Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Ett optimerat O9-1/Hydrogel-system för att studera mekaniska signaler i neurala vapenceller

Published: August 13, 2021 doi: 10.3791/62693
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3, 3, 1, 1,2
1Department of Pediatrics, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2The University of Texas MD Anderson Cancer Center UTHealth Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas Health Science Center at Houston, 3SEM AFM Core in the Houston Methodist Hospital Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Detaljerade steg-för-steg protokoll beskrivs här för att studera mekaniska signaler in vitro med hjälp av multipotenta O9-1 neurala vapenceller och polyakrylamid hydrogeler av varierande styvhet.

Abstract

Neurala vapenceller (NCCs) är ryggradsdjur embryonala multipotenta celler som kan migrera och differentiera sig till ett brett spektrum av celltyper som ger upphov till olika organ och vävnader. Vävnadsstelhet ger mekanisk kraft, en fysisk signal som spelar en avgörande roll i NCC-differentiering; Mekanismen är dock fortfarande oklar. Metoden som beskrivs här ger detaljerad information för optimerad generering av polyakrylamidhydrogeler med varierande styvhet, noggrann mätning av sådan styvhet och utvärdering av effekten av mekaniska signaler i O9-1-celler, en NCC-linje som efterliknar in vivo NCCs.

Hydrogel styvhet mättes med hjälp av atomkraft mikroskopi (AFM) och anges olika styvhet nivåer i enlighet därmed. O9-1 NCCs odlade på hydrogeler av varierande styvhet visade olika cell morfologi och gen uttryck av stress fibrer, som anges varierande biologiska effekter orsakas av mekaniska signal förändringar. Dessutom fastställde detta att varierad hydrogelstyvhet resulterade i ett effektivt in vitro-system för att manipulera mekanisk signalering genom att ändra gelstyvhet och analysera den molekylära och genetiska regleringen i NCCs. O9-1 NCCs kan differentieras till ett brett spektrum av celltyper under påverkan av motsvarande differentieringsmedium, och det är bekvämt att manipulera kemiska signaler in vitro. Därför är detta in vitro-system ett kraftfullt verktyg för att studera den mekaniska signaleringens roll i NCCs och dess interaktion med kemiska signaler, vilket hjälper forskare att bättre förstå de molekylära och genetiska mekanismerna för neural vapenutveckling och sjukdomar.

Introduction

Neurala vapenceller (NCCs) är en grupp stamceller under ryggradsdjur embryogenes med en anmärkningsvärd förmåga att migrera och bidra till utvecklingen av olika organ och vävnader. NCCs kan skilja sig åt i olika celltyper, inklusive sensoriska nervceller, brosk, ben, melanocyter och släta muskelceller, beroende på platsen för axiellt ursprung och den lokala miljövägledningen för NCC1,2. Med förmågan att differentiera sig till ett brett spektrum av celltyper kan genetiska avvikelser som orsakar dysregulation i något skede av neural crest (NC) utveckling leda till många medfödda sjukdomar2. Till exempel leder störningar under bildandet, migrationen och utvecklingen av nccs till utvecklingsstörningar som kollektivt kallas neurokristopater1,3. Dessa sjukdomar sträcker sig från kraniofacial defekter på grund av misslyckande i NCC-bildandet, såsom Treacher Collins syndrom, till utvecklingen av olika cancerformer på grund av NCC metastaserad migrationsförmåga, som ses i melanom3,4,5,6. Under de senaste decennierna har forskare gjort anmärkningsvärda upptäckter om nccs roller och mekanismer i utveckling och sjukdomar, med de flesta resultaten fokuserade på kemiska signaler7,8. På senare tid har mekaniska signaler indikerats spela en kritisk men dåligt förstådd roll i NCC-utveckling9,10.

De nationella centralbankernas miljösignaler spelar en avgörande roll under deras utveckling, inklusive regleringen av NCC-differentiering i olika celltyper. Miljösignaler, t.ex. fysiska signaler, påverkar pivotala beteenden och cellulära svar, såsom funktionell diversifiering. Mekanotransduktion gör det möjligt för celler att känna av och svara på dessa signaler för att upprätthålla olika biologiska processer2. NCCs är omgivna av närliggande celler och olika substrat, såsom den extracellulära matrisen (ECM), som kan ge upphov till mekaniska stimuli för att upprätthålla homeostas och anpassa sig till förändringarna genom ödesbestämning, spridning och apoptos11. Mekanotransduktion börjar vid plasmamembranet där den sensoriska komponenten i mekaniska extracellulära stimuli uppstår, vilket resulterar i intracellulär reglering av cellen12. Integriner, fokala vidhäftningar och korsningar av plasmamembranrelä mekaniska signaler, såsom skjuvningskrafter, stress och styvheten hos omgivande substrat, till kemiska signaler för att producera cellulära svar12. Reläing av kemiska signaler från plasmamembranet till den slutliga cellregleringen utförs via olika signalvägar för att slutföra vitala processer för organismen, såsom differentiering.

Flera studier har föreslagit att mekanisk signalering från substratstelhet spelar en roll i celldifferentiering13,14. Till exempel har tidigare studier visat att mesenkymala stamceller (MSCs) odlade på mjuka substrat med en styvhet som liknar den hos hjärnvävnad (i intervallet 0,1-1,0 kPa) resulterade i neuronal celldifferentiering15,16. Emellertid, mer MSCs differentieras i myocyt-liknande celler när odlade på 8-17 kPa substrat som efterliknar styvheten i muskeln, medan osteoblast-liknande differentiering observerades när MSCs odlades på styva substrat (25-40 kPa)15,16. Betydelsen av mekanotransduktion belyses av oegentligheter och avvikelser i den mekaniska signalvägen som potentiellt leder till allvarliga utvecklingsdefekter och sjukdomar, inklusive cancer, hjärt-kärlsjukdomar och osteoporos17,18,19. Vid cancer är normal bröstvävnad mjuk, och risken för bröstcancer ökar i stel och tät bröstvävnad, en miljö som mer liknar brösttumörer15. Med denna kunskap kan effekterna av mekanisk signalering på NCC-utveckling studeras genom enkel manipulering av substratstelhet genom ett in vitro-system, vilket ger ytterligare fördelar och möjligheter att förstå grunderna i NC-relaterad sjukdomsprogression och etiologi.

För att studera effekten av mekaniska signaler i nccs etablerade vi ett effektivt in vitro-system för nccs baserat på optimering av tidigare publicerade metoder och utvärdering av nccs svar på olika mekaniska signaler20,21. Ett detaljerat protokoll tillhandahölls för varierande hydrogel styvhet förberedelse och utvärdering av effekterna av mekanisk signalering i NCCs. För att uppnå detta används O9-1 NCCs som NC-modell för att studera effekterna och förändringarna som svar på styva kontra mjuka hydrogeler. O9-1 NCCs är en stabil NC-cellinje isolerad från musembryon (E) dag 8.5. O9-1 NCCs efterliknar nccs in vivo eftersom de kan skilja sig åt i olika NC-härledda celltyper i definierade differentieringsmedier22. För att studera den mekaniska signalningen av nccs tillverkades ett matrissubstrat med tunable elasticitet från varierande koncentrationer av akrylamid och bis-akrylamidlösningar för att uppnå önskad styvhet, korrelera till den biologiska substratstyvheten20,21,23. För att optimera villkoren för matrissubstrat för NCCs, särskilt O9-1 celler, gjordes ändringar från det tidigare publicerade protokollet20. En förändring som gjordes i detta protokoll var att inkubera hydrogeler i kollagen I, utspädd i 0,2% ättiksyra istället för 50 mM HEPES, vid 37 °C över natten. Det låga pH-värdet av ättiksyra leder till en homogen fördelning och högre kollagen I-inkorporering, vilket möjliggör en mer enhetlig fastsättning av ECM-proteinet24. Dessutom användes en kombination av hästserum och fetala bovin serum (FBS) i koncentrationerna av 10% respektive 5% i fosfatbuffert saltlösning (PBS), innan hydrogelerna i inkubatorn förvarades. Hästserum användes som ett extra komplement till FBS på grund av dess förmåga att främja cellproliferation och differentiering vid koncentrationen av 10%25.

Med denna metod efterliknades en biologisk miljö av ECM-proteinbeläggningen (t.ex. kollagen I) för att skapa en exakt in vitro-miljö för nccs att växa och överleva20,21. Styvheten hos de beredda hydrogelerna analyserades kvantitativt via atomkraftmikroskopi (AFM), en välkänd teknik för att skildra den elastiska modulus26. För att studera effekten av olika styvhetsnivåer på NCCs odlades och framställdes vilda O9-1-celler på hydrogeler för immunofluorescens (IF) färgning mot filamentös aktin (F-aktin) för att visa skillnaderna i cell vidhäftning och morfologier som svar på förändringar i substrate styvhet. Med hjälp av detta in vitro-system kommer forskare att kunna studera rollerna för mekanisk signalering i NCC och dess interaktion med andra kemiska signaler för att få en djupare förståelse för förhållandet mellan NCCs och mekanisk signalering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hydrogelberedning

OBS: Alla steg måste utföras i en cellodlingshuv som har desinficerats med etanol och ultraviolett (UV)-steriliserat före användning för att upprätthålla steriliteten. Verktyg, såsom pincett och pipetter, måste sprutas med etanol. Buffertlösningar måste också sterilt filtreras.

  1. Beredning av aminosilanebelagda glasöverdrag
    1. Placera önskat antal glasöverdrag på en bit laboratorieservett.
      OBS: Förbered ytterligare 3-4 täckbesked för att säkerställa tillräckliga reservtillbehör när de lätt bryts. Olika material av glasöverdrag kommer att ge olika kompatibilitet med cellsådd och fastsättning. Det är bättre att bestämma vilken typ som passar experimentet bäst innan du startar experimenten (se materialtabellen).
    2. Använd en alkoholbrännare eller Bunsenbrännare för att sterilisera varje täckmantel genom att föra det fram och tillbaka genom lågan (30 s för proteinanalysexperiment). Placera varje glasöverdrag på en laboratorieservett för att svalna.
    3. När glasöverdragen har svalnat, överför dem till en Petri-skål fodrad med parafilm för att förhindra glidning.
      OBS: Om täcksläparna inte är tillräckligt svala smälter den kvarvarande värmen parafilmen på sliparna, vilket gör dem oanvändbara.
    4. Täck täck täcksliparna med cirka 200 μL och 800 μL 0,1 M NaOH för ett 12 mm respektive ett 25 mm täckslip och låt dem sitta i 5 min. Aspirera sedan 0,1 M NaOH och låt täcksliparna lufttorka i ytterligare 5 minuter för att bilda en jämn film.
    5. När täckbeskeden har torkats, pipettera cirka 80 μL respektive 150 μL 3-aminopropyltrietoxisann (APTS) för 12 mm respektive 25 mm täckben. Var noga med att undvika att sprida lösningen på parafilmen. Låt lösningen sitta i 5 min.
    6. Aspirera så mycket överskott av APTS som möjligt och låt resterna APTS torka i 5 min. Skölj täcksläcken väl genom att dränka dem i sterila, avjoniserade (DI) H2O tre gånger i 5 min varje gång.
      OBS: Om glasöverdraget inte sköljs väl orsakar resterna av APTS oönskade reaktioner med glutaraldehyd, vilket gör att en vit fällning bildas och resulterar i oanvändbara täckslipar.
    7. Flytta täckena till en ny Petri-skål med den reaktiva sidan vänd uppåt. Tillsätt tillräckligt med 0,5% glutaraldehyd till Petri-skålen för att täcka täcksliparna helt och låt täcksliparna sitta i 30 minuter.
    8. Aspirera 0,5% glutaraldehyd och skölj täcksliparna igen i DI H2O en gång i 3 min. Ställ in täckslipens reaktiva sida på en laboratorieservett eller en ren Petri-skål för att lufttorka helt innan du använder den.
      PROTOKOLLET kan pausas här; Täcken måste placeras i sterila DI H2O fram till användning.
  2. Beredning av silikoniserade täckglas
    1. Placera samma antal täckslipar som de aminosilanebelagda täcksliparna (steg 1.1.1) i en Petri-skål fodrad med parafilm.
    2. Pipett 40 μL eller 150 μL för 12 mm respektive 25 mm täckben av diklorometylsilane (DCMS) på ena sidan av täckslipet och låt lösningen sitta i 5 min.
    3. Aspirera på eventuell återstående lösning från täckslipet, tvätta i steril DI H2O en gång i 1 min och placera de reaktiva täcksedena med framsidan uppåt på en laboratorietorka för att lufttorka helt innan du går vidare till nästa steg.
  3. Förbereda hydrogeler
    1. Blanda akrylamid, bis akrylamid och DI H2O i ett 1,5 mL centrifugrör för att bereda 500 μL lösningar med varierande styvhet (se tabell 1). Vortex lösningen för 30 s för att blanda den noggrant.
    2. Arbeta snabbt, tillsätt 10% ammoniumpersulfatlösning (APS) och tetrametylletylendiamin (TEMED) till röret och virvla lösningarna igen för att blanda lösningarna.
      OBS: Förbered färsk 10% APS och lämna den på is eller frys till engångs alikvoter på grund av dess känsliga frysnings- / tinacykel.
    3. Pipettera cirka 33 μL respektive 100 μL av lösningen på de torkade 12 mm respektive 25 mm aminosilanebelagda täcksliparna (punkt 1.1).
    4. Använd böjda pincett, placera omedelbart det DCMS-behandlade täcket ovanpå gellösningen med den behandlade sidan vidrör gellösningen och därmed smöra gellösningen mellan det DCMS-behandlade täcket och aminosilane-belagt täckslip.
    5. Låt gellösningen polymeriseras i 5-15 min, samtidigt som du aktivt övervakar för gelpolymerisering av den överblivna lösningen i röret.
    6. När gelén har polymeriserats, separera det DCMS-behandlade täckslipet med böjda pincett eller ett rakblad och lämna gelén fäst vid det ursprungliga aminosilanebelagda täckslipet.
    7. Placera omedelbart täckslipet med den bifogade hydrogelen i en förutbestämd 4-brunn/24-brunns- och 6-välplatta täckt med 500 μL och 2 ml steril PBS eller DI H2O för 12 mm respektive 25 mm täckslip för att förhindra att gelén torkar ut.
    8. Upprepa steg 1.3.4-1.3.7 för alla täckslipar.
    9. Dränka hydrogelerna i steril PBS eller DI H2O i 30 minuter för att avlägsna överflödig akrylamidlösning. Förvara hydrogelerna i steril PBS eller DI H2O vid 4 °C för ett procedurstopp här.
    10. I ett mörkt rum, förbereda sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoat (sulfo-SANPAH) blandning genom att blanda 2,5 ml 50 mM 2-[4-(2-hydroxyetyl) piperazin-1-yl] etanesulfonsyra (HEPES) (pH=8,5) med 25 000 9000 90000 Använd en pipett för att blanda lösningen väl innan du använder den.
      OBS: En volym på 2,5 ml sulfo-SANPAH-lösning räcker för cirka tjugofem 12 mm hydrogeler eller fem 25 mm hydrogeler.
    11. Aspirate PBS eller DI H2O från brunnsplattan. Tillsätt cirka 100 μL eller 500 μL för 12 mm respektive 25 mm täckslip av sulfo-SANPAH-lösningen (steg 1.3.10) för att täcka gelén. Se till att lösningen täcker gelén helt.
      OBS: Justera vakuumsugningsstyrkan för att förhindra att den starka kraften slits sönder eller stör hydrogelerna.
    12. Placera gelerna med lösningen under ett UV-ljus på 15 W, 365 nm i 10 minuter, avtäckt för att minimera eventuella störningar i UV-ljuset som reagerar med sulfo-SANPAH.
    13. Aspirera överskottet av sulfo-SANPAH genom att luta plattan för att samla så mycket av lösningen som möjligt. Tvätta gelén med 50 mM HEPES två till tre gånger.
    14. Tillsätt 500 μL och 2 ml för 12 mm respektive 25 mm geler av 50 mg/ml kollagen som jag spädde ut i 0,2% ättiksyra till varje brunn som innehåller hydrogelen. Låt gelerna inkubera över natten i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
      OBS: Späd kollagen I i 0,2% ättiksyra istället för 50 mM HEPES för att främja homogen fördelning och fastsättning av kollagen I.
    15. Aspirera kollagenet I och tvätta gelerna med steril PBS tre gånger för att ta bort överskott av kollagen I i 5 min varje tvätt. Inkubera hydrogelerna i PBS med 10% hästserum, 5% FBS för 2 h i 37 °C, 5% CO2 inkubator.
      OBS: Tillägget av 10% hästserum främjar högre spridning jämfört med att endast använda FBS som i föregående publikation.
    16. Aspirera på mediet. Tillsätt 500 ml sterilfiltrerad Dulbeccos modifierade eaglemedium (DMEM) med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin (P/S) till varje brunn. Förvara gelerna i inkubatorn 37 °C, 5% CO2 tills de är klara för cellodling.
    17. När du är klar, plätera cirka 1,5 × 104 O9-1 celler/cm2 i basalmedium i odlingsfaten. Inkubera cellerna i 2 dagar i en inkubator vid 37 °C, 5% CO2. Kontrollera cellerna för sammanflöde för att säkerställa att cellerna är tillräckligt fästa vid geler, och att antalet celler är tillräckligt innan de samlas in för analys.
      OBS: Se det tidigare publicerade protokollet för stegen för återställning, passage och insamling av O9-1 celler20.
    18. Fortsätt till avsnitten 2, 3 eller 4 för ytterligare analys av hydrogelerna.

2. Kvantitativ analys av styvhet via AFM

  1. Starta AFM-systemdatorn, följt av AFM-styrenheten (se tabellen över material).
  2. Montera AFM-grenen på AFM-sondens hållare. Använd en sfärisk cantilever med en 0,5 μm kiseldioxidpärla monterad i änden av cantilever (cantilever med sfärisk pärla).
    OBS: För styvare hydrogeler, såsom 10 kPa, 20 kPa och 40 kPa, användes en styvare sond med fjäderkonstanten på 0,24 N/m. En mjukare sond användes för mjukare hydrogeler, såsom 0,5 kPa och 1 kPa, med en fjäderkonstant på 0,059 N/m.
  3. Ställ in AFM-programvaran i kontaktläge.
  4. Montera kiselskivan på AFM-provstadiet för att samla kraftkurvor genom att klicka på Engage för att cantileveren ska röra vid kiselsubstratet, vilket genererar kraftkurvorna.
  5. Använd kraftkurvorna ovan (2.4) för kalibrering, klicka på Kalibrera i styrprogramvaran för att erhålla en genomsnittlig fjäderkonstant på grenen under termiskt tune-tillstånd och spara de kalibrerade värdena i styrprogramvaran.
  6. Montera proverna genom att placera täckslipet med den bifogade hydrogelen i en 60 mm Petri-skål på AFM-skanningssteget. Tillsätt 3 ml PBS i skålen innan du utför mätningar för att förhindra att gelén torkar ut.
  7. Ställ in AFM så att den fungerar i kontaktläge (vätska) för att starta mätningen. Aktivera den sfäriska pärlan för att kontinuerligt röra och lyfta från gelprovet.
  8. Ställ in cantilever så att dess avböjningströskel förblir 10 nm. Håll sondens rampstorlek på 10 μm. Registrera sedan kraftkurvorna som i steg 2,4.
  9. Skaffa minst 20 kraftkurvor från minst 3 till 10 olika fläckar över hydrogelens yta.
  10. Beräkna den genomsnittliga Youngs modulus på ~ 20 kraftkurvor för varje plats med AFM-bild- och analysprogramvara. Använd förläng rampkraftskurvor och en linjär modell (sfärisk). Beräkna medelvärdet av alla fläckar för varje prov för att ge den slutliga styvheten.
    OBS: Youngs modulus och relaterade data(dvs. standardavvikelser) sparas automatiskt som ett kalkylblad.
  11. Upprepa steg 2.6-2.10 för alla prover.

3. Molekylär analys av styvhet via immunofluorescensfärgning

  1. Använd pincett för att transportera täcket till en ny platta för att minimera falska signaler från celler som odlas direkt på plattan. Tvätta cellerna med 500 μL steril PBS tre gånger för att avlägsna döda celler och eventuellt återstående odlingsmedium.
  2. Fixera cellerna med 500 μL 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 min vid rumstemperatur, ostört. Tvätta sedan cellerna tre gånger med 500 μL PBS/brunn i 2 min vardera.
    OBS: Förvara vid 4 °C för ett procedurstopp.
  3. Behandla cellerna med 500 μL av 0,1% Triton X-100 i 15 min vid rumstemperatur. Tvätta sedan cellerna tre gånger med 500 μL PBS/well.
  4. Blockera cellerna med 250 μL 10% åsneserum (utspädd i PBS och 0,1% Interpolering 20) per brunn i 30 min vid rumstemperatur.
  5. Inkubera cellerna med 250 μL primära antikroppar i 2 timmar vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C. Tvätta sedan cellerna tre gånger med 500 μL PBS/brunn i 5 min vardera.
    OBS: Anti-Vinculin (Vcl) (1:250) och anti-AP2 alfa (1:250) användes i detta experiment och späddes ut i 10% åsne serum.
  6. Inkubera cellerna med motsvarande sekundära antikroppar och/eller falloidin som används för F-aktinfärgning vid en utspädning av 1:400 i 250 μL 10% åsneserum i 30 min vid rumstemperatur. Tvätta sedan cellerna tre gånger med PBS i 5 min vardera.
    OBS: 568 nm Phalloidin kan samkuberas med 488 nm eller 647 nm sekundära antikroppar eller på egen hand.
  7. Inkubera cellerna med 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI, 1:1000 utspädning) i 250 μL PBS i 10 min följt av en sista tvätt av PBS i 2 min.
  8. Tillsätt 3-4 droppar monteringsmedium till varje brunn. Förvara proverna vid 4 °C för att ställa in i minst 2 timmar före avbildning för att säkerställa att monteringsmediet har ställts in ordentligt.
  9. Ta bilder av minst 3 slumpmässiga ramar per hydrogelprov med fluorescensmikroskop, som producerar enskilda och sammanslagna kanaler.

4. Kvantitativt PCR i realtid (RT-qPCR)

  1. Överför hydrogelerna med de vidhäftande cellerna för RNA-insamling till en ny platta för att minimera oönskade RNA från celler som är fästa vid cellplattan. Tvätta cellerna med PBS tre gånger för att ta bort döda celler och odlingsmedium.
  2. Extrahera det totala mRNA med hjälp av ett RNA-extraktionskit. Utför omvänd transkription av RNA till cDNA med hjälp av en omvänd transkriptions supermix enligt tillverkarens instruktioner.
  3. Utför RT-qPCR med primers för Vcl som den styvhetsmarkör som valts och analysera med 2-ΔΔCT-metoden.
    OBS: Primersekvens av Vcl: Framåt 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; omvänd 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hydrogelberedning och styvhetsbedömning genom AFM och Hertz-modellen
Här tillhandahålls ett detaljerat protokoll för att generera polyakrylamidhydrogeler med varierande styvhet genom att reglera förhållandet mellan akrylamid och bisakryamid. Polyakrylamidhydrogelerna är dock inte redo för vidhäftning av celler på grund av bristen på ECM-proteiner. Således binder sulfo-SANPAH, som fungerar som en länkare, kovalent till hydrogelerna och reagerar med de primära aminer av ECM-proteiner för att möjliggöra vidhäftning av ECM-proteiner till hydrogelernas ytor via N-hydroxysuccinimide ester i sulfo-SANPAH efter UV-aktivering. Kollagen typ I användes som ECM protein val för att effektivt främja O9-1 cell fastsättning. För att säkerställa exakta styvhetsvärden för olika hydrogeler utfördes en styvhetsbedömning med AFM, en välkänd teknik för att skildra den elastiska modulen.

Vid framgångsrik bildning och fastsättning av polyakrylamidhydrogelen till glasöverdraget förblev gelén vidhäftande vid täckslipet med en jämn yta och minimal rivning. Styvheten mättes med AFM baserat på indragsprincipen, där en styv indenter applicerades på provet med den kraft som krävs för att nå ett indragsdjup26. Med denna mätning beräknades Youngs elastiska modul baserat på indragningen av djup och kraft i Hertz modell, en elastisk teori26. På grund av afm:s stora variation i resultaten tillämpades dock ytterligare en statistisk metod för att uppnå ett kvantitativt resultat med minimal inverkan av ojämna ytor och ofullkomlig homogenitet hos gellösningarna26. För att göra en kvantitativ mätning med afm togs en sammanställning av minst 50 kraft- och avståndskurvor från varje plats på gelprovet för en genomsnittlig provstyvhet. Den kraft som applicerades på högstyvhetsgelen var högre än den som applicerades på den mjukare gelen, vilket indikerar att ett styvare substrat gav en brantare lutning i grafen Force vs. Z, där kraften mäts i nN, och Z anger indragsdjupet mellan indenter och provet.

På mjuka hydrogeler var lutningen på den genererade kraftkurvan mild eftersom den erforderliga kraften från AFM-sonden var mindre (figur 1A). Men på styva hydrogeler, som de med modulus på 40 kPa, var den genererade lutningen mycket brantare eftersom den applicerade kraften var högre än för mjukare geler (figur 1B). När separationen mellan sonden och hydrogelprovet minskar ökar kurvan avsevärt när sondens spets vidrör glastäcket. Men när separationsavståndet ökar närmar sig kurvan bara 0 eftersom det inte finns någon tillämpad kraft närvarande.

Som visas i figur 1Anärmade sig kantileveren på AFM-sonden gelén, indikerad av den blå linjen, och sonden mätte den applicerade kraft som krävs för att penetrera gelprovet och så småningom nå glastäcket, vilket orsakade en plötslig ökning av kraften. På grund av eventuella procedurmässiga och instrumentella fel, såsom kvaliteten på de nödvändiga lösningarna, varierar hydrogelprovernas verkliga styvhet till stor del och långt från önskad styvhet. Afm är således ett användbart verktyg för att validera och bekräfta metoden samtidigt som falska datapresentation förhindras i ytterligare experiment.

I denna afm-bedömning mättes de fem beredda hydrogelproverna genom det kvantitativa tillvägagångssättet. Protokollet fokuserade på hydrogelstelhetsnivåer på 0,5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa och 40 kPa, som efterliknar bredden av biologiska substratstelhetsnivåer som rapporterats för differentiering av olika celltyper. Kraftkurvorna från AFM-mätningar användes för att generera Youngs elastiska modul i kilopascals med hjälp av en AFM-analysalgoritmprogramvara (figur 2).

Jämförelse av polyakrylamidhydrogelsystem och celltyper
Denna anpassning av det ursprungliga protokollet av Tse och kollegor ger ett effektivt och effektivt tillvägagångssätt för att studera de mekanosensitiva aspekterna av NCC med hjälp av O9-1 celler20. Ändringar av det tidigare protokollet inkluderar ändring av ECM-proteininkubation: ersätta 50 mM HEPES med 0,2% ättiksyra och tillsats av 10% hästserum och FBS för cellodling (steg 1.3.14-1.3.15). Dessa ändringar validerades genom att jämföra tillväxten och underhållet av O9-1 NCCs på detta modifierade gelsystem med det i det ursprungliga (kontroll) protokollet. Här odlade vi vilda O9-1-celler på båda hydrogelsystemen med elastisk modulus på 1 kPa och 40 kPa för varje system i basalt medium. Den övergripande cell tillväxt status och utveckling visualiserades med hjälp av ett brightfield ljusmikroskop för apoptotiska egenskaper, stressad morfologi och cell fastsättning till hydrogelerna. O9-1 celler som odlades på det ursprungliga gelsystemet resulterade i ett högre antal döda celler som indikerades av ett överskott av runda celler (figur 3E, F) för både 1 kPa och 40 kPa hydrogeler.

Däremot uppvisade O9-1-cellerna som odlades på det modifierade gelsystemet en sund celltillväxt och tillräcklig fastsättning vid hydrogelsubstratet (figur 3G,H). Dessutom bedömdes nccs kompatibilitet med det modifierade hydrogelsystemet genom att utföra IF-färgning av NCC-markören, Tcfap2α (AP-2). AP-2 är en transkriptionsfaktor uttryckt i NC-härstamningarna för att reglera utvecklingen av musembryon, vilket gör det lämpligt att bedöma kompatibilitet27. Även om O9-1-celler som odlas på kontroll- och modifierade hydrogelsystem båda uttryckte AP-2, fanns det en betydande ökning av AP-2-uttryck i O9-1-celler pläterade på det modifierade hydrogelsystemet, vilket indikeras av den starkare fluorescenssignalen och motsvarande kvantifiering (figur 4A, B).

Dessutom användes P19-celler för att ytterligare validera fördelarna med det modifierade hydrogelsystemet för tillväxt av celler. P19 är en embryonal karcinom cellinje som härleddes från embryo-härledd teratocarcinom i mus28. Med hjälp av motsvarande kulturprotokoll odlades P19-celler på både kontroll- och modifierade hydrogelsystem för att övervaka överlevnads- och tillväxtegenskaper. Brightfield imaging visade att P19 celler pläterade på båda hydrogelsystemen visade ett överskott av runda flytande celler och brist på cell-substrat bilagor(figur 3A-D). Denna iakttagelse föreslog att det ändrade protokollet var mer lämpligt för O9-1 NCCs att studera mekanisk signalering i NCCs.

Visualisering av högspänningsfiberuttryck på styva substrat
Den modifierade hydrogelen möjliggjorde kvantitativ och kvalitativ analys av skillnaderna i morfologin hos celler som odlas på geler med olika styvhetsnivåer och andra effektorer. När hydrogelerna var redo för cellsådd, vilda-typ O9-1 celler var passages på hydrogeler av olika styvhet nivåer. Cellerna övervakades för deras hälsa och tillväxt genom att observera deras form, rumsliga spridning och även fastsättning på hydrogelen med minimala döda celler. Vissa studier har visat en ökning av stressfibrer och cell vidhäftning för MPC på substrat med hög styvhet, vilket tyder på att nccs som odlas på ett styvare substrat också skulle uppvisa liknande resultat jämfört med nccs odlade på mjukare substrat29,30.

F-aktin tillsammans med myosin II, α-aktinin och andra cytoskeletala proteiner är gemensamt kända som stressfibrer31. Tidigare studier observerade en ökning av spänningsfibermontering som svar på ökad mekanisk kraft31. I en eller båda ändarna av stressfibrerna gör bilagor till brännviddskomplexet det möjligt för celler att migrera och följa ECM31. Phalloidin färgning för att visualisera F-aktin uttryck och organisation i nccs visade hälsosam cell tillväxt som svar på mekanisk signalering (figur 5). Dessutom uppvisade O9-1-cellerna som odlades på hydrogeler med låg eller hög styvhet olika morfologier genom olika mängder stressfibrer (figur 5). I likhet med observationer från rapporterade studier som utförts med MSC observerades att O9-1 celler odlade på ett styvare substrat, 40 kPa, uppvisade mer stressfibrer och var väl spridda jämfört med celler som odlades på en mjukare hydrogel, indikerad av 1 kPa styvhet29,30.

Bedömning av cellarvationer
För att ytterligare bekräfta hypotesen att förändringen i substrate styvhet påverkar NCC vidhäftning, mättes förändringar i Vcl uttryck kvantitativt via RT-qPCR i NCC som svarar på olika hydrogelstelhetsnivåer. Vcl är ett av de många cytoskeletala proteiner som finns i fokal vidhäftningskomplexet under cellprocessen och etablerar kontakter med substratet och känner av ECM-egenskaperna32. Fokala vidhäftningar är cellernas kontaktpunkter till ECM via integrinreceptorer, som förankrar sig i cytoplasmisk aktin cytoskeleton, F-aktin33 Vcl-genuttrycksnivån föreslår förändringar i fokala vidhäftningar och cell vidhäftningar av O9-1-cellerna som svar på substratestelheten.

Tidigare studier visade effekten av Vcl på cell vidhäftning i embryonala stamceller och fibroblastceller genom skillnader i dess uttryck. Som svar på det höga uttrycket av Vclökade också antalet och storlekarna på fokala vidhäftningar men minskade när Vcl slogs ner34. Konsekvent visade Vcl-bristfälligaceller också en signifikant minskning av cell vidhäftning och spridning35. Dessutom spelar Vcl en roll i regleringen av cell vidhäftning genom att stabilisera fokala vidhäftningar36. Storleken på fokala vidhäftningar, mognadsnivå och kompositioner varierar beroende på substratets styvhet, vilket gör att signaler kan överföras intracellulärt och cellerna att svara på deras miljösignaler37. Således är Vcl mycket rekryterad till fokala vidhäftningskomplex i celler som odlas på styva substrat, vilket återspeglas av högre mRNA-nivåer som detekteras av RT-qPCR (figur 6C).

Celler som odlas på mjukare substrat bildar minimala fokala vidhäftningskomplex, vilket återspeglas av lägre mRNA-nivåer av Vcl i cellerna15. I figur 6Cuppvisade O9-1 celler ett högre uttryck av Vcl på det styva substratet än på det mjuka substratet. Dessa resultat tyder på en högre nivå av cell-substrat vidhäftningar av O9-1 celler på styva substrat än O9-1 celler på mjukare substrat. Dessutom visualiserades Vcl uttryck kvalitativt genom IF färgning med en anti-Vcl antikropp för att ytterligare komplettera och stödja RT-qPCR konstaterandet. Genomgående var Vcl-uttrycket i O9-1-celler som odlades på det styvare substratet högre än de som odlades på det mjukare substratet (figur 6A,B), vilket ytterligare stödde det första konstaterandet av högcells vidhäftning och spridning på 40 kPa hydrogel jämfört med 1 kPa hydrogel som observerats med F-aktin phalloidin färgning och Vcl uttrycksnivåer via RT-qPCR.

Figure 1
Bild 1:Kraftkurvor som genereras av AFM-sondens indrag. Kraft (y-axel) anger den erforderliga kraft som appliceras i nN, och Z (x-axel) anger Bruker AFM-sondens avstånd från provet i μm. För 1 kPa hydrogel (A) är den genererade lutningen skonsam jämfört med den brantare sluttning som observerats för 40 kPa hydrogel (B). De färgade kurvorna representerar cantileverens rörelse på AFM-sonden när den närmar sig (blå) och drar tillbaka (röd) från hydrogelprovet. Kurvans högsta startpunkt indikerar den styva kontakten hos glasöverdraget. b)Den stora dippen i den indragna kurvan i hydrogelen på 40 kPa indikerar vidhäftning mellan pärlan och provet. Förkortning: AFM = atomkraftmikroskopi. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Den genomsnittliga styvheten hos hydrogeler (i kPa) beräknad från Youngs elastiska modul. Youngs modulus genererades från kraftkurvorna från figur 1. De refererade elastiska moduli av hydrogels var 0,5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa och 40 kPa. Felstaplar anger standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Ljusfältsbilder av P19- och O9-1-celler pläterade på 1 kPa och 40 kPa-hydrogeler av kontroll- och modifierade gelsystem för att upptäcka celltillväxtegenskaper. döda celler indikeras med röda pilar. Skalningsstaplar = 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Immunofluorescensfärgning av NCC-markör AP-2 i O9-1 NCCs för att visualisera NCC-kompatibilitet. (A) Ett 40 kPa modifierat hydrogelsystem jämfört med (B) en 40 kPa-kontroll. AP-2 (grön); kärnor var färgade med DAPI (blå). Skalningsstaplar = 25 μm. (C) Stapeldiagram ger kvantifiering av AP-2-uttrycksnivån som visar signifikans (p-värde = 0,003) (n = 3). Data visar det relativa uttrycket med angivna standardavvikelsefelstaplar. Förkortningar: NCC = neural crest cell; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Fluorescerande falloidinfärgning av F-aktin som visar stressfibrer som är väl spridda i O9-1-celler på 40 kPa hydrogel. O9-1 celler odlades på 1 kPa (A) och 40 kPa hydrogeler (B). O9-1 celler färgades med Alexa Fluor 488 Phalloidin (grön), och atomkärnorna var färgade med DAPI (blå). Skalstänger = 25 μm. Förkortning: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Immunofluorescensbilder av vinkulin i O9-1-celler. O9-1 celler pläterades på 1 kPa (A) och 40 kPa (B) hydrogeler. Kärnor var färgade med DAPI (blå). Skalstänger = 25 μm. (C) Kvantitativ PCR-analys i realtid av den totala mRNA-nivån av Vcl i O9-1-celler odlade på 1 kPa och 40 kPa hydrogeler. Vcl uttrycksnivån på 1 kPa hydrogel är betydligt lägre än på 40 kPa hydrogel (p-värde= 0,02). Data visar medelvärdet med angivna standardavvikelsefelstaplar. Förkortning: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

500 μL total volym 0,5 kPa 1 kPa 10 kPa 20 kPa 40 kPa
40% akrylamid (μL) 37.5 62.5 125 100 100
20% Bis-akrylamid (μL) 15 7.5 25 66 120
H2O (μL) 447.5 430 350 334 280
10% APS (μL) 5 5 5 5 5
TEMED (μL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Tabell 1: Motsvarande volymer av lösningar för att uppnå önskade styvhetsnivåer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målet med den aktuella studien är att tillhandahålla ett effektivt och effektivt in vitro-system för att bättre förstå effekten av mekaniska signaler i nccs. Förutom att följa det steg-för-steg-protokoll som nämns ovan måste forskare komma ihåg att cellkulturen hos O9-1 NCCs påverkas av den typ av glastäcke som används för att förbereda hydrogeler. Det noterades till exempel att celler som såtts på en viss typ av glastäcke (se tabellen över material) överlevde och spred sig väl, medan odlade celler som såddes på andra typer av glasöverdrag visade mer celldöd. Dessutom är det viktigt att strikt följa de korrekta cellodlingsvillkoren för O9-1 NCCs38. Cellkulturens kvalitet är optimal när hydrogelerna används så snart som möjligt eller förvaras i en steril 37 °C inkubator i upp till två dagar.

På grund av känsligheten hos varje komponent i protokollet kan den elastiska modulen variera mellan experiment. Förutom de punkter som nämns i protokollet (steg 1.3.2) om 10 % APS påverkar även andra kritiska faktorer att tänka på variationen. En annan faktor som misstänktes orsaka stora variationer i AFM-mätningar var tjockleken på hydrogelerna. En tidigare studie hade undersökt tjocklekens effekt på Youngs moduli, från 15 till 1000 μm, och hade funnit att skillnader i tjocklek inte förändrade Youngs moduli signifikant39. Men tjockleken på substraten påverkar också de mekaniska egenskaperna som cellerna kan känna, vilket leder till olika morfologier40,41,42. Olika studier visade att en betydande ökning av tjockleken på hydrogeler ledde till en minskning av cellområdet, spridning och effektivitet av hydrogeler40,41,42. Men cellernas fenotyper förändras också som svar på betydligt tunna hydrogeler, t.ex. högre spridning även på hydrogeler med låg styvhet40,41,42. Med en jämn volym polyakrylamidgeler bör tjockleken på hydrogeler vara enhetlig så att små avvikelser inte kommer att påverka den elastiska modulen i AFM-mätningar.

Det är bättre att sterilisera täckslipar genom att skicka dem fram och tillbaka i lågan med en alkoholbrännare eftersom andra steriliseringsmetoder kan vara mer komplicerade och orsaka potentiella skador på glasskyddssläparna. Olika storlekar av glasöverdrag kan användas baserat på experimentella krav. Detta protokoll används 12 mm och 25 mm täckslipar för immunohistochemistry respektive RT-qPCR. Att använda geler av lämplig storlek för att passa experimenten uppmuntrar effektivitet och minimerar avfall. Dessa modifieringar validerades kvalitativt och kvantitativt för att säkerställa optimering för O9-1 NCCs jämfört med det ursprungliga (kontroll) hydrogelsystemet20. Den övergripande hälsan och tillväxten av O9-1 NCCs bedömdes under ett brightfield mikroskop för cellulära och substrat tillbehör egenskaper.

Dessutom jämfördes kompatibiliteten hos O9-1 celler mellan både kontroll och modifierade hydrogelsystem för att ytterligare validera ändringarna i detta protokoll genom att kvalitativt visualisera AP-2 uttryck med hjälp av IF färgning. Intensiteten av signalerna kvantifierades för att ytterligare stödja de representativa bilderna av AP-2 uttryck i O9-1 celler mellan kontroll kontra de modifierade hydrogelsystemen. Medan AP-2 är en vanlig NCC-markör, måste andra välkända markörer övervägas för validering, såsom Sox10 och Pax3, på grund av deras betydelse för NCC-underhåll av pluripotens och överlevnad28. Dessutom bekräftades optimeringen i detta protokoll ytterligare genom att jämföra O9-1 NC-cellerna med en annan cellinje, P19, för att säkerställa att detta hydrogelsystem är effektivt och tillförlitligt för NC-celler. Även om P19-celler har odödliga egenskaper och är lätt odlade, trivdes de inte bra på något av hydrogelsystemen.

Motståndet mot den långsträckta kraften som genereras från substratet eller vävnadsstelheten där cellerna fäster uttrycks ofta som Youngs elastiskamodulus 45. Med AFM erhålls Youngs elastiska modulus från kraftkurvan som genereras från den applicerade vertikala kraften26. Stora variationer kan uppstå vid AFM-mätning, mellan mätningar som kan leda till felaktiga avläsningar för de styvare hydrogelerna. Inkonsekvensen kan orsakas av felaktiga sonder som används för mätning. Till exempel kräver mätning av 20 kPa och 40 kPa hydrogeler användning av en styvare sond med en högre fjäderkonstant (k = 0,24 N/m). En styvare sond möjliggör en lägre upplösning jämfört med en mjukare sond; Det finns dock skäl att föredra valet av en styvare sond eftersom alltför mjuka cantilevers kan hålla fast vid proverna46. Dessutom är alltför mjuka sonder mycket känsliga, vilket bidrar till falska signaler från oönskade partiklar och resulterar i artificiellt lägre eller högre styvhetsvärden än den sanna styvheten46. Dessutom måste korrekt inmatning av Poissons förhållande noteras, beroende på mätmaterialet. Detta kan hittas i standardiserade studier eftersom detta väsentligt påverkar datautgången.

Dessutom användes AFM för att mäta tjockleken på hydrogelerna, eftersom tjocklek är en annan mekanisk egenskap som påverkar hur celler känner av sin miljö47,42. I olika rapporterade studier observeras celler som odlas på mjuka hydrogeler vara runda i form vid och bortom "kritisk tjocklek", vilket rapporteras vid ~ 2-5 μm, beroende på celltyp47,42,48. Mycket högre spridning observerades dock när celler pläterades på hydrogeler med samma styvhet men lägre tjocklek än den "kritiska tjockleken"42,48. En potentiell förklaring till detta intressanta fynd är att den subkritiska tjockleken på hydrogeler gör det möjligt för cellerna att känna av de styva underliggande glasöverdragen när cellerna utövar dragkraft för lateral förskjutning47. Den genomsnittliga tjockleken över allstyvhet hydrogeler var 342 μm med en standardavvikelse på 27 μm. Tjockleken på hydrogelerna var högre än den föreslagna "kritiska tjockleken", och inom testområdet under 400 μm, vilket rapporterades i studier och de tillverkade färdiga hydrogelerna, så att cellerna kunde känna av hydrogelernas olika styvhet och inte de underliggande styva glasöverdragen42,48.

Förutom den kvantitativa AFM-analysmetoden analyserades hydrogelerna också kvalitativt genom immunohistokemi för att studera uttrycket av de markörer som påverkas av den varierande styvheten i O9-1-celler och för att visualisera en hälsosam tillväxt av cellerna. F-aktin i cytoplasman är ansluten till de membranbundna integrinerna via en uppsättning cytoskeletala proteiner, såsom talin och Vcl, som bildar det fokala vidhäftningskomplexet33. Uttryck av stressfibrer i celler kan också analyseras genom att mäta uttrycket av andra cytoskeletala gener i celler, såsom talin och integrin, som kan visualiseras tillsammans med hjälp av fokal vidhäftningsfärgningssatsen.

Det fanns olika grader av hydrogelstelhet som påverkade NCC morfologi och respons, vilket ses i förändringen i cell vidhäftning och stressfibrer genom mekanisk signalering. Detta protokoll erbjuder förmågan att påverka celldifferentiering i olika celltyper genom att ändra motsvarande odlingsförhållanden in vitro, vilket ger en bekväm metod för manipulering av mekaniska signaler och kemiska signaler i NCCs. Som tidigare nämnts styrs NCC-differentieringens öde till stor del av mekaniska krafter som finns i den omgivande vävnaden, inklusive dess styvhet2,3. Även om det omedelbara målet med detta dokument var att utveckla ett steg-för-steg-protokoll för att förbereda hydrogeler för NCC-kultur, sträcker sig de potentiella fördelarna med detta protokoll utöver metoden och strävar efter ytterligare kunskap om mekanisk signalering i nccs. Det är också värt att notera att detta in vitro-system har vissa begränsningar. Denna teknik för tillverkning av hydrogeler består av flera steg som potentiellt kan införa tekniska variationer längs vägen, inklusive heterogenitet, ojämn yta och felaktig styvhet. Därför måste användarna utföra dessa steg noggrant för att minimera tekniska variationer under experiment. Dessutom begränsade polyakrylamidgeler i detta system studier till 2D-kultur på grund av akrylamidens toxicitet och ignorerade den exakta 3D-biologiska miljön som NCCs bori 50.

Trots dessa begränsningar möjliggör detta in vitro-system en billig och enkel metod som gynnar alla forskningsnivåer och gör det möjligt för forskare att utföra tillräckliga och funktionella nedströmstester. Som framgår av de senaste resultaten förlitar sig NCCs starkt på både mekanisk signalering, såsom skjuvkraft och substratstelhet, och kemisk signalering, såsom Wnt och fibroblast tillväxtfaktorsignalering, i kraniofacial, liksom hjärtutveckling hos ryggradsdjur6,15. Med hjälp av detta protokoll kan de lokala mikromiljön för in vitro-experiment enkelt efterliknas för framtida studier på NCCs, inklusive differentiering, migrering, cellulära svar och potentialen för skadlig sjukdomsprogression. Därför kommer detta in vitro-system att vara ett kraftfullt verktyg för att studera rollerna för mekanisk signalering i NCCs och deras interaktioner med andra signalvägar, vilket kommer att fördjupa förståelsen av de molekylära och genetiska mekanismerna för NCC-utveckling och relaterade sjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Dr. Ana-Maria Zaske, operatör av Atomic Force Microscope-UT Core-anläggningen vid University of Texas Health Sciences Center, för den bidrog expertisen inom AFM i detta projekt. Vi tackar också finansieringskällorna från National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 och R01HL142704 till J. Wang).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip Chemglass Life Sciences CLS-1763-012
2% Bis-Acrylamide Sigma Aldrich M1533
24-well plate Greiner Bio-one 662165
25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip Chemglass Life Sciences CLS-1763-025
3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) Sigma Aldrich A3648
4-well cell culture plate Thermo Scientific 179830
4% Paraformaldehyde Sigma Aldrich J61899-AP
40% Acrylamide Sigma Aldrich A4058
50% glutaraldehyde Sigma Aldrich G7651
6-well cell culture plate Greiner Bio-one 657160
AFM cantilever (spherical bead) Novascan
AFM software Catalyst NanoScope Model: 8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher A12379
Ammonium Persulfate (APS) Sigma Aldrich 248614 Powder
anti-AP-2α Antibody Santa Cruz sc-12726
anti-Vinculin antibody Abcam ab129002
Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst Bruker Corporation
Collagen type I (100mg) Corning 354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher D1306
Dichloromethylsilane (DCMS) Sigma Aldrich 440272
Donkey serum Sigma Aldrich D9663
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Corning 10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV
Fluorescence microscope Leica Model DMi8
Fluoromount-G mounting medium SouthernBiotech 0100-35
HEPES Sigma Aldrich H3375 Powder
Horse serum Corning 35-030-CI
iScript Reverse Transcription Supermix Bio-Rad 1708841
Penicillin-Streptomycin antibiotic Thermo Fisher 15140148
RNeasy micro kit Qiagen 74004
Sterile 1x PBS Hyclone SH30256.02
Sterile deionized water Hardy Diagnostics U284
sulfo-SANPAH Thermo Fisher 22589
SYBR green Applied Biosystems 4472908
TEMED Sigma Aldrich T9281
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Tween 20 Sigma Aldrich P9416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
  2. Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
  3. Watt, K. E. N., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. Trainor, P. A. , Academic Press. 361-394 (2014).
  4. Lavelle, C. L. B. Applied oral physiology. , Butterworth-Heinemann. (1988).
  5. Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
  6. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  7. Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
  8. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
  9. Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
  10. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  11. Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
  12. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
  13. Lu, Y. -B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
  14. Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
  15. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  16. Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
  17. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  18. Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
  19. Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
  20. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10, Unit 10.16 (2010).
  21. Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
  22. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  23. Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
  24. Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
  25. Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
  26. Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
  27. Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
  28. Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
  29. Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
  30. Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
  31. Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
  32. Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
  33. Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
  34. Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze'ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
  35. Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
  36. Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
  37. Kuo, J. -C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
  38. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
  39. Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
  40. Lin, Y. -C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review E. 82 (4), 041918 (2010).
  41. Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
  42. Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
  43. McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
  44. Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
  45. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  46. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  47. Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  48. Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
  49. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  50. Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , Academic Press. 363-373 (2017).

Tags

Utvecklingsbiologi nummer 174 neurala vapenceller mekaniska signaler O9-1-celler atomkraftmikroskopi
Ett optimerat O9-1/Hydrogel-system för att studera mekaniska signaler i neurala vapenceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Le, T. P., Zhao, X., Erhardt, S.,… More

Le, T. P., Zhao, X., Erhardt, S., Gu, J., Wang, H., Findley, T. O., Wang, J. An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells. J. Vis. Exp. (174), e62693, doi:10.3791/62693 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter