Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

מערכת O9-1/הידרוג'ל ממוטבת לחקר אותות מכניים בתאי ציצית עצבית

Published: August 13, 2021 doi: 10.3791/62693
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3, 3, 1, 1,2
1Department of Pediatrics, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2The University of Texas MD Anderson Cancer Center UTHealth Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas Health Science Center at Houston, 3SEM AFM Core in the Houston Methodist Hospital Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקולים מפורטים שלב אחר שלב מתוארים כאן לחקר אותות מכניים במבחנה באמצעות תאי פסגה עצביים O9-1 רב-תכליתיים והידרוגלים פוליאקרילמידים בעלי קשיחות משתנה.

Abstract

תאי ציצית עצבית (NCCs) הם תאים רב-תכליתיים עובריים בעלי חוליות שיכולים לנדוד ולהבדיל למגוון רחב של סוגי תאים המעוררים איברים ורקמות שונים. נוקשות רקמות מייצרת כוח מכני, סימן פיזי הממלא תפקיד קריטי בבידול NCC; עם זאת, המנגנון עדיין לא ברור. השיטה המתוארת כאן מספקת מידע מפורט עבור הדור הממוטב של הידרוג'לים polyacrylamide של נוקשות משתנה, מדידה מדויקת של נוקשות כזו, ואת ההערכה של ההשפעה של אותות מכניים בתאי O9-1, קו NCC המחקה ב NCCs vivo.

נוקשות הידרוג'ל נמדדה באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) והצביעה על רמות נוקשות שונות בהתאם. O9-1 NCCs תרבית על הידרוג'לים של נוקשות משתנה הראה מורפולוגיה תאים שונים ביטוי גנים של סיבי מתח, אשר הצביעו על השפעות ביולוגיות שונות הנגרמות על ידי שינויים באותות מכניים. יתר על כן, זה קבע כי שינוי נוקשות הידרוג'ל הביא מערכת במבחנה יעילה כדי לתפעל איתות מכני על ידי שינוי נוקשות ג'ל וניתוח הרגולציה המולקולרית והגנטית ב NCCs. O9-1 NCCs יכול להבדיל למגוון רחב של סוגי תאים תחת השפעת מדיית הבידול המתאימה, וזה נוח לתפעל אותות כימיים במבחנה. לכן, מערכת במבחנה זו היא כלי רב עוצמה לחקור את התפקיד של איתות מכני ב- NCCs ואת האינטראקציה שלה עם אותות כימיים, אשר יסייע לחוקרים להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים והגנטיים של התפתחות ציצית עצבית ומחלות.

Introduction

תאי ציצית עצבית (NCCs) הם קבוצה של תאי גזע במהלך עובר חוליות עם יכולת יוצאת דופן לנדוד ולתרום להתפתחות של איברים ורקמות שונים. NCCs יכול להבדיל לסוגי תאים שונים, כולל נוירונים חושיים, סחוס, עצם, מלנוציטים ותאי שריר חלקים, בהתאם למיקום המקור האקסיאלי וההדרכה הסביבתית המקומית של NCC1,2. עם היכולת להבדיל למגוון רחב של סוגי תאים, חריגות גנטיות הגורמות לדיסרגציה בכל שלב של התפתחות פסגת עצבים (NC) יכולות להוביל למחלות מולדות רבות2. לדוגמה, הפרעות במהלך היווצרות, הגירה, ופיתוח של NCCs להוביל להפרעות התפתחותיות המכונה באופן קולקטיבי נוירוקריסטופתיות1,3. מחלות אלה נעות בין פגמים craniofacial עקב כישלון בהיווצרות NCC, כגון תסמונת Treacher קולינס, להתפתחות של סוגי סרטן שונים עקב יכולת הנדידה גרורתית NCC, כפי שניתן לראות מלנומה3,4,5,6. במהלך העשורים האחרונים, חוקרים גילו תגליות מדהימות על התפקידים והמנגנונים של NCCs בפיתוח ומחלות, כאשר רוב הממצאים התמקדו באותות כימיים7,8. לאחרונה, אותות מכניים צוינו לשחק תפקיד קריטי אך לא מובן בפיתוח NCC9,10.

הרמזים הסביבתיים של NCCs לשחק תפקיד קריטי במהלך הפיתוח שלהם, כולל הרגולציה של בידול NCC לסוגי תאים שונים. רמזים סביבתיים, למשל רמזים פיזיים, משפיעים על התנהגויות מרכזיות ותגובות תאיות, כגון גיוון תפקודי. Mechanotransduction מאפשר לתאים לחוש ולהגיב לרמזים אלה כדי לשמור על תהליכים ביולוגיים שונים2. NCCs מוקפים בתאים שכנים ומצעים שונים, כגון מטריצה חוץ תאית (ECM), אשר יכול להוליד גירויים מכניים כדי לשמור על הומאוסטזיס ולהתאים את השינויים באמצעות קביעת גורל, התפשטות, אפופטוזיס11. Mechanotransduction מתחיל בקרום הפלזמה שבו המרכיב החושי של גירויים חוץ תאיים מכני מתרחש, וכתוצאה מכך את הוויסות התאי של התא12. אינטגרינים, הידבקויות מוקד וצמתים של ממסר קרום הפלזמה אותות מכניים, כגון כוחות גיסת, מתח, ואת נוקשות של המצעים שמסביב, לתוך אותות כימיים כדי לייצר תגובות תאיות12. העברת אותות כימיים מקרום הפלזמה לוויסות התאי הסופי מתבצעת באמצעות מסלולי איתות שונים כדי לסיים תהליכים חיוניים עבור האורגניזם, כגון בידול.

מספר מחקרים הראו כי איתות מכני מנוקשות מצע ממלא תפקיד בבידול התא13,14. לדוגמה, מחקרים קודמים הראו כי תאי גזע mesenchymal (MSCs) גדל על מצעים רכים עם נוקשות דומה לזו של רקמת המוח (בטווח של 0.1-1.0 kPa) הביא בידול תאים עצביים15,16. עם זאת, יותר MSCs להבדיל לתוך תאים דמויי myocyte כאשר גדל על מצעים 8-17 kPa מחקה את נוקשות השריר, בעוד בידול דמוי osteoblast נצפתה כאשר MSCs היו תרבית על מצעים נוקשים (25-40 kPa)15,16. המשמעות של mechanotransduction מודגשת על ידי אי סדרים וחריגות במסלול איתות מכני שעלול להוביל פגמים התפתחותיים חמורים ומחלות, כולל סרטן, מחלות לב וכלי דם, אוסטאופורוזיס17,18,19. בסרטן, רקמת שד רגילה רכה, והסיכון לסרטן השד עולה ברקמת שד נוקשה וצפופה, סביבה הדומה יותר לגידולי השד15. עם ידע זה, ההשפעות של איתות מכני על פיתוח NCC ניתן ללמוד באמצעות מניפולציה פשוטה של נוקשות מצע באמצעות מערכת במבחנה, מתן יתרונות נוספים ואפשרויות בהבנת היסודות של התקדמות המחלה הקשורים NC ואטיולוגיה.

כדי לחקור את ההשפעה של אותות מכניים ב- NCCs, הקמנו מערכת במבחנה יעילה עבור NCCs המבוססת על אופטימיזציה של שיטות שפורסמו בעבר והערכה של התגובות של NCCs לאותות מכניים שונים20,21. פרוטוקול מפורט סופק להכנת נוקשות הידרוג'ל משתנה והערכה של ההשפעה של איתות מכני ב- NCCs. כדי להשיג זאת, O9-1 NCCs מנוצלים כמודל NC כדי ללמוד את ההשפעות והשינויים בתגובה הידרוג'ל נוקשה לעומת רך. O9-1 NCCs הם קו תא NC יציב מבודד מעובר העכבר (E) ביום 8.5. O9-1 NCCs מחקים NCCs ב- vivo מכיוון שהם יכולים להבדיל לסוגי תאים שונים שמקורם ב- NC במדיה מוגדרת של בידול22. כדי לחקור את האיתות המכני של NCCs, מצע מטריצה היה מפוברק עם גמישות טונה מריכוזים שונים של אקרילאמיד ופתרונות ביס-אקרילאמיד כדי להשיג את הנוקשות הרצויה, בקורלציה נוקשות המצע הביולוגי20,21,23. כדי למטב את התנאים של מצע מטריצה עבור NCCs, במיוחד תאי O9-1, שינויים נעשו מפרוטוקול20שפורסם בעבר . שינוי אחד שנעשה בפרוטוקול זה היה לדגור על הידרוג'לים בקולגן I, מדולל ב 0.2% חומצה אצטית במקום 50 mM HEPES, ב 37 °C (57 °F) לילה. ה- pH הנמוך של חומצה אצטית מוביל להפצה הומוגנית ושילוב קולגן I גבוה יותר, ובכך מאפשר התקשרות אחידה יותר של חלבון ECM24. בנוסף, שילוב של סרום סוס סרום בקר עוברי (FBS) שימש בריכוזים של 10% ו 5% מלוחים חוצץ פוספט (PBS), בהתאמה, לפני אחסון הידרוג'ל באינקובטור. סרום סוס שימש כתוספת נוספת FBS בשל יכולתו לקדם התפשטות תאים ובידול בריכוז של 10%25.

בשיטה זו, סביבה ביולוגית חיקה על ידי ציפוי חלבון ECM (למשל, קולגן I) כדי ליצור סביבת במבחנה מדויקת עבור NCCs לגדול ולשרוד20,21. נוקשות ההידרוגלים המוכנים נותחה כמותית באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM), טכניקה ידועה לתיאור המודולוס האלסטי26. כדי לחקור את ההשפעה של רמות נוקשות שונות על NCCs, תאי O9-1 מסוג בר היו בתרבית והוכנו על הידרוג'לים עבור immunofluorescence (IF) מכתים נגד actin filamentous (F-actin) כדי להראות את ההבדלים הידבקות תאים ומורפולוגיות בתגובה לשינויים נוקשות מצע. תוך שימוש במערכת במבחנה זו, החוקרים יוכלו לחקור את התפקידים של איתות מכני ב- NCCs ואת האינטראקציה שלה עם אותות כימיים אחרים כדי לקבל הבנה עמוקה יותר של היחסים בין NCCs ואיתות מכני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת הידרוג'ל

הערה: כל השלבים חייבים להתבצע במכסה המנוע של תרבית התא שחוטא באתנול וחיטוי אולטרה סגול (UV) לפני השימוש כדי לשמור על סטריליות. כלים, כגון פינצטה ופיפטות, חייבים להיות מרוססים באתנול. פתרונות מאגר חייבים להיות גם מסוננים סטריליים.

  1. הכנת כיסויי זכוכית מצופים אמינוסילן
    1. מניחים את המספר הרצוי של כיסויי זכוכית על פיסת מגבון מעבדה.
      הערה: הכן כיסוי נוסף של 3-4 כדי להבטיח אספקת גיבוי מספקת בזמן שהם נשברים בקלות. חומרים שונים של כיסויי זכוכית יניבו תאימות שונה של זריעת תאים וחיבור. עדיף לקבוע איזה סוג מתאים ביותר לניסוי לפני תחילת הניסויים (ראה טבלת החומרים).
    2. השתמש מבער אלכוהול או מבער Bunsen כדי לחטא כל כיסוי על ידי העברתו הלוך ושוב דרך הלהבה (30 s לניסויי חלבון. מניחים כל כיסוי זכוכית על מגבון מעבדה כדי להתקרר.
    3. לאחר כיסויי הזכוכית מקוררים, מעבירים אותם לצלחת פטרי מרופד בפרפילם כדי למנוע החלקה.
      הערה: אם כיסויים אינם קרירים מספיק, החום שיורית יהיה להמיס את parafilm על החלקים, מה שהופך אותם שמיש.
    4. לכסות את כיסויים עם כ 200 μL ו 800 μL של 0.1 M NaOH עבור כיסוי 12 מ"מ ו 25 מ"מ, בהתאמה, ולתת להם לשבת במשך 5 דקות. לאחר מכן, שאפו את 0.1 M NaOH ואפשרו לכיסויים להתייבש באוויר למשך 5 דקות נוספות כדי ליצור סרט זוגי.
    5. לאחר כיסויים מיובשים, pipette כ 80 μL ו 150 μL של 3 אמינופרופיל triethoxysilane (APTS) עבור כיסוי 12 מ"מ ו 25 מ"מ, בהתאמה. היזהרו כדי למנוע שפיכת הפתרון על parafilm. אפשר לפתרון לשבת במשך 5 דקות.
    6. לשאוף כמה שיותר APTS עודף ככל האפשר ולאפשר APTS שיורית להתייבש במשך 5 דקות. לשטוף את כיסויים היטב על ידי שקוע אותם סטרילי, deionized (DI) H2O שלוש פעמים במשך 5 דקות בכל פעם.
      הערה: אם כיסויי הזכוכית אינם שטופים היטב, שאריות APTS גורמות לתגובות לא רצויות עם גלוטרדהיד, מה שגורם למזרז לבן להיווצר וכתוצאה מכך כיסויים שאינם שמיש.
    7. מעבירים את כיסויי הכיסוי לצלחת פטרי חדשה כשהצד הריאקטיבי פונה כלפי מעלה. מוסיפים מספיק 0.5% גלוטרלדהיד לצלחת פטרי כדי לכסות את כיסויי הכיסוי לחלוטין ולאפשר כיסויים לשבת במשך 30 דקות.
    8. שאפו את הגלוטארלדהיד 0.5% ושטפו שוב את כיסויי המכסים ב-DI H2O פעם אחת למשך 3 דקות. יש להקפיד את כיסויי הגב בצד המגיב על מגבון מעבדה או צלחת פטרי נקייה לייבוש אוויר לחלוטין לפני השימוש.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן; כיסויים חייבים להיות ממוקמים ב- DI H2O סטרילי עד לשימוש.
  2. הכנת כיסויים מסיליקון
    1. מניחים את אותו מספר כיסויים כמו כיסויים מצופים אמינוסילן (שלב 1.1.1) בצלחת פטרי מרופדת בפרפילם.
    2. Pipette 40 μL או 150 μL עבור כיסויים 12 מ"מ ו 25 מ"מ, בהתאמה, של dichloromethylsilane (DCMS) לצד אחד של כיסוי ולאפשר את הפתרון לשבת במשך 5 דקות.
    3. שאפו כל פתרון שנותר מהכיסוי, שטפו ב-DI H2O סטרילי פעם אחת למשך דקה אחת, והניחו את הכיסויים תגובתיים עם הפנים כלפי מעלה על מגבון מעבדה לייבוש אוויר לחלוטין לפני המעבר לשלב הבא.
  3. הכנת הידרוג'לים
    1. מערבבים אקרילאמיד, ביס-אקרילאמיד ו- DI H2O בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל כדי להכין 500 μL של פתרונות עם נוקשות משתנה (ראה טבלה 1). מערבולת הפתרון עבור 30 s לערבב אותו ביסודיות.
    2. עבודה מהירה, להוסיף את פתרון 10% אמוניום אסולפט (APS) ו tetramethyl אתילנדיאמין (TEMED) לצינור מערבולת את הפתרונות שוב כדי לערבב את הפתרונות.
      הערה: הכן 10% APS טריים ולהשאיר אותו על קרח או להקפיא aliquots חד פעמי בשל מחזור ההקפאה / הפשרה הרגיש שלה.
    3. Pipette כ 33 μL או 100 μL של הפתרון על 12 מ"מ מיובשים או 25 מ"מ aminosilane מצופה כיסויים (סעיף 1.1), בהתאמה.
    4. בעזרת פינצטה מעוקלת, הניחו מיד את כיסוי הכיסוי שטופל ב-DCMS על גבי תמיסת הג'ל כשהצד המטופל נוגע בתמיסת הג'ל, ובכך דוחפים את תמיסת הג'ל בין כיסויי הציפוי של DCMS לבין כיסוי מצופה אמינוסילן.
    5. אפשר לתמיסת הג'ל לפולימר במשך 5-15 דקות, תוך ניטור פעיל של פילמור ג'ל של התמיסה השארית בצינור.
    6. לאחר הג'ל הוא פילמרי, להפריד את כיסויים שטופלו DCMS עם פינצטה מעוקלת או סכין גילוח, משאיר את הג'ל מחובר כיסוי המקורי מצופה aminosilane.
    7. מניחים מיד את כיסוי הכיסוי עם הידרוג'ל המצורף בצלחת קבועה מראש של 4-well/24-well ו-6-well מכוסה ב-500 μL ו-2 מ"ל של PBS סטרילי או DI H2O לכיסויים של 12 מ"מ ו-25 מ"מ, בהתאמה, כדי למנוע מהג'ל להתייבש.
    8. חזור על שלבים 1.3.4-1.3.7 עבור כל כיסויי.
    9. שקועים הידרוג'לים PBS סטרילי או DI H2O במשך 30 דקות כדי להסיר פתרון אקרילאמיד עודף. אחסנו את ההידרוג'לים ב-PBS סטרילי או ב-DI H2O ב-4 מעלות צלזיוס לעצירה פרוצדורלית כאן.
    10. בחדר חשוך, הכינו את תערובת הסולפוסוצינימידיל 6-(4'-אזידו-2'-ניטרופינילמינו) הקנואט (סולפו-SANPAH) על ידי ערבוב תערובת של 2.5 מ"ל של 50 מ"מ 2-[4-(2-הידרוקסיאתיל) פיפראזין-1-yl] חומצה אתאנסולפונית (HEPES) (pH= 8.5) עם 25 μL של 50 מיקרוגרם / mL סולפו-SANPAH בצינור חרוטי, עטוף בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור. השתמש פיפטה לערבב את הפתרון היטב לפני השימוש.
      הערה: נפח של 2.5 מ"ל של פתרון סולפו-SANPAH מספיק לכעשרים וחמישה הידרוג'ל 12 מ"מ או חמישה הידרוג'ל 25 מ"מ.
    11. שאפו PBS או DI H2O מהצלחת היטב. הוסף כ 100 μL או 500 μL עבור כיסוי 12 מ"מ ו 25 מ"מ, בהתאמה, של פתרון גופרו-SANPAH (שלב 1.3.10) כדי לכסות את הג'ל. ודא הפתרון מכסה את הג'ל לחלוטין.
      הערה: התאימו את עוצמת היניקה בוואקום כדי למנוע מהכוח החזק לקרוע או להפריע להידרוג'ל.
    12. מניחים את הג'לים עם הפתרון תחת אור UV 15 W, 365 ננומטר במשך 10 דקות, נחשף כדי למזער כל הפרעה של אור UV מגיב עם sulfo-SANPAH.
    13. שאפו את עודף גופרו-SANPAH על ידי הטיית הצלחת כדי לאסוף כמה שיותר מהפתרון ככל האפשר. לשטוף את הג'ל עם 50 mM HEPES פעמיים עד שלוש פעמים.
    14. הוסיפו 500 μL ו-2 מ"ל לג'לים 12 מ"מ ו-25 מ"מ, בהתאמה, של קולגן 50 מ"ג/מ"ל שדיללתי ב-0.2% חומצה אצטית לכל באר המכילה את ההידרוג'ל. אפשר ג'לים לדגור לילה בחממה 37 °C (5°F), 5% CO2 אינקובטור.
      הערה: לדלל קולגן I ב 0.2% חומצה אצטית במקום 50 mM HEPES כדי לקדם הפצה הומוגנית וחיבור של קולגן I.
    15. שאפו את הקולגן I ושטפו את הג'לים עם PBS סטרילי שלוש פעמים כדי להסיר קולגן עודף I במשך 5 דקות בכל שטיפה. לדגור את ההידרוג'ל ב- PBS עם סרום סוס 10%, 5% FBS עבור 2 שעות ב 37 °C (5°F), 5% CO2 אינקובטור.
      הערה: התוספת של סרום סוס 10% מקדמת התפשטות גבוהה יותר בהשוואה לשימוש ב- FBS בלבד כפי שנעשה בפרסום הקודם.
    16. שאף את המדיום. הוסיפו 500 מ"ל של מדיום הנשר (DMEM) של דולבק המסונן סטרילי עם 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) לכל באר. לאחסן את הג'לים 37 °C ,5% CO2 אינקובטור עד מוכן לתרבות התא.
    17. לאחר מוכנים, צלחת כ 1.5 × 104 O9-1 תאים / ס"מ2 במדיום בזאלי במנות התרבות. לדגור את התאים במשך 2 ימים באינקובטור ב 37 °C (5 °F), 5% CO2. בדוק את התאים למפגש כדי לוודא שהתאים מחוברים מספיק לג'לים, וכי מספר התאים מספיק לפני איסוף לניתוח.
      הערה: עיין בפרוטוקול שפורסם בעבר עבור שלבי השחזור, המעבר והאיסוף של תאי O9-120.
    18. המשך לסעיפים 2, 3 או 4 לניתוח נוסף של ההידרוגלים.

2. ניתוח כמותי של נוקשות באמצעות AFM

  1. הפעל את מחשב המערכת של AFM ולאחריו את בקר AFM (ראה טבלת החומרים).
  2. הר את ה- AFM cantilever על מחזיק הגשושית AFM. השתמש cantilever כדורי עם 0.5 מיקרומטר חרוז סיליקה רכוב בסוף cantilever (cantilever עם חרוז כדורי).
    הערה: עבור הידרוג'ל נוקשה יותר, כגון 10 kPa, 20 kPa, ו 40 kPa, בדיקה נוקשה יותר שימש עם קבוע האביב של 0.24 N/ m. בדיקה רכה יותר שימשה הידרוג'לים רכים יותר, כגון 0.5 kPa ו- 1 kPa, עם קבוע קפיץ של 0.059 N/ m.
  3. הגדר את תוכנת AFM במצב איש קשר.
  4. הר את רקיק הסיליקון על שלב המדגם של AFM כדי לאסוף עקומות כוח על ידי לחיצה על Engage עבור הקנטילור לגעת במצע הסיליקון, ובכך ליצור את עקומות הכוח.
  5. השתמש בעקומות הכוח לעיל (2.4) לכיול, לחץ על כיול בתוכנת השליטה כדי להשיג קבוע קפיץ ממוצע של הקנטילוור בתנאי מנגינה תרמית, ולשמור את הערכים המכוילים בתוכנה השולטת.
  6. הר את הדגימות על ידי הצבת כיסוי עם הידרוג'ל מצורף בצלחת פטרי 60 מ"מ על שלב הסריקה AFM. הוסיפו 3 מ"ל PBS לצלחת לפני ביצוע מדידות כדי למנוע את התייבשות הג'ל.
  7. הגדר את ה- AFM כך שיפעל במצב מגע (נוזל) כדי להתחיל למדידה. הפעילו את החרוז הכדורי כדי לגעת ולהרים ללא הרף מדגם הג'ל.
  8. הגדר את הקנטילוור כך שסף ההסטה שלו יישאר על 10 ננומטר. שמור על גודל ההשתוללות של הגשוש ב-10 מיקרומטר. לאחר מכן, הקלט את עקומות הכוח כמו בשלב 2.4.
  9. לרכוש לפחות 20 עקומות כוח מ 3 עד 10 כתמים שונים על פני השטח של הידרוג'ל.
  10. חשב את המודולוס הממוצע של יאנג של ~ 20 עקומות כוח עבור כל נקודה עם תוכנת הדמיה וניתוח AFM. השתמש בעקומות כוח רמפה מורחבות ובמודל ליניארי (כדורי). חשב את הממוצע של כל הכתמים עבור כל מדגם כדי להניב את הנוקשות הסופית.
    הערה: מודולוס של יאנג ונתונים קשורים(כלומר, סטיות תקן) נשמרים באופן אוטומטי כגיליון אלקטרוני.
  11. חזור על שלבים 2.6-2.10 עבור כל הדגימות.

3. ניתוח מולקולרי של נוקשות באמצעות כתמי אימונופלואורסצנטיות

  1. השתמש פינצטה כדי להעביר את כיסוי לצלחת חדשה כדי למזער אותות שווא מתאים גדל ישירות על הצלחת. לשטוף את התאים עם 500 μL של PBS סטרילי שלוש פעמים כדי להסיר תאים מתים וכל מדיום תרבית שנותר.
  2. תקן את התאים באמצעות 500 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ללא הפרעה. לאחר מכן, לשטוף מחדש את התאים שלוש פעמים באמצעות 500 μL של PBS / well במשך 2 דקות כל אחד.
    הערה: יש לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס לעצירה פרוצדורלית.
  3. לטפל בתאים עם 500 μL של 0.1% טריטון X-100 במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 500 μL של PBS / well.
  4. לחסום את התאים עם 250 μL של סרום חמור 10% (מדולל PBS ו 0.1% Tween 20) לבאר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. לדגור על התאים עם 250 μL של נוגדנים ראשוניים עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 °C (50 °F). לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 500 μL של PBS / well במשך 5 דקות כל אחד.
    הערה: אנטי וינקולין (Vcl) (1:250) ונגד AP2 אלפא (1:250) שימשו בניסוי זה ודוללו בסרום חמור 10%.
  6. לדגור על התאים עם נוגדנים משניים מתאימים ו /או פאלואידין המשמש להכתמת F-actin בדילול של 1:400 ב 250 μL של סרום חמור 10% במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד.
    הערה: 568 ננומטר פאלואידין ניתן לדגירה משותפת עם 488 ננומטר או 647 ננומטר נוגדנים משניים או בכוחות עצמו.
  7. לדגור על התאים עם 4′,6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI, 1:1000 דילול) ב 250 μL של PBS במשך 10 דקות ואחריו לשטוף האחרון של PBS במשך 2 דקות.
  8. מוסיפים 3-4 טיפות של הרכבה בינונית לכל באר. אחסן את הדגימות ב 4 °C (70 °F) כדי להגדיר לפחות 2 שעות לפני הדמיה כדי להבטיח המדיום הרכבה מוגדר כראוי.
  9. ללכוד תמונות של לפחות 3 מסגרות אקראיות לכל דגימת הידרוג'ל עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לייצר ערוצים בודדים וממוזגים.

4. כמותית בזמן אמת PCR (RT-qPCR)

  1. העבר את ההידרוג'לים עם התאים החסידים לאיסוף RNA ללוח חדש כדי למזער RNA לא רצוי מתאים המחוברים ללוח התא. לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים כדי להסיר תאים מתים ומדיום תרבית.
  2. חלץ את ה- mRNA הכולל באמצעות ערכת חילוץ RNA. בצע תמלול הפוך של RNA ל- cDNA באמצעות supermix שעתוק הפוך בהתאם להוראות היצרן.
  3. בצע RT-qPCR עם פריימרים עבור Vcl כסמן נוקשות של בחירה ולנתח באמצעות שיטת 2-ΔΔCT.
    הערה: רצף פריימר של Vcl: קדימה 5' GCTTCAGTCAGACCACTACTCG 3'; הפוך 5' AggTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הכנת הידרוג'ל והערכת נוקשות באמצעות AFM ומודל הרץ
כאן, פרוטוקול מפורט מסופק כדי ליצור הידרוג'לים polyacrylamide של נוקשות משתנה על ידי ויסות היחס של אקרילאמיד וביס-אקרילאמיד. עם זאת, הידרוג'לים polyacrylamide אינם מוכנים להידבקות של תאים בשל היעדר חלבוני ECM. לכן, סולפו-SANPAH, הפועל כמקשר, נקשר באופן קוולנטי להידרוג'ל ומגיב עם האמינים העיקריים של חלבוני ECM כדי לאפשר הידבקות של חלבוני ECM למשטחי ההידרוג'ל באמצעות אסתר N-hydroxysuccinimide בסולפו-SANPAH לאחר הפעלת UV. סוג קולגן הייתי בשימוש כחלבון ECM של בחירה כדי לקדם ביעילות חיבור תאים O9-1. כדי להבטיח ערכי נוקשות מדויקים של הידרוג'לים שונים, בוצעה הערכת נוקשות באמצעות AFM, טכניקה ידועה לתיאור המודולוס האלסטי.

עם היווצרות מוצלחת וחיבור של הידרוג'ל polyacrylamide לכיסוי הזכוכית, הג'ל נשאר דבק כיסוי עם משטח אחיד וקריעה מינימלית. הנוקשות נמדדה על ידי AFM בהתבסס על העיקרון של טכניקת הכניסה, שבו נכנס נוקשה הוחל על המדגם עם הכוח הנדרש כדי להגיע לעומק כניסה26. עם מדידה זו, מודולוס האלסטי של יאנג חושב על סמך חריץ של עומק וכוח במודל של הרץ, תיאוריה אלסטית26. עם זאת, בשל השונות הגדולה בתוצאות על ידי AFM, שיטה סטטיסטית נוספת הוחלה כדי להשיג תוצאה כמותית עם השפעה מינימלית של משטחים לא אחידים הומוגניות לא מושלמת של פתרונות ג'ל26. כדי לייצר מדידה כמותית באמצעות AFM, אוסף של לפחות 50 עקומות כוח ומרחק מכל מיקום על דגימת הג'ל נלקח עבור נוקשות מדגם ממוצע. הכוח שהופעל על ג'ל הנוקשות הגבוהה היה גבוה יותר מזה שהוחל על הג'ל הרך יותר, מה שמצביע על כך שמצע נוקשה יותר הניב שיפוע תלול יותר בגרף כוח לעומת Z, שבו נמדד כוח ב- nN, ו- Z מציין את עומק הכניסה בין הכניסה למדגם.

בהידרו-ג'ל רך, השיפוע של עקומת הכוח שנוצר היה עדין מכיוון שהכוח הנדרש מהגשושית AFM היה פחות (איור 1A). עם זאת, על הידרוג'ל נוקשה, כגון אלה עם מודולוס של 40 kPa, המדרון שנוצר היה תלול בהרבה כמו הכוח החל היה גבוה יותר מאשר עבור ג'לים רכים יותר(איור 1B). ככל שההפרדה בין הגשושית לדגימת ההידרוג'ל פוחתת, העקומה גדלה באופן משמעותי כאשר קצה הגשושית נוגע בכיסוי הזכוכית. עם זאת, ככל שמרחק ההפרדה גדל, העקומה רק מתקרבת ל-0 מכיוון שאין כוח מיושם.

כפי שניתן לראות באיור 1A, הקנטילוור בגשושית AFM התקרב לג'ל, המצוין על ידי הקו הכחול, והגשושית מדדה את הכוח המוחל הנדרש כדי לחדור לדגימת הג'ל ובסופו של דבר להגיע לכיסוי הזכוכית, מה שגרם לעלייה פתאומית בכוח. בשל טעויות פרוצדורליות ואינסטרומנטליות אפשריות, כגון איכות הפתרונות הנדרשים, הנוקשות האמיתית של דגימות הידרוג'ל משתנה במידה רבה ורחוקה מהנוקשות הרצויה. לכן, AFM הוא כלי שימושי כדי לאמת ולאשר את המתודולוגיה תוך מניעת הצגת נתונים כוזבים בניסויים נוספים.

בהערכה זו של AFM נמדדו חמש דגימות הידרוג'ל מוכנות באמצעות הגישה הכמותית. הפרוטוקול התמקד ברמות נוקשות הידרוג'ל של 0.5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa, ו 40 kPa, אשר לחקות את הרוחב של רמות נוקשות מצע ביולוגי שדווחו לבידול של סוגי תאים שונים. עקומות הכוח שהתקבלו ממדידות AFM נוצלו כדי ליצור מודולוס אלסטי של יאנג בקילפסקלים באמצעות תוכנת אלגוריתם ניתוח AFM (איור 2).

השוואה בין מערכות הידרוג'ל פוליאקרילמיד וסוגי תאים
התאמה זו של הפרוטוקול המקורי על ידי Tse ועמיתיה מספקת גישה יעילה ויעילה ללמוד את ההיבטים המכניים של NCC באמצעות תאים O9-120. שינויים בפרוטוקול הקודם כוללים שינוי דגירה של חלבון ECM: החלפת HEPES של 50 מ"מ בחומצה אצטית ותוספת של 10% סרום סוס ו- FBS לתרבות תאים (שלב 1.3.14-1.3.15). שינויים אלה אומתו על ידי השוואת הצמיחה והתחזוקה של O9-1 NCCs במערכת ג'ל שונה זו עם זה בפרוטוקול המקורי (בקרה). כאן, תרבנו תאי O9-1 מסוג פראי בשתי מערכות ההידרוג'ל עם מודולוס אלסטי של 1 kPa ו-40 kPa לכל מערכת במדיום בזאלי. מצב גידול התא הכולל והתפתחות הוצגו באמצעות מיקרוסקופ אור בהיר עבור מאפיינים אפופטוטיים, מורפולוגיה לחוצה, וחיבור תאים הידרוג'ל. תאי O9-1 שגדלו במערכת הג'ל המקורית הביאו למספר גבוה יותר של תאים מתים המצוינים על ידי עודף תאים עגולים (איור 3E,F) הן עבור 1 kPa והן עבור 40 kPa הידרוג'לים.

לעומת זאת, תאי O9-1 שגדלו במערכת הג'ל המותאמת הציגו צמיחת תאים בריאה וחיבור מספיק למצע ההידרוג'ל(איור 3G,H). בנוסף, התאימות של NCCs עם מערכת הידרוג'ל שונה הוערך על ידי ביצוע מכתים IF של סמן NCC, Tcfap2α (AP-2). AP-2 הוא גורם שעתוק המתבטא בשושלת NC כדי לווסת את ההתפתחות בעוברי עכבר, ובכך להפוך אותומתאים להעריך תאימות 27. למרות שתאי O9-1 גדלו על מערכות הידרוג'ל שליטה ומערכות הידרוג'ל מותאמות שניהם הביעו AP-2, חלה עלייה משמעותית בביטוי AP-2 בתאי O9-1 מצופים במערכת ההידרוג'ל המותאמת, כפי שצוין על ידי אות הפלואורסצנטיות החזק יותר והכימות המתאים (איור 4A,B).

בנוסף, תאי P19 שימשו כדי לאמת עוד יותר את היתרונות של מערכת הידרוג'ל שונה לצמיחת תאים. P19 הוא קו תאים קרצינומה עוברי שמקורו בטרטוקרטוקרצינומה שמקורה בעובר בעכבר28. באמצעות פרוטוקול התרבות המתאים, תאי P19 גדלו הן במערכות הידרוג'ל שליטה והן במערכות הידרוג'ל מותאמות כדי לפקח על מאפייני ההישרדות והצמיחה. הדמיית ברייטפילד גילתה שתאי P19 מצופים בשתי מערכות ההידרוג'ל הציגו עודף של תאים צפים עגולים והיעדר קבצים מצורפים למצע התא(איור 3A-D). תצפית זו הציעה כי הפרוטוקול שונה היה מתאים יותר O9-1 NCCs ללמוד איתות מכני ב NCCs.

הדמיה של ביטוי סיבים בלחץ גבוה על מצעים נוקשים
ההידרוג'ל המותאם אפשר ניתוח כמותי ואיכותי של ההבדלים במורפולוגיה של תאים בתרבית על ג'לים ברמות נוקשות שונות ומשפיעים אחרים. ברגע שההידרוגלים היו מוכנים לזריעת תאים, תאי O9-1 מסוג בר הועברו להידרוג'ל ברמות נוקשות שונות. התאים היו במעקב על בריאותם וצמיחתם על ידי התבוננות בצורתם, התפשטות מרחבית, ואפילו התקשרות על הידרוג'ל עם תאים מתים מינימליים. כמה מחקרים הראו עלייה סיבי מתח הידבקות תאים עבור MSCs על מצעים נוקשות גבוהה, מציע כי NCCs גדל על מצע נוקשה יציג גם ממצאים דומים לעומת NCCs גדל עלמצעים רכים 29,30.

F-actin יחד עם מיוסין II, α-actinin, וחלבונים ציטוסד שלד אחרים ידועים באופן קולקטיבי כמו סיבי מתח31. מחקרים קודמים הבחינו בעלייה בהרכבת סיבי הלחץ בתגובה לכוח מכני מוגבר31. בקצה אחד או בשני הקצוות של סיבי הלחץ, קבצים מצורפים לקומפלקס ההידבקות במוקד מאפשרים לתאים לנדוד ולדבוק ב- ECM31. כתמי פאלואידין כדי לדמיין ביטוי F-actin וארגון ב- NCCs הפגינו צמיחת תאים בריאה בתגובה לאיתות מכני (איור 5). בנוסף, תאי O9-1 שגדלו על הידרוג'לים בעלי קשיחות נמוכה או גבוהה הציגו מורפולוגיות שונות באמצעות כמויות שונות של סיבי לחץ(איור 5). בדומה תצפיות ממחקרים שדווחו שבוצעו באמצעות MSCs, נצפתה כי תאי O9-1 גדלו על מצע נוקשה יותר, 40 kPa, הציגו סיבי מתח יותר היו מפוזרים היטב בהשוואה לתאים שגדלו על הידרוג'ל רך יותר, המצוין על ידי 1 kPa נוקשות29,30.

הערכת הידבקויות תאים
כדי לאשר עוד יותר את ההשערה כי השינוי נוקשות המצע משפיע על הידבקות NCC, שינויים בביטוי Vcl נמדדו כמותית באמצעות RT-qPCR ב NCCs להגיב רמות נוקשות הידרוג'ל שונים. Vcl הוא אחד החלבונים הציטוסד הרבים הקיימים במתחם הידבקות המוקד במהלך תהליך התא יצירת קשרים עם המצע וחישה את המאפיינים ECM32. הידבקויות מוקד הן נקודות המגע של התאים ל- ECM באמצעות קולטנים integrin, אשר עוגנים את אקטין ציטוסקלטון ציטופלסמי, F-actin33 רמת ביטוי הגן Vcl מרמז על השינויים הידבקויות מוקד והידבקויות תאים של תאי O9-1 בתגובה נוקשות המצע.

מחקרים קודמים הראו את ההשפעה של Vcl על הידבקות תאים בגזע העוברי ובתאים פיברובלסט על ידי הבדלים בביטוי שלה. בתגובה לביטוי הגבוה של Vcl, מספר וגדלים של הידבקויות מוקד גם גדל אבל ירד כאשר Vcl הופללמטה 34. באופן עקבי, תאים Vcl-לקוי גם הראו ירידה משמעותית הידבקות התא והתפשטות35. בנוסף, Vcl ממלא תפקיד בוויסות הידבקות התא על ידי ייצוב הידבקויות מוקד36. גודל ההידבקויות במוקד, רמת ההתבגרות וההרכבים משתנים בהתאם לנוקשות המצע, ובכך מאפשרים אותות להיות transellularly ואת התאים להגיב רמזים סביבתיים שלהם37. לכן, Vcl מגויס מאוד למתחמי הידבקות מוקד בתאים הגדלים על מצעים נוקשים, כפי שמשתקף על ידי רמות mRNA גבוהות יותר שזוהו על ידי RT-qPCR (איור 6C).

תאים הגדלים על מצעים רכים יותר יוצרים מתחמי הידבקות מוקד מינימליים, כפי שהם משתקפים על ידי רמות mRNA נמוכות יותר של Vcl בתאים15. באיור 6C, תאי O9-1 הציגו ביטוי גבוה יותר של Vcl על המצע הנוקשה מאשר על המצע הרך. תוצאות אלה מצביעות על רמה גבוהה יותר של הידבקויות מצע התא של תאי O9-1 על מצעים נוקשים מאשר תאי O9-1 על מצעים רכים יותר. בנוסף, ביטוי Vcl היה חזותי באופן איכותי באמצעות מכתים IF עם נוגדן אנטי Vcl כדי להשלים עוד יותר ולתמוך בממצא RT-qPCR. באופן עקבי, ביטוי Vcl בתאי O9-1 גדל על המצע נוקשה יותר היה גבוה יותר מאלה שגדלו על המצע הרך יותר (איור 6A,B),אשר תמך עוד יותר את הממצא הראשוני של הידבקות תאים גבוהה להתפשט על הידרוג'ל 40 kPa בהשוואה הידרוג'ל 1 kPa נצפה עם כתמי F-actin פאלואידין ורמות ביטוי Vcl באמצעות RT-qPCR.

Figure 1
איור 1: כפה עקומות שנוצרו מהכניסה של הגשושית AFM. כוח (ציר y) מציין את הכוח הנדרש המוחל ב- nN, ו- Z (ציר x) מציין את מרחק הבדיקה של Bruker AFM מהדגימה ב- μm. עבור הידרוג'ל 1 kPa(A),המדרון שנוצר הוא עדין לעומת המדרון התלול יותר נצפה עבור הידרוג'ל 40 kPa(B). העקומות הצבעוניות מייצגות את תנועת הקנטילוור בגשושית AFM כשהיא מתקרבת (כחולה) ונסוגה (אדומה) מדגם ההידרוג'ל. נקודת ההתחלה הגבוהה ביותר של העקומה מציינת את המגע הנוקשה של כיסוי הזכוכית. (B)הטבילה הגדולה בעקומה הנסוגה בהידרוג'ל 40 kPa מצביעה על הידבקות בין החרוז לדגימה. קיצור: AFM = מיקרוסקופיה של כוח אטומי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הנוקשות הממוצעת של הידרוג'לים (ב- kPa) המחושבת מהמודלוס האלסטי של הצעיר. המודולוס של יאנג נוצר מעקומות הכוח מאיור 1. המודולי האלסטי המוזכר של ההידרוג'לים היה 0.5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa ו-40 kPa. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3:תמונות שדה בהיר של תאי P19 ו- O9-1 מצופות ב- 1 kPa ו - 40 kPa הידרוג'לים של שליטה ומערכות ג'ל מותאמות כדי לזהות מאפייני צמיחת תאים. (A-D) P19 ותאי O9-1 (E-H). תאים מתים מסומנים על-ידי חצים אדומים. סרגלי קנה מידה = 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: כתמי אימונופלואורסצנטיות של סמן NCC AP-2 ב- O9-1 NCCs כדי לדמיין תאימות NCC. (A) מערכת הידרוג'ל מותאמת 40 kPa בהשוואה ל -B) בקרת 40 kPa. AP-2 (ירוק); גרעינים היו מוכתמים עם DAPI (כחול). סרגלי קנה מידה = 25 מיקרומטר. (C) גרף עמודות מספק כימות של רמת הביטוי AP-2 המציגה משמעות (p-value = 0.003) (n = 3). הנתונים מציגים את הביטוי היחסי עם קווי שגיאה של סטיית תקן שסופקו. קיצורים: NCC = תא סמל עצבי; DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: כתמי פאלואידין פלואורסצנטיים של F-actin המציגים סיבי לחץ הפרוסים היטב בתאי O9-1 על הידרוג'ל 40 kPa. תאי O9-1 היו בתרבית על 1 kPa(A)ו 40 kPa הידרוג'ל(B). תאי O9-1 הוכתמו באמצעות אלכסה פלור 488 פאלואידין (ירוק), והגרעין היה מוכתם ב- DAPI (כחול). סרגלי קנה מידה = 25 מיקרומטר. קיצור: DAPI = 4′,6-דימידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תמונות אימונופלואורסצנטיות של וינקולין בתאי O9-1. תאי O9-1 היו מצופים על 1 kPa (A) ו 40 kPa (B) הידרוג'לים. גרעינים היו מוכתמים עם DAPI (כחול). סרגלי קנה מידה = 25 מיקרומטר. (C)ניתוח PCR כמותי בזמן אמת של רמת ה- mRNA הכוללת של Vcl בתאי O9-1 בתרבית על 1 kPa ו 40 kPa הידרוג'ל. רמת ביטוי Vcl בהידרוג'ל 1 kPa נמוכה משמעותית מזו של הידרוג'ל 40 kPa (p-value = 0.02). הנתונים מציגים את הממוצע עם קווי שגיאה של סטיית תקן שסופקו. קיצור: DAPI = 4′,6-דימידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

נפח כולל של 500 μL 0.5 kPa 1 kPa 10 kPa 20 kPa 40 kPa
40% אקרילאמיד (μL) 37.5 62.5 125 100 100
20% ביס-אקרילאמיד (μL) 15 7.5 25 66 120
H2O (μL) 447.5 430 350 334 280
10% APS (μL) 5 5 5 5 5
TEMED (μL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

טבלה 1: נפחים מתאימים של פתרונות כדי להשיג את רמות הנוקשות הרצויות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מטרת המחקר הנוכחי היא לספק מערכת במבחנה יעילה ויעילה כדי להבין טוב יותר את ההשפעה של אותות מכניים ב- NCCs. בנוסף בעקבות הפרוטוקול צעד אחר צעד שהוזכר לעיל, החוקרים צריכים לזכור כי התרבות התאית של O9-1 NCCs מושפעת מסוג כיסויי זכוכית המשמשים להכנת הידרוג'ל. לדוגמה, צוין כי תאים שנזרעו על סוג מסוים של כיסוי זכוכית (ראה טבלת החומרים) שרדו והתרבו היטב, בעוד תאים בתרבית שנזרעו על סוגים אחרים של כיסויי זכוכית הראו יותר מוות של תאים. יתר על כן, חשוב לעקוב בקפדנות אחר תנאי תרבית התא הנכונים עבור O9-1 NCCs38. איכות תרבית התא היא אופטימלית כאשר הידרוג'ל משמשים בהקדם האפשרי או מאוחסנים בחממה סטרילית 37 °C עד יומיים.

בשל הרגישות של כל רכיב בפרוטוקול, המודולי האלסטי יכול להשתנות על פני ניסויים. בנוסף לנקודות המוזכרות בפרוטוקול (שלב 1.3.2) לגבי 10% APS, גורמים קריטיים אחרים שיש לזכור משפיעים גם הם על השונות. גורם נוסף שנחשד בגרימת שינויים גדולים במדידות AFM היה עובי ההידרוגלים. מחקר קודם חקר את השפעת העובי על המודולי של הצעיר, הנע בין 15 ל -1000 מיקרומטר, ומצא כי הבדלי העובי לא שינו את המודולי של יאנג באופן משמעותי39. עם זאת, עובי המצעים משפיע גם על המאפיינים המכניים שהתאים יכולים לחוש, מה שמוביל למורפורולוגיות שונות40,41,42. מחקרים שונים הראו כי עלייה משמעותית בעובי ההידרוגלים הובילה לירידה באזור התא, מתפשט, נוקשות יעילה של הידרוג'ל40,41,42. עם זאת, פנוטיפים של תאים גם לשנות בתגובה הידרוג'ל דק משמעותית, למשל, התפשטות גבוהה יותר אפילו על הידרוג'לים נוקשות נמוכה40,41,42. עם נפח עקבי של ג'לים polyacrylamide, עובי הידרוג'ל צריך להיות אחיד, כך סטיות קלות לא ישפיעו באופן משמעותי על מודולוס אלסטי במדידות AFM.

עדיף לחטא כיסויים על ידי העברתם הלוך ושוב בלהבה באמצעות מבער אלכוהול מכיוון ששיטות עיקור אחרות יכולות להיות מסובכות יותר ולגרום נזק פוטנציאלי לכיסויי הזכוכית. בגדלים שונים של כיסויי זכוכית ניתן להשתמש בהתבסס על דרישות ניסיוניות. פרוטוקול זה השתמש כיסויים 12 מ"מ ו 25 מ"מ עבור אימונוהיסטוכימיה ו RT-qPCR, בהתאמה. שימוש בג'לים בגודל המתאים כדי להתאים לניסויים מעודד יעילות וממזער את הפסולת. שינויים אלה אומתו באופן איכותי וכמותי כדי להבטיח אופטימיזציה עבור O9-1 NCCs לעומת מערכת הידרוג'ל המקורית (בקרה)20. הבריאות הכללית והצמיחה של O9-1 NCCs הוערכו תחת מיקרוסקופ Brightfield עבור מאפייני התקשרות תאית ומצע.

בנוסף, התאימות של תאי O9-1 הושוותה בין הן בקרה והן מערכות הידרוג'ל שהשתנו כדי לאמת עוד יותר את השינויים בפרוטוקול זה על ידי הדמיה איכותית של ביטוי AP-2 באמצעות כתמי IF. עוצמת האותות כותמה כדי לתמוך עוד יותר בתמונות הייצוגיות של ביטוי AP-2 בתאי O9-1 בין שליטה לעומת מערכות ההידרוגל ששונו. בעוד AP-2 הוא סמן NCC נפוץ, סמנים ידועים אחרים חייבים להיחשב לאימות, כגון Sox10 ו Pax3, בשל משמעותם לתחזוקת NCC של pluripotency והישרדות28. בנוסף, האופטימיזציה בפרוטוקול זה אושרה עוד יותר על ידי השוואת תאי O9-1 NC עם קו תא אחר, P19, כדי להבטיח כי מערכת הידרוג'ל זו יעילה ואמינה עבור תאי NC. למרות שלתאי P19 יש מאפיינים אלמותיים והם מתורבתים בקלות, הם לא שגשגו היטב באף אחת ממערכות ההידרוגל.

ההתנגדות לכוח המאריך שנוצר מהמצע או נוקשות הרקמות שבה התאים מתחברים מתבטאת לעתים קרובות כמודולוס האלסטי של יאנג45. עם AFM, מודולוס אלסטי של יאנג מתקבל מעקומת הכוח שנוצר מהכוח האנכי המיושם26. שינויים גדולים יכולים להתרחש במהלך מדידת AFM, בין מדידות שיכולות להוביל לקריאות לא מדויקות עבור הידרוג'ל נוקשה יותר. חוסר העקביות יכול להיגרם על ידי בדיקות לא נאותות המשמשות למדידה. לדוגמה, מדידה של 20 kPa ו 40 kPa הידרוג'ל דורשים שימוש בדיקה נוקשה יותר עם קבוע קפיץ גבוה יותר (k = 0.24 N / m). בדיקה נוקשה יותר מאפשרת רזולוציה נמוכה יותר בהשוואה לבדיקה רכה יותר; עם זאת, ישנן סיבות להעדיף את הבחירה של בדיקה נוקשה יותר כמו cantilevers רך מדי יכול לדבוק בדגימות46. בנוסף, בדיקות רכות מדי רגישות מאוד, תורמות לאותות שווא מחלקיקים לא רצויים וכתוצאה מכך ערכי נוקשות נמוכים או גבוהים יותר באופן מלאכותי מאשר נוקשות אמיתית46. יתר על כן, יש לציין קלט מדויק של יחס פואסון, בהתאם לחומר המדידה; זה ניתן למצוא במחקרים סטנדרטיים כמו זה משפיע באופן משמעותי על פלט הנתונים.

בנוסף, AFM נוצל כדי למדוד את עובי ההידרוגלים, שכן עובי הוא מאפיין מכני נוסף המשפיע על האופן שבו תאים חשים אתסביבתם 47,42. במחקרים שונים שדווחו, תאים הגדלים על הידרוג'לים רכים נצפים להיות עגולים בצורתם ב ומעבר "עובי קריטי", אשר מדווח על ~ 2-5 מיקרומטר, בהתאם לסוג התא47,42,48. עם זאת, התפשטות גבוהה בהרבה נצפתה כאשר תאים היו מצופים על הידרוג'לים של אותה נוקשות אבל עובי נמוך יותר מאשר "עובי קריטי"42,48. הסבר פוטנציאלי לממצא מעניין זה הוא כי העובי התת קריטי של הידרוג'לים מאפשר לתאים לחוש את כיסויי הזכוכית הנוקשים שבבסיסו כשהתאים מפעילים אחיזה לעקירה לרוחב47. העובי הממוצע על פני הידרוג'לים נוקשים היה 342 מיקרומטר עם סטיית תקן של 27 מיקרומטר. עובי ההידרוג'ל היה גבוה יותר מה"עובי הקריטי", ובתוך טווח הבדיקות של פחות מ-400 מיקרומטר, שדווח במחקרים ובהידרוג'לים המיוצרים מראש, כך שהתאים יכלו לחוש את הנוקשות השונה של ההידרוג'ל ולא את כיסויי הזכוכית הנוקשה הבסיסיים42,48.

בנוסף לשיטת הניתוח הכמותי של AFM, ההידרוגלים נותחו גם באופן איכותי באמצעות אימונוהיסטוכימיה כדי לחקור את הביטוי של הסמנים המושפעים מהנוקשות המשתנה בתאי O9-1 ולדמיין צמיחה בריאה של התאים. F-actin בציטופלסמה מחובר אינטאגרין הקשורים לממברנה באמצעות קבוצה של חלבונים שלד ציטוס, כגון טאלין ו- Vcl, ויוצרים את קומפלקס הידבקות המוקד33. ביטוי של סיבי מתח בתאים יכול גם להיות מנותח על ידי מדידת הביטוי של גנים ציטוס שלד אחרים בתאים, כגון טאלין ו integrin, אשר ניתן לדמיין יחד באמצעות ערכת הכתמת הידבקות מוקד.

היו דרגות שונות של נוקשות הידרוג'ל שהשפיעו על המורפולוגיה והתגובה של NCC, כפי שניתן לראות בשינוי בהידבקות התא ובסיבי הלחץ באמצעות איתות מכני. פרוטוקול זה מציע את היכולת להשפיע על בידול תאים לסוגי תאים שונים על ידי שינוי תנאי התרבות המתאימים במבחנה, ובכך מספק שיטה נוחה של מניפולציה של אותות מכניים אותות כימיים ב- NCCs. כאמור, גורלה של בידול NCC מונחה במידה רבה על ידי כוחות מכניים הנמצאים ברקמה שמסביב, כולל נוקשותו2,3. בעוד המטרה המיידית של מאמר זה הייתה לפתח פרוטוקול שלב אחר שלב כדי להכין הידרוג'לים לתרבות NCC, היתרונות הפוטנציאליים של פרוטוקול זה חורגים מעבר למתודולוגיה, רודף ידע נוסף של איתות מכני ב- NCCs. ראוי גם לציין כי זה במערכת במבחנה יש כמה מגבלות. טכניקה זו של ייצור הידרוג'לים כוללת מספר שלבים שיכולים להכניס וריאציות טכניות לאורך הדרך, כולל הטרוגניות, משטח לא אחיד ונוקשות לא מדויקת. לכן, משתמשים חייבים לבצע שלבים אלה בקפידה כדי למזער וריאציות טכניות במהלך ניסויים. בנוסף, ג'לים polyacrylamide במערכת זו מוגבלת מחקרים לתרבות 2D בשל הרעילות של אקרילאמיד, תוך התעלמות הסביבה הביולוגית 3D המדויק כי NCCs לאכלס50.

למרות אילוצים אלה, מערכת במבחנה זו מאפשרת שיטה זולה ופשוטה המיטיבה עם כל רמות המחקר ומאפשרת לחוקרים לבצע בדיקות מספיקות ופונקציונליות במורד הזרם. כפי שניתן לראות בממצאים האחרונים, NCCs מסתמכים במידה רבה הן על איתות מכני, כגון כוח גיסת ונוקשות מצע, ואיתות כימי, כגון Wnt ו פיברובלסט גורם גדילה איתות, בקרניופאקיאל, כמו גם התפתחות הלב בחולייתנים6,15. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לתחום את המיקרו-סביבה המקומית לניסויי במבחנה למחקרים עתידיים על NCCs, כולל בידול, הגירה, תגובות תאיות ופוטנציאל של התקדמות מחלות מזיקות. לכן, מערכת במבחנה זו תהיה כלי רב עוצמה ללמוד את התפקידים של איתות מכני ב- NCCs ואת האינטראקציות שלהם עם מסלולי איתות אחרים, אשר יעמיק את ההבנה של המנגנונים המולקולריים והגנטיים של התפתחות NCC ומחלות נלוות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר אנה-מריה זסקה, מפעילת מתקן הליבה של הכוח האטומי מיקרוסקופ-UT במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס, על המומחיות שנתרמה ב- AFM בפרויקט זה. אנו מודים גם למקורות המימון של המכונים הלאומיים לבריאות (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 ו- R01HL142704 לג'יי וואנג).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip Chemglass Life Sciences CLS-1763-012
2% Bis-Acrylamide Sigma Aldrich M1533
24-well plate Greiner Bio-one 662165
25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip Chemglass Life Sciences CLS-1763-025
3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) Sigma Aldrich A3648
4-well cell culture plate Thermo Scientific 179830
4% Paraformaldehyde Sigma Aldrich J61899-AP
40% Acrylamide Sigma Aldrich A4058
50% glutaraldehyde Sigma Aldrich G7651
6-well cell culture plate Greiner Bio-one 657160
AFM cantilever (spherical bead) Novascan
AFM software Catalyst NanoScope Model: 8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher A12379
Ammonium Persulfate (APS) Sigma Aldrich 248614 Powder
anti-AP-2α Antibody Santa Cruz sc-12726
anti-Vinculin antibody Abcam ab129002
Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst Bruker Corporation
Collagen type I (100mg) Corning 354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher D1306
Dichloromethylsilane (DCMS) Sigma Aldrich 440272
Donkey serum Sigma Aldrich D9663
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Corning 10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV
Fluorescence microscope Leica Model DMi8
Fluoromount-G mounting medium SouthernBiotech 0100-35
HEPES Sigma Aldrich H3375 Powder
Horse serum Corning 35-030-CI
iScript Reverse Transcription Supermix Bio-Rad 1708841
Penicillin-Streptomycin antibiotic Thermo Fisher 15140148
RNeasy micro kit Qiagen 74004
Sterile 1x PBS Hyclone SH30256.02
Sterile deionized water Hardy Diagnostics U284
sulfo-SANPAH Thermo Fisher 22589
SYBR green Applied Biosystems 4472908
TEMED Sigma Aldrich T9281
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Tween 20 Sigma Aldrich P9416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
  2. Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
  3. Watt, K. E. N., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. Trainor, P. A. , Academic Press. 361-394 (2014).
  4. Lavelle, C. L. B. Applied oral physiology. , Butterworth-Heinemann. (1988).
  5. Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
  6. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  7. Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
  8. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
  9. Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
  10. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  11. Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
  12. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
  13. Lu, Y. -B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
  14. Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
  15. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  16. Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
  17. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  18. Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
  19. Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
  20. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10, Unit 10.16 (2010).
  21. Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
  22. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  23. Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
  24. Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
  25. Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
  26. Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
  27. Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
  28. Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
  29. Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
  30. Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
  31. Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
  32. Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
  33. Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
  34. Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze'ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
  35. Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
  36. Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
  37. Kuo, J. -C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
  38. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
  39. Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
  40. Lin, Y. -C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review E. 82 (4), 041918 (2010).
  41. Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
  42. Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
  43. McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
  44. Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
  45. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  46. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  47. Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  48. Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
  49. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  50. Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , Academic Press. 363-373 (2017).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 174 תאי ציצית עצבית אותות מכניים תאי O9-1 מיקרוסקופיה של כוח אטומי
מערכת O9-1/הידרוג'ל ממוטבת לחקר אותות מכניים בתאי ציצית עצבית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Le, T. P., Zhao, X., Erhardt, S.,… More

Le, T. P., Zhao, X., Erhardt, S., Gu, J., Wang, H., Findley, T. O., Wang, J. An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells. J. Vis. Exp. (174), e62693, doi:10.3791/62693 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter