Summary
Dette manuskript beskriver en detaljeret protokol for differentiering af humane embryonale stamceller (hESC'er) til funktionelle hepatocytlignende celler (HLC' er) ved løbende at supplere Activin A og CHIR99021 under hESC-differentiering til endelig endoderm (DE).
Abstract
De potentielle funktioner i hepatocytlignende celler (HLC'er) fra menneskelige embryonale stamceller (HESC'er) rummer store løfter om sygdomsmodellering og lægemiddelscreeningsapplikationer. Forudsat her er en effektiv og reproducerbar metode til differentiering af HESCs i funktionelle HLCs. Etableringen af en endoderm afstamning er et vigtigt skridt i differentieringen til HLCs. Ved vores metode regulerer vi de vigtigste signalveje ved løbende at supplere Activin A og CHIR99021 under hESC-differentiering til endelig endoderm (DE), efterfulgt af generering af lever stamceller og endelig HLCs med typisk hepatocytmorfologi i en trinvis metode med helt definerede reagenser. De hESC-afledte NPC'er, der produceres ved denne metode, udtrykker scenespecifikke markører (herunder albumin, HNF4α nuclear receptor og natrium taurocholat cotransporterende polypeptid (NTCP)) og udviser særlige egenskaber i forbindelse med modne og funktionelle hepatocytter (herunder indokyaningrøn farvning, glykogenlagring, hæmatoboxyl-eosin farvning og CYP3-aktivitet) og kan udgøre en platform for udvikling af HLC-baserede anvendelser i undersøgelsen af leversygdomme.
Introduction
Leveren er et meget metabolisk organ, der spiller flere roller, herunder deoxidation, opbevaring af glykogen og sekretion og syntese af proteiner1. Forskellige patogener, stoffer og arvelighed kan forårsage patologiske ændringer i leveren og påvirke dens funktioner2,3. Hepatocytter, som den vigtigste funktionelle enhed i leveren, spiller en vigtig rolle i kunstig leverstøtte systemer og narkotika toksicitet elimination. Men, ressourcen af primære menneskelige hepatocytter er begrænset i celle-baseret behandling, samt i leversygdom forskning. Derfor er udvikling af nye kilder til funktionelle menneskelige hepatocytter en vigtig forskningsretning inden for regenerativ medicin. Siden 1998, hvor hESC'er er blevet etableret4, hESC'er er blevet bredt overvejet af forskere på grund af deres overlegne differentieringspotentiale (de kan differentiere sig til forskellige væv i et passende miljø) og høj grad af selvfornyelse og dermed give ideelle kildeceller til bioartificial lever, hepatocyttransplantation og endda levervævsteknik5.
I øjeblikket kan den hepatisk differentieringseffektivitet øges betydeligt ved at berige endoderm6. I differentieringsdifferentiering af stamceller til endoderm er niveauer af den transformerende vækstfaktor β (TGF-β) signalering og WNT-signalveje de vigtigste faktorer i lyden i endodermdannelsesfasen. Aktivering af et højt niveau af TGF-β og WNT signalering kan fremme udviklingen af endoderm7,8. Activin A er en cytokin, der tilhører TGF-β superfamilien. Derfor anvendes Activin A i vid udstrækning til endoderminduktion af menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC'er) og HESC'er9,10. GSK3 er en serine-threonine protein kinase. Forskere har konstateret, at CHIR99021, en specifik hæmmer af GSK3β, kan stimulere typiske WNT-signaler og kan fremme stamcelledifferentiering under visse betingelser, hvilket tyder på, at CHIR99021 har potentiale til at inducere stamcelledifferentiering i endoderm 11,12,13.
Her rapporterer vi om en effektiv og reproducerbar metode til effektivt at reducere differentieringen af HESC'er til funktionelle HLC'er. Den sekventielle tilføjelse af Activin A og CHIR99021 producerede omkring 89,7±0,8% SOX17 (DE-markør)-positive celler. Efter at være blevet yderligere modnet in vitro, udtrykte disse celler leverspecifikke markører og udøvede hepatocytlignende morfologi (baseret på hematoxylin-eosin farvning (H &E)) og funktioner, såsom optagelse af indocyaningrøn (ICG), glykogenlagring og CYP3-aktivitet. Resultaterne viser, at HESC'er med succes kan differentieres til modne funktionelle HLC'er ved denne metode og kan danne grundlag for leversygdomsrelateret forskning og in vitro-lægemiddelscreening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vedligeholdelse af stamceller
BEMÆRK: Den cellevedligeholdelsesprotokol, der er beskrevet nedenfor, gælder for hES03-cellelinjen, der vedligeholdes i et klæbende monolag. For alle følgende protokoller i dette manuskript skal celler håndteres under et biologisk sikkerhedsskab.
- Forbered 1x mTesR stamcellekultur medium ved at fortynde 5x supplerende medium til mTesR grundlæggende medium.
- Forbered 30x hESC-kvalificeret Matrigel medium ved at fortynde 5 mL hESC-kvalificeret Matrigel med 5 mL DMEM/F12 på isen. Opbevares ved -20 °C.
- 1x hESC-kvalificeret Matrigel-medium fremstilles ved at fortynde 33,3 μL af 30x hESC-kvalificeret Matrigel med 1 mL DMEM/F12.
- Coat sterile 6 brønd, vævskulturbehandlede plader med 1 mL 1x hESC-kvalificeret Matrigel i hver i god tid og opbevares ved 4 °C natten over. Lad det stå ved stuetemperatur (RT) i mindst 30 minutter før brug.
- Cryopreserved hESC'erne optøs i et 37 °C vandbad i 3 minutter uden at ryste. Derefter overføres cellerne straks ved at pipette til et 15 mL centrifugerør, der indeholder 4 mL forvarmet 37 °C mTesR medium, pipet op og ned forsigtigt 2 gange.
- Centrifuge hESC'erne ved 200 x g i 2 min. ved RT.
- Aspirere supernatant og forsigtigt genbruge cellerne i 1 mL mTesR medium.
- Aspirere DMEM/F12 medium fra pladen og frø cellerne i en brønd på 6-brønds plade ved en tæthed på 1 x 105 celler i 2 mL mTesR.
- Inkuber i en 5% CO2 inkubator og vedligeholde cellerne ved at erstatte med forvarmet mTesR medium dagligt. Passage cellerne på omkring 70-80% sammenløb, eller når cellen kolonier begynder at komme i kontakt.
2. Stamcellepassage og differentiering
- For passaging celler, aspirere mediet og inkubere cellerne med 1 ml pr. brønd af enzymopløsning (f.eks. Accutase i 5 min ved 37 °C. Derefter overføres cellerne ved pipettering til et 15 mL centrifugerør, der indeholder 4 mL DMEM/F12, forvarmet til 37 °C.
- Centrifuge cellerne ved 200 x g ved RT i 2 min.
- Aspirere mediet og forsigtigt genbruge celle pellet i 1 mL mTesR medium.
- Forbered 24-brønds plader ved belægning med 250 μL 1x hESC-kvalificeret Matrigel medium på forhånd. Frø hESC'er som beskrevet ovenfor ved en tæthed på 1 - 1,5 x 105 celler pr. brønd i 500 μL mTesR-medium.
- Lad cellerne inkubere i 24 timer ved 37 °C i en CO 2-inkubator.
3. DE-dannelse
- Forbered stamløsninger på 100 μg/mL Activin A med DPBS indeholdende 0,2% BSA og 3 mM CHIR99021 med DMSO.
- Forbered Stage I differentiering grundlæggende medium ved at supplere RPMI medium med 1x B27.
- Activin A til en endelig koncentration på 100 ng/mL og CHIR99021 til en endelig koncentration på 3 μM i et passende volumen af forvarmet fase I differentieringsgrundmedium.
- Aspirat mTesR-medium fra cellerne og erstatte med fase I differentieringsmedier, der indeholder ekstra differentieringsfaktorer (f.eks. 0,5 mL pr. brønd af en 24-brønds plade).
- Lad cellerne inkubere i 3 dage ved 37 °C i en CO 2-inkubator og dagligt erstatte fase I-medier med frisktilsatte differentieringsfaktorer (Dag 0-2).
BEMÆRK: Efter 3 dages differentiering skal differentierede celler udtrykke markører for DE-celler, såsom FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 og FOXA1 (mindst 80% af SOX17, der er nødvendige for at fortsætte).
4. Differentiering af lever stamceller
- Forbered Stage II differentiering grundlæggende medier ved at opløse knockout serum udskiftning (KOSR) til en endelig koncentration på 20% i Knock Out DMEM.
- Forbered fase II differentieringsmedium indeholdende 1% DMSO, 1x GlutaMAX, 1x ikke-essentiel aminosyre (NEAA) opløsning, 100 μM 2-mercaptoethanol og 1x penicillin/streptomycin (P/S) til det relevante volumen af KOSR/knockout DMEM.
- På dag 3 af differentiering, aspirere mediet og erstatte med Stage II medium (f.eks 0,5 mL per brønd af en 24 godt plade). Derefter inkuberes i 24 timer.
- På dag 4 af differentiering, aspirere mediet og erstatte med Stage II medium (f.eks 1 mL per brønd af en 24 godt plade).
- Skift mediet hver anden dag (erstat medie på dag 6).
BEMÆRK: Efter 8 dages differentiering bør differentierede celler udtrykke passende markører for lever stamceller, såsom HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA (mindst 80% af HNF4α er nødvendige for at fortsætte).
5. Hepatocyt differentiering
- Der fremstilles 10 μg/mL hepatocytvækstfaktor (HGF), 20 μg/mL Oncostatin (OSM) med DBPS (indeholdende 0,2% BSA) og filtreres med en 0,22 μm filtermembran.
- Forbered fase III differentieringsgrundmedium (HepatoZYME-SFM (HZM) medium suppleret med 10 μM hydrocortison-21-hemisuccinat og 1x P/S).
- HGF til en endelig koncentration på 10 ng/mL og OSM til en endelig koncentration på 20 ng/mL til den relevante mængde forvarmet fase III differentieringsmedium.
- På dag 8 af differentiering, aspirat Stage II medium fra celler og erstatte med Stage III medium (f.eks 1 mL per brønd af en 24 godt plade).
- Lad cellerne inkubere i 10 dage ved 37 °C i en CO 2-inkubator, hvilket ændrer stage III-medier hver anden dag med frisk tilsatte differentieringsfaktorer (Dag 8-18).
BEMÆRK: Efter 18 dages differentiering skal differentierede celler udtrykke karakteristiske markører for hepatocytter, såsom AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Procentdelen af Albumin-positive celler er normalt mere end 90%.
6. RNA-isolation, cDNA-syntese og RT-qPCR-analyse
- Aspirat medium fra celler og tilsæt den korrekte mængde RNAiso Plus reagens(f.eks. 0,3 mL pr. brønd af en 24-brønds plade). Opsamle supernatant i en 1,5 mL rør og lad stå på RT i 5 min.
- Der tilsættes 60 μL chloroformreagens, og det efterlades på RT i 5 min. Derefter centrifuge ved 12.000 x g i 15 min.
- 125 μL supernatanten opsamles, og det overføres til et andet centrifugerør. Der tilsættes 160 μL isopropanol, blandes godt og stå ved RT i 10 min.
- Centrifuge ved 12.000 x g i 10 min.
- Fjern supernatanten, tilsæt 75% ethanol til den udfældede, og centrifuge ved 7.500 x g i 5 min.
- Efter tørring ved RT tilsættes 40 μL DEPC-behandlet vand for at opløse det. For qPCR skal der omvendte transskriberes 2 μg samlet RNA med et omvendt transskriberingssæt i henhold til producentens protokol.
- Udfør RT-qPCR ved hjælp af et kommercielt sæt i henhold til producentens protokol.
- Normalisere genekspression i forhold til ikke-inducerede stamceller og bestemme fold variation efter normalisering til GAPDH.
7. Immunfluorescensvalidering af differentiering
- Forbered 1x PBST vaskebuffer ved at tilføje 0,1% Tween-20 til PBS.
- Aspirat medium fra vedhængende celler og vask kort med PBS på RT på en shaker.
- Aspirat PBS og inkuber celler med 500 μL iskold methanol pr. brønd af en 24-brønds plade til at fastgøre cellerne ved -20 °C natten over.
- Fjern methanol og vask cellerne 3 gange med PBS på en shaker i 10 min hver gang på RT.
- Blokceller med 500 μL på 5% BSA tilberedt i PBS i 1-2 timer ved RT på en shaker.
- Primær antistof fortyndes ved 1: 200 i samme opløsning, som anvendes til blokering.
- De faste celler inkuberes i 300 μL primær antistofopløsning natten over ved 4 °C på en shaker.
- Efter natten inkubation, vaske celler 3 gange med PBST i 10 min hver gang på RT på en shaker.
- Forbered sekundær antistofopløsning i blokeringsopløsning kl. 1:1000.
- Inkuber i 300 μL sekundær antistofopløsning beskyttet mod lys i 1 time ved RT på en shaker.
- Aspirat sekundær antistofopløsning og vask celler 3 gange med PBST i 10 minutter hver gang på RT på en shaker.
- Inkuber celler med 300 μL på 1 μg/mL DAPI i 3-5 min, og vask derefter to gange med PBST.
- Efter indsugning af PBST tilsættes en passende mængde PBS til at tage billeder under et fluorescensmikroskop.
8. Analyse af vestlige skamplet
- Forbered 1x TBST vaskebuffer ved at tilføje 0,1% Tween-20 til Tris-buffered saltvand (TBS).
- Forbered SDS-PAGE elektroforesebuffer og vestlig overførselsbuffer ved hjælp af et kommercielt sæt i henhold til producentens protokol.
- Det samlede celleprotein (40 μg) på en 10% natriumdodecylesulfatpolyacrylamidgel, og der køres i SDS-PAGE elektroforesebuffer ved 15 mA konstant strøm i ca. 2 timer.
- Gelen overføres til en polyvinyliden difluoridmembran (PVDF) ved 300 mA konstant strøm i 2 timer ved lav temperatur.
BEMÆRK: Køretiden og overførselstiden kan variere afhængigt af det anvendte udstyr og gelens type og procentdel. - Bloker membranen med 3% BSA tilberedt i TBST i 1 time ved RT på en shaker.
- Inkuberes i primær antistofopløsning (1:1000 fortynding) natten over ved 4 °C på en shaker.
- Efter natten inkubation, vask blotting membran 3 gange med TBST i 15 min per gang på RT på en shaker.
- Inkuberes i sekundær antistofopløsning (1:2000 fortynding) i 2 timer ved RT på en shaker.
- Kassér sekundær antistofopløsning, og vask membranen 3 gange med TBST i 15 minutter hver gang ved RT på en shaker.
- Visualiser immunoreaktive bånd ved hjælp af et chemiluminescensreagensreagens efterfulgt af autoradiografi. Brug β-actin som lastekontrol.
9. Indokyanin grøn optagelse
- Forbered 200 mg/mL indokyanin grøn stamopløsning i DMSO.
- Forbered en arbejdsopløsning ved at supplere fase III differentieringsmedium med indokyaningrøn opløsning til en endelig koncentration på 1 mg/mL.
- Inkuber i en 37 °C, 5% CO2 inkubator til 1-2 timer.
- Aspirat medium og vask cellerne 3 gange med PBS.
- Fotografi under et mikroskop.
10. Periodisk syre-Schiff (PAS) farvning og Hematoxylin-Eosin (H &E) farvning
- Aspirat medium fra vedhængende celler og kort vaske to gange med PBS.
- Til cellefiksering aspirat PBS og inkuber celler med iskold methanol ved -20 °C natten over.
- Glykogenopbevaring ved hjælp af PAS-farvning, og overhold binucleerede celler ved H &E-farvning ved hjælp af et sæt, der følger producentens anvisninger.
- Tag billeder med et fluorescensmikroskop.
11. Analyse af CYP-aktivitet
- Mål CYP450-aktivitet ved hjælp af kommercielt tilgængelige cellebaserede assays (P450-Glo Assays) i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Brug tre uafhængige gentagelser til test. Data repræsenteres som middelværdi ± SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det skematiske diagram over HLC-induktion fra HESC'er og repræsentative lysfeltsbilleder af hvert differentieringsstadium er vist i figur 1. I fase I blev Activin A og CHIR99021 tilføjet i 3 dage for at få stamceller til at danne endodermceller. I fase II differentierede endodermcellerne sig til lever stamceller efter at være blevet behandlet med differentieringsmedium i 5 dage. I fase III var tidlige hepatocytter modnet og differentieret til HLC'er efter 10 dage i HGF og OSM (Figur 1A). I den sidste fase af differentieringen viste cellerne en typisk hepatocyt fænotype (Cellerne er polygon og fordelt jævnt og regelmæssigt)(Figur 1B).
For yderligere at bekræfte hepatisk differentiering blev RT-qPCR, immunfluorescensfarvning og vestlig blotting brugt til at detektere markører for endodermceller, lever stamceller og modne hepatocytter (Figur 2). De differentierede celler viste høje ekspressionsniveauer af differentieringsrelaterede gener og proteiner i hvert trin, såsom endodermmarkører SOX17 (89,7± 0,8%) på dag 3, hepatisk stamfadermarkør HNF4α (81,3±2,9%) på dag 8, AFP (86,6±0,3%) på dag 14 og moden hepatocytmarkør ALB (94,5±1,1%) på dag 18. Disse resultater viser, at hepatocytlignende celler genereres af denne protokol.
For at opdage, om HLC'er har hepatocytfunktioner, opdagede vi ICG-optagelse, glykogenlagring og CYP-aktivitet af HLC'er samt udført H &E-farvning. Som det kan ses, blev HLC'erne udstillet grøn farvning (Figur 3A) og omfattende cytoplasmisk periodisk syre-Schiff farvning (pink til lilla) (Figur 3B), hvilket er i overensstemmelse med glykogenopbevaring. Derudover kan vi se den repræsentative morfologi af en typisk binucleated hepatocyt(Figur 3C). Endelig blev CYP3A4's enzymatiske aktivitet, den vigtigste metaboliske CYP i leveren, bekræftet af enzymatisk aktivitetsanalyse (Figur 3D).
| Navn på reagens | Firma | Katalognummer | Koncentration af bestanden | Endelig koncentration |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | 50 mM | 100 μM |
| 488 mærket ged mod mus IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | - | HVIS: 1:1000 |
| 488 mærket ged mod kanin IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | - | HVIS: 1:1000 |
| Accutase | Stamcelleteknologier | 7920 | 1 x | 1 x |
| Aktiviteter A | PeproTech | 120-14E | 100 μg/ml | 100 ng/ml |
| Anti - Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | - | HVIS: 1:200; WB:1:1000 |
| Anti - Menneskelige Oct4 | Abcam | Ab 19587 | - | HVIS: 1:200 |
| Anti - α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | - | HVIS: 1:200; WB:1:1000 |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | - | HVIS: 1:200 |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | - | HVIS: 1:200 |
| B-27 Tillæg | Gibco | 17504-044 | 50 x | 1 x |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | - | 5.00% |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | 3 mM | 3 μM |
| DAPI | Beyotime | C1006 | - | - |
| DEPC-vand | Beyotime | R0021 | - | - |
| 3189 DM | MCE | HY-12071 | 500 μM | 250 nM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | 1 x | 1 x |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | 1 x | 1 x |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | 1 x | 1 x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 x | 1 x |
| H&E farvning kit | Beyotime | C0105S | - | - |
| Hepatocyt vækstfaktor (HGF) | PeproTech | 100-39 | 10 μg/ml | 10 ng/ml |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | - | - |
| Hydrocortison-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | 1 mM | 10 μM |
| Indokyanin | Sangon Biotech | A606326 | 200 mg/mL | 1 mg/mL |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | 1 x | 1 x |
| Knock Out SR Multi-Art | Gibco | A3-1815/02 | - | 20% |
| Matrigel hESC-kvalificeret | Corning | 354277 | 60 x | 1 x |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | 100 x | 1 x |
| mTesR 5X Tillæg | Stamcelleteknologier | 85852 | 5 x | 1 x |
| mTesR Basal-mellem | Stamcelleteknologier | 85851 | 1 x | 1 x |
| Oncostatin (OSM) | PeproTech | 300-10 | 20 μg/ml | 20 ng/ml |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega | V8901 | - | - |
| PAS farvning kit | Solarbio | G1281 | - | - |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | 100 x | 1 x |
| Peroxidase-konjugeret ged anti-mus IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | - | WB: 1:2000 |
| Primær antistoffortyndingsbuffer til vestlig blot | Beyotime | P0256 | - | - |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | - | - |
| RNAiso Plus | Takara | 9109 | - | - |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | 1 x | 1 x |
| Skummetmælk | Sangon Biotech | A600669 | - | 5.00% |
| SYBR Grøn Master Mix | Thermo Fisher Videnskabelig | A25742 | - | - |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | 15 μM | 15 nM |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | - | 0.10% |
Tabel 1: Komponenter i cellekultur og differentieringsbasismedier.
| Genets navn | Forkortelser | primere sekvenser(F) | primere sekvenser (R) |
| POU Klasse 5 Homeobox 1 | OKT4 | AGCGAACCAG TATCGAGAAC |
TTACAGAACC ACACTCGGAC |
| Gaffeltrøje Boks A2 | FOXA2 | GCATTCCCAATC TTGACACGGTGA |
GCCCTTGCAGC CAGAATACACATT |
| SRY-Box Transskriberingsfaktor 17 | SOX17 | TATTTTGTCTGC CACTTGAACAGT |
TTGGGACACAT TCAAAGCTAGTTA |
| Frisprængt klasse receptor 8 | FZD8 | ATCGGCTACAA CTACACCTACA |
GTACATGCTGC ACAGGAAGAA |
| CX-C Motiv Kemokin Receptor 4 | CXCR4 | CACCGCATCT GGAGAACCA |
GCCCATTTCCT CGGTGTAGTT |
| Gaffeltrøje Boks A1 | FOXA1 | AAGGCATACGA ACAGGCACTG |
TACACACCTTG GTAGTACGCC |
| Msh Homeobox 1 | MSX1 | CGCCAAGGCA AAGAGACTAC |
GCCATCTTCAG CTTCTCCAG |
| Mesogenin 1 | MSGN1 | GCTGGAATCCTA TTCTTCTTTCC |
TGGAAAGCTAACA TATTGTAGTCCAC |
| Startboks til kaudale typer 1 | CDX1 | AAGGAGTTTCAT TACAGCCGTTAC |
TGCTGTTT CTT TGTTCACTTTG |
| Homeobox 1, der er sprunget over | EVX1 | GCTGTCTCTG AACAAAATGCT |
CATCTCTCACTCT CTCCTCCAAA |
| Mesoderm Posterior BHLH Transskription Factor 2 | 1982 1982 | AGCTTGGGTG FTTKT.1111 |
TGCTTCCCTGAA AGACATCA |
| NK2 Homeobox 5 | NKX2.5 | CAAGTGTGCG TCTGCCTTT |
CAGCTCTTTCTTT TTCGGCTCTA |
| ISL LIM Homeobox 1 | ISL1 | AGATTATATCAGGT TGTACGGGATCA |
ACACAGCGGA AACACTCGAT |
| Hepatocyte Nuclear Factor 4 Alpha | HNF4α | ACATGGACATG GCCGACTAC |
CGTTGAGGTTG GTGCCTTCT |
| Alpha Fetoprotein | AFP | ACTGAATCCAG AACACTGCA |
TGCAGTCAATG CATCTTTCA |
| T-Box Transskriberingsfaktor 3 | TBX3 | TTATGTCCCAG CGAGGGTGA |
ACGTGGTGGTG GAGATCTTG |
| Transthyretin | TTR | AGAAAGGCTG CTGATGAC |
GTGCCTTCCA GTAAGATTTG |
| Albumin | ALB | CCCCAAGTGT CAACTCCA |
GTTCAGGACCA CGGATAG |
| Natrium taurocholat samtransport af polypeptid | NTCP | CATAGGGATCGT CCTCAAATCCA |
GCCACACTGCAC AAGAGAATG |
| CCAAT Forstærker Bindende Protein Alpha | CEBPA | AGGAGGATGAA GCCAAGCAGCT |
AGTGCGCGATC TGGAACTGCAG |
| Serpin Familie Et medlem 1 | AAT | AAATGAACTCA CCCACGAT |
ACCTTAGTGATG CCCAGT |
| Asialoglycoprotein Receptor 1 | Asgr1 | CAGACCCTGAGA CCCTGAGCAA |
TCCTGCAGCTGG GAGTCTTTTCT |
| Cytochrom P450 Familie 3 Underfamilie A Medlem 4 | CYP3A4 | TTGTAATCACTG TTGGCGTGGG |
AATGGGCAAAGT CACAGTGGA |
Tabel 2: Primer-sekvenser til q-PCR-analyse.
Figur 1: Skematisk protokoldiagram til specifikation af DE og HDC-lande. (A) Skematisk præsentation af den 3-trins differentieringsstrategi, der anvendes i denne undersøgelse. (B) De differentierede cellers morfologi ved dag 0, 3, 8, 14 og 18. Skalalinje = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Scenespecifikt markørudtryk under hESC-differentiering til HSC'er. (B-C) Proteinudtryk af scenespecifikke gener. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Funktioner af hESC-afledte HLC'er. (B) Repræsentative PAS-farvningsbilleder, der angiver glykogenopbevaring. (C) Repræsentant HE farvning billeder, der viser binucleates celler. (D) Basal aktivitet af større cytochrom P450-enzymer. Alle værdier præsenteres som middelværdi ± SD. Skalalinje = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi en trinvis metode, der fremkalder HLC'er fra HESC'er i tre faser. I første fase blev Activin A og CHIR99021 brugt til at differentiere HESC'er til DE. I anden fase blev KO-DMEM og DMSO brugt til at differentiere DE til lever stamceller. I tredje fase blev HZM plus HGF, OSM og hydrocortison 21-hemisuccinat natriumsalt brugt til fortsat at differentiere lever stamceller til HLC'er.
Følgende kritiske trin skal tages i betragtning, når protokollen bruges. Den oprindelige differentieringstæthed af celler og den nøjagtige timing af medium ændringer er vigtige faktorer for en vellykket differentiering. Når vi begynder at differentiere, skal vi sikre, at den oprindelige såningstæthed er passende ved et sammenløb på ca. 30-40%, når cellerne lige er begyndt at komme i kontakt med hinanden, og at de intercellulære rum er jævnt arrangeret i et netværk under synsfeltet. Under differentiering skal det tilsvarende differentieringsmedium ændres præcist på det angivne tidspunkt, især i første fase og det centrale øjeblik i hvert udskiftningsstadium, for at sikre, at celler differentierer i den tilstand og fase, der efterligner processen med embryonal udvikling.
Den første fase af differentiering af HESC'er til DE er særlig vigtig. Der er normalt et stort antal celler, der løsner og flyder op i fase I af differentiering, hvilket er en kritisk fase for celle skæbne, men på dette tidspunkt cellerne stadig bevare evnen til at formere sig. Derfor kan sammenløbet af celler nå op på omkring 90-100% i slutningen af fase I. Derudover skal det bemærkes, at i begyndelsen af fase III af differentiering (dvs. dag 8) begynder cellernes cytoplasma at kondensere, hvilket resulterer i, at cellerne gradvist erhverver en slank morfologi. Men på dag 10 kommer cytoplasmaet gradvist tilbage, og på dag 14 begynder cellerne at vise hepatocytters åbenlyse polyhedrale morfologi.
I denne undersøgelse er de opnåede HLC'er faktisk tættere på fosterets hepatocytter, da AFP er højere udtrykt end ALB på dag 18. Selvom de genererede HLC'er udøver hepatocytegenskaber og -funktioner, er der stadig en kløft mellem HLC'er og primære menneskelige hepatocytter, hvilket indikerer, at vores differentierede celler stadig ikke er funktionelt modne. Derfor skal det fremtidige arbejde fokusere på yderligere optimering af differentieringsmetoden.
På nuværende tidspunkt er vækstfaktorer og små molekylære forbindelser som Activin A9,10,14, Wnt3a15, CHIR16, Torin217 og IDE118,19 almindeligt anvendt til at fremkalde DE differentiering i forskellige differentieringssystemer. Song-gruppen brugte Activin A til at differentiere stamceller til DE og brugte FGF4 (Fibroblast Growth Factor 4), BMP2(Bone morphogenetic protein 2), HGF, KGF (Keratinocyte vækstfaktor), OSM og Dex til leverspecifikation og HLCs modning20. Sullivan-gruppen induceret DE af Activin A og Wnt 3a, og induceret HLCs af β-ME (2-mercaptoethanol), DMSO, Insulin, HGF, OSM21. Siller-teamet brugte CHIR99021 til DE-differentiering, DMSO, Dihexa (Hepatocyt vækstfaktorreceptor agonist N-hexanoic-Tyr) og Dex til HLC-differentiering for at opnå HLC med leverfunktionskarakteristika16. Men nogle af disse metoder bruger mange rekombinante vækstfaktorer til at generere DE med høje omkostninger, og nogle af dem bruger kun små molekyler til at generere DE med lavere effektivitet. Activin A er en kritisk faktor for DE-generering. Vi har forsøgt at erstatte Activin A med andre små molekyler, men får normalt en lavere effektivitet. Derfor anvender vi metoden til at tilføje Activin A og CHIR99021 som inducerende faktorer i DE og registrerer differentieringsrelaterede gener i hvert trin ved q-PCR, immunfluorescens og vestlig blotting.
I de senere år er etableringen af et eksperimentelt system for styret HLC-induktion fra HESC'er et vigtigt grundlag for modellering af hepatocytudvikling og screening af lægemidler til leverrelaterede sygdomme. Samtidig kan det også give en effektiv kilde til celler til hepatocyttransplantation, levervævsteknik, bioartificial lever og anden forskning. Det er blevet rapporteret , at HLC'er afledt af stamceller er blevet brugt til at gennemføre forskellige undersøgelser af virusinfektion som en lægemiddelscreeningsmodel for at forudsige hepatotoksiske lægemiddelinducerede reaktioner og til at studere den medfødte immunvej og signalvejene i cellerne10,22,23,24,25. Generelt introducerer denne metode i detaljer en effektiv hepatocytlignende celledifferentieringsteknik fra HESC'er, der med succes kan differentiere HESC'er til modne funktionelle hepatocytter. Resultaterne giver en platform for udvikling af HLC-baserede applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Nr. 81870432 og 81570567 til X.L.Z.), (Nr. 81571994 til P.N.S.); Natural Science Foundation of Guangdong-provinsen, Kina (nr. 2020A1515010054 til P.N.S.), Li Ka Shing Shantou University Foundation (nr. L1111 2008 til P.N.S.). Vi vil gerne takke professor Stanley Lin fra Shantou University Medical College for nyttige råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti - Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti - Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti - α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
References
- Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
- Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19. Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).
- Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B.
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Li, Z., et al. Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Cell Death & Disease. 10, 763 (2019).
- Rassouli, H., et al. Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems. Cell Journal. 21, 290-299 (2019).
- Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Mukherjee, S., et al. Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network. Elife. 9, (2020).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).
- Gomez, G. A., et al. Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation. Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).
- Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells. Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).
- Matsuno, K., et al. Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells. Differentiation. 92, 281-290 (2016).
- Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).
- Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).
- Yu, J. S., et al. PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation. Nature Communications. 6, 7212 (2015).
- Borowiak, M., et al. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).
- Tahamtani, Y., et al. Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm. Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).
- Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 329-335 (2010).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Li, S., et al. Derivation and applications of human hepatocyte-like cells. World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, 1-9 (2017).
