Summary
Aquí se describen protocolos detallados paso a paso para estudiar señales mecánicas in vitro utilizando células de cresta neural O9-1 multipotentes e hidrogeles de poliacrilamida de rigidez variable.
Abstract
Las células de la cresta neural (NCC) son células multipotentes embrionarias de vertebrados que pueden migrar y diferenciarse en una amplia gama de tipos de células que dan lugar a diversos órganos y tejidos. La rigidez tisular produce fuerza mecánica, una señal física que juega un papel crítico en la diferenciación de NCC; sin embargo, el mecanismo sigue sin estar claro. El método descrito aquí proporciona información detallada para la generación optimizada de hidrogeles de poliacrilamida de rigidez variable, la medición precisa de dicha rigidez y la evaluación del impacto de las señales mecánicas en las células de O9-1, una línea NCC que imita a los NCC in vivo.
La rigidez del hidrogel se midió mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) e indicó diferentes niveles de rigidez en consecuencia. Los NCC de O9-1 cultivados en hidrogeles de rigidez variable mostraron una morfología celular y una expresión génica diferentes de las fibras de estrés, lo que indicó efectos biológicos variables causados por cambios en las señales mecánicas. Además, esto estableció que la variación de la rigidez del hidrogel dio como resultado un sistema in vitro eficiente para manipular la señalización mecánica alterando la rigidez del gel y analizando la regulación molecular y genética en nccs. O9-1 NCCs pueden diferenciarse en una amplia gama de tipos de células bajo la influencia de los medios de diferenciación correspondientes, y es conveniente manipular señales químicas in vitro. Por lo tanto, este sistema in vitro es una herramienta poderosa para estudiar el papel de la señalización mecánica en los NCC y su interacción con las señales químicas, lo que ayudará a los investigadores a comprender mejor los mecanismos moleculares y genéticos del desarrollo de la cresta neural y las enfermedades.
Introduction
Las células de la cresta neural (NCC) son un grupo de células madre durante la embriogénesis de vertebrados con una notable capacidad para migrar y contribuir al desarrollo de diversos órganos y tejidos. Los NCC pueden diferenciarse en diferentes tipos de células, incluidas las neuronas sensoriales, el cartílago, el hueso, los melanocitos y las células del músculo liso, dependiendo de la ubicación del origen axial y la orientación ambiental local del NCC1,2. Con la capacidad de diferenciarse en una amplia gama de tipos de células, las anomalías genéticas que causan desregulación en cualquier etapa del desarrollo de la cresta neural (NC) pueden conducir a numerosas enfermedades congénitas2. Por ejemplo, las perturbaciones durante la formación, migración y desarrollo de las NCC conducen a trastornos del desarrollo conocidos colectivamente como neurocristopatías1,3. Estas enfermedades van desde defectos craneofaciales debido a fallas en la formación de NCC, como el síndrome de Treacher Collins, hasta el desarrollo de varios cánceres debido a la capacidad migratoria metastásica de NCC, como se ve en el melanoma3,4,5,6. En las últimas décadas, los investigadores han hecho descubrimientos notables sobre los roles y mecanismos de los NCC en el desarrollo y las enfermedades, y la mayoría de los hallazgos se centran en las señales químicas7,8. Más recientemente, se ha indicado que las señales mecánicas desempeñan un papel crítico pero poco comprendido en el desarrollo de NCC9,10.
Las señales ambientales de los NCC juegan un papel crítico durante su desarrollo, incluida la regulación de la diferenciación de NCC en varios tipos de células. Las señales ambientales, por ejemplo, las señales físicas, influyen en los comportamientos fundamentales y las respuestas celulares, como la diversificación funcional. La mecanotransducción permite a las células detectar y responder a esas señales para mantener diversos procesos biológicos2. Los NCC están rodeados de células vecinas y diferentes sustratos, como la matriz extracelular (ECM), que puede dar lugar a estímulos mecánicos para mantener la homeostasis y adaptarse a los cambios a través de la determinación del destino, la proliferación y la apoptosis11. La mecanotransducción comienza en la membrana plasmática donde se produce el componente sensorial de los estímulos mecánicos extracelulares, dando lugar a la regulación intracelular de la célula12. Las integrinas, las adherencias focales y las uniones de la membrana plasmática transmiten señales mecánicas, como las fuerzas de cizallamiento, la tensión y la rigidez de los sustratos circundantes, en señales químicas para producir respuestas celulares12. La retransmisión de señales químicas desde la membrana plasmática hasta la regulación celular final se lleva a cabo a través de diferentes vías de señalización para finalizar procesos vitales para el organismo, como la diferenciación.
Varios estudios han sugerido que la señalización mecánica de la rigidez del sustrato juega un papel en la diferenciación celular13,14. Por ejemplo, estudios previos han demostrado que las células madre mesenquimales (MSC) cultivadas en sustratos blandos con una rigidez similar a la del tejido cerebral (en el rango de 0.1-1.0 kPa) resultaron en la diferenciación de células neuronales15,16. Sin embargo, más MSC se diferencian en células similares a los miocitos cuando se cultivan en sustratos de 8-17 kPa que imitan la rigidez del músculo, mientras que la diferenciación similar a los osteoblastos se observó cuando las MSC se cultivaron en sustratos rígidos (25-40 kPa)15,16. La importancia de la mecanotransducción se destaca por las irregularidades y anomalías en la vía de señalización mecánica que potencialmente conducen a defectos y enfermedades graves del desarrollo, incluidos el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y la osteoporosis17,18,19. En los cánceres, el tejido mamario normal es blando, y el riesgo de cáncer de mama aumenta en el tejido mamario rígido y denso, un ambiente que es más parecido a los tumores de mama15. Con este conocimiento, los efectos de la señalización mecánica en el desarrollo de NCC se pueden estudiar a través de la manipulación simple de la rigidez del sustrato a través de un sistema in vitro, proporcionando más ventajas y posibilidades para comprender los fundamentos de la progresión y etiología de la enfermedad relacionada con NC.
Para estudiar el impacto de las señales mecánicas en los NCC, establecimos un sistema in vitro eficiente para ncCs basado en la optimización de métodos previamente publicados y la evaluación de las respuestas de los NCCs a diferentes señales mecánicas20,21. Se proporcionó un protocolo detallado para la preparación de la rigidez variable del hidrogel y la evaluación del impacto de la señalización mecánica en los NCC. Para lograr esto, los NCC O9-1 se utilizan como modelo NC para estudiar los efectos y cambios en la respuesta a los hidrogeles rígidos frente a los blandos. Los NCC O9-1 son una línea celular NC estable aislada del embrión de ratón (E) en el día 8.5. Los NCC de O9-1 imitan a los NCC in vivo porque pueden diferenciarse en varios tipos de células derivadas de NC en medios de diferenciación definidos22. Para estudiar la señalización mecánica de los NCC, se fabricó un sustrato de matriz con elasticidad sintonizable a partir de concentraciones variables de soluciones de acrilamida y bisacrilamida para lograr la rigidez deseada, correlacionándose con la rigidez biológica del sustrato20,21,23. Para optimizar las condiciones de sustrato matricial para NCCs, específicamente células O9-1, se realizaron modificaciones a partir del protocolo20previamente publicado. Un cambio realizado en este protocolo fue incubar hidrogeles en colágeno I, diluidos en ácido acético al 0,2% en lugar de 50 mM HEPES, a 37 °C durante la noche. El bajo pH del ácido acético conduce a una distribución homogénea y una mayor incorporación de colágeno I, lo que permite una unión más uniforme de la proteína ECM24. Además, se utilizó una combinación de suero de caballo y suero fetal bovino (FBS) en las concentraciones de 10% y 5% en solución salina tampón de fosfato (PBS), respectivamente, antes de almacenar los hidrogeles en la incubadora. El suero de caballo se utilizó como un suplemento adicional a FBS debido a su capacidad para promover la proliferación y diferenciación celular a la concentración de 10%25.
Con este método, un entorno biológico fue imitado por el recubrimiento de proteína ECM (por ejemplo, colágeno I) para crear un entorno in vitro preciso para que los NCC crezcan y sobrevivan20,21. La rigidez de los hidrogeles preparados se analizó cuantitativamente mediante microscopía de fuerza atómica (AFM), una técnica bien conocida para representar el módulo elástico26. Para estudiar el efecto de diferentes niveles de rigidez en los NCC, se cultivaron células O9-1 de tipo salvaje y se prepararon en hidrogeles para la tinción de inmunofluorescencia (IF) contra la actina filamentosa (F-actina) para mostrar las diferencias en la adhesión celular y las morfologías en respuesta a los cambios en la rigidez del sustrato. Utilizando este sistema in vitro, los investigadores podrán estudiar las funciones de la señalización mecánica en los NCC y su interacción con otras señales químicas para obtener una comprensión más profunda de la relación entre los NCC y la señalización mecánica.
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Protocol
1. Preparación de hidrogel
NOTA: Todos los pasos deben realizarse en una campana de cultivo celular que haya sido desinfectada con etanol y ultravioleta (UV) esterilizado antes de su uso para mantener la esterilidad. Las herramientas, como pinzas y pipetas, deben rociarse con etanol. Las soluciones tampón también deben ser filtradas estérilmente.
- Preparación de fundas de vidrio recubiertas de aminosilano
- Coloque el número deseado de hojas de cubierta de vidrio en un trozo de toallita de laboratorio.
NOTA: Prepare 3-4 cubiertas adicionales para garantizar suficientes suministros de respaldo a medida que se rompen fácilmente. Los diferentes materiales de las cubiertas de vidrio producirán una compatibilidad diferente de siembra y fijación celular. Es mejor determinar qué tipo se adapta mejor al experimento antes de comenzar los experimentos (consulte la Tabla de materiales). - Use un quemador de alcohol o un quemador Bunsen para esterilizar cada hoja de cubierta pasándola de un lado a otro a través de la llama (30 s para experimentos de ensayo de proteínas). Coloque cada funda de vidrio en una toallita de laboratorio para enfriar.
- Una vez que las cubiertas de vidrio se hayan enfriado, transfiéralas a una placa de Petri forrada con parafilm para evitar el deslizamiento.
NOTA: Si las cubiertas no están lo suficientemente frías, el calor residual derretirá la parapelícula en los resbalones, dejándolos inutilizables. - Cubra los cubrecolchas con aproximadamente 200 μL y 800 μL de 0,1 M NaOH para un funda de 12 mm y 25 mm, respectivamente, y déjelos reposar durante 5 min. Luego, aspire el NaOH de 0.1 M y deje que las cubiertas se sequen al aire durante otros 5 minutos para formar una película uniforme.
- Una vez que se secan los cubrebocas, pipetee aproximadamente 80 μL y 150 μL de 3-aminopropil trietoxisilano (APTS) para los cobertores de 12 mm y 25 mm, respectivamente. Tenga cuidado de evitar derramar la solución sobre la parapelícula. Deje que la solución repose durante 5 minutos.
- Aspire la mayor cantidad de exceso de APTS como sea posible y deje que el APTS residual se seque durante 5 minutos. Enjuague bien los cubrehojas sumergiéndolos en estériles desionizados (DI) H2O tres veces durante 5 minutos cada vez.
NOTA: Si las cubiertas de vidrio no se enjuagan bien, el APTS residual causa reacciones no deseadas con glutaraldehído, lo que hace que se forme un precipitado blanco y da como resultado un deslizamiento inutilizable. - Mueva los cubrehojas a una nueva placa de Petri con el lado reactivo hacia arriba. Agregue suficiente glutaraldehído al 0.5% a la placa de Petri para cubrir los cubrecolchas por completo y permita que los cubrecolchas se asienten durante 30 minutos.
- Aspire el glutaraldehído al 0,5% y enjuague las hojas de cubierta nuevamente en DI H2O una vez durante 3 min. Coloque el lado reactivo de los cubrehojas hacia arriba en una toallita de laboratorio o una placa de Petri limpia para que se seque completamente al aire antes de usarlo.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí; Las fundas deben colocarse en DI H2O estéril hasta su uso.
- Coloque el número deseado de hojas de cubierta de vidrio en un trozo de toallita de laboratorio.
- Preparación de fundas siliconadas
- Coloque el mismo número de fundas que las fundas recubiertas de aminosilano (paso 1.1.1) en una placa de Petri forrada con parafilm.
- Pipetear 40 μL o 150 μL para fundas de 12 mm y 25 mm, respectivamente, de diclorometilsilano (DCMS) a un lado de la cubierta y dejar reposar la solución durante 5 min.
- Aspire cualquier solución restante de la cubierta, lave en DI H2O estéril una vez durante 1 minuto y coloque las hojas de cubierta reactivas boca arriba en una toallita de laboratorio para que se sequen completamente al aire antes de pasar al siguiente paso.
- Preparación de hidrogeles
- Mezcle acrilamida, bisacrilamida y DI H2O en un tubo de centrífuga de 1,5 ml para preparar 500 μL de soluciones con rigidezs variables (ver Tabla 1). Vórtice la solución durante 30 s para mezclarla a fondo.
- Trabajando rápidamente, agregue la solución de persulfato de amonio al 10% (APS) y la tetrametilendiamina (TEMED) al tubo y vórtice las soluciones nuevamente para mezclar las soluciones.
NOTA: Prepare un 10% de APS fresco y déjelo en hielo o congele en alícuotas de un solo uso debido a su ciclo de congelación / descongelación sensible. - Pipetear aproximadamente 33 μL o 100 μL de la solución sobre las fundas recubiertas de aminosilano secas de 12 mm o 25 mm (sección 1.1), respectivamente.
- Usando pinzas curvas, coloque inmediatamente el coverslip tratado con DCMS sobre la solución de gel con el lado tratado tocando la solución de gel, intercalando así la solución de gel entre el coverslip tratado con DCMS y el coverlip recubierto de aminosilano.
- Deje que la solución de gel polimerice durante 5-15 minutos, mientras monitorea activamente la polimerización en gel de la solución sobrante en el tubo.
- Una vez polimerizado el gel, separe el estuche tratado con DCMS con pinzas curvas o una cuchilla de afeitar, dejando el gel unido a la funda original recubierta de aminosilano.
- Coloque inmediatamente la cubierta con el hidrogel conectado en una placa predeterminada de 4 pocillos/24 pocillos y 6 pocillos cubierta con 500 μL y 2 ml de PBS estéril o DI H2O para fundas de 12 mm y 25 mm, respectivamente, para evitar que el gel se seque.
- Repita los pasos 1.3.4-1.3.7 para todas las fundas.
- Sumergir los hidrogeles en PBS estéril o DI H2O durante 30 min para eliminar el exceso de solución de acrilamida. Guarde los hidrogeles en PBS estéril o DI H2O a 4 °C para una parada de procedimiento aquí.
- En una habitación oscura, prepare la mezcla de sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate (sulfo-SANPAH) mezclando 2.5 mL de 50 mM 2-[4-(2-hidroxietil) piperazina-1-il] ácido etanosulfónico (HEPES) (pH=8.5) con 25 μL del sulfo-SANPAH de 50 μg/mL en un tubo cónico, envuelto en papel de aluminio para protegerlo de la luz. Use una pipeta para mezclar bien la solución antes de usarla.
NOTA: Un volumen de 2,5 ml de solución de sulfo-SANPAH es suficiente para aproximadamente veinticinco hidrogeles de 12 mm o cinco hidrogeles de 25 mm. - Aspire PBS o DI H2O de la placa del pozo. Añadir aproximadamente 100 μL o 500 μL para las fundas de 12 mm y 25 mm, respectivamente, de solución de sulfo-SANPAH (paso 1.3.10) para cubrir el gel. Asegúrese de que la solución cubra el gel por completo.
NOTA: Ajuste la fuerza de succión al vacío para evitar que la fuerza fuerte rasgue o perturbe los hidrogeles. - Coloque los geles con la solución bajo una luz UV de 15 W, 365 nm durante 10 min, descubierta para minimizar cualquier interferencia de la luz UV que reacciona con el sulfo-SANPAH.
- Aspire el exceso de sulfo-SANPAH inclinando la placa para recoger la mayor cantidad posible de la solución. Lave el gel con HEPES de 50 mM dos o tres veces.
- Añadir 500 μL y 2 mL para geles de 12 mm y 25 mm, respectivamente, de 50 mg/ml de colágeno I diluido en ácido acético al 0,2% a cada pocillo que contenga el hidrogel. Deje que los geles se incuben durante la noche en una incubadora de 37 ° C, 5% de CO2.
NOTA: Diluya el colágeno I en ácido acético al 0,2% en lugar de 50 mM HEPES para promover la distribución homogénea y la unión del colágeno I. - Aspire el colágeno I y lave los geles con PBS estéril tres veces para eliminar el exceso de colágeno I durante 5 minutos cada lavado. Incubar los hidrogeles en PBS con 10% de suero de caballo, 5% de FBS durante 2 h en la incubadora de 37 °C, 5% de CO2.
NOTA: La adición de 10% de suero de caballo promueve una mayor proliferación en comparación con solo el uso de FBS como se hizo en la publicación anterior. - Aspirar el medio. Agregue 500 ml de Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) filtrado estérilmente con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) a cada pozo. Guarde los geles en la incubadora de 37 °C, 5% de CO2 hasta que estén listos para el cultivo celular.
- Una vez listo, envasar aproximadamente 1,5 × 104 células de O9-1/cm2 en medio basal en las placas de cultivo. Incubar las células durante 2 días en una incubadora a 37 °C, 5% CO2. Verifique la confluencia de las células para asegurarse de que las células estén suficientemente unidas a los geles y que el número de células sea suficiente antes de recolectarlas para su análisis.
NOTA: Consulte el protocolo publicado anteriormente para conocer los pasos de recuperación, paso y recolección de células O9-120. - Continúe con las secciones 2, 3 o 4 para un análisis más detallado de los hidrogeles.
2. Análisis cuantitativo de la rigidez a través de AFM
- Inicie la computadora del sistema AFM, seguido del controlador AFM (consulte la Tabla de materiales).
- Monte el voladizo AFM en el soporte de la sonda AFM. Utilice un voladizo esférico con una cuenta de sílice de 0,5 μm montada en el extremo del voladizo (voladizo con perla esférica).
NOTA: Para hidrogeles más rígidos, como 10 kPa, 20 kPa y 40 kPa, se utilizó una sonda más rígida con la constante de resorte de 0,24 N/m. Se utilizó una sonda más suave para hidrogeles más blandos, como 0,5 kPa y 1 kPa, con una constante de resorte de 0,059 N/m. - Establezca el software AFM en modo de contacto.
- Monte la oblea de silicio en la etapa de muestra AFM para recolectar curvas de fuerza haciendo clic en Activar para que el voladizo toque el sustrato de silicio, generando así las curvas de fuerza.
- Utilice las curvas de fuerza anteriores (2.4) para la calibración, haga clic en Calibrar en el software de control para obtener una constante de resorte promedio del voladizo en condiciones de ajuste térmico y guarde los valores calibrados en el software de control.
- Monte las muestras colocando el trozo de cubierta con el hidrogel conectado en una placa de Petri de 60 mm en la etapa de escaneo AFM. Agregue 3 ml de PBS en el plato antes de realizar mediciones para evitar que el gel se seque.
- Configure el AFM para que funcione en modo de contacto (fluido) para iniciar la medición. Enganche la cuenta esférica para tocar y levantar continuamente de la muestra de gel.
- Establezca el voladizo para que su umbral de deflexión permanezca en 10 nm. Mantenga el tamaño de rampa de la sonda en 10 μm. A continuación, registre las curvas de fuerza como en el paso 2.4.
- Adquirir al menos 20 curvas de fuerza de al menos 3 a 10 puntos diferentes a través de la superficie del hidrogel.
- Calcule el módulo promedio de Young de ~ 20 curvas de fuerza para cada punto con el software de imágenes y análisis AFM. Utilice curvas de fuerza de rampa extendidas y un modelo linealizado (esférico). Calcule el promedio de todos los puntos para cada muestra para obtener la rigidez final.
NOTA: El módulo de Young y los datos relacionados(es decir, las desviaciones estándar) se guardan automáticamente como una hoja de cálculo. - Repita los pasos 2.6 a 2.10 para todas las muestras.
3. Análisis molecular de la rigidez a través de la tinción por inmunofluorescencia
- Use pinzas para transportar la cubierta a una nueva placa para minimizar las señales falsas de las células que crecen directamente en la placa. Lave las células con 500 μL de PBS estéril tres veces para eliminar las células muertas y cualquier medio de cultivo restante.
- Fije las células usando 500 μL de paraformaldehído al 4% (PFA) durante 10 minutos a temperatura ambiente, sin ser molestado. Luego, vuelva a lavar las células tres veces usando 500 μL de PBS / pozo durante 2 minutos cada una.
NOTA: Conservar a 4 °C para una parada de procedimiento. - Tratar las células con 500 μL de Tritón X-100 al 0,1% durante 15 min a temperatura ambiente. Luego, lave las células tres veces con 500 μL de PBS/pozo.
- Bloquee las células con 250 μL de suero de burro al 10% (diluido en PBS y 0.1% Tween 20) por pocillo durante 30 min a temperatura ambiente.
- Incubar las células con 250 μL de anticuerpos primarios durante 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C. Luego, lave las células tres veces con 500 μL de PBS/pozo durante 5 min cada una.
NOTA: En este experimento se utilizaron anti-vinculina (Vcl) (1:250) y anti-AP2 alfa (1:250) y se diluyeron en suero de burro al 10%. - Incubar las células con los anticuerpos secundarios correspondientes y/o faloidina utilizados para la tinción de F-actina a una dilución de 1:400 en 250 μL de suero de burro al 10% durante 30 min a temperatura ambiente. Luego, lave las células tres veces con PBS durante 5 minutos cada una.
NOTA: La faloidina de 568 nm se puede coincubar con anticuerpos secundarios de 488 nm o 647 nm o por sí sola. - Incubar las células con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, dilución 1:1000) en 250 μL de PBS durante 10 min seguido de un último lavado de PBS durante 2 min.
- Agregue 3-4 gotas de medio de montaje a cada pozo. Almacene las muestras a 4 °C para ajustarlas durante al menos 2 h antes de la toma de imágenes para asegurarse de que el medio de montaje se ha ajustado correctamente.
- Capture imágenes de al menos 3 fotogramas aleatorios por muestra de hidrogel con un microscopio de fluorescencia, produciendo canales individuales y combinados.
4. PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)
- Transfiera los hidrogeles con las células adherentes para la recolección de ARN a una nueva placa para minimizar el ARN no deseado de las células unidas a la placa celular. Lave las células con PBS tres veces para eliminar las células muertas y el medio de cultivo.
- Extraiga el ARNm total utilizando un kit de extracción de ARN. Realice la transcripción inversa de ARN a ADNc utilizando una supermezcla de transcripción inversa siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Realizar RT-qPCR con cebadores para Vcl como marcador de rigidez de elección y analizar utilizando el método 2-ΔΔCT.
NOTA: Secuencia de imprimación de Vcl: Adelante 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; reverso 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.
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Representative Results
Preparación de hidrogel y evaluación de rigidez a través de AFM y el modelo Hertz
Aquí, se proporciona un protocolo detallado para generar hidrogeles de poliacrilamida de rigidez variable mediante la regulación de la proporción de acrilamida y bisacrilamida. Sin embargo, los hidrogeles de poliacrilamida no están listos para la adhesión de las células debido a la falta de proteínas ECM. Por lo tanto, sulfo-SANPAH, actuando como un enlazador, se une covalentemente a los hidrogeles y reacciona con las aminas primarias de las proteínas ECM para permitir la adhesión de las proteínas ECM a las superficies de los hidrogeles a través del éster N-hidroxisuccinimida en sulfo-SANPAH después de la activación UV. El colágeno tipo I se utilizó como la proteína ECM de elección para promover eficazmente la unión celular O9-1. Para garantizar valores precisos de rigidez de diferentes hidrogeles, se realizó una evaluación de rigidez utilizando AFM, una técnica bien conocida para representar el módulo elástico.
Tras la formación exitosa y la fijación del hidrogel de poliacrilamida a la cubierta de vidrio, el gel permaneció adherido a la cubierta con una superficie uniforme y un desgarro mínimo. La rigidez se midió mediante AFM basado en el principio de la técnica de indención, en la que se aplicó un indentador rígido a la muestra con la fuerza requerida para alcanzar una profundidad de indentación26. Con esta medición, se calculó el módulo elástico de Young basado en la sangría de profundidad y fuerza en el modelo de Hertz, una teoría elástica26. Sin embargo, debido a la gran variación en los resultados por AFM, se aplicó un método estadístico adicional para obtener un resultado cuantitativo con un impacto mínimo de superficies irregulares y homogeneidad imperfecta de las soluciones de gel26. Para producir una medición cuantitativa utilizando AFM, se tomó una compilación de al menos 50 curvas de fuerza y distancia de cada ubicación en la muestra de gel para una rigidez promedio de la muestra. La fuerza aplicada al gel de alta rigidez fue mayor que la aplicada al gel más blando, lo que indica que un sustrato más rígido produjo una pendiente más pronunciada en el gráfico Fuerza vs. Z, en el que la fuerza se mide en nN, y Z indica la profundidad de indentación entre el indentador y la muestra.
En hidrogeles blandos, la pendiente de la curva de fuerza generada fue suave ya que la fuerza requerida de la sonda AFM fue menor(Figura 1A). Sin embargo, en hidrogeles rígidos, como los que tienen el módulo de 40 kPa, la pendiente generada fue mucho más pronunciada ya que la fuerza aplicada fue mayor que para los geles más blandos(Figura 1B). A medida que disminuye la separación entre la sonda y la muestra de hidrogel, la curva aumenta significativamente a medida que la punta de la sonda toca la cubierta de vidrio. Sin embargo, a medida que aumenta la distancia de separación, la curva simplemente se acerca a 0 ya que no hay fuerza aplicada presente.
Como se muestra en la Figura 1A,el voladizo de la sonda AFM se acercó al gel, indicado por la línea azul, y la sonda midió la fuerza aplicada requerida para penetrar en la muestra de gel y finalmente alcanzar la cubierta de vidrio, causando un aumento repentino de la fuerza. Debido a posibles errores de procedimiento e instrumentales, como la calidad de las soluciones requeridas, la verdadera rigidez de las muestras de hidrogel varía en gran medida y lejos de la rigidez deseada. Por lo tanto, AFM es una herramienta útil para validar y confirmar la metodología al tiempo que evita la presentación de datos falsos en experimentos posteriores.
En esta evaluación de la AFM, las cinco muestras de hidrogel preparadas se midieron a través del enfoque cuantitativo. El protocolo se centró en los niveles de rigidez del hidrogel de 0,5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa y 40 kPa, que imitan la amplitud de los niveles de rigidez del sustrato biológico informados para la diferenciación de varios tipos de células. Las curvas de fuerza obtenidas de las mediciones de AFM se utilizaron para generar el módulo elástico de Young en kilopascales utilizando un software de algoritmo de análisis AFM(Figura 2).
Comparación de sistemas de hidrogel de poliacrilamida y tipos de células
Esta adaptación del protocolo original por parte de Tse y sus colegas proporciona un enfoque eficiente y efectivo para estudiar los aspectos mecanosensibles de NCC utilizando células O9-120. Las modificaciones al protocolo anterior incluyen la modificación de la incubación de proteínas ECM: la sustitución de HEPES de 50 mM con ácido acético al 0,2% y la adición de suero de caballo al 10% y FBS para cultivo celular (paso 1.3.14-1.3.15). Estas modificaciones se validaron comparando el crecimiento y mantenimiento de los NCC de O9-1 en este sistema de gel modificado con el del protocolo original (de control). Aquí, cultivamos células O9-1 de tipo silvestre en ambos sistemas de hidrogel con el módulo elástico de 1 kPa y 40 kPa para cada sistema en medio basal. El estado general de crecimiento y desarrollo celular se visualizó utilizando un microscopio de luz de campo brillante para las características apoptóticas, la morfología estresada y la unión celular a los hidrogeles. Las células O9-1 cultivadas en el sistema de gel original dieron como resultado un mayor número de células muertas indicadas por un exceso de células redondas(Figura 3E,F)para hidrogeles de 1 kPa y 40 kPa.
En contraste, las células O9-1 cultivadas en el sistema de gel modificado exhibieron un crecimiento celular saludable y suficiente unión al sustrato de hidrogel(Figura 3G,H). Además, se evaluó la compatibilidad de los NCC con el sistema de hidrogel modificado mediante la tinción IF del marcador NCC, Tcfap2α (AP-2). AP-2 es un factor de transcripción expresado en los linajes NC para regular el desarrollo en embriones de ratón, por lo que es adecuado para evaluar la compatibilidad27. Aunque las células de O9-1 cultivadas en sistemas de control e hidrogel modificado expresaron AP-2, hubo un aumento significativo en la expresión de AP-2 en células de O9-1 chapadas en el sistema de hidrogel modificado, como lo indica la señal de fluorescencia más fuerte y la cuantificación correspondiente (Figura 4A,B).
Además, se utilizaron células P19 para validar aún más los beneficios del sistema de hidrogel modificado para el crecimiento de las células. P19 es una línea celular de carcinoma embrionario que se derivó del teratocarcinoma derivado de embriones enratón 28. Utilizando el protocolo de cultivo correspondiente, las células P19 se cultivaron tanto en sistemas de control como de hidrogel modificados para monitorear las características de supervivencia y crecimiento. Las imágenes de campo brillante revelaron que las células P19 chapadas en ambos sistemas de hidrogel mostraron un exceso de células flotantes redondas y una falta de accesorios de sustrato celular(Figura 3A-D). Esta observación sugirió que el protocolo modificado era más adecuado para los NCC O9-1 para estudiar la señalización mecánica en los NCC.
Visualización de la expresión de fibras de alta tensión sobre sustratos rígidos
El hidrogel modificado permitió el análisis cuantitativo y cualitativo de las diferencias en la morfología de las células cultivadas en geles de diferentes niveles de rigidez y otros efectores. Una vez que los hidrogeles estaban listos para la siembra celular, las células O9-1 de tipo salvaje se pasaron a hidrogeles de diferentes niveles de rigidez. Las células fueron monitoreadas por su salud y crecimiento mediante la observación de su forma, propagación espacial e incluso unión en el hidrogel con un mínimo de células muertas. Algunos estudios han demostrado un aumento en las fibras de estrés y la adhesión celular para las MSC en sustratos de alta rigidez, lo que sugiere que las NCC cultivadas en un sustrato más rígido también exhibirían hallazgos similares en comparación con las NCC cultivadas en sustratos más blandos29,30.
La F-actina junto con la miosina II, la α-actinina y otras proteínas citoesqueléticas se conocen colectivamente como fibras de estrés31. Estudios previos observaron un aumento en el ensamblaje de fibra de tensión en respuesta al aumento de la fuerza mecánica31. En uno o ambos extremos de las fibras de tensión, las uniones al complejo de adhesión focal permiten a las células migrar y adherirse a la ECM31. La tinción de faloidina para visualizar la expresión y organización de F-actina en los NCC demostró un crecimiento celular sano en respuesta a la señalización mecánica(Figura 5). Además, las células O9-1 cultivadas en hidrogeles de baja o alta rigidez exhibieron diferentes morfologías a través de cantidades variables de fibras de estrés(Figura 5). De manera similar a las observaciones de los estudios reportados realizados con MSC, se observó que las células O9-1 cultivadas en un sustrato más rígido, 40 kPa, exhibieron más fibras de estrés y estaban bien distribuidas en comparación con las células cultivadas en un hidrogel más blando, indicado por la rigidez de 1 kPa29,30.
Evaluación de adherencias celulares
Para confirmar aún más la hipótesis de que el cambio en la rigidez del sustrato afecta la adhesión de NCC, los cambios en la expresión de Vcl se midieron cuantitativamente a través de RT-qPCR en NCC que responden a diferentes niveles de rigidez de hidrogel. Vcl es una de las numerosas proteínas citoesqueléticas presentes en el complejo de adhesión focal durante el proceso de la célula estableciendo contactos con el sustrato y detectando las propiedades ecm32. Las adherencias focales son los puntos de contacto de las células con la ECM a través de los receptores de integrina, que se anclan al citoesqueleto de actina citoplasmática, F-actina33 El nivel de expresión del gen Vcl sugiere los cambios en las adherencias focales y las adherencias celulares de las células O9-1 en respuesta a la rigidez del sustrato.
Estudios previos mostraron el efecto de Vcl sobre la adhesión celular en células madre embrionarias y fibroblastos por diferencias en su expresión. En respuesta a la alta expresión de Vcl,el número y los tamaños de las adherencias focales también aumentaron, pero disminuyeron cuando Vcl fue derribado34. Consistentemente, las células deficientes en Vcltambién mostraron una disminución significativa en la adhesión celular y la propagación35. Además, Vcl desempeña un papel en la regulación de la adhesión celular mediante la estabilización de las adherencias focales36. El tamaño de las adherencias focales, el nivel de maduración y las composiciones varían según la rigidez del sustrato, lo que permite que las señales se transduzcan intracelularmente y que las células respondan a sus señales ambientales37. Por lo tanto, Vcl es altamente reclutado para los complejos de adhesión focal en células cultivadas sobre sustratos rígidos, como se refleja en los niveles más altos de ARNm detectados por RT-qPCR(Figura 6C).
Las células cultivadas en sustratos más blandos forman complejos de adhesión focal mínimos, como se refleja en los niveles más bajos de ARNm de Vcl en las células15. En la Figura 6C,las células O9-1 exhibieron una mayor expresión de Vcl en el sustrato rígido que en el sustrato blando. Estos resultados sugieren un mayor nivel de adherencias célula-sustrato de células O9-1 en sustratos rígidos que células O9-1 en sustratos más blandos. Además, la expresión de Vcl se visualizó cualitativamente a través de la tinción de IF con un anticuerpo anti-Vcl para complementar y apoyar aún más el hallazgo de RT-qPCR. Consistentemente, la expresión de Vcl en células O9-1 cultivadas en el sustrato más rígido fue mayor que las cultivadas en el sustrato más blando(Figura 6A,B),lo que apoyó aún más el hallazgo inicial de alta adhesión celular y propagación en el hidrogel de 40 kPa en comparación con el hidrogel de 1 kPa observado con tinción de f-actina faloidina y niveles de expresión de Vcl a través de RT-qPCR.
Figura 1: Curvas de fuerza generadas a partir de la sangría de la sonda AFM. La fuerza (eje y) indica la fuerza requerida aplicada en nN, y Z (eje x) indica la distancia de la sonda Bruker AFM de la muestra en μm. Para el hidrogel de 1 kPa (A), la pendiente generada es suave frente a la pendiente más pronunciada observada para el hidrogel de 40 kPa (B). Las curvas de color representan el movimiento del voladizo en la sonda AFM a medida que se acerca (azul) y se retrae (rojo) de la muestra de hidrogel. El punto de partida más alto de la curva indica el contacto rígido de la cubierta de vidrio. (B) La gran caída en la curva retraída en el hidrogel de 40 kPa indica adhesión entre la perla y la muestra. Abreviatura: AFM = microscopía de fuerza atómica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Rigidez media de los hidrogeles (en kPa) calculada a partir del módulo elástico de Young. El módulo de Young se generó a partir de las curvas de fuerza de la Figura 1. Los módulos elásticos referenciados de los hidrogeles fueron 0,5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa y 40 kPa. Las barras de error indican una desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes de campo brillante de células P19 y O9-1 chapadas en hidrogeles de 1 kPa y 40 kPa de sistemas de control y gel modificado para detectar características de crecimiento celular. (A-D) Células P19 y (E-H) O9-1; las células muertas se indican con flechas rojas. Barras de escala = 25 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Tinción de inmunofluorescencia del marcador NCC AP-2 en NCC O9-1 para visualizar la compatibilidad con NCC. (A) Un sistema de hidrogel modificado de 40 kPa en comparación con (B) un control de 40 kPa. AP-2 (verde); los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Barras de escala = 25 μm. (C) El gráfico de barras proporciona una cuantificación del nivel de expresión de AP-2 que muestra significación (p-valor = 0,003) (n = 3). Los datos muestran la expresión relativa con las barras de error de desviación estándar proporcionadas. Abreviaturas: NCC = célula de la cresta neural; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:Tinción fluorescente de faloidina de F-actina que muestra fibras de estrés que están bien distribuidas en células O9-1 en el hidrogel de 40 kPa. Las células de O9-1 se cultivaron en hidrogeles de 1 kPa (A) y 40 kPa (B). Las células de O9-1 se tiñeron con Alexa Fluor 488 Phalloidin (verde), y los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Barras de escala = 25 μm. Abreviatura: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imágenes de inmunofluorescencia de vinculina en células O9-1. Las células de O9-1 fueron chapadas en hidrogeles de 1 kPa(A)y 40 kPa(B). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Barras de escala = 25 μm. (C) Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real del nivel total de ARNm de Vcl en células O9-1 cultivadas en hidrogeles de 1 kPa y 40 kPa. El nivel de expresión de Vcl en el hidrogel de 1 kPa es significativamente menor que el del hidrogel de 40 kPa (p-valor = 0,02). Los datos muestran el promedio con barras de error de desviación estándar proporcionadas. Abreviatura: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Volumen total de 500 μL | 0,5 kPa | 1 kPa | 10 kPa | 20 kPa | 40 kPa | ||
| 40% acrilamida (μL) | 37.5 | 62.5 | 125 | 100 | 100 | ||
| 20% Bis-acrilamida (μL) | 15 | 7.5 | 25 | 66 | 120 | ||
| H2O (μL) | 447.5 | 430 | 350 | 334 | 280 | ||
| 10% APS (μL) | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | ||
| TEMED (μL) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | ||
Tabla 1: Volúmenes correspondientes de soluciones para obtener los niveles de rigidez deseados.
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Discussion
El objetivo del estudio actual es proporcionar un sistema in vitro eficaz y eficiente para comprender mejor el impacto de las señales mecánicas en los NCC. Además de seguir el protocolo paso a paso mencionado anteriormente, los investigadores deben tener en cuenta que el cultivo celular de NCC O9-1 se ve afectado por el tipo de cubiertas de vidrio utilizadas para preparar hidrogeles. Por ejemplo, se observó que las células sembradas en un tipo específico de cubierta de vidrio (ver la Tabla de Materiales)sobrevivieron y proliferaron bien, mientras que las células cultivadas sembradas en otros tipos de cubiertas de vidrio mostraron más muerte celular. Además, es importante seguir estrictamente las condiciones correctas de cultivo celular para O9-1 NCCs38. La calidad del cultivo celular es óptima cuando los hidrogeles se utilizan lo antes posible o se almacenan en una incubadora estéril de 37 °C durante un máximo de dos días.
Debido a la sensibilidad de cada componente en el protocolo, los módulos elásticos podrían variar entre los experimentos. Además de los puntos mencionados en el protocolo (paso 1.3.2) con respecto al 10% de APS, otros factores críticos a tener en cuenta también afectan la variación. Otro factor que se sospechaba que causaba grandes variaciones en las mediciones de AFM era el grosor de los hidrogeles. Un estudio previo había investigado el efecto del grosor en los módulos de Young, que oscilaban entre 15 y 1000 μm, y había encontrado que las diferencias en el grosor no cambiaban significativamente los módulos de Young39. Sin embargo, el grosor de los sustratos también afecta a las propiedades mecánicas que las células pueden sentir, dando lugar a diferentes morfologías40,41,42. Diversos estudios mostraron que un aumento significativo en el grosor de los hidrogeles condujo a una disminución en el área celular, la propagación y la rigidez efectiva de los hidrogeles40,41,42. Sin embargo, los fenotipos de las células también cambian en respuesta a hidrogeles significativamente delgados, por ejemplo, mayor propagación incluso en hidrogeles de baja rigidez40,41,42. Con un volumen constante de geles de poliacrilamida, el grosor de los hidrogeles debe ser uniforme para que las ligeras desviaciones no afecten significativamente el módulo elástico en las mediciones de AFM.
Es mejor esterilizar los cubrehojas pasándolos de un lado a otro en la llama usando un quemador de alcohol porque otros métodos de esterilización pueden ser más complicados y causar daños potenciales a las cubiertas de vidrio. Se pueden utilizar diferentes tamaños de fundas de vidrio en función de los requisitos experimentales. Este protocolo utilizó fundas de 12 mm y 25 mm para inmunohistoquímica y RT-qPCR, respectivamente. El uso de geles de tamaño adecuado para adaptarse a los experimentos fomenta la eficiencia y minimiza el desperdicio. Estas modificaciones se validaron cualitativa y cuantitativamente para garantizar la optimización de las NCC de O9-1 en comparación con el sistema de hidrogel original (de control)20. La salud general y el crecimiento de los NCC de O9-1 se evaluaron bajo un microscopio de campo brillante para las características de unión celular y de sustrato.
Además, se comparó la compatibilidad de las células O9-1 entre los sistemas de control e hidrogel modificados para validar aún más las modificaciones en este protocolo mediante la visualización cualitativa de la expresión de AP-2 mediante tinción IF. La intensidad de las señales se cuantificó para apoyar aún más las imágenes representativas de la expresión de AP-2 en células O9-1 entre el control frente a los sistemas de hidrogel modificados. Si bien AP-2 es un marcador NCC común, otros marcadores conocidos deben considerarse para su validación, como Sox10 y Pax3, debido a su importancia para el mantenimiento de la pluripotencia y la supervivencia de NCC28. Además, la optimización en este protocolo se confirmó aún más al comparar las células O9-1 NC con otra línea celular, P19, para garantizar que este sistema de hidrogel sea eficiente y confiable para las células NC. Aunque las células P19 tienen características inmortales y se cultivan fácilmente, no prosperaron bien en ninguno de los sistemas de hidrogel.
La resistencia a la fuerza de alargamiento generada a partir del sustrato o rigidez tisular donde se unen las células a menudo se expresa como módulo elástico de Young45. Con AFM, el módulo elástico de Young se obtiene a partir de la curva de fuerza generada a partir de la fuerza vertical aplicada26. Pueden ocurrir grandes variaciones durante la medición de AFM, entre mediciones que pueden conducir a lecturas inexactas para los hidrogeles más rígidos. La inconsistencia puede ser causada por sondas inadecuadas utilizadas para la medición. Por ejemplo, la medición de hidrogeles de 20 kPa y 40 kPa requiere el uso de una sonda más rígida con una constante de resorte más alta (k = 0,24 N/m). Una sonda más rígida permite una resolución más baja en comparación con una sonda más suave; sin embargo, hay razones para favorecer la elección de una sonda más rígida ya que los voladizos demasiado blandos podrían adherirse a las muestras46. Además, las sondas demasiado blandas son altamente sensibles, lo que contribuye a las señales falsas de partículas no deseadas y da como resultado valores de rigidez artificialmente más bajos o más altos que la verdadera rigidez46. Además, se debe tener en cuenta la entrada precisa de la relación de Poisson, dependiendo del material de medición; esto podría encontrarse en estudios estandarizados, ya que esto afecta significativamente la producción de datos.
Además, se utilizó AFM para medir el grosor de los hidrogeles, ya que el espesor es otra propiedad mecánica que afecta la forma en que las células perciben su entorno47,42. En varios estudios reportados, se observa que las células que se cultivan en hidrogeles blandos tienen forma redonda en y más allá del "espesor crítico", que se informa a ~ 2-5 μm, dependiendo del tipo de célula47,42,48. Sin embargo, se observó una propagación mucho mayor cuando las células se enchaparon en hidrogeles de la misma rigidez pero menor grosor que el "espesor crítico"42,48. Una posible explicación para este interesante hallazgo es que el espesor subcrítico de los hidrogeles permite a las células detectar las cubiertas rígidas de vidrio subyacentes a medida que las células ejercen tracción para el desplazamiento lateral47. El espesor promedio en los hidrogeles de rigidez total fue de 342 μm con una desviación estándar de 27 μm. El espesor de los hidrogeles fue mayor que el "espesor crítico" sugerido, y dentro del rango de prueba de menos de 400 μm, que se informó en los estudios y los hidrogeles prefabricados fabricados, de modo que las células pudieron detectar la diferente rigidez de los hidrogeles y no las cubiertas de vidrio rígido subyacentes42,48.
Además del método de análisis cuantitativo AFM, los hidrogeles también se analizaron cualitativamente a través de la inmunohistoquímica para estudiar la expresión de los marcadores afectados por la rigidez variable en las células O9-1 y para visualizar el crecimiento saludable de las células. La F-actina en el citoplasma está conectada a las integrinas unidas a la membrana a través de un conjunto de proteínas citoesqueléticas, como la talina y el Vcl, formando el complejo de adhesión focal33. La expresión de fibras de estrés en las células también podría analizarse midiendo la expresión de otros genes citoesqueléticos en las células, como la talina y la integrina, que podrían visualizarse juntos utilizando el kit de tinción de adhesión focal.
Hubo diversos grados de rigidez del hidrogel que influyeron en la morfología y respuesta de NCC, como se ve en el cambio en la adhesión celular y las fibras de estrés a través de la señalización mecánica. Este protocolo ofrece la capacidad de influir en la diferenciación celular en varios tipos de células modificando las condiciones de cultivo correspondientes in vitro,proporcionando así un método conveniente de manipulación de señales mecánicas y señales químicas en NCC. Como se mencionó anteriormente, el destino de la diferenciación de NCC está guiado en gran medida por las fuerzas mecánicas presentes en el tejido circundante, incluida su rigidez2,3. Si bien el objetivo inmediato de este documento fue desarrollar un protocolo paso a paso para preparar hidrogeles para el cultivo de NCC, los beneficios potenciales de este protocolo se extienden más allá de la metodología, persiguiendo un mayor conocimiento de la señalización mecánica en NCC. También vale la pena señalar que este sistema in vitro tiene algunas limitaciones. Esta técnica de fabricación de hidrogeles comprende múltiples pasos que potencialmente pueden introducir variaciones técnicas en el camino, incluida la heterogeneidad, la superficie desigual y la rigidez inexacta. Por lo tanto, los usuarios deben realizar estos pasos cuidadosamente para minimizar las variaciones técnicas durante los experimentos. Además, los geles de poliacrilamida en este sistema limitaron los estudios al cultivo 2D debido a la toxicidad de la acrilamida, ignorando el entorno biológico 3D preciso en el que habitan lasNCC 50.
A pesar de estas limitaciones, este sistema in vitro permite un método económico y simple que beneficia a todos los niveles de investigación y permite a los investigadores realizar pruebas posteriores suficientes y funcionales. Como se ha visto en hallazgos recientes, los NCC dependen en gran medida tanto de la señalización mecánica, como la fuerza de cizallamiento y la rigidez del sustrato, como la señalización química, como la señalización Wnt y del factor de crecimiento de fibroblastos, en craneofacial, así como del desarrollo cardíaco en vertebrados6,15. Usando este protocolo, los microambientes locales para experimentos in vitro se pueden imitar fácilmente para futuros estudios sobre NCC, incluida la diferenciación, la migración, las respuestas celulares y el potencial de progresión perjudicial de la enfermedad. Por lo tanto, este sistema in vitro será una herramienta poderosa para estudiar los roles de la señalización mecánica en los NCC y sus interacciones con otras vías de señalización, lo que profundizará la comprensión de los mecanismos moleculares y genéticos del desarrollo de NCC y las enfermedades relacionadas.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a la Dra. Ana-Maria Zaske, operadora de las instalaciones de Atomic Force Microscope-UT Core en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas, por la experiencia aportada en AFM en este proyecto. También agradecemos a las fuentes de financiamiento de los Institutos Nacionales de Salud (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 y R01HL142704 a J. Wang).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
| 50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
| 6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
| AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
| anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
| Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
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