de 1,5 mL y dejar reposar en RT durante 5 min.
- Añadir 60 μL de reactivo de cloroformo y dejarlo en RT durante 5 min. Luego centrífuga a 12.000 x g durante 15 min.
- Recoja el sobrenadante de 125 μL y transfiéralo a otro tubo de centrífuga. Añadir 160 μL de isopropanol, mezclar bien, y reposar en RT durante 10 min.
- Centrífuga a 12.000 x g durante 10 min.
- Retire el sobrenadante, agregue etanol al 75% al precipitado y centrífuga a 7,500 x g durante 5 min.
- Después de secar en RT, añadir 40 μL de agua tratada con DEPC para disolverla. Para qPCR, transcriba inversamente 2 μg de ARN total con un kit de transcripción inversa de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Realice RT-qPCR utilizando un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Normalizar la expresión génica en relación con las células madre no inducidas y determinar la variación del pliegue después de la normalización a GAPDH.
7. Validación de inmunofluorescencia de la diferenciación
- Prepare 1x Tampón de lavado de PBST agregando 0.1% de Tween-20 a PBS.
- Aspirar el medio de las células adherentes y lavar brevemente con PBS en RT en una coctelera.
- Aspirar PBS e incubar células con 500 μL de metanol helado por pozo de una placa de 24 pozos para fijar las células a -20 °C durante la noche.
- Retire el metanol y lave las células 3 veces con PBS en una coctelera durante 10 min cada vez en RT.
- Células de bloque con 500 μL de BSA al 5% preparadas en PBS durante 1-2 h a RT en una coctelera.
- Diluir el anticuerpo primario a 1: 200 en la misma solución utilizada para el bloqueo.
- Incubar las células fijas en una solución de anticuerpos primarios de 300 μL durante la noche a 4 °C en una coctelera.
- Después de la incubación durante la noche, lave las células 3 veces con PBST durante 10 min cada vez en RT en una coctelera.
- Prepare la solución secundaria del anticuerpo en la solución de bloqueo en 1:1000.
- Incubar en 300 μL de solución de anticuerpos secundarios protegida de la luz durante 1 h a RT en una coctelera.
- Aspirar la solución de anticuerpos secundarios y lavar las células 3 veces con PBST durante 10 min cada vez en RT en una coctelera.
- Incubar las células con 300 μL de 1 μg/mL DAPI durante 3-5 min, y luego lavar dos veces con PBST.
- Después de aspirar PBST, agregue una cantidad adecuada de PBS para tomar fotografías bajo un microscopio de fluorescencia.
8. Análisis de Western blot
- Prepare 1x Tampón de lavado TBST agregando 0.1% Tween-20 a solución salina tamponada tris (TBS).
- Prepare el tampón de electroforesis SDS-PAGE y el tampón de transferencia occidental utilizando un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Resuelva la proteína total de la célula (40 μg) en un gel de la poliacrilamida del sulfato del dodecil del sodio del 10% y funcione en almacenador intermediario de la electroforesis de SDS-PAGE en la corriente constante de 15 mA por cerca de 2 h.
- Transfiera el gel a una membrana de difluoruro de polivinidideno (PVDF) a 300 mA de corriente constante durante 2 h a baja temperatura.
NOTA: El tiempo de ejecución y el tiempo de transferencia pueden variar dependiendo del equipo utilizado y del tipo y porcentaje del gel. - Bloquee la membrana con BSA al 3% preparado en TBST durante 1 h a RT en una coctelera.
- Incubar en solución de anticuerpos primarios (dilución 1:1000) durante la noche a 4 °C en una coctelera.
- Después de la incubación durante la noche, lave la membrana secante 3 veces con TBST durante 15 minutos por vez en RT en una coctelera.
- Incubar en solución de anticuerpos secundarios (dilución 1:2000) durante 2 h en RT en una coctelera.
- Deseche la solución de anticuerpos secundarios y lave la membrana 3 veces con TBST, durante 15 minutos cada vez, en RT en una coctelera.
- Visualice las vendas immunoreactive usando un reactivo de la quimioluminiscencia seguido por la autordiografía. Utilice β-actina como control de carga.
9. Absorción verde de indocyanine
- Preparar 200 mg/mL de solución verde de culata de indocianina en DMSO.
- Prepare una solución de trabajo complementando el medio de diferenciación de la etapa III con la solución verde de la indocyanina a una concentración final de 1 mg/mL.
- Incubar en una incubadora de 37 °C, 5% deCO2 durante 1-2 h.
- Aspirar el medio y lavar las células 3 veces con PBS.
- Fotografía bajo un microscopio.
10. Tinción periódica de Ácido-Schiff (PAS) y tinción de hematoxilina-eosina (H&E)
- Aspirar el medio de las células adherentes y lavar brevemente dos veces con PBS.
- Para la fijación celular, aspirar PBS e incubar células con metanol helado a -20 °C durante la noche.
- Visualice el almacenamiento de glucógeno por tinción PAS y observe las células binucleadas por tinción H + E utilizando un kit siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Tome imágenes con un microscopio de fluorescencia.
11. Ensayo para la actividad del CYP
- Mida la actividad del CYP450 utilizando ensayos basados en células disponibles en el comercio (ensayos P450-Glo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Utilice tres repeticiones independientes para las pruebas. Los datos se representan como la media ± DE.
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Representative Results
El diagrama esquemático de la inducción de HLC a partir de hESCs y las imágenes representativas de campo brillante de cada etapa de diferenciación se muestran en la Figura 1. En la etapa I, Activin A y CHIR99021 fueron agregados por 3 días para inducir a las células madres para formar las células del endodermo. En la etapa II, las células del endodermo diferenciadas en células progenitoras hepáticas después de ser tratadas con medio de diferenciación durante 5 días. En el estadio III, los hepatocitos tempranos habían madurado y diferenciado en HLCs después de 10 días en HGF y OSM(Figura 1A). En la etapa final de diferenciación, las células mostraron un fenotipo típico de hepatocitos (Las células son poligonales y distribuidas uniforme y regularmente) (Figura 1B).
Para confirmar aún más la diferenciación hepática, se utilizaron RT-qPCR, tinción de inmunofluorescencia y western blotting para detectar marcadores de células endodermo, células progenitoras hepáticas y hepatocitos maduros(Figura 2). Las células diferenciadas mostraron altos niveles de expresión de genes y proteínas relacionados con la diferenciación en cada etapa, como los marcadores de endodermo SOX17 (89,7± 0,8%) en el día 3, el marcador de progenitor hepático HNF4α (81,3±2,9%) en el día 8, AFP (86,6±0,3%) en el día 14, y el marcador de hepatocitos maduros ALB (94,5±1,1%) en el día 18. Estos resultados indican que hepatocito-como las células son generadas por este protocolo.
Para detectar si HLCs tiene funciones del hepatocito, detectamos la absorción de ICG, el almacenaje del glicógeno, y la actividad de CYP de HLCs, así como la coloración realizada de H&E. Como se puede observar en los HLCs se exhibió tinción verde(Figura 3A)y se observó una extensa tinción periódica citoplasmática de ácido-Schiff (rosa a púrpura)(Figura 3B),lo que es consistente con el almacenamiento de glucógeno. Además, podemos ver la morfología representativa de un hepatocito binucleado típico(Figura 3C). Finalmente, la actividad enzimática del CYP3A4, el CYP metabólico más importante en el hígado, fue confirmada por el ensayo de actividad enzimática(Figura 3D).
| Nombre del reactivo | Compañía | Número de catálogo | Concentración de existencias | Concentración Final |
| 2-Mercaptoetanol | Sigma | M7522 | 50 mM | 100 μM |
| 488 cabra etiquetada contra ratón IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | - | SI: 1:1000 |
| 488 cabra etiquetada contra Conejo IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | - | SI: 1:1000 |
| Accutase | Tecnologías de células madre | 7920 | 1 x | 1 x |
| Actividad A | peproTech | 120-14e | 100 μg/ml | 100 ng/ml |
| Anti - Albúmina (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | - | SI: 1:200; WB:1:1000 |
| Anti - Humano Oct4 | Abcam | Ab19587 | - | SI: 1:200 |
| Anti-α-fetoproteína (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | - | SI: 1:200; WB:1:1000 |
| Anti-SOX17 | Abcam | ab224637 | - | SI: 1:200 |
| Anti-Hepatocitos Nuclear Factor 4 alfa (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | - | SI: 1:200 |
| Suplemento B-27 | Gibco | 17504-044 | 50 x | 1 x |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | - | 5.00% |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | 3 mM | 3 μM |
| DAPI | Beyotime | C1006 | - | - |
| DEPC-agua | Beyotime | R0021 | - | - |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | 500 μM | 250 nM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | 1 x | 1 x |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | 1 x | 1 x |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | 1 x | 1 x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 x | 1 x |
| Kit de tinción H&E | Beyotime | C0105S | - | - |
| Factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) | peproTech | 100-39 | 10 μg/ml | 10 ng/ml |
| Hepatocigima-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | - | - |
| Hidrocortisona-21-hemisuccinato | Sigma-Aldrich | H4881 | 1 mM | 10 μM |
| Indocianina | Sangon Biotecnología | A606326 | 200 mg/mL | 1 mg/mL |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | 1 x | 1 x |
| Knock Out SR Multi-Especies | Gibco | A31815-02 | - | 20% |
| Matrigel hESC-calificado | Corning | 354277 | 60 x | 1 x |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | 100 x | 1 x |
| Suplemento mTesR 5X | Tecnologías de células madre | 85852 | 5 x | 1 x |
| Medio basal mTesR | Tecnologías de células madre | 85851 | 1 x | 1 x |
| Oncostatina (OSM) | peproTech | 300-10 | 20 μg/ml | 20 ng/ml |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega | V8901 | - | - |
| Kit de tinción PAS | Solarbio | G1281 | - | - |
| Pluma/Estreptococo | Gibco | 15140-122 | 100 x | 1 x |
| Cabra conjugada con peroxidasa anti-ratón IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | - | BM: 1:2000 |
| Tampón de dilución de anticuerpos primarios para Western Blot | Beyotime | P0256 | - | - |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | - | - |
| RNAiso Plus | Takara | 9109 | - | - |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | 1 x | 1 x |
| Leche desnatada | Sangon Biotecnología | A600669 | - | 5.00% |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Científico | A25742 | - | - |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | 15 μM | 15 nM |
| Interpolación | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | - | 0.10% |
Tabla 1: Componentes del cultivo celular y medios base de diferenciación.
| Nombre del gen | Abreviaturas | secuencias de cebadores(F) | secuencias de cebadores (R) |
| POU Clase 5 Homeobox 1 | OCT4 | AGCGAACCAG TATCGAGAAC |
TTACAGAACC ACACTCGGAC |
| Caja de la cabeza de horquilla A2 | FOXA2 | GCATTCCCAATC TTGACACGGTGA |
GCCCTTGCAGC CAGAATACACATT |
| Factor de transcripción de la caja SRY 17 | SOX17 | TATTTTGTCTGC CACTTGAACAGT |
TTGGGACACAT TCAAAGCTAGTTA |
| Receptor de clase frizzled 8 | FZD8 | ATCGGCTACAA CTACACCTACA |
GTACATGCTGC ACAGGAAGAA |
| C-X-C Motif Chemokine Receptor 4 | CXCR4 | CACCGCATCT GGAGAACCA |
GCCCATTTCCT CGGTGTAGTT |
| Caja de la cabeza de horquilla A1 | FOXA1 | AAGGCATACGA ACAGGCACTG |
TACACACCTTG GTAGTACGCC |
| Msh Homeobox 1 | MSX1 | CGCCAAGGCA AAGAGACTAC |
GCCATCTTCAG CTTCTCCAG |
| Mesogenina 1 | MSGN1 | GCTGGAATCCTA TTCTTCTTCTCC |
TGGAAAGCTAACA TATTGTAGTCCAC |
| Homeobox tipo caudal 1 | CDX1 | AAGGAGTTTCAT TACAGCCGTTAC |
TGCTGTTTCTTCT TGTTCACTTTG |
| Homeobox 1 incluso omitido | EVX1 | GCTGTCTCTCTG AACAAAATGCT |
CATCTCACTCT CTCCTCCAAA |
| Mesodermo posterior BHLH Factor de transcripción 2 | MESP2 | AGCTTGGGTG CCTCCTTATT |
TGCTTCCCTGAA AGACATCA |
| NK2 Homeobox 5 | NKX2.5 | CAAGTGTGCG TCTGCCTTT |
CAGCTCTTTCTT TTCGGCTCTA |
| ISL LIM Homeobox 1 | ISL1 | AGATTATATCAGGT TGTACGGGATCA |
ACACAGCGGA AACACTCGAT |
| Hepatocito Factor Nuclear 4 Alfa | HNF4α | ACATGGACATG GCCGACTAC |
CGTTGAGGTTG GTGCCTTCT |
| Alfa fetoproteína | AFP | ACTGAATCCAG AACACTGCA |
TGCAGTCAATG CATCTTTCA |
| Factor de transcripción T-Box 3 | TBX3 | TTATGTCCCAG CGAGGGTGA |
ACGTGGTGGTG GAGATCTTG |
| Transtiretina | TTR | AGAAAGGCTG CTGATGAC |
GTGCCTTCCA GTAAGATTTG |
| Albúmina | ALBA | CCCCAAGTGT CAACTCCA |
GTTCAGGACCA CGGATAG |
| Polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio | NTCP | CATAGGGATCGT CCTCAAATCCA |
GCCACACTGCAC AAGAGAATG |
| CCAAT Enhancer Unión a la proteína alfa | CEBPA | AGGAGGATGAA GCCAAGCAGCT |
AGTGCGCGATC TGGAACTGCAG |
| Serpin Familia A Miembro 1 | AAT | AAATGAACTCA CCCACGAT |
ACCTTAGTGATG CCCAGT |
| Receptor de Asialoglycoprotein 1 | ASGR1 | CAGACCCTGAGA CCCTGAGCAA |
TCCTGCAGCTGG GAGTCTTTTCT |
| Citocromo P450 Familia 3 Subfamilia A Miembro 4 | CYP3A4 | TTGTAATCACTG TTGGCGTGGG |
AATGGGCAAAGT CACAGTGGA |
Tabla 2: Secuencias de cebadores para el análisis q-PCR.
Figura 1:Diagrama esquemático del protocolo para la especificación de DE y HLCs. (A)Presentación esquemática de la estrategia de diferenciación de 3 etapas utilizada en este estudio. (B)Morfología de las células diferenciadas en los días 0, 3, 8, 14 y 18. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:Expresión de marcadores específicos dela etapa durante la diferenciación de hESC en HLCs. (A)Expresión de ARNm de genes específicos de la etapa. b)a c) Expresión proteica de genes específicos de la etapa. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3:Las funciones de los HLCs derivados de hESC. (A)los HLCs tratados durante 1 h con 1 mg/mL de verde indocianina demuestran la absorción según lo evaluado por microscopía de fase. (B)Imágenes representativas de tinción pas que indican almacenamiento de glucógeno. (C)Imágenes representativas de tinción de HE que muestran células binucleados. (D)Actividad de nivel basal de las principales enzimas del citocromo P450. Todos los valores se presentan como media ± SD. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, presentamos un método gradual que induce HLCs de hESCs en tres etapas. En la primera etapa, Activin A y CHIR99021 se utilizaron para diferenciar hESCs en DE. En la segunda etapa, KO-DMEM y DMSO fueron utilizados para distinguir DE en las células hepáticas del progenitor. En la tercera etapa, HZM más HGF, OSM y la sal de sodio del hemisuccinate 21 de la hidrocortisona fueron utilizados para continuar diferenciando las células hepáticas del progenitor en HLCs.
Los siguientes pasos críticos deben tenerse en cuenta al utilizar el protocolo. La densidad de diferenciación inicial de las células y el momento preciso de los cambios en el medio son factores importantes para una diferenciación exitosa. Cuando empezamos a diferenciar, debemos asegurarnos de que la densidad de siembra inicial sea apropiada, con una confluencia de aproximadamente el 30-40%, cuando las células apenas están comenzando a entrar en contacto entre sí, y que los espacios intercelulares estén dispuestos uniformemente en una red bajo el campo de visión. Durante la diferenciación, el medio de diferenciación correspondiente debe cambiarse con precisión en el momento indicado, especialmente en la primera etapa y el momento clave de cada etapa de reemplazo, para asegurar que las células se diferencien en el modo y la etapa imitando el proceso de desarrollo embrionario.
La primera etapa de la diferenciación de hESCs en DE es particularmente importante. Por lo general, hay un gran número de células que se desprenden y flotan durante la etapa I de diferenciación, que es una etapa crítica para el destino de la célula, pero en este momento las células todavía conservan la capacidad de proliferar. Por lo tanto, la confluencia de células puede alcanzar aproximadamente el 90-100% al final de la Etapa I. Además, cabe señalar que al comienzo de la etapa III de diferenciación (es decir, día 8), el citoplasma de las células comienza a condensarse, lo que resulta en que las células adquieran gradualmente una morfología delgada. Sin embargo, en el día 10, el citoplasma se recupera gradualmente, y en el día 14, las células comienzan a mostrar la morfología poliédrica obvia de los hepatocitos.
En este estudio, los HLCs obtenidos están realmente más cercanos a los hepatocitos fetales pues AFP es más alto expresado que ALB en el día 18. Aunque los HLCs generados ejerzan características y funciones del hepatocito, todavía hay un boquete entre HLCs y los hepatocitos humanos primarios, indicando que nuestras células distinguidas todavía no son funcionalmente maduras. Por lo tanto, la labor futura tendrá que centrarse en seguir optimizando el método de diferenciación.
En la actualidad, los factores de crecimiento y pequeños compuestos moleculares como la Activina A9,10,14,Wnt3a15,CHIR16,Torin217 e IDE118,19 se utilizan comúnmente para inducir la diferenciación de DE en varios sistemas de diferenciación. El grupo Song utilizó Activin A para diferenciar las células madre en DE, y utilizó FGF4 (Factor de crecimiento de fibroblastos 4), BMP2 (proteína morfogenética ósea 2), HGF, KGF (factor de crecimiento de queratinocitos), OSM y Dex para la especificación hepática y la maduración de hlcs20. El grupo de Sullivan indujo DE por Activin A y Wnt 3a, e indujo HLCs por β-ME (2-mercaptoetanol), DMSO, insulina, HGF, OSM21. El equipo de Siller utilizó CHIR99021 para la diferenciación de DE, DMSO, Dihexa (agonista del receptor del factor de crecimiento hepatocito N-hexanoico-Tyr), y Dex para la diferenciación de HLC para obtener HLC con características de función hepática16. Sin embargo, algunos de estos métodos utilizan muchos factores de crecimiento recombinantes para generar DE con alto costo y algunos de ellos utilizan sólo moléculas pequeñas para generar DE con menor eficiencia. La activina A es un factor crítico para la generación de DE. Hemos intentado sustituir la Activina A por otras moléculas pequeñas pero normalmente conseguimos una menor eficiencia. Por lo tanto, adoptamos el método de adición de Activina A y CHIR99021 como factores inductores de DE, y detectamos genes relacionados con la diferenciación en cada etapa por q-PCR, inmunofluorescencia y western blotting.
En los últimos años, el establecimiento de un sistema experimental para la inducción dirigida de HLC a partir de hESCs es una base importante para el modelado del desarrollo de hepatocitos y la detección de fármacos para enfermedades relacionadas con el hígado. Al mismo tiempo, también puede proporcionar una fuente eficaz de células para el trasplante de hepatocitos, ingeniería de tejido hepático, hígados bioartificiales y otras investigaciones. Se ha informado de que los LHC derivados de células madre se han utilizado para realizar diversos estudios sobre la infección viral como modelo de detección de fármacos para predecir las respuestas inducidas por fármacos hepatotóxicos y para estudiar la vía inmune innata y las vías de señalización de las células10,22,23,24,25. Generalmente, este método introduce detalladamente un hepatocito-como eficiente técnica de la diferenciación de célula de los hESCs que pueden distinguir con éxito los hESCs en hepatocitos funcionales maduros. Los resultados proporcionan una plataforma para el desarrollo de aplicaciones basadas en HLC.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta labor contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81870432 y 81570567 a X.L.Z.), (Nº 81571994 a P.N.S.); the Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (No. 2020A1515010054 to P.N.S.), The Li Ka Shing Shantou University Foundation (No. L1111 2008 a P.N.S.). Nos gustaría agradecer al Prof. Stanley Lin de la Facultad de Medicina de la Universidad de Shantou por sus útiles consejos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti - Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti - Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti - α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
References
- Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
- Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19. Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).
- Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B.
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Li, Z., et al. Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Cell Death & Disease. 10, 763 (2019).
- Rassouli, H., et al. Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems. Cell Journal. 21, 290-299 (2019).
- Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Mukherjee, S., et al. Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network. Elife. 9, (2020).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).
- Gomez, G. A., et al. Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation. Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).
- Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells. Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).
- Matsuno, K., et al. Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells. Differentiation. 92, 281-290 (2016).
- Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).
- Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).
- Yu, J. S., et al. PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation. Nature Communications. 6, 7212 (2015).
- Borowiak, M., et al. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).
- Tahamtani, Y., et al. Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm. Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).
- Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 329-335 (2010).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Li, S., et al. Derivation and applications of human hepatocyte-like cells. World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, 1-9 (2017).
