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Developmental Biology

तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं में यांत्रिक संकेतों का अध्ययन करने के लिए एक अनुकूलित O9-1/हाइड्रोजेल सिस्टम

Published: August 13, 2021 doi: 10.3791/62693
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3, 3, 1, 1,2
1Department of Pediatrics, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2The University of Texas MD Anderson Cancer Center UTHealth Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas Health Science Center at Houston, 3SEM AFM Core in the Houston Methodist Hospital Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

विस्तृत कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल यहां बहुपेंट O9-1 तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं और अलग कठोरता के पॉलीएक्रीलैमाइड हाइड्रोगेल का उपयोग करके विट्रो में यांत्रिक संकेतों का अध्ययन करने के लिए वर्णित हैं।

Abstract

तंत्रिका शिखा कोशिकाएं (एनसीसी) कशेरुकी भ्रूणीय बहुपंत कोशिकाएं हैं जो विभिन्न अंगों और ऊतकों को जन्म देने वाली कोशिका प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला में स्थानांतरित और अंतर कर सकती हैं। ऊतक कठोरता यांत्रिक बल, एक शारीरिक क्यू है कि एनसीसी भेदभाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है पैदा करता है; हालांकि, तंत्र अस्पष्ट बना हुआ है । यहां वर्णित विधि अलग-अलग कठोरता के पॉलीएक्रीलामाइड हाइड्रोगेल के अनुकूलित उत्पादन, ऐसी कठोरता की सटीक माप और O9-1 कोशिकाओं में यांत्रिक संकेतों के प्रभाव का मूल्यांकन, एक एनसीसी लाइन है जो वीवो एनसीसी में नकल करती है, के लिए विस्तृत जानकारी प्रदान करती है।

हाइड्रोजेल कठोरता को परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) का उपयोग करके मापा गया था और तदनुसार विभिन्न कठोरता के स्तर का संकेत दिया गया था। अलग-अलग कठोरता के हाइड्रोगेल पर सुसंस्कृत O9-1 एनसीसी ने विभिन्न सेल आकृति विज्ञान और तनाव फाइबर की जीन अभिव्यक्ति दिखाई, जिसने यांत्रिक संकेत परिवर्तनों के कारण विभिन्न जैविक प्रभावों का संकेत दिया। इसके अलावा, इसने स्थापित किया कि हाइड्रोजेल कठोरता को अलग-अलग करने के परिणामस्वरूप जेल कठोरता में फेरबदल करके यांत्रिक संकेतों में हेरफेर करने और एनसीसी में आणविक और आनुवंशिक विनियमन का विश्लेषण करने के लिए एक कुशल के परिणामस्वरूप। O9-1 NCCs इसी भेदभाव मीडिया के प्रभाव में सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला में अंतर कर सकते हैं, और विट्रो मेंरासायनिक संकेतों में हेरफेर करना सुविधाजनक है। इसलिए, यह इन विट्रो प्रणाली एनसीसी में यांत्रिक सिग्नलिंग की भूमिका और रासायनिक संकेतों के साथ इसकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, जो शोधकर्ताओं को तंत्रिका क्रेस्ट विकास और रोगों के आणविक और आनुवंशिक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने में मदद करेगा।

Introduction

तंत्रिका शिखा कोशिकाएं (एनसीसी) कशेरुकी भ्रूणजेनेसिस के दौरान स्टेम कोशिकाओं का एक समूह है जिसमें विभिन्न अंगों और ऊतकों के विकास में माइग्रेट करने और योगदान करने की उल्लेखनीय क्षमता है। एनसीसी अक्षीय मूल के स्थान और एनसीसी1,2के स्थानीय पर्यावरणीय मार्गदर्शन के आधार पर संवेदी न्यूरॉन्स, उपास्थि, हड्डी, मेलानोसाइट्स और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं सहित विभिन्न सेल प्रकारों में अंतर कर सकते हैं। कोशिका प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला में अंतर करने की क्षमता के साथ, तंत्रिका क्रेस्ट (एनसी) विकास के किसी भी चरण में डिस्रेगुलेशन का कारण बनने वाली आनुवंशिक असामान्यताएं कई जन्मजात बीमारियों का कारण बन सकती हैं2। उदाहरण के लिए, एनसीसी के गठन, प्रवास और विकास के दौरान क्षोभ से विकासात्मक विकारों को सामूहिक रूप से न्यूरोक्रिस्टोपैथी1, 3के रूप में जानाजाताहै। ये बीमारियां एनसीसी गठन में विफलता के कारण क्रैनियोफेशियल दोषों से लेकर, जैसे कि टांगर कोलिंस सिंड्रोम, एनसीसी मेटास्टैटिक प्रवासी क्षमता के कारण विभिन्न कैंसर के विकास तक, जैसा कि मेलानोमा3,4,5, 6मेंदेखा गयाहै। पिछले कुछ दशकों में, शोधकर्ताओं ने विकास और रोगों में एनसीसी की भूमिकाओं और तंत्रों के बारे में उल्लेखनीय खोज की है, जिसमें अधिकांश निष्कर्ष रासायनिक संकेतों7,8पर केंद्रित हैं। हाल ही में, यांत्रिक संकेतों को एनसीसी विकास9,10में एक महत्वपूर्ण लेकिन खराब समझ में भूमिका निभाने के लिए संकेत दिया गया है ।

एनसीसी के पर्यावरणीय संकेत उनके विकास के दौरान एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जिसमें विभिन्न सेल प्रकारों में एनसीसी भेदभाव का नियमन शामिल है । पर्यावरणीय संकेत, उदाहरण के लिए, भौतिक संकेत, कार्यात्मक विविधीकरण जैसे निर्णायक व्यवहार और सेलुलर प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करते हैं। मशीनोट्रांजेक्शन कोशिकाओं को विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं को बनाए रखने के लिए उन संकेतों को समझने और उनका जवाब देने की अनुमति देता है2. एनसीसी पड़ोसी कोशिकाओं और विभिन्न सब्सट्रेट्स से घिरे हुए हैं, जैसे कि एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम), जो होमोसैटसिस को बनाए रखने और भाग्य निर्धारण, प्रसार और एपोप्टोसिस11के माध्यम से परिवर्तनों के अनुकूल बनाने के लिए यांत्रिक उत्तेजनाओं को जन्म दे सकता है। मेकानोट्रांजेशन प्लाज्मा झिल्ली से शुरू होता है जहां यांत्रिक बाह्य उत्तेजनाओं का संवेदी घटक होता है, जिसके परिणामस्वरूप सेल12का इंट्रासेलुलर विनियमन होता है। इन्टेग्रिन, फोकल आसंजन, और प्लाज्मा झिल्ली रिले यांत्रिक संकेतों के जंक्शन, जैसे कतरनी बल, तनाव, और आसपास के सब्सट्रेट्स की कठोरता, सेलुलर प्रतिक्रियाओं का उत्पादन करने के लिए रासायनिक संकेतों में12। प्लाज्मा झिल्ली से अंतिम सेलुलर विनियमन के लिए रासायनिक संकेतों के रीलिंग विभिन्न संकेत रास्ते के माध्यम से किया जाता है ताकि जीव के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं को अंतिम रूप दिया जा सके, जैसे भेदभाव।

कई अध्ययनों से यह पता चला है कि सब्सट्रेट कठोरता से यांत्रिक संकेत कोशिका भेदभाव13,14में भूमिकानिभाताहै । उदाहरण के लिए, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि मस्तिष्क के ऊतकों (0.1-1.0 केपीए की सीमा में) के समान कठोरता के साथ नरम सब्सट्रेट्स पर उगाए जाने वाले मेसेंचिमल स्टेम सेल (एमएससी) के परिणामस्वरूप न्यूरोनल सेल भेदभाव15,16हुआ। हालांकि, अधिक एमएससी 8-17 केपीए पर उगाए जाने पर मायोसाइट जैसी कोशिकाओं में अंतर करते हैं, जबकि ऑस्टियोब्लास्ट जैसे भेदभाव को देखा गया जब एमएससी को कठोर सब्सट्रेट्स (25-40 केपीए)15, 16पर सुसंस्कृत किया गया था। मेकेनोट्रांजडक्शन का महत्व यांत्रिक सिग्नलिंग मार्ग में अनियमितताओं और असामान्यताओं से उजागर होता है जो संभावित रूप से कैंसर, हृदय रोगों औरऑस्टियोपोरोसिस17, 18,19सहित गंभीर विकासात्मक दोषों और बीमारियों का कारणबनताहै। कैंसर में, सामान्य स्तन ऊतक नरम होता है, और स्तन कैंसर का खतरा कठोर और घने स्तन ऊतक में बढ़ जाता है, एक वातावरण जो स्तन ट्यूमर के समान है15। इस ज्ञान के साथ, एनसीसी विकास पर यांत्रिक संकेत के प्रभाव का अध्ययन इन विट्रो सिस्टम के माध्यम से सब्सट्रेट कठोरता के सरल हेरफेर के माध्यम से किया जा सकता है, जो नेकां से संबंधित रोग प्रगति और एटियोलॉजी के बुनियादी सिद्धांतों को समझने में आगे लाभ और संभावनाएं प्रदान करता है।

एनसीसी में यांत्रिक संकेतों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, हमने एनसीसी के लिए एक कुशल इन विट्रो प्रणाली स्थापित की, जो पहले प्रकाशित तरीकों के अनुकूलन और एनसीसी की प्रतिक्रियाओं के विभिन्न यांत्रिक संकेतों20,21के मूल्यांकन के आधार पर थी । एनसीसी में मैकेनिकल सिग्नलिंग के प्रभाव के हाइड्रोजेल कठोरता तैयारी और मूल्यांकन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया था। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, O9-1 एनसीसी का उपयोग एनसी मॉडल के रूप में किया जाता है ताकि कठोर बनाम सॉफ्ट हाइड्रोगेल्स के जवाब में प्रभाव और परिवर्तनों का अध्ययन किया जा सके। O9-1 NCCs एक स्थिर नेकां सेल लाइन माउस भ्रूण (ई) से ८.५ दिन में अलग कर रहे हैं । O9-1 एनसीसी वीवो में एनसीसी की नकल करते हैं क्योंकि वे परिभाषित विभेदन मीडिया22में विभिन्न एनसी-व्युत्पन्न सेल प्रकारों में अंतर कर सकते हैं । एनसीसी के यांत्रिक संकेत का अध्ययन करने के लिए, एक मैट्रिक्स सब्सट्रेट को वांछित कठोरता प्राप्त करने के लिए एक्रिलामाइड और बीआईएस-एक्रिलामाइड समाधानों की अलग-अलग सांद्रता से ट्यूनेबल लोच के साथ गढ़ा गया था, जो जैविक सब्सट्रेट कठोरता20,21,23से संबंधित था। एनसीसी, विशेष रूप से O9-1 कोशिकाओं के लिए मैट्रिक्स सब्सट्रेट की शर्तों को अनुकूलित करने के लिए, पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल20से संशोधन किए गए थे। इस प्रोटोकॉल में किया गया एक परिवर्तन कोलेजन I में हाइड्रोगेल को इनक्यूबेट करना था, जो रात 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 एमएम एचईपीई के बजाय 0.2% एसिटिक एसिड में पतला था। एसिटिक एसिड के कम पीएच एक सजातीय वितरण और उच्च कोलेजन मैं निगमन की ओर जाता है, इस प्रकार ईसीएम प्रोटीन24के अधिक समान लगाव के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, इनक्यूबेटर में हाइड्रोगेल के भंडारण से पहले, फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में क्रमशः 10% और 5% की सांद्रता पर घोड़े सीरम और भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) का संयोजन किया गया था। 10%25की एकाग्रता पर सेल प्रसार और भेदभाव को बढ़ावा देने की क्षमता के कारण घोड़े सीरम का उपयोग एफबीएस के अतिरिक्त पूरक के रूप में किया जाता था ।

इस विधि के साथ, एनसीसी के विकास और जीवित रहने के लिए20, 21के विकास और जीवित रहने के लिए ईसीएम प्रोटीन कोटिंग (जैसे, कोलेजन I) द्वारा एक जैविक वातावरण की नकल की गई थी। तैयार हाइड्रोगेल की कठोरता का मात्रात्मक रूप से परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) के माध्यम से विश्लेषण किया गया था, जो लोचदार मॉड्यूलस26को चित्रित करने के लिए एक प्रसिद्ध तकनीक है। एनसीसी पर विभिन्न कठोरता के स्तर के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, जंगली प्रकार O9-1 कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया गया था और इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) के लिए हाइड्रोगेल पर तैयार किया गया था, जो सबस्ट्रेट कठोरता में परिवर्तन के जवाब में सेल आसंजन और मोर्फोलोजी में अंतर दिखाने के लिए फिलामेंटस ऐक्टिन (एफ-ऐक्टिन) के खिलाफ धुंधला था। इस इन विट्रो प्रणाली का उपयोग करते हुए, शोधकर्ता एनसीसी में यांत्रिक सिग्नलिंग की भूमिकाओं और एनसीसी और यांत्रिक सिग्नलिंग के बीच संबंधों की गहरी समझ हासिल करने के लिए अन्य रासायनिक संकेतों के साथ इसकी बातचीत का अध्ययन करने में सक्षम होंगे।

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Protocol

1. हाइड्रोजेल तैयारी

नोट: सभी चरणों को सेल कल्चर हुड में किया जाना चाहिए जिसे बंध्यता बनाए रखने के लिए उपयोग से पहले इथेनॉल और पराबैंगनी (यूवी) से कीटाणुरहित किया गया है। चिमटी और पिपेट जैसे उपकरण, इथेनॉल के साथ छिड़काव किया जाना चाहिए। बफर समाधान भी बाँझ-फ़िल्टर किया जाना चाहिए।

  1. अमीनोसिलेन-लेपित ग्लास कवरस्लिप की तैयारी
    1. प्रयोगशाला पोंछ के एक टुकड़े पर कांच कवरस्लिप की वांछित संख्या रखें।
      नोट: पर्याप्त बैकअप आपूर्ति सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त 3-4 कवरस्लिप तैयार करें क्योंकि वे आसानी से टूटते हैं। कांच के कवर्लिप की विभिन्न सामग्रियों से सेल सीडिंग और अटैचमेंट की अलग-अलग अनुकूलता निकलेगी। यह निर्धारित करना बेहतर है कि प्रयोग शुरू करने से पहले कौन सा प्रकार प्रयोग को सबसे अच्छा सूट करता है (सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. लौ (प्रोटीन परख प्रयोगों के लिए 30 एस) के माध्यम से आगे और पीछे से गुजर कर प्रत्येक कवरस्लिप को निष्फल करने के लिए अल्कोहल बर्नर या बुनसेन बर्नर का उपयोग करें। ठंडा करने के लिए प्रत्येक ग्लास कवरलिप को प्रयोगशाला पोंछ पर रखें।
    3. एक बार जब ग्लास कवरलिप ठंडा हो जाते हैं, तो उन्हें फिसलन को रोकने के लिए पैराफिल्म के साथ लाइन में लगे पेट्री डिश पर स्थानांतरित करें।
      नोट: यदि कवर्लिप्स पर्याप्त शांत नहीं हैं, तो अवशिष्ट गर्मी पर्चियों पर पैराफिल्म को पिघला देगी, जिससे उन्हें अनुपयोगी हो जाएगा।
    4. कवरस्लिप को क्रमशः 12 मिमी और 25 मिमी कवरलिप के लिए लगभग 200 माइक्रोल और 0.1 एम नाओएच के 800 माइक्रोन के साथ कवर करें, और उन्हें 5 मिनट के लिए बैठने दें। फिर, 0.1 एम नाओएच को एस्पिरेट करें और कवरस्लिप को एक भी फिल्म बनाने के लिए एक और 5 मिनट के लिए हवा-सूखी करने की अनुमति दें।
    5. एक बार कवरस्लिप सूख जाने के बाद, क्रमशः 12 मिमी और 25 मिमी कवर्लिप के लिए लगभग 80 माइक्रोन और 3-अमीनोप्रोपिल ट्राइएथॉक्सीलेन (एपीटीएस) के 150 माइक्रोन। पैराफिल्म पर समाधान को गिराने से बचने के लिए सावधान रहें। समाधान को 5 मिनट तक बैठने दें।
    6. जितना संभव हो उतना अतिरिक्त एपीटीएस को एस्पिरेट करें और अवशिष्ट एपीटीएस को 5 मिनट के लिए सूखने दें। उन्हें बाँझ, deionized (DI) एच2O में हर बार 5 मिनट के लिए तीन बार जलमग्न करके अच्छी तरह से कवरस्लिप कुल्ला ।
      नोट: यदि ग्लास कवर्लिप्स को अच्छी तरह से धोया नहीं जाता है, तो अवशिष्ट एपीटीएस ग्लूटारल्डिहाइड के साथ अवांछित प्रतिक्रियाओं का कारण बनता है, जिससे एक सफेद वर्षा के रूप में होती है और जिसके परिणामस्वरूप अनुपयोगी कवर्लिप होते हैं।
    7. रिएक्टिव साइड का सामना करने के साथ एक नई पेट्री डिश में कवरस्लिप ले जाएं। कवरस्लिप को पूरी तरह से कवर करने के लिए पेट्री डिश में पर्याप्त 0.5% ग्लूटारल्डिहाइड जोड़ें और कवरस्लिप को 30 मिनट तक बैठने की अनुमति दें।
    8. 0.5% ग्लूटारल्डिहाइड को एस्पिरेट करें और डीआई एच2ओ में फिर से कवरस्लिप को 3 मिनट के लिए एक बार कुल्ला करें। कवरस्लिप प्रतिक्रियाशील पक्ष को प्रयोगशाला पोंछ या एक साफ पेट्री डिश पर हवा-सूखी पूरी तरह से उपयोग करने से पहले सेट करें।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है; कवरस्लिप को उपयोग तक बाँझ डीआई एच2ओ में रखा जाना चाहिए।
  2. सिलिकॉनाइज्ड कवर्लिप्स की तैयारी
    1. पैराफिल्म के साथ लाइन में लगी पेट्री डिश में अमीनोसिलेन-कोटेड कवरस्लिप (चरण 1.1.1) के समान संख्या में कवरस्लिप रखें।
    2. पिपेट 40 माइक्रोल या 150 माइक्रोल के लिए क्रमशः 12 मिमी और 25 मिमी कवरस्लिप, डाइक्लोरोमेथाइलसिलेन (डीसीएमएस) के कवरस्लिप के एक तरफ और समाधान को 5 मिनट तक बैठने की अनुमति देते हैं।
    3. कवरस्लिप से किसी भी शेष समाधान को एस्पिरेट करें, बाँझ डीआई एच2ओ में एक बार 1 मिनट के लिए धोएं, और प्रतिक्रियाशील कवरस्लिप को अगले चरण पर जाने से पहले पूरी तरह से हवा-सूखी करने के लिए एक प्रयोगशाला पोंछ पर सामना करें।
  3. हाइड्रोगेल तैयार करना
    1. अलग-अलग कठोरता के साथ समाधान के 500 माइक्रोन तैयार करने के लिए 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में एक्रिलमाइड, बीआईएस-एक्रिलमाइड और डीआई एच2ओ मिलाएं (टेबल 1देखें)। भंवर 30 एस के लिए समाधान इसे अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए।
    2. तेजी से काम करते हुए, ट्यूब में 10% अमोनियम पर्सुल्फेट समाधान (एपीएस) और टेट्रामेथाइलेल्लीनडाइमाइन (टेमेड) जोड़ें और समाधानों को मिलाने के लिए समाधानों को फिर से भंवर करें।
      नोट: ताजा 10% एपीएस तैयार करें और इसे बर्फ पर छोड़ दें या अपने संवेदनशील फ्रीज/गल चक्र के कारण एकल उपयोग वाले एलिकोट्स में फ्रीज करें ।
    3. पिपेट क्रमशः सूखे 12 मिमी या 25 मिमी अमीनोसिलेन-लेपित कवरस्लिप (धारा 1.1) पर समाधान का लगभग 33 माइक्रोल या 100 माइक्रोन।
    4. घुमावदार चिमटी का उपयोग करके, तुरंत जेल समाधान को छूने वाले पक्ष के साथ जेल समाधान के शीर्ष पर डीसीएमएस-इलाज कवरस्लिप रखें, इस प्रकार डीसीएमएस-इलाज कवरस्लिप और अमीनोसिलेन-लेपित कवरस्लिप के बीच जेल समाधान को सैंडविच करें।
    5. जेल समाधान को 5-15 मिनट के लिए बहुलीकरण करने की अनुमति दें, जबकि ट्यूब में बचे हुए समाधान के जेल पॉलीमराइजेशन के लिए सक्रिय रूप से निगरानी करें।
    6. एक बार जेल बहुलक हो जाने के बाद, डीसीएमएस-इलाज कवरस्लिप को घुमावदार चिमटी या रेजर ब्लेड के साथ अलग करें, जिससे जेल मूल अमीनोसिनेल-लेपित कवरस्लिप से जुड़ा हो।
    7. जेल को सुखाने से रोकने के लिए क्रमशः 12 मिमी और 25 मिमी कवरलिप के लिए 500 माइक्रोल और बाँझ पीबीएस या डीआई एच2ओ के 2 एमएल के साथ कवर्ड 500 माइक्रोल और 2 एमएल के साथ कवर्ड, एक पूर्व निर्धारित 4-वेल/24-वेल और 6-वेल प्लेट में संलग्न हाइड्रोजेल के साथ तुरंत कवरस्लिप रखें।
    8. सभी कवर्लिप्स के लिए 1.3.4-1.3.7 चरण दोहराएं।
    9. अतिरिक्त एक्रिलामाइड समाधान को हटाने के लिए 30 मिनट के लिए बाँझ पीबीएस या डीआई एच2ओ में हाइड्रोगेल्स को जलमग्न करें। यहां प्रक्रियात्मक स्टॉप के लिए बाँझ पीबीएस या डीआई एच2ओ में हाइड्रोगेल्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    10. एक अंधेरे कमरे में, सल्फोसुस्यूसिनिमिडिल 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) हेक्सानोएट (सल्फो-सैंपा) मिश्रण को 50 mM 2-[4-4-05-2-4-)। (2-हाइड्रोक्सीथिल) पिपराजिन-1-एल] एथेलसुल्फोनिक एसिड (एचईपीईएस) (पीएच = 8.5) एक शंकुदाता में 50 μg/mL सल्फो-सैंपा के 25 माइक्रोन के साथ, प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे। उपयोग करने से पहले समाधान को अच्छी तरह से मिलाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
      नोट: सल्फो-सैंपा समाधान की 2.5 एमएल की मात्रा लगभग पच्चीस 12 मिमी हाइड्रोगेल या पांच 25 मिमी हाइड्रोगेल के लिए पर्याप्त है।
    11. अच्छी तरह से थाली से पीबीएस या डीआई एच2ओ को एस्पिरेट करें। जेल को कवर करने के लिए सल्फो-सैंपा समाधान (चरण 1.3.10) के क्रमशः 12 मिमी और 25 मिमी कवर्लिप्स के लिए लगभग 100 माइक्रोल या 500 माइक्रोल जोड़ें। सुनिश्चित करें कि समाधान पूरी तरह से जेल को कवर करता है।
      नोट: वैक्यूम सक्शन ताकत को समायोजित करें ताकि मजबूत बल को हाइड्रोगेल को तेजस्वी या परेशान करने से रोका जा सके।
    12. 10 मिनट के लिए 15 डब्ल्यू, 365 एनएम यूवी लाइट के तहत समाधान के साथ जैल रखें, जो सल्फो-सैंपा के साथ प्रतिक्रिया करने वाली यूवी लाइट के किसी भी हस्तक्षेप को कम करने के लिए खुला है।
    13. जितना संभव हो उतना समाधान एकत्र करने के लिए प्लेट को झुकाकर अतिरिक्त सल्फो-सैंपा को एएसपिरेट करें। जेल को दो से तीन बार 50 एमएम एचईपी के साथ धोएं।
    14. 50 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन के क्रमशः 12 मिमी और 25 मिमी जैल के लिए 500 μL और 2 एमएल जोड़ें, जो हाइड्रोगेल युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से 0.2% एसिटिक एसिड में पतला होता है। जैल को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
      नोट: कोलेजन I के समरूप वितरण और लगाव को बढ़ावा देने के लिए 50 एमएम एचईपी के बजाय 0.2% एसिटिक एसिड में पतला कोलेजन I।
    15. कोलेजन मैं aspirate और बाँझ PBS के साथ जैल धोने तीन बार 5 मिनट प्रत्येक धोने के लिए अतिरिक्त कोलेजन मैं हटाने के लिए । पीबीएस में हाइड्रोजेल को 10% हॉर्स सीरम के साथ, 37 डिग्री सेल्सियस में 2 घंटे के लिए 5% एफबीएस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर के साथ इनक्यूबेट करें।
      नोट: 10% घोड़े सीरम के अलावा केवल पिछले प्रकाशन में किया के रूप में FBS का उपयोग करने की तुलना में उच्च प्रसार को बढ़ावा देता है ।
    16. माध्यम को एएसपीरेट करें। 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस) के साथ बाँझ-फ़िल्टर किए गए डल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) के 500 एमएल को प्रत्येक कुएं में जोड़ें। सेल कल्चर के लिए तैयार होने तक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में जैल स्टोर करें।
    17. एक बार तैयार होने के बाद, संस्कृति व्यंजनों में बेसल माध्यम में लगभग 1.5 × 104 O9-1 कोशिकाओं/ 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर एक इनक्यूबेटर में2दिनों के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाएं पर्याप्त रूप से जैल से जुड़ी हुई हैं, और विश्लेषण के लिए एकत्र करने से पहले कोशिकाओं की संख्या पर्याप्त है, यह सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं की जांच करें।
      नोट: वसूली, मार्ग, और O9-1 कोशिकाओं20के संग्रह के कदम के लिए पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल देखें ।
    18. हाइड्रोगेल के आगे के विश्लेषण के लिए सेक्शन 2, 3 या 4 पर आगे बढ़ें।

2. एएफएम के माध्यम से कठोरता का मात्रात्मक विश्लेषण

  1. एएफएम सिस्टम कंप्यूटर शुरू करें, इसके बाद एएफएम नियंत्रक (सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. एएफएम जांच धारक पर एएफएम कैंटिलीवर माउंट करें। कैंटिलीवर (गोलाकार मनका के साथ कैंटिलीवर) के अंत में घुड़सवार 0.5 माइक्रोन सिलिका मनका के साथ गोलाकार कैंटिलीवर का उपयोग करें।
    नोट: 10 केपीए, 20 केपीए और 40 केपीए जैसे स्टिकर हाइड्रोगेल्स के लिए, 0.24 एन/एम के स्प्रिंग कॉन्स्टेंट के साथ एक स्टिकर जांच का उपयोग किया गया था। नरम हाइड्रोगेल के लिए एक नरम जांच का उपयोग किया गया था, जैसे 0.5 केपीए और 1 केपीए, 0.059 एन/एम के वसंत स्थिर के साथ।
  3. एएफएम सॉफ्टवेयर को संपर्क मोडके तहत सेट करें।
  4. सिलिकॉन सब्सट्रेट को छूने के लिए कैंटिलीवर के लिए संलग्न पर क्लिक करके बल घटता इकट्ठा करने के लिए AFM नमूना चरण पर सिलिकॉन वेफर माउंट करें, इस प्रकार बल घटता पैदा करते हैं।
  5. अंशांकन के लिए ऊपर (2.4) बल घटता का प्रयोग करें, थर्मल ट्यून स्थिति के तहत कैंटिलीवर के एक औसत वसंत स्थिर प्राप्त करने के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर में कैलिब्रेट पर क्लिक करें, और नियंत्रण सॉफ्टवेयर में अंशांकित मूल्यों को बचाने के लिए।
  6. एएफएम स्कैनिंग चरण पर 60 मिमी पेट्री डिश में संलग्न हाइड्रोगेल के साथ कवरस्लिप रखकर नमूनों को माउंट करें। जेल को सूखने से रोकने के लिए माप आयोजित करने से पहले डिश में पीबीएस के 3 एमएल जोड़ें।
  7. माप शुरू करने के लिए संपर्क मोड (तरल पदार्थ) में काम करने के लिए एएफएम सेट करें। जेल के नमूने से लगातार छूने और उठाने के लिए गोलाकार मनका संलग्न करें।
  8. कैंटिलीवर सेट करें ताकि इसकी विक्षेप सीमा 10 एनएम पर बनी रहे। जांच के रैंपिंग आकार को 10 माइक्रोन पर रखें। फिर, चरण 2.4 के रूप में बल घटता रिकॉर्ड करें।
  9. हाइड्रोगेल की सतह पर कम से कम 3 से 10 विभिन्न स्थानों से कम से कम 20 बल घटता प्राप्त करें।
  10. एएफएम इमेजिंग और विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ प्रत्येक स्थान के लिए ~ 20 बल घटता के औसत युवा के मॉड्यूलस की गणना करें। रैंप बल घटता और एक रैखिक मॉडल (गोलाकार) का विस्तार का उपयोग करें। अंतिम कठोरता उपज के लिए प्रत्येक नमूने के लिए सभी स्थानों के औसत की गणना करें।
    नोट: यंग के मॉड्यूलस और संबंधित डेटा(यानी, मानक विचलन) स्वचालित रूप से स्प्रेडशीट के रूप में सहेजे जाते हैं।
  11. सभी नमूनों के लिए 2.6-2.10 कदम दोहराएं।

3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के माध्यम से कठोरता का आणविक विश्लेषण

  1. प्लेट पर सीधे उगाई जाने वाली कोशिकाओं से झूठे संकेतों को कम करने के लिए कवरस्लिप को एक नई प्लेट में परिवहन करने के लिए चिमटी का उपयोग करें। मृत कोशिकाओं और किसी भी शेष संस्कृति माध्यम को हटाने के लिए तीन बार बाँझ पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को धोएं।
  2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 500 माइक्रोन का उपयोग करके कोशिकाओं को ठीक करें, अव्यवस्थित। फिर, कोशिकाओं को तीन बार PBS के ५०० μL का उपयोग कर फिर से धोना/
    नोट: प्रक्रियात्मक स्टॉप के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन एक्स-100 के 500 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं का इलाज करें। फिर, कोशिकाओं को पीबीएस/वेल के 500 माइक्रोन से तीन बार धोएं।
  4. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 10% गधे सीरम (पीबीएस में पतला और 0.1% ट्वीन 20) प्रति अच्छी तरह से 250 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक करें।
  5. कमरे के तापमान पर या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के 250 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। फिर, कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए पीबीएस/वेल के 500 माइक्रोल के साथ तीन बार धोएं।
    नोट: एंटी-विनक्यूलिन (वीसीएल) (1:250) और एंटी-एपी 2 अल्फा (1:250) का उपयोग इस प्रयोग में किया गया था और 10% गधे सीरम में पतला किया गया था।
  6. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 10% गधा सीरम के 250 माइक्रोन में 1:400 के कमजोर पड़ने पर एफ-ऐक्टिन धुंधला के लिए उपयोग किए जाने वाले इसी माध्यमिक एंटीबॉडी और/या फल्लोइडिन के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। फिर, कोशिकाओं को 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    नोट: 568 एनएम फालोइडिन को 488 एनएम या 647 एनएम माध्यमिक एंटीबॉडी या अपने दम पर सह-इनक्यूबेटेड किया जा सकता है।
  7. 10 मिनट के लिए पीबीएस के 250 माइक्रोन में 4′,6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडल (डीएपीआई, 1:1000 कमजोर पड़ने) के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और इसके बाद 2 मिनट के लिए पीबीएस का एक अंतिम धोना।
  8. प्रत्येक कुएं में बढ़ते माध्यम की 3-4 बूंदें जोड़ें। बढ़ते माध्यम को ठीक से सेट किया गया है सुनिश्चित करने के लिए इमेजिंग से पहले कम से कम 2 घंटे के लिए सेट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को स्टोर करें।
  9. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ हाइड्रोजेल नमूने के प्रति कम से कम 3 यादृच्छिक फ्रेम की छवियों को कैप्चर करें, जो व्यक्तिगत और विलय किए गए चैनलों का उत्पादन करते हैं।

4. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर)

  1. कोशिका प्लेट से जुड़ी कोशिकाओं से अवांछित आरएनए को कम करने के लिए आरएनए संग्रह के लिए अनुयायी कोशिकाओं के साथ हाइड्रोगेल को एक नई प्लेट में स्थानांतरित करें। मृत कोशिकाओं और संस्कृति माध्यम को हटाने के लिए कोशिकाओं को तीन बार पीबीएस से धोएं।
  2. आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके कुल एमआरएनए निकालें। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन सुपरमिक्स का उपयोग करके सीडीएनए को आरएनए का रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन करें।
  3. पसंद की कठोरता मार्कर के रूप में वीसीएल के लिए प्राइमर के साथ आरटी-क्यूपीसीआर करें और 2-ΤΤCT विधि का उपयोग करके विश्लेषण करें।
    नोट: वीसीएल का प्राइमर अनुक्रम: फॉरवर्ड 5 'GCTTCAGTCCCCATACTCG 3'; रिवर्स 5 'AGGTAAGCAGGATTCAGATGT 3'।

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Representative Results

एएफएम और हर्ट्ज मॉडल के माध्यम से हाइड्रोजेल तैयारी और कठोरता मूल्यांकन
यहां, एक्रिलैमाइड और बीआईएस-एक्रिलैमाइड के अनुपात को विनियमित करके अलग-अलग कठोरता के पॉलीएक्रीलामाइड हाइड्रोगेल उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है। हालांकि ईसीएम प्रोटीन की कमी के कारण पॉलीएक्रीलैमाइड हाइड्रोगेल कोशिकाओं के आसंजन के लिए तैयार नहीं हैं। इस प्रकार, सल्फो-सैंपाएच, एक लिंकर के रूप में कार्य करते हुए, हाइड्रोगेल से बांधता है और ईसीएम प्रोटीन के प्राथमिक अमीनों के साथ प्रतिक्रिया करता है ताकि यूवी सक्रियण के बाद सल्फो-सैंपाएच में एन-हाइड्रोक्सीसुक्यूनिमाइड एस्टर के माध्यम से हाइड्रोगेल की सतहों पर ईसीएम प्रोटीन के आसंजन की अनुमति दी जा सके। कोलेजन प्रकार मैं पसंद के ईसीएम प्रोटीन के रूप में इस्तेमाल किया गया था प्रभावी ढंग से O9-1 सेल लगाव को बढ़ावा देने के । विभिन्न हाइड्रोगेल के सटीक कठोरता मूल्यों को सुनिश्चित करने के लिए, एएफएम का उपयोग करके एक कठोरता मूल्यांकन किया गया, जो लोचदार मॉड्यूलस को चित्रित करने के लिए एक प्रसिद्ध तकनीक है।

ग्लास कवरलिप के लिए पॉलीएक्रीलामाइड हाइड्रोगेल के सफल गठन और लगाव पर, जेल एक भी सतह और न्यूनतम फाड़ के साथ कवरस्लिप के अनुयायी बने रहे। कठोरता को एएफएम द्वारा इंडेंटेशन तकनीक के सिद्धांत के आधार पर मापा गया था, जिसमें एक इंडेंटेशन गहराईतकपहुंचने के लिए आवश्यक बल के साथ नमूने पर एक कठोर इंडेंटर लागू किया गया था। इस माप के साथ, युवा के लोचदार मॉड्यूलस की गणना हर्ट्ज के मॉडल में गहराई और बल के इंडेंटेशन के आधार पर की गई थी, जो एक लोचदार सिद्धांत26था। हालांकि, एएफएम द्वारा परिणामों में बड़ी भिन्नता के कारण, असमान सतहों के न्यूनतम प्रभाव और जेल समाधान26की अपूर्ण एकरूपता के साथ मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए एक अतिरिक्त सांख्यिकीय विधि लागू की गई थी। एएफएम का उपयोग करके मात्रात्मक माप का उत्पादन करने के लिए, जेल के नमूने पर प्रत्येक स्थान से कम से कम 50 बल और दूरी घटता का संकलन औसत नमूना कठोरता के लिए लिया गया था। उच्च कठोरता जेल के लिए लागू बल नरम जेल पर लागू की तुलना में अधिक था, यह दर्शाता है कि एक कठोर सब्सट्रेट बल बनाम जेड ग्राफ में एक खड़ी ढलान मिले, जिसमें बल को एनएन में मापा जाता है, और जेड इंडेंटर और नमूने के बीच इंडेंटेशन गहराई को इंगित करता है।

नरम हाइड्रोगेल पर, उत्पन्न बल वक्र की ढलान कोमल थी क्योंकि एएफएम जांच से आवश्यक बल कम था(चित्रा 1A)। हालांकि, कठोर हाइड्रोगेल पर, जैसे कि 40 केपीए के मॉड्यूलस वाले, उत्पन्न ढलान बहुत अधिक था क्योंकि लागू बल नरम जैल(चित्रा 1 B)की तुलना में अधिक था। जैसे-जैसे जांच और हाइड्रोजेल नमूने के बीच अलगाव कम हो जाता है, वक्र काफी बढ़ जाता है क्योंकि जांच की नोक ग्लास कवरलिप को छूती है। हालांकि, के रूप में जुदाई दूरी बढ़ जाती है, वक्र केवल 0 दृष्टिकोण के रूप में वहां कोई लागू बल मौजूद है ।

जैसा कि चित्रा 1Aमें दिखाया गया है, एएफएम जांच पर कैंटिलीवर ने जेल से संपर्क किया, ब्लू लाइन द्वारा इंगित किया गया, और जांच ने जेल के नमूने को भेदने और अंततः ग्लास कवरलिप तक पहुंचने के लिए आवश्यक लागू बल को मापा, जिससे बल में अचानक वृद्धि हुई। संभावित प्रक्रियात्मक और वाद्य त्रुटियों के कारण, जैसे कि आवश्यक समाधानों की गुणवत्ता, हाइड्रोजेल नमूनों की असली कठोरता काफी हद तक और वांछित कठोरता से दूर भिन्न होती है। इस प्रकार, एएफएम आगे के प्रयोगों में झूठी डेटा प्रस्तुति को रोकते हुए कार्यप्रणाली को मान्य और पुष्टि करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है।

इस एएफएम आकलन में तैयार किए गए पांच हाइड्रोजेल नमूनों को मात्रात्मक दृष्टिकोण के माध्यम से मापा गया। प्रोटोकॉल 0.5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa, और 40 kPa, जो जैविक सब्सट्रेट कठोरता के स्तर की चौड़ाई की नकल विभिन्न सेल प्रकार के भेदभाव के लिए रिपोर्ट के हाइड्रोजेल कठोरता के स्तर पर ध्यान केंद्रित किया। एएफएम मापों से प्राप्त बल घटता एक एएफएम विश्लेषण एल्गोरिदम सॉफ्टवेयर(चित्रा 2)का उपयोग करके किलोपास्कल्स में युवा के लोचदार मॉड्यूलस उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया था।

पॉलीएक्रिलैमाइड हाइड्रोजेल सिस्टम और सेल प्रकारों की तुलना
टीएसई और सहयोगियों द्वारा मूल प्रोटोकॉल का यह अनुकूलन O9-1 कोशिकाओं20का उपयोग करके एनसीसी के मशीनी पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक कुशल और प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करता है। पिछले प्रोटोकॉल में संशोधनों में ईसीएम प्रोटीन इनक्यूबेशन को संशोधित करना शामिल है: 0.2% एसिटिक एसिड के साथ 50 mM HEPES की जगह और सेल संस्कृति के लिए 10% घोड़े सीरम और एफबीएस (चरण 1.3.14-1.3.15) के अलावा। इन संशोधनों को मूल (नियंत्रण) प्रोटोकॉल में इस संशोधित जेल प्रणाली पर O9-1 एनसीसी के विकास और रखरखाव की तुलना करके मान्य किया गया था। यहां, हमने बेसल माध्यम में प्रत्येक प्रणाली के लिए 1 kpa और 40 kPa के लोचदार मॉड्यूलस के साथ दोनों हाइड्रोजेल सिस्टम पर जंगली प्रकार O9-1 कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया। समग्र कोशिका विकास की स्थिति और विकास को एपोप्टोटिक विशेषताओं, तनावग्रस्त आकृति विज्ञान और हाइड्रोगेल के सेल अटैचमेंट के लिए एक ब्राइटफील्ड लाइट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कल्पना की गई थी। मूल जेल प्रणाली पर उगाई जाने वाली O9-1 कोशिकाओं के परिणामस्वरूप 1 किलोमीटरपीए और 40 केपीए हाइड्रोगेल दोनों के लिए गोल कोशिकाओं(चित्रा 3E,एफ)की अधिकता से संकेत दिया गया मृत कोशिकाओं की एक उच्च संख्या हुई।

इसके विपरीत, संशोधित जेल प्रणाली पर उगाई गई O9-1 कोशिकाओं ने स्वस्थ कोशिका विकास और हाइड्रोगेल सब्सट्रेट(चित्रा 3जी,एच)के लिए पर्याप्त लगाव का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, संशोधित हाइड्रोजेल प्रणाली के साथ एनसीसी की अनुकूलता का आकलन एनसीसी मार्कर, Tcfap2α (एपी-2) के यदि धुंधला प्रदर्शन करके किया गया था। एपी-2 माउस भ्रूण में विकास को विनियमित करने के लिए नेकां वंश में व्यक्त किया गया एक प्रतिलेखन कारक है, इस प्रकार यह अनुकूलता27का आकलन करने के लिए उपयुक्त बना रहा है । यद्यपि नियंत्रण और संशोधित हाइड्रोगेल प्रणालियों पर विकसित O9-1 कोशिकाओं दोनों ने एपी-2 व्यक्त किया था, लेकिन संशोधित हाइड्रोगेल सिस्टम पर चढ़ाया गया O9-1 कोशिकाओं में एपी-2 अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी, जैसा कि मजबूत फ्लोरेसेंस सिग्नल और इसी क्वांटिफिकेशन(चित्रा 4 ए,बी)द्वारा इंगित किया गया था।

इसके अलावा, P19 कोशिकाओं का उपयोग कोशिकाओं के विकास के लिए संशोधित हाइड्रोजेल प्रणाली के लाभों को और मान्य करने के लिए किया गया था। P19 एक भ्रूण कार्सिनोमा सेल लाइन है जो माउस28में भ्रूण-व्युत्पन्न टेराटोकार्सिनोमा से ली गई थी। इसी संस्कृति प्रोटोकॉल का उपयोग करना, P19 कोशिकाओं को अस्तित्व और विकास विशेषताओं की निगरानी के लिए नियंत्रण और संशोधित हाइड्रोजेल सिस्टम दोनों पर उगाया गया था। ब्राइटफील्ड इमेजिंग से पता चला है कि दोनों हाइड्रोजेल सिस्टम पर चढ़ाया गया P19 कोशिकाओं ने गोल फ्लोटिंग कोशिकाओं की अधिकता और सेल-सब्सट्रेट अटैचमेंट(चित्रा 3ए-डी)की कमी प्रदर्शित की। इस अवलोकन में यह सुझाव दिया गया था कि एनसीसी में यांत्रिक सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए O9-1 एनसीसी के लिए संशोधित प्रोटोकॉल अधिक उपयुक्त था ।

कठोर सब्सट्रेट्स पर उच्च तनाव फाइबर अभिव्यक्ति का दृश्य
संशोधित हाइड्रोगेल ने विभिन्न कठोरता स्तरों और अन्य प्रभावकर्ताओं के जैल पर सुसंस्कृत कोशिकाओं की आकृति विज्ञान में अंतर के मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति दी। एक बार जब हाइड्रोगेल सेल सीडिंग के लिए तैयार हो गए थे, तो जंगली प्रकार की O9-1 कोशिकाओं को विभिन्न कठोरता स्तर के हाइड्रोगेल पर पारित किया गया था। कोशिकाओं को उनके आकार, स्थानिक प्रसार, और यहां तक कि न्यूनतम मृत कोशिकाओं के साथ हाइड्रोगेल पर लगाव देख कर उनके स्वास्थ्य और विकास के लिए निगरानी की गई । कुछ अध्ययनों से उच्च कठोरता सब्सट्रेट्स पर एमएससी के लिए तनाव फाइबर और सेल आसंजन में वृद्धि देखी गई है, जिसमें यह सुझाव दिया गया है कि एक कठोर सब्सट्रेट पर उगाए गए एनसीसी भी नरम सब्सट्रेट्स29,30पर उगाए गए एनसीसी की तुलना में समान निष्कर्ष प्रदर्शित करेंगे।

एफ-ऐक्टिन के साथ-साथ मायोसिन II, α-ऐक्टिनिन, और अन्य साइटोस्केलेल प्रोटीन को सामूहिक रूप से तनाव फाइबर31के रूप में जाना जाता है। पिछले अध्ययनों में यांत्रिक बल में वृद्धि के प्रत्युत्तर में तनाव फाइबर असेंबली में वृद्धि देखीगई। तनाव फाइबर के एक या दोनों सिरों पर, फोकल आसंजन परिसर के अनुलग्नक कोशिकाओं को प्रवास और ईसीएम31का पालन करने में सक्षम बनाते हैं। एनसीसीएस में एफ-ऐक्टिन अभिव्यक्ति और संगठन की कल्पना करने के लिए फालोइडिन धुंधला ने मैकेनिकल सिग्नलिंग(चित्र 5)के जवाब में स्वस्थ सेल विकास का प्रदर्शन किया। इसके अतिरिक्त, कम या उच्च कठोरता हाइड्रोगेल पर उगाई जाने वाली O9-1 कोशिकाओं ने तनाव फाइबर(चित्र 5)की अलग-अलग मात्रा के माध्यम से विभिन्न मॉर्फोलोजी का प्रदर्शन किया। एमएससी का उपयोग करके किए गए रिपोर्ट किए गए अध्ययनों के अवलोकनों के समान, यह देखा गया कि एक कठोर सब्सट्रेट पर उगाई जाने वाली O9-1 कोशिकाओं, 40 kPa, अधिक तनाव फाइबर प्रदर्शित करती है और एक नरम हाइड्रोगेल पर उगाई गई कोशिकाओं की तुलना में अच्छी तरह से फैलती थी, जो 1 kPa कठोरता29,30द्वारा इंगित की गई थी।

सेल आसंजन का आकलन
इस परिकल्पना की पुष्टि करने के लिए कि सब्सट्रेट कठोरता में परिवर्तन एनसीसी आसंजन को प्रभावित करता है, वीसीएल अभिव्यक्ति में परिवर्तन को एनसीसी में आरटी-क्यूपीसीआर के माध्यम से मात्रात्मक रूप से मापा गया था जो विभिन्न हाइड्रोजेल कठोरता के स्तर का जवाब देते हैं । वीसीएल कोशिका की प्रक्रिया के दौरान फोकल आसंजन परिसर में मौजूद कई साइटोस्केलेल प्रोटीन में से एक है जो सब्सट्रेट के साथ संपर्क स्थापित करता है और ईसीएम गुणों को32को संवेदन करता है। फोकल आसंजन इंटीग्रीन रिसेप्टर्स के माध्यम से ईसीएम के लिए कोशिकाओं के संपर्क बिंदु हैं, जो साइटोप्लाज्मिक ऐक्टिन साइटोस्केलेटन, एफ-ऐक्टिन33 वीसीएल जीन अभिव्यक्ति स्तर के लिए लंगर डालते हैं, जो सब्सट्रेट्स कठोरता के जवाब में ओ 9-1 कोशिकाओं के फोकल आसंजन और सेल आसंजन में बदलाव का सुझाव देता है।

पिछले अध्ययनों ने अपनी अभिव्यक्ति में अंतर से भ्रूणीय स्टेम और फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं में कोशिका आसंजन पर वीसीएल का प्रभाव दिखाया । वीसीएलकी उच्च अभिव्यक्ति के प्रत्युत्तर में फोकल आसंजन की संख्या और आकार भी बढ़ गया लेकिन जब वीसीएल ने 34नीचे दस्तक दी तो कम हो गई . लगातार, वीसीएलकी कमी कोशिकाओं ने भी कोशिका आसंजन में उल्लेखनीय कमी दिखाई और35फैल रहे हैं। इसके अलावा, वीसीएल फोकल आसंजन36को स्थिर करके सेल आसंजन को विनियमित करने में भूमिका निभाता है। फोकल आसंजन, परिपक्वता स्तर और रचनाओं का आकार सब्सट्रेट कठोरता के अनुसार भिन्न होता है, इस प्रकार संकेतों को इंट्रासेल्यूलर रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति देता है और कोशिकाओं को उनके पर्यावरणीय संकेतों का जवाब देने के लिए37। इस प्रकार, वीसीएल को कठोर सब्सट्रेट्स पर उगाई जाने वाली कोशिकाओं में फोकल आसंजन परिसरों में अत्यधिक भर्ती किया जाता है, जैसा कि आरटी-क्यूपीसीआर(चित्रा 6 सी)द्वारा पाए गए उच्च एमआरएनए स्तरों द्वारा परिलक्षित होताहै।

नरम सब्सट्रेट्स पर उगाई जाने वाली कोशिकाएं न्यूनतम फोकल आसंजन परिसर बनाती हैं, जैसा कि कोशिकाओं में वीसीएल के निचले एमआरएनए स्तर15से परिलक्षित होता है। चित्रा 6Cमें, O9-1 कोशिकाओं ने नरम सब्सट्रेट की तुलना में कड़े सब्सट्रेट पर वीसीएल की उच्च अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया। ये परिणाम नरम सब्सट्रेट्स पर O9-1 कोशिकाओं की तुलना में कठोर सब्सट्रेट्स पर O9-1 कोशिकाओं के सेल-सब्सट्रेट आसंजन के उच्च स्तर का सुझाव देते हैं। इसके अलावा, वीसीएल अभिव्यक्ति को आरटी-क्यूपीसीआर खोज को और पूरक और समर्थन देने के लिए एंटी-वीसीएल एंटीबॉडी के साथ धुंधला होने के माध्यम से गुणात्मक रूप से कल्पना की गई थी। लगातार, कठोर सब्सट्रेट पर उगाए जाने वाले O9-1 कोशिकाओं में वीसीएल अभिव्यक्ति नरम सब्सट्रेट(चित्रा 6A,बी) पर उगाए गए लोगों की तुलना में अधिकथी,जिसने उच्च सेल आसंजन के प्रारंभिक निष्कर्ष का समर्थन किया और आरटी-क्यूपीसीआर के माध्यम से एफ-ऐक्टिन फ्लाइडिन दाग और वीसीएल अभिव्यक्ति के साथ मनाया गया 1 केपीए हाइड्रोजेल की तुलना में 40 केपीए हाइड्रोगेल पर फैल गया।

Figure 1
चित्रा 1:एएफएम जांच के इंडेंटेशन से उत्पन्न बल वक्र। बल (वाई-एक्सिस) एनएन में लागू आवश्यक बल को इंगित करता है, और जेड (एक्स-एक्सिस) माइक्रोन में नमूने से ब्रूकर एएफएम जांच दूरी को इंगित करता है। 1 केपीए हाइड्रोजेल(ए)के लिए, उत्पन्न ढलान कोमल बनाम 40 केपीए हाइड्रोजेल(बी)के लिए मनाया गया स्टीपर ढलान है। रंगीन घटता एएफएम जांच पर कैंटिलीवर के आंदोलन का प्रतिनिधित्व करते हैं क्योंकि यह हाइड्रोगेल नमूने से (नीला) और रिएक (लाल) तक पहुंचता है। वक्र का उच्चतम प्रारंभिक बिंदु ग्लास कवरलिप के कठोर संपर्क को इंगित करता है। (ख)40 केपीए हाइड्रोगेल में मुकर गए वक्र में बड़ी डुबकी मनका और नमूने के बीच आसंजन को इंगित करती है। संक्षिप्त नाम: एएफएम = परमाणु बल माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:हाइड्रोगेल्स (केपीए में) की औसत कठोरता की गणना युवा के लोचदार मॉड्यूलस से की जाती है। युवा के मॉड्यूलस चित्रा 1से बल घटता से उत्पन्न किया गया था । हाइड्रोगेल्स के संदर्भित इलास्टिक मोडुली 0.5 केपीए, 1 केपीए, 10 केपीए, 20 केपीए और 40 केपीए थे। त्रुटि सलाखों मानक विचलन का संकेत मिलता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:कोशिका विकास विशेषताओं का पता लगाने के लिए 1 केपीए और संशोधित जेल प्रणालियों के 40 केपीए हाइड्रोगेल पर चढ़ाए गए पी 19 और O9-1 कोशिकाओं की उज्ज्वल-क्षेत्र छवियां। मृत कोशिकाओं को लाल तीर से इंगित किया जाता है। स्केल बार = 25 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:एनसीसी अनुकूलता की कल्पना करने के लिए ओ9-1 एनसीसी में एनसीसी मार्कर एपी-2 का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला। (ए)40 केपीए संशोधित हाइड्रोजेल सिस्टम की तुलना में(बी)40 केपीए नियंत्रण। एपी-2 (हरा); नाभिक दापी (नीला) से सना हुआ था। स्केल बार = 25 माइक्रोन(C)बार ग्राफ एपी-2 अभिव्यक्ति स्तर का मात्राकरण प्रदान करता है जो महत्व दिखाता है(पी-वैल्यू= 0.003) (एन = 3)। डेटा प्रदान की मानक विचलन त्रुटि सलाखों के साथ सापेक्ष अभिव्यक्ति दिखाते हैं। संक्षिप्त रूप: एनसीसी = तंत्रिका क्रेस्ट सेल; DAPI = 4', 6-diamidino-2-फेनिलिंडोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:एफ-ऐक्टिन के फ्लोरोसेंट फ्लोइडिन स्टेनिंग में तनाव फाइबर दिखाई देते हैं जो 40 केपीए हाइड्रोगेल पर O9-1 कोशिकाओं में अच्छी तरह से फैलते हैं। O9-1 कोशिकाओं को 1 kPa(A)और 40 kPa हाइड्रोगेल(बी)पर सुसंस्कृत किया गया था। O9-1 कोशिकाओं एलेक्सा फ्लोर 488 फलोडिन (हरे) का उपयोग कर दाग थे, और नाभिक DAPI (नीले) के साथ दाग थे। स्केल बार = 25 माइक्रोन। संक्षिप्त नाम: DAPI = 4′, 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6:O9-1 कोशिकाओं में विनक्यूलिन की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। O9-1 कोशिकाओं को 1 केपीए(ए)और 40 केपीए(बी)हाइड्रोगेल पर चढ़ाया गया था। नाभिक दापी (नीला) से सना हुआ था। स्केल बार = 25 माइक्रोन(सी)O9-1 कोशिकाओं में वीसीएल के कुल एमएनए स्तर का वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण 1 केपीए और 40 केपीए हाइड्रोगेल पर सुसंस्कृत है। 1 केपीए हाइड्रोगेल पर वीसीएल अभिव्यक्ति स्तर 40 केपीए हाइड्रोगेल(पी-वैल्यू= 0.02) की तुलना में काफी कम है। डेटा प्रदान किए गए मानक विचलन त्रुटि सलाखों के साथ औसत दिखाता है। संक्षिप्त नाम: DAPI = 4′, 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

500 माइक्रोल कुल मात्रा 0.5 केपीए 1 केपीए 10 केपीए 20 केपीए 40 केपीए
40% एक्रिलैमाइड (माइक्रोन) 37.5 62.5 125 100 100
20% बीआईएस-एक्रिलैमाइड (μL) 15 7.5 25 66 120
एच2O (μL) 447.5 430 350 334 280
10% एपीएस (μL) 5 5 5 5 5
TEMED (μL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

तालिका 1: वांछित कठोरता के स्तर को प्राप्त करने के लिए समाधानों की इसी मात्रा।

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Discussion

वर्तमान अध्ययन का लक्ष्य एनसीसी में यांत्रिक संकेतों के प्रभाव को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक प्रभावी और कुशल इन विट्रो प्रणाली प्रदान करना है । ऊपर उल्लिखित कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का पालन करने के अलावा, शोधकर्ताओं को यह ध्यान में रखना होगा कि O9-1 NCCs की सेल संस्कृति हाइड्रोगेल्स तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लास कवरस्लिप के प्रकार से प्रभावित होती है। उदाहरण के लिए, यह नोट किया गया था कि एक विशिष्ट प्रकार के ग्लास कवरलिप (सामग्री की मेजदेखें) पर वरीयता प्राप्त कोशिकाएं बच गईं और अच्छी तरह से बढ़ी, जबकि अन्य प्रकार के ग्लास कवरस्लिप पर वरीयता प्राप्त सुसंस्कृत कोशिकाओं ने अधिक कोशिका मृत्यु दिखाई। इसके अलावा, O9-1 NCCs38के लिए सही सेल संस्कृति की स्थिति का कड़ाई से पालन करना महत्वपूर्ण है। कोशिका संस्कृति की गुणवत्ता इष्टतम है जब हाइड्रोगेल का उपयोग जितनी जल्दी हो सके या दो दिनों तक बाँझ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संग्रहीत किया जाता है।

प्रोटोकॉल में प्रत्येक घटक की संवेदनशीलता के कारण, लोचदार मॉड्यूली प्रयोगों में भिन्न हो सकता है। 10% एपीएस के बारे में प्रोटोकॉल (चरण 1.3.2) में उल्लिखित बिंदुओं के अलावा, ध्यान में रखने के लिए अन्य महत्वपूर्ण कारक भी भिन्नता को प्रभावित करते हैं। एक अन्य कारक जो एएफएम माप में बड़ी विविधताओं के कारण होने का संदेह था, हाइड्रोगेल की मोटाई थी। पिछले एक अध्ययन में 15 से १० माइक्रोन तक के युवा मोडुली पर मोटाई के प्रभाव की जांच की गई थी, और पाया था कि मोटाई में अंतर युवा की मोडुली को काफी३९नहीं बदलता था । हालांकि, सब्सट्रेट्स की मोटाई यांत्रिक गुणों को भी प्रभावित करती है जिन्हें कोशिकाएं समझ सकती हैं, जिससे विभिन्न मॉर्फोलोजी40,41,42होते हैं। विभिन्न अध्ययनों से पता चला है कि हाइड्रोगेल की मोटाई में उल्लेखनीय वृद्धि के कारण कोशिका क्षेत्र में कमी आई, फैल गया, और हाइड्रोगेल की प्रभावी कठोरता40,41,42हो गई। हालांकि, कोशिकाओं के फेनोटाइप भी काफी पतले हाइड्रोगेल के जवाब में बदलते हैं, उदाहरण के लिए, कम कठोरता वाले हाइड्रोगेल40,41,42पर भी उच्च फैलते हैं। पॉलीएक्रिलैमाइड जैल की लगातार मात्रा के साथ, हाइड्रोगेल की मोटाई एक समान होनी चाहिए ताकि मामूली विचलन एएफएम मापों में लोचदार मॉड्यूलस को काफी प्रभावित न करे।

अल्कोहल बर्नर का उपयोग करके लौ में उन्हें आगे और पीछे से गुजरकर कवरस्लिप को स्टरलाइज करना बेहतर होता है क्योंकि अन्य नसबंदी विधियां अधिक जटिल हो सकती हैं और ग्लास कवरस्लिप को संभावित क्षति पहुंचा सकती हैं। प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर ग्लास कवर्लिप्स के विभिन्न आकारों का उपयोग किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में क्रमशः इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और आरटी-क्यूपीसीआर के लिए 12 मिमी और 25 मिमी कवरस्लिप का उपयोग किया गया। प्रयोगों के अनुरूप उचित आकार के जैल का उपयोग करना दक्षता को प्रोत्साहित करता है और कचरे को कम करता है। इन संशोधनों को मूल (नियंत्रण) हाइड्रोजेल प्रणाली20की तुलना में O9-1 एनसीसी के लिए अनुकूलन सुनिश्चित करने के लिए गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से मान्य किया गया था । ओ 9-1 एनसीसी के समग्र स्वास्थ्य और विकास का आकलन सेलुलर और सब्सट्रेट अटैचमेंट विशेषताओं के लिए एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के तहत किया गया था।

इसके अलावा, O9-1 कोशिकाओं की अनुकूलता की तुलना नियंत्रण और संशोधित हाइड्रोगेल प्रणालियों दोनों के बीच की गई थी ताकि यदि धुंधला का उपयोग करके एपी-2 अभिव्यक्ति की गुणात्मक कल्पना करके इस प्रोटोकॉल में संशोधनों को और मान्य किया जा सके। संकेतों की तीव्रता को संशोधित हाइड्रोगेल सिस्टम बनाम नियंत्रण बनाम O9-1 कोशिकाओं में एपी-2 अभिव्यक्ति की प्रतिनिधि छवियों का समर्थन करने के लिए निर्धारित किया गया था। जबकि एपी-2 एक आम एनसीसी मार्कर है, अन्य प्रसिद्ध मार्कर को सत्यापन के लिए विचार किया जाना चाहिए, जैसे Sox10 और Pax3, पूर्णपितता और अस्तित्व28के एनसीसी रखरखाव के लिए उनके महत्व के कारण। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में अनुकूलन को एक अन्य सेल लाइन, पी 19 के साथ O9-1 एनसी कोशिकाओं की तुलना करके पुष्टि की गई थी, ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि यह हाइड्रोगेल प्रणाली नेकां कोशिकाओं के लिए कुशल और विश्वसनीय है। हालांकि P19 कोशिकाओं अमर विशेषताओं है और आसानी से सुसंस्कृत कर रहे हैं, वे अच्छी तरह से हाइड्रोगेल प्रणालियों में से किसी पर कामयाब नहीं किया ।

सब्सट्रेट या ऊतक कठोरता से उत्पन्न विस्तारक बल का प्रतिरोध जहां कोशिकाएं संलग्न होती हैं, अक्सर युवा के लोचदार मॉड्यूलस45के रूप में व्यक्त की जाती हैं। एएफएम के साथ, युवा के लोचदार मॉड्यूलस को लागू ऊर्ध्वाधर बल26से उत्पन्न बल वक्र से प्राप्त किया जाता है। एएफएम माप के दौरान बड़ी भिन्नताएं हो सकती हैं, माप के बीच जो कठोर हाइड्रोगेल के लिए गलत रीडिंग का कारण बन सकती हैं। विसंगति माप के लिए उपयोग की जाने वाली अनुचित जांच के कारण हो सकती है। उदाहरण के लिए, 20 kPa और 40 kPa हाइड्रोगेल के माप के लिए उच्च वसंत स्थिर (k = 0.24 N/m) के साथ एक कठोर जांच के उपयोग की आवश्यकता होती है। एक कठोर जांच एक नरम जांच की तुलना में एक कम संकल्प के लिए अनुमति देता है; हालांकि, वहाँ कारणों के रूप में भी नरम कैंटिलीवर्स नमूनों का पालन कर सकता है एक stiffer जांच की पसंद एहसान कर रहे हैं46. इसके अलावा, बहुत नरम जांच अत्यधिक संवेदनशील हैं, अवांछित कणों से झूठे संकेतों में योगदान देते हैं और जिसके परिणामस्वरूप वास्तविक कठोरता46की तुलना में कृत्रिम रूप से कम या उच्च कठोरता मूल्य होते हैं। इसके अलावा, पॉइसन के अनुपात के सटीक इनपुट को मापने वाली सामग्री के आधार पर ध्यान दिया जाना चाहिए; यह मानकीकृत अध्ययनों में पाया जा सकता है क्योंकि यह डेटा आउटपुट को काफी प्रभावित करता है।

इसके अलावा, एएफएम का उपयोग हाइड्रोगेल की मोटाई को मापने के लिए किया गया था, क्योंकि मोटाई एक और यांत्रिक संपत्ति है जो प्रभावित करती है कि कोशिकाएं अपने पर्यावरणको 47,42कैसे समझती हैं। विभिन्न रिपोर्ट किए गए अध्ययनों में, नरम हाइड्रोगेल पर उगाई जाने वाली कोशिकाओं को "महत्वपूर्ण मोटाई" पर और उससे परे आकार में पाया जाता है, जो कोशिका प्रकार47, 42, 48के आधार पर ~2-5माइक्रोन पर रिपोर्ट कियाजाताहै। हालांकि, बहुत अधिक प्रसार तब देखा गया जब कोशिकाओं को उसी कठोरता के हाइड्रोगेल पर चढ़ाया गया था लेकिन "महत्वपूर्णमोटाई" 42, 48की तुलना में कममोटाईथी। इस रोचक निष्कर्ष के लिए एक संभावित स्पष्टीकरण यह है कि हाइड्रोगेल की उप-महत्वपूर्ण मोटाई कोशिकाओं को कठोर अंतर्निहित ग्लास कवरस्लिप को समझने में सक्षम बनाती है क्योंकि कोशिकाएं पार्श्व विस्थापन47के लिए कर्षण डालती हैं। सभी कठोरता हाइड्रोगेल में औसत मोटाई 27 माइक्रोन के मानक विचलन के साथ 342 माइक्रोन थी। हाइड्रोगेल की मोटाई सुझाए गए "महत्वपूर्ण मोटाई" से अधिक थी, और 400 माइक्रोन के तहत परीक्षण सीमा के भीतर, जो अध्ययनों और निर्मित प्रीमेड हाइड्रोगेल में रिपोर्ट की गई थी, जैसे कि कोशिकाएं हाइड्रोगेल की अलग कठोरता को समझ सकती हैं न कि अंतर्निहित कठोर ग्लास कवर्लिप42,48।

एएफएम मात्रात्मक विश्लेषण विधि के अलावा, O9-1 कोशिकाओं में अलग-अलग कठोरता से प्रभावित मार्कर की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने और कोशिकाओं के स्वस्थ विकास की कल्पना करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के माध्यम से हाइड्रोगेल का भी गुणात्मक विश्लेषण किया गया था। साइटोप्लाज्म में एफ-ऐक्टिन साइटोस्केलेल प्रोटीन के एक सेट के माध्यम से झिल्ली से बंधे इंटीग्रीन से जुड़ा हुआ है, जैसे तालिन और वीसीएल, फोकल आसंजन परिसर33बनाते हैं। कोशिकाओं में तनाव फाइबर की अभिव्यक्ति का विश्लेषण कोशिकाओं में अन्य साइटोस्केलेल जीन की अभिव्यक्ति को मापने के द्वारा भी किया जा सकता है, जैसे कि टैलिन और इंटीग्रीन, जिसे फोकल आसंजन धुंधला किट का उपयोग करके एक साथ कल्पना की जा सकती है।

हाइड्रोजेल कठोरता की अलग-अलग डिग्री थी जो एनसीसी आकृति विज्ञान और प्रतिक्रिया को प्रभावित करती थीं, जैसा कि यांत्रिक सिग्नलिंग के माध्यम से सेल आसंजन और तनाव फाइबर में परिवर्तन में देखा गया था। यह प्रोटोकॉल विट्रोमें इसी संस्कृति की स्थितियों को संशोधित करके विभिन्न सेल प्रकारों में सेल भेदभाव को प्रभावित करने की क्षमता प्रदान करता है, इस प्रकार एनसीसी में यांत्रिक संकेतों और रासायनिक संकेतों में हेरफेर का एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, एनसीसी भेदभाव का भाग्य काफी हद तक आसपास के ऊतकों में मौजूद यांत्रिक बलों द्वारा निर्देशित होता है, जिसमें इसकी कठोरता2,3शामिल है। जबकि इस पत्र का तात्कालिक लक्ष्य एनसीसी संस्कृति के लिए हाइड्रोगेल तैयार करने के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल विकसित करना था, इस प्रोटोकॉल के संभावित लाभ कार्यप्रणाली से परे हैं, जो एनसीसी में यांत्रिक सिग्नलिंग के आगे ज्ञान का पीछा करते हैं । यह भी देखने लायक है कि इस इन विट्रो सिस्टम की कुछ सीमाएं हैं। हाइड्रोगेल बनाने की इस तकनीक में कई कदम शामिल हैं जो संभावित रूप से रास्ते में तकनीकी विविधताओं को पेश कर सकते हैं, जिसमें विषमता, असमान सतह और गलत कठोरता शामिल हैं। इसलिए, प्रयोगों के दौरान तकनीकी विविधताओं को कम करने के लिए उपयोगकर्ताओं को इन चरणों को सावधानीपूर्वक करना चाहिए। इसके अलावा, इस प्रणाली में पॉलीएक्रेलैमाइड जैल एक्रिलैमाइड की विषाक्तता के कारण 2डी संस्कृति तक सीमित अध्ययन करते हैं, सटीक 3 डी जैविक वातावरण की अनदेखी करते हुए एनसीसी50में रहते हैं।

इन बाधाओं के बावजूद, यह इन विट्रो सिस्टम एक सस्ती और सरल विधि के लिए अनुमति देता है जो अनुसंधान के सभी स्तरों को लाभान्वित करता है और शोधकर्ताओं को पर्याप्त और कार्यात्मक डाउनस्ट्रीम परीक्षण करने में सक्षम बनाता है। जैसा कि हाल के निष्कर्षों में देखा गया है, एनसीसी दोनों यांत्रिक सिग्नलिंग पर काफी भरोसा करते हैं, जैसे कतरनी बल और सब्सट्रेट कठोरता, और रासायनिक सिग्नलिंग, जैसे कि डब्ल्यूएनटी और फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर सिग्नलिंग, क्रैनियोफेशियल में, साथ ही कशेरुकी6,15में दिल का विकास। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, इन विट्रो प्रयोगों के लिए स्थानीय माइक्रोएनवायरमेंट्स को एनसीसी पर भविष्य के अध्ययनों के लिए आसानी से नकल की जा सकती है, जिसमें भेदभाव, माइग्रेशन, सेलुलर प्रतिक्रियाएं और हानिकारक रोग प्रगति की क्षमता शामिल है। इसलिए, यह इन विट्रो प्रणाली एनसीसी में यांत्रिक संकेत की भूमिकाओं और अन्य सिग्नलिंग रास्तों के साथ उनकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण होगी, जो एनसीसी विकास और संबंधित बीमारियों के आणविक और आनुवंशिक तंत्र की समझ को गहरा करेगी ।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस परियोजना में AFM में योगदान विशेषज्ञता के लिए, टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के विश्वविद्यालय में परमाणु बल माइक्रोस्कोप-यूटी कोर सुविधा के ऑपरेटर डॉ एना-मारिया Zaske का शुक्रिया अदा करते हैं । हम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704, और R01HL142704 से जे वांग) के वित्तपोषण स्रोतों का भी धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip Chemglass Life Sciences CLS-1763-012
2% Bis-Acrylamide Sigma Aldrich M1533
24-well plate Greiner Bio-one 662165
25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip Chemglass Life Sciences CLS-1763-025
3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) Sigma Aldrich A3648
4-well cell culture plate Thermo Scientific 179830
4% Paraformaldehyde Sigma Aldrich J61899-AP
40% Acrylamide Sigma Aldrich A4058
50% glutaraldehyde Sigma Aldrich G7651
6-well cell culture plate Greiner Bio-one 657160
AFM cantilever (spherical bead) Novascan
AFM software Catalyst NanoScope Model: 8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher A12379
Ammonium Persulfate (APS) Sigma Aldrich 248614 Powder
anti-AP-2α Antibody Santa Cruz sc-12726
anti-Vinculin antibody Abcam ab129002
Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst Bruker Corporation
Collagen type I (100mg) Corning 354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher D1306
Dichloromethylsilane (DCMS) Sigma Aldrich 440272
Donkey serum Sigma Aldrich D9663
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Corning 10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV
Fluorescence microscope Leica Model DMi8
Fluoromount-G mounting medium SouthernBiotech 0100-35
HEPES Sigma Aldrich H3375 Powder
Horse serum Corning 35-030-CI
iScript Reverse Transcription Supermix Bio-Rad 1708841
Penicillin-Streptomycin antibiotic Thermo Fisher 15140148
RNeasy micro kit Qiagen 74004
Sterile 1x PBS Hyclone SH30256.02
Sterile deionized water Hardy Diagnostics U284
sulfo-SANPAH Thermo Fisher 22589
SYBR green Applied Biosystems 4472908
TEMED Sigma Aldrich T9281
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Tween 20 Sigma Aldrich P9416

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 174 तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाएं यांत्रिक संकेत O9-1 कोशिकाएं परमाणु बल माइक्रोस्कोपी
तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं में यांत्रिक संकेतों का अध्ययन करने के लिए एक अनुकूलित O9-1/हाइड्रोजेल सिस्टम
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Le, T. P., Zhao, X., Erhardt, S.,… More

Le, T. P., Zhao, X., Erhardt, S., Gu, J., Wang, H., Findley, T. O., Wang, J. An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells. J. Vis. Exp. (174), e62693, doi:10.3791/62693 (2021).

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