Summary
Gedetailleerde stapsgewijze protocollen worden hier beschreven voor het bestuderen van mechanische signalen in vitro met behulp van multipotente O9-1 neurale crest cellen en polyacrylamide hydrogels van verschillende stijfheid.
Abstract
Neurale crest-cellen (NCC's) zijn embryonale multipotente cellen van gewervelde dieren die kunnen migreren en differentiëren in een breed scala aan celtypen die aanleiding geven tot verschillende organen en weefsels. Weefselstijfheid produceert mechanische kracht, een fysieke aanwijzing die een cruciale rol speelt bij NCC-differentiatie; het mechanisme blijft echter onduidelijk. De hier beschreven methode biedt gedetailleerde informatie voor de geoptimaliseerde generatie van polyacrylamidehydrogels met verschillende stijfheid, de nauwkeurige meting van dergelijke stijfheid en de evaluatie van de impact van mechanische signalen in O9-1-cellen, een NCC-lijn die in vivo NCC's nabootst.
Hydrogelstijfheid werd gemeten met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM) en gaf dienovereenkomstig verschillende stijfheidsniveaus aan. O9-1 NCC's gekweekt op hydrogels met verschillende stijfheid vertoonden verschillende celmorfologie en genexpressie van stressvezels, wat duidde op verschillende biologische effecten veroorzaakt door mechanische signaalveranderingen. Bovendien werd vastgesteld dat het variëren van de hydrogelstijfheid resulteerde in een efficiënt in vitro systeem om mechanische signalering te manipuleren door de gelstijfheid te veranderen en de moleculaire en genetische regulatie in NCC's te analyseren. O9-1 NCC's kunnen differentiëren in een breed scala aan celtypen onder invloed van de overeenkomstige differentiatiemedia, en het is handig om chemische signalen in vitrote manipuleren . Daarom is dit in vitro systeem een krachtig hulpmiddel om de rol van mechanische signalering in NCC's en de interactie met chemische signalen te bestuderen, wat onderzoekers zal helpen de moleculaire en genetische mechanismen van de ontwikkeling en ziekten van de neurale top beter te begrijpen.
Introduction
Neurale crest-cellen (NCC's) zijn een groep stamcellen tijdens gewervelde embryogenese met een opmerkelijk vermogen om te migreren en bij te dragen aan de ontwikkeling van verschillende organen en weefsels. NCC's kunnen differentiëren in verschillende celtypen, waaronder sensorische neuronen, kraakbeen, bot, melanocyten en gladde spiercellen, afhankelijk van de locatie van axiale oorsprong en de lokale omgevingsrichtlijnen van de NCC1,2. Met het vermogen om te differentiëren in een breed scala aan celtypen, kunnen genetische afwijkingen die ontregeling veroorzaken in elk stadium van de ontwikkeling van de neurale top (NC) leiden tot tal van aangeboren ziekten2. Verstoringen tijdens de vorming, migratie en ontwikkeling van NCC's leiden bijvoorbeeld tot ontwikkelingsstoornissen die gezamenlijk bekend staan als neurocristopathieën1,3. Deze ziekten variëren van craniofaciale defecten als gevolg van falen in NCC-vorming, zoals het Treacher Collins-syndroom, tot de ontwikkeling van verschillende kankers als gevolg van NCC-gemetastaseerd migratievermogen, zoals te zien bij melanoom3,4,5,6. In de afgelopen decennia hebben onderzoekers opmerkelijke ontdekkingen gedaan over de rollen en mechanismen van NCC's in ontwikkeling en ziekten, waarbij de meeste bevindingen gericht zijn op chemische signalen7,8. Meer recent is aangegeven dat mechanische signalen een kritische maar slecht begrepen rol spelen in de ontwikkeling van NCC9,10.
De omgevingsfactoren van NCC's spelen een cruciale rol tijdens hun ontwikkeling, inclusief de regulering van NCC-differentiatie in verschillende celtypen. Omgevingssignalen, bijvoorbeeld fysieke signalen, beïnvloeden cruciaal gedrag en cellulaire reacties, zoals functionele diversificatie. Mechanotransductie stelt cellen in staat om die signalen te detecteren en erop te reageren om verschillende biologische processen in stand te houden2. NCC's zijn omgeven door naburige cellen en verschillende substraten, zoals de extracellulaire matrix (ECM), die aanleiding kan geven tot mechanische stimuli om de homeostase te behouden en zich aan te passen aan de veranderingen door lotbepaling, proliferatie en apoptose11. Mechanotransductie begint bij het plasmamembraan waar de sensorische component van mechanische extracellulaire stimuli optreedt, wat resulteert in de intracellulaire regulatie van de cel12. Integrinen, focale verklevingen en juncties van het plasmamembraan geven mechanische signalen, zoals schuifkrachten, spanning en de stijfheid van omliggende substraten, in chemische signalen om cellulaire reacties te produceren12. Het doorgeven van chemische signalen van het plasmamembraan naar de uiteindelijke cellulaire regulatie wordt uitgevoerd via verschillende signaalroutes om vitale processen voor het organisme, zoals differentiatie, af te ronden.
Verschillende studies hebben gesuggereerd dat mechanische signalering van substraatstijfheid een rol speelt bij celdifferentiatie13,14. Eerdere studies hebben bijvoorbeeld aangetoond dat mesenchymale stamcellen (MSC's) gekweekt op zachte substraten met een stijfheid vergelijkbaar met die van hersenweefsel (in het bereik van 0,1-1,0 kPa) resulteerden in neuronale celdifferentiatie15,16. Meer MSC's differentiëren echter in myocytachtige cellen wanneer ze worden gekweekt op 8-17 kPa-substraten die de stijfheid van spieren nabootsen, terwijl osteoblastachtige differentiatie werd waargenomen wanneer MSC's werden gekweekt op stijve substraten (25-40 kPa)15,16. Het belang van mechanotransductie wordt benadrukt door de onregelmatigheden en afwijkingen in de mechanische signaleringsroute die mogelijk leiden tot ernstige ontwikkelingsstoornissen en ziekten, waaronder kanker, hart- en vaatziekten en osteoporose17,18,19. Bij kankers is normaal borstweefsel zacht en neemt het risico op borstkanker toe in stijf en dicht borstweefsel, een omgeving die meer lijkt op borsttumoren15. Met deze kennis kunnen de effecten van mechanische signalering op de ontwikkeling van NCC worden bestudeerd door eenvoudige manipulatie van substraatstijfheid door middel van een in vitro systeem, wat verdere voordelen en mogelijkheden biedt bij het begrijpen van de fundamenten van NC-gerelateerde ziekteprogressie en etiologie.
Om de impact van mechanische signalen in NCC's te bestuderen, hebben we een efficiënt in vitro systeem voor NCC's opgezet op basis van de optimalisatie van eerder gepubliceerde methoden en evaluatie van de reacties van NCC's op verschillende mechanischesignalen 20,21. Er werd een gedetailleerd protocol verstrekt voor de voorbereiding van de variërende hydrogelstijfheid en evaluatie van de impact van mechanische signalering in NCC's. Om dit te bereiken, worden O9-1 NCC's gebruikt als het NC-model om de effecten en veranderingen in reactie op stijve versus zachte hydrogels te bestuderen. O9-1 NCC's zijn een stabiele NC-cellijn geïsoleerd uit muizenembryo (E) op dag 8,5. O9-1 NCC's bootsen NCC's in vivo na omdat ze kunnen differentiëren in verschillende NC-afgeleide celtypen in gedefinieerde differentiatiemedia22. Om de mechanische signalering van NCC's te bestuderen, werd een matrixsubstraat vervaardigd met instelbare elasticiteit van verschillende concentraties acrylamide en bis-acrylamide-oplossingen om de gewenste stijfheid te bereiken, correlerend met de biologische substraatstijfheid20,21,23. Om de omstandigheden van matrixsubstraat voor NCC's, met name O9-1-cellen, te optimaliseren, werden wijzigingen aangebracht in het eerder gepubliceerde protocol20. Een verandering in dit protocol was het incuberen van hydrogels in collageen I, verdund in 0,2% azijnzuur in plaats van 50 mM HEPES, bij 37 °C gedurende de nacht. De lage pH van azijnzuur leidt tot een homogene verdeling en een hogere collageen I-opname, waardoor een meer uniforme aanhechting van het ECM-eiwit mogelijk is24. Daarnaast werd een combinatie van paardenserum en foetaal runderserum (FBS) gebruikt in concentraties van respectievelijk 10% en 5% in fosfaatbufferzoutoplossing (PBS), voordat de hydrogels in de couveuse werden bewaard. Paardenserum werd gebruikt als een extra aanvulling op FBS vanwege het vermogen om celproliferatie en differentiatie te bevorderen bij een concentratie van 10%25.
Met deze methode werd een biologische omgeving nagebootst door de ECM-eiwitcoating (bijv. Collageen I) om een nauwkeurige in vitro omgeving te creëren voor NCC's om te groeien en te overleven20,21. De stijfheid van de bereide hydrogels werd kwantitatief geanalyseerd via atomic force microscopy (AFM), een bekende techniek om de elastische modulus weer te geven26. Om het effect van verschillende stijfheidsniveaus op NCC's te bestuderen, werden wild-type O9-1-cellen gekweekt en bereid op hydrogels voor immunofluorescentie (IF) kleuring tegen filamenteuze actine (F-actine) om de verschillen in celadhesie en morfologieën aan te tonen als reactie op veranderingen in substraatstijfheid. Met behulp van dit in vitro systeem zullen onderzoekers in staat zijn om de rol van mechanische signalering in NCC's en de interactie met andere chemische signalen te bestuderen om een dieper inzicht te krijgen in de relatie tussen NCC's en mechanische signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hydrogel voorbereiding
OPMERKING: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een celkweekkap die vóór gebruik is gedesinfecteerd met ethanol en ultraviolet (UV) -gesteriliseerd om de steriliteit te behouden. Gereedschappen, zoals pincetten en pipetten, moeten worden besproeid met ethanol. Bufferoplossingen moeten ook steriel worden gefilterd.
- Bereiding van aminosilane-gecoate glazen coverslips
- Plaats het gewenste aantal glazen afdekplaten op een stuk laboratoriumdoekje.
OPMERKING: Bereid een extra 3-4 coverslips voor om ervoor te zorgen dat er voldoende back-upvoorraden zijn als ze gemakkelijk breken. Verschillende materialen van glazen coverslips zullen verschillende compatibiliteit van celzaaien en hechten opleveren. Het is beter om te bepalen welk type het beste bij het experiment past voordat u met de experimenten begint (zie de tabel met materialen). - Gebruik een alcoholbrander of Bunsen-brander om elke coverslip te steriliseren door deze heen en weer door de vlam te laten gaan (30 s voor eiwittestexperimenten). Plaats elke glazen afdekplaat op een laboratoriumdoekje om af te koelen.
- Zodra de glazen afdekkingen zijn afgekoeld, breng je ze over op een petrischaaltje bekleed met parafilm om uitglijden te voorkomen.
OPMERKING: Als de coverslips niet koel genoeg zijn, zal de restwarmte de parafilm op de slips smelten, waardoor ze onbruikbaar worden. - Dek de coverslips af met ongeveer 200 μL en 800 μL van 0,1 M NaOH voor respectievelijk een coverslip van 12 mm en 25 mm en laat ze 5 minuten zitten. Adem vervolgens de 0,1 M NaOH op en laat de coverslips nog 5 minuten aan de lucht drogen om een gelijkmatige film te vormen.
- Pipetteer na het drogen van de coverslips ongeveer 80 μL en 150 μL 3-aminopropyltriethoxysilaan (APTS) voor respectievelijk 12 mm en 25 mm coverslips. Wees voorzichtig om te voorkomen dat de oplossing op de parafilm wordt gemorst. Laat de oplossing 5 minuten zitten.
- Zuig zoveel mogelijk overtollige APTS op en laat de resterende APTS 5 min drogen. Spoel de coverslips goed af door ze drie keer gedurende 5 minuten onder te dompelen in steriele, gedeïoniseerde (DI) H2O.
OPMERKING: Als de glazen afdekplaten niet goed worden gespoeld, veroorzaakt de resterende APTS ongewenste reacties met glutaaraldehyde, waardoor een wit neerslag ontstaat en resulteert in onbruikbare coverslips. - Verplaats de coverslips naar een nieuwe petrischaal met de reactieve kant naar boven gericht. Voeg voldoende 0,5% glutaaraldehyde toe aan de petrischaal om de coverslips volledig te bedekken en laat de coverslips 30 minuten zitten.
- Zuig de 0,5% glutaaraldehyde op en spoel de afdeksels gedurende 3 min één keer opnieuw af in DI H2O. Zet de coverslips reactief met de zijkant naar boven op een laboratoriumdoekje of een schone petrischaal om volledig aan de lucht te drogen voor gebruik.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd; coverslips moeten tot gebruik in steriel DI H2O worden geplaatst.
- Plaats het gewenste aantal glazen afdekplaten op een stuk laboratoriumdoekje.
- Bereiding van gesiliconiseerde coverslips
- Plaats hetzelfde aantal coverslips als de met aminosilaan gecoate coverslips (stap 1.1.1) in een petrischaaltje bekleed met parafilm.
- Pipetteer 40 μL of 150 μL voor respectievelijk 12 mm en 25 mm coverslips van dichlooremethylsilaan (DCMS) aan één kant van de coverslip en laat de oplossing 5 minuten zitten.
- Zuig de resterende oplossing uit de deklap aan, was eenmaal gedurende 1 minuut in steriel DI H2O en plaats de reactieve dekzeilen met de voorkant naar boven op een laboratoriumdoekje om volledig aan de lucht te drogen voordat u naar de volgende stap gaat.
- Hydrogels bereiden
- Meng acrylamide, bisacrylamide en DI H2O in een centrifugebuis van 1,5 ml om 500 μL oplossingen met verschillende stijfheid te bereiden (zie tabel 1). Vortex de oplossing voor 30 s om het grondig te mengen.
- Voeg snel de 10% ammoniumpersulfaatoplossing (APS) en tetramethylethyleendiamine (TEMED) toe aan de buis en draai de oplossingen opnieuw om de oplossingen te mengen.
OPMERKING: Bereid verse 10% APS en laat het op ijs of vries het in tot aliquots voor eenmalig gebruik vanwege de gevoelige vries- / dooicyclus. - Pipetteer ongeveer 33 μL of 100 μL van de oplossing op de gedroogde 12 mm of 25 mm aminosilane-gecoate coverslips (punt 1.1).
- Plaats met behulp van een gebogen pincet onmiddellijk de met DCMS behandelde coverslip bovenop de geloplossing met de behandelde zijde die de geloplossing raakt, waardoor de geloplossing tussen de met DCMS behandelde coverslip en aminosilane-gecoate coverslip wordt gesandwicht.
- Laat de geloplossing gedurende 5-15 minuten polymeriseren, terwijl u actief controleert op gelpolymerisatie van de overgebleven oplossing in de buis.
- Zodra de gel is gepolymeriseerd, scheidt u de met DCMS behandelde coverslip met een gebogen pincet of een scheermesje, waardoor de gel vastzit aan de originele aminosilane-gecoate coverslip.
- Plaats de coverslip met de aangehechte hydrogel onmiddellijk in een vooraf bepaalde 4-well/24-well en 6-well plaat bedekt met 500 μL en 2 ml steriele PBS of DI H2O voor respectievelijk 12 mm en 25 mm coverslips, om te voorkomen dat de gel uitdroogt.
- Herhaal stap 1.3.4-1.3.7 voor alle coverslips.
- Dompel de hydrogels gedurende 30 minuten onder in steriel PBS of DI H2O om overtollige acrylamideoplossing te verwijderen. Bewaar de hydrogels in steriel PBS of DI H2O bij 4 °C voor een procedurele stop hier.
- Bereid in een donkere kamer het sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrofenylamino) hexanoaat (sulfo-SANPAH) mengsel door 2,5 ml van 50 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] ethaansulfonzuur (HEPES) (pH = 8,5) te mengen met 25 μL van de 50 μg / ml sulfo-SANPAH in een conische buis, gewikkeld in aluminiumfolie om te beschermen tegen licht. Gebruik een pipet om de oplossing goed te mengen voor gebruik.
OPMERKING: Een volume van 2,5 ml sulfo-SANPAH-oplossing is voldoende voor ongeveer vijfentwintig 12 mm hydrogels of vijf 25 mm hydrogels. - Aspirateer PBS of DI H2O uit de putplaat. Voeg ongeveer 100 μL of 500 μL voor respectievelijk 12 mm en 25 mm coverslips van sulfo-SANPAH-oplossing (stap 1.3.10) toe om de gel te bedekken. Zorg ervoor dat de oplossing de gel volledig bedekt.
OPMERKING: Pas de vacuümzuigkracht aan om te voorkomen dat de sterke kracht de hydrogels scheurt of verstoort. - Plaats de gels met de oplossing gedurende 10 minuten onder een UV-licht van 15 W, 365 nm, onbedekt om eventuele interferentie van het UV-licht dat reageert met de sulfo-SANPAH te minimaliseren.
- Zuig het teveel aan sulfo-SANPAH op door de plaat te kantelen om zoveel mogelijk van de oplossing te verzamelen. Was de gel twee tot drie keer met 50 mM HEPES.
- Voeg 500 μL en 2 ml voor respectievelijk 12 mm en 25 mm gels van 50 mg/ml collageen I verdund in 0,2% azijnzuur toe aan elke put die de hydrogel bevat. Laat de gels een nacht incuberen in een incubator van 37 °C, 5% CO2.
OPMERKING: Verdun collageen I in 0,2% azijnzuur in plaats van 50 mM HEPES om homogene distributie en aanhechting van collageen I te bevorderen. - Zuig het collageen I op en was de gels drie keer met steriel PBS om overtollig collageen I gedurende 5 minuten per wasbeurt te verwijderen. Incubeer de hydrogels in PBS met 10% paardenserum, 5% FBS gedurende 2 uur in de incubator van 37 °C, 5% CO2 incubator.
OPMERKING: De toevoeging van 10% paardenserum bevordert een hogere proliferatie in vergelijking met alleen het gebruik van FBS zoals gedaan in de vorige publicatie. - Adem het medium op. Voeg 500 ml steriel gefilterd Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine (P / S) toe aan elke put. Bewaar de gels in de 37 °C, 5% CO2 incubator totdat ze klaar zijn voor celkweek.
- Eenmaal klaar, bord ongeveer 1,5 × 104 O9-1 cellen / cm2 in basaal medium in de kweekschalen. Incubeer de cellen gedurende 2 dagen in een incubator bij 37 °C, 5% CO2. Controleer de cellen op confluïteit om ervoor te zorgen dat de cellen voldoende aan gels zijn bevestigd en dat het aantal cellen voldoende is voordat ze worden verzameld voor analyse.
OPMERKING: Zie het eerder gepubliceerde protocol voor de stappen van herstel, passage en verzameling van O9-1-cellen20. - Ga verder met secties 2, 3 of 4 voor verdere analyse van de hydrogels.
2. Kwantitatieve analyse van stijfheid via AFM
- Start de AFM-systeemcomputer, gevolgd door de AFM-controller (zie de Tabel met Materialen).
- Monteer de AFM-uitkraging op de AFM-sondehouder. Gebruik een bolvormige cantilever met een silicakraal van 0,5 μm gemonteerd aan het uiteinde van de cantilever (cantilever met bolvormige kraal).
OPMERKING: Voor stijvere hydrogels, zoals 10 kPa, 20 kPa en 40 kPa, werd een stijvere sonde gebruikt met de veerconstante van 0,24 N/m. Een zachtere sonde werd gebruikt voor zachtere hydrogels, zoals 0,5 kPa en 1 kPa, met een veerconstante van 0,059 N/m. - Stel de AFM-software in op contactmodus.
- Monteer de siliciumwafer op de AFM-monstertrap om krachtcurven te verzamelen door op Engage te klikken om de cantilever het siliciumsubstraat te laten raken, waardoor de krachtcurven worden gegenereerd.
- Gebruik de krachtcurven hierboven (2.4) voor kalibratie, klik op Kalibreren in de besturingssoftware om een gemiddelde veerconstante van de cantilever onder thermische afstemconditie te verkrijgen en sla de gekalibreerde waarden op in de besturingssoftware.
- Monteer de monsters door de afdekplaat met de aangehechte hydrogel in een petrischaaltje van 60 mm op de AFM-scanfase te plaatsen. Voeg 3 ml PBS toe aan de schaal voordat u metingen uitvoert om te voorkomen dat de gel uitdroogt.
- Stel de AFM in om in contactmodus (vloeistof) te werken om de meting te starten. Schakel de bolvormige kraal in om het gelmonster continu aan te raken en op te tillen.
- Stel de uitkraging zo in dat de afbuigingsdrempel op 10 nm blijft. Houd de oplopende grootte van de sonde op 10 μm. Noteer vervolgens de krachtcurven zoals in stap 2.4.
- Verkrijg ten minste 20 krachtcurven van ten minste 3 tot 10 verschillende plekken over het oppervlak van de hydrogel.
- Bereken de gemiddelde Young's modulus van ~20 krachtcurves voor elke plek met AFM imaging en analyse software. Gebruik uitschuifbare hellingkrachtcurven en een lineair model (bolvormig). Bereken het gemiddelde van alle vlekken voor elk monster om de uiteindelijke stijfheid op te leveren.
OPMERKING: De modulus van Young en gerelateerde gegevens(d.w.z. standaarddeviaties) worden automatisch opgeslagen als een spreadsheet. - Herhaal stap 2.6-2.10 voor alle monsters.
3. Moleculaire analyse van stijfheid via immunofluorescentiekleuring
- Gebruik een pincet om de afdekplaat naar een nieuwe plaat te transporteren om valse signalen van cellen die rechtstreeks op de plaat zijn gegroeid te minimaliseren. Was de cellen driemaal met 500 μL steriel PBS om dode cellen en eventueel achtergebleven kweekmedium te verwijderen.
- Fixeer de cellen met 500 μL 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 minuten ongestoord bij kamertemperatuur. Spoel de cellen vervolgens drie keer opnieuw met 500 μL PBS / put gedurende 2 minuten elk.
OPMERKING: Bewaren bij 4 °C voor een procedurele stop. - Behandel de cellen met 500 μL van 0,1% Triton X-100 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen vervolgens drie keer met 500 μL PBS /put.
- Blokkeer de cellen met 250 μL 10% ezelserum (verdund in PBS en 0,1% Tween 20) per put gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer de cellen met 250 μL primaire antilichamen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C. Was de cellen vervolgens drie keer met 500 μL PBS / put gedurende 5 minuten elk.
OPMERKING: Anti-Vinculin (Vcl) (1:250) en anti-AP2 alfa (1:250) werden gebruikt in dit experiment en werden verdund in 10% ezelsserum. - Incubeer de cellen met overeenkomstige secundaire antilichamen en/of falloïdine die worden gebruikt voor F-actinekleuring bij een verdunning van 1:400 in 250 μL 10% ezelserum gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen vervolgens drie keer met PBS gedurende elk 5 minuten.
OPMERKING: 568 nm falloïdine kan worden gecoïncubeerd met 488 nm of 647 nm secundaire antilichamen of op zichzelf. - Incubeer de cellen met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, 1:1000 verdunning) in 250 μL PBS gedurende 10 minuten gevolgd door een laatste wasbeurt van PBS gedurende 2 minuten.
- Voeg 3-4 druppels montagemedium toe aan elke put. Bewaar de monsters bij 4 °C om ten minste 2 uur vóór het afbeelden in te stellen om ervoor te zorgen dat het montagemedium correct is ingesteld.
- Leg beelden vast van ten minste 3 willekeurige frames per hydrogelmonster met een fluorescentiemicroscoop, waardoor individuele en samengevoegde kanalen worden geproduceerd.
4. Kwantitatieve real-time PCR (RT-qPCR)
- Breng de hydrogels met de aanhangende cellen voor RNA-verzameling over naar een nieuwe plaat om ongewenst RNA van cellen die aan de celplaat zijn bevestigd te minimaliseren. Was de cellen drie keer met PBS om dode cellen en kweekmedium te verwijderen.
- Extraheer het totale mRNA met behulp van een RNA-extractiekit. Voer reverse-transcriptie van RNA naar cDNA uit met behulp van een reverse transcriptie supermix volgens de instructies van de fabrikant.
- Voer RT-qPCR uit met primers voor Vcl als de stijfheidsmarker van keuze en analyseer met behulp van de 2-ΔΔCT-methode.
OPMERKING: Primervolgorde van Vcl: Voorwaarts 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; omgekeerd 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hydrogelvoorbereiding en stijfheidsbeoordeling via AFM en het Hertz-model
Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt om polyacrylamidehydrogels van verschillende stijfheid te genereren door de verhouding acrylamide en bis-acrylamide te reguleren. De polyacrylamide hydrogels zijn echter niet klaar voor de hechting van cellen vanwege het gebrek aan ECM-eiwitten. Sulfo-SANPAH, dat als linker fungeert, bindt dus covalent aan de hydrogels en reageert met de primaire amines van ECM-eiwitten om de hechting van ECM-eiwitten aan de oppervlakken van de hydrogels mogelijk te maken via de N-hydroxysuccinimide-ester in sulfo-SANPAH na UV-activering. Collageentype I werd gebruikt als het ECM-eiwit bij uitstek om de aanhechting van O9-1-cellen effectief te bevorderen. Om nauwkeurige stijfheidswaarden van verschillende hydrogels te garanderen, werd een stijfheidsbeoordeling uitgevoerd met AFM, een bekende techniek om de elastische modulus weer te geven.
Na succesvolle vorming en bevestiging van de polyacrylamide hydrogel aan de glazen coverslip, bleef de gel hechten aan de coverslip met een gelijkmatig oppervlak en minimale scheuring. De stijfheid werd gemeten door AFM op basis van het principe van de indrukkingstechniek, waarbij een stijve indrukker op het monster werd aangebracht met de vereiste kracht om een inkepingsdiepte te bereiken26. Met deze meting werd de elastische modulus van de Young berekend op basis van de inkeping van diepte en kracht in het model van Hertz, een elastische theorie26. Vanwege de grote variatie in resultaten door AFM werd echter een aanvullende statistische methode toegepast om een kwantitatief resultaat te verkrijgen met minimale impact van ongelijke oppervlakken en onvolmaakte homogeniteit van de geloplossingen26. Om een kwantitatieve meting met AFM te produceren, werd een compilatie van ten minste 50 kracht- en afstandscurven van elke locatie op het gelmonster genomen voor een gemiddelde monsterstijfheid. De kracht die op de gel met hoge stijfheid werd uitgeoefend, was hoger dan die op de zachtere gel, wat aangeeft dat een stijver substraat een steilere helling opleverde in de grafiek Kracht versus Z, waarin kracht wordt gemeten in nN, en Z geeft de inkepingsdiepte aan tussen het indruklichaam en het monster.
Op zachte hydrogels was de helling van de gegenereerde krachtcurve zacht omdat de vereiste kracht van de AFM-sonde minder was(figuur 1A). Op stijve hydrogels, zoals die met de modulus van 40 kPa, was de gegenereerde helling echter veel steiler omdat de uitgeoefende kracht hoger was dan voor zachtere gels (figuur 1B). Naarmate de scheiding tussen de sonde en het hydrogelmonster afneemt, neemt de curve aanzienlijk toe naarmate de punt van de sonde de glazen afdekking raakt. Naarmate de scheidingsafstand toeneemt, nadert de curve echter slechts 0 omdat er geen uitgeoefende kracht aanwezig is.
Zoals te zien is in figuur 1A,naderde de cantilever op de AFM-sonde de gel, aangegeven door de blauwe lijn, en de sonde mat de uitgeoefende kracht die nodig was om het gelmonster binnen te dringen en uiteindelijk de glazen afdekkingslip te bereiken, waardoor een plotselinge toename van de kracht ontstond. Door mogelijke procedurele en instrumentele fouten, zoals de kwaliteit van de benodigde oplossingen, varieert de werkelijke stijfheid van hydrogelmonsters grotendeels en ver van de gewenste stijfheid. Afm is dus een nuttig instrument om de methodologie te valideren en te bevestigen en tegelijkertijd valse gegevenspresentatie in verdere experimenten te voorkomen.
In deze AFM-beoordeling zijn de vijf voorbereide hydrogelmonsters gemeten via de kwantitatieve benadering. Het protocol richtte zich op hydrogelstijfheidsniveaus van 0,5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa en 40 kPa, die de breedte van biologische substraatstijfheidsniveaus nabootsen die zijn gerapporteerd voor differentiatie van verschillende celtypen. De krachtcurven verkregen uit AFM-metingen werden gebruikt om de elastische modulus van de Young in kilopascals te genereren met behulp van een AFM-analysealgoritmesoftware(figuur 2).
Vergelijking van polyacrylamide hydrogel systemen en celtypes
Deze aanpassing van het oorspronkelijke protocol door Tse en collega's biedt een efficiënte en effectieve aanpak om de mechanosensieve aspecten van NCC te bestuderen met behulp van O9-1 cellen20. Wijzigingen aan het vorige protocol omvatten het wijzigen van ECM-eiwitincubatie: het vervangen van 50 mM HEPES door 0,2% azijnzuur en de toevoeging van 10% paardenserum en FBS voor celkweek (stap 1.3.14-1.3.15). Deze modificaties werden gevalideerd door de groei en het onderhoud van O9-1 NCC's op dit gemodificeerde gelsysteem te vergelijken met die in het oorspronkelijke (controle)protocol. Hier kweekten we wild-type O9-1-cellen op beide hydrogelsystemen met de elastische modulus van 1 kPa en 40 kPa voor elk systeem in basaal medium. De algehele celgroeistatus en -ontwikkeling werden gevisualiseerd met behulp van een brightfield-lichtmicroscoop voor apoptotische kenmerken, gestreste morfologie en celaanhechting aan de hydrogels. O9-1 cellen gekweekt op het oorspronkelijke gelsysteem resulteerden in een hoger aantal dode cellen aangegeven door een overmaat aan ronde cellen (Figuur 3E, F) voor zowel 1 kPa als 40 kPa hydrogels.
Daarentegen vertoonden de O9-1-cellen die op het gemodificeerde gelsysteem werden gekweekt een gezonde celgroei en voldoende hechting aan het hydrogelsubstraat(figuur 3G,H). Bovendien werd de compatibiliteit van NCC's met het gemodificeerde hydrogelsysteem beoordeeld door IF-kleuring van de NCC-marker, Tcfap2α (AP-2), uit te voeren. AP-2 is een transcriptiefactor die wordt uitgedrukt in de NC-afstammingslijnen om de ontwikkeling in muizenembryo's te reguleren, waardoor het geschikt is om compatibiliteit te beoordelen27. Hoewel O9-1-cellen gekweekt op controle- en gemodificeerde hydrogelsystemen beide AP-2 tot expressie brachten, was er een significante toename van AP-2-expressie in O9-1-cellen op het gemodificeerde hydrogelsysteem, zoals aangegeven door het sterkere fluorescentiesignaal en de bijbehorende kwantificering (Figuur 4A,B).
Bovendien werden P19-cellen gebruikt om de voordelen van het gemodificeerde hydrogelsysteem voor de groei van cellen verder te valideren. P19 is een embryonaal carcinoom cellijn die werd afgeleid van embryo-afgeleid teratocarcinoom in muis28. Met behulp van het bijbehorende kweekprotocol werden P19-cellen gekweekt op zowel controle- als gemodificeerde hydrogelsystemen om overlevings- en groeikenmerken te monitoren. Brightfield-beeldvorming onthulde dat P19-cellen op beide hydrogelsystemen een overmaat aan ronde zwevende cellen vertoonden en een gebrek aan cel-substraataanhechtingen (Figuur 3A-D). Deze observatie suggereerde dat het aangepaste protocol meer geschikt was voor O9-1 NCC's om mechanische signalering in NCC's te bestuderen.
Visualisatie van stressvolle vezelexpressie op stijve substraten
De gemodificeerde hydrogel maakte kwantitatieve en kwalitatieve analyse mogelijk van de verschillen in de morfologie van cellen gekweekt op gels van verschillende stijfheidsniveaus en andere effectoren. Zodra de hydrogels klaar waren voor celzaaien, werden wild-type O9-1-cellen doorgegeven aan hydrogels met verschillende stijfheidsniveaus. Cellen werden gecontroleerd op hun gezondheid en groei door hun vorm, ruimtelijke verspreiding en zelfs aanhechting op de hydrogel te observeren met minimale dode cellen. Sommige studies hebben een toename van stressvezels en celhechting aangetoond voor MSC's op substraten met een hoge stijfheid, wat suggereert dat NCC's die op een stijver substraat worden gekweekt, ook vergelijkbare bevindingen zouden vertonen in vergelijking met NCC's die op zachtere substraten werden gekweekt29,30.
F-actine samen met myosine II, α-actinine en andere cytoskeletale eiwitten zijn gezamenlijk bekend als stressvezels31. Eerdere studies zagen een toename van de assemblage van stressvezels als reactie op verhoogde mechanische kracht31. Aan een of beide uiteinden van de stressvezels stellen hechtingen aan het focale adhesiecomplex cellen in staat om te migreren en zich te hechten aan de ECM31. Falloïdinekleuring om F-actine-expressie en -organisatie in de NCC's te visualiseren, toonde een gezonde celgroei als reactie op mechanische signalering(figuur 5). Bovendien vertoonden de O9-1-cellen gekweekt op hydrogels met lage of hoge stijfheid verschillende morfologieën door verschillende hoeveelheden stressvezels(figuur 5). Vergelijkbaar met observaties van gerapporteerde studies uitgevoerd met MSC's, werd waargenomen dat O9-1-cellen gekweekt op een stijver substraat, 40 kPa, meer stressvezels vertoonden en goed verspreid waren in vergelijking met cellen gekweekt op een zachtere hydrogel, aangegeven door 1 kPa stijfheid29,30.
Beoordeling van celverklevingen
Om de hypothese verder te bevestigen dat de verandering in substraatstijfheid van invloed is op NCC-adhesie, werden veranderingen in Vcl-expressie kwantitatief gemeten via RT-qPCR in NCC's die reageerden op verschillende hydrogelstijfheidsniveaus. Vcl is een van de talrijke cytoskeletale eiwitten die aanwezig zijn in het focale adhesiecomplex tijdens het proces van de cel die contacten legt met het substraat en de ECM-eigenschappen waarneemt32. Focale verklevingen zijn de contactpunten van de cellen naar de ECM via integrinereceptoren, die verankeren aan het cytoplasmatische actinecytoskelet, F-actine33 Het Vcl-genexpressieniveau suggereert de veranderingen in focale verklevingen en celverklevingen van de O9-1-cellen als reactie op de substraatstijfheid.
Eerdere studies toonden het effect van Vcl op celadhesie in embryonale stam- en fibroblastcellen door verschillen in de expressie ervan. Als reactie op de hoge expressie van Vclnam het aantal en de grootte van focale verklevingen ook toe, maar namen af toen Vcl werd neergehaald34. Consequent vertoonden Vcl-deficiënte cellen ook een significante afname van celadhesie en verspreiding35. Daarnaast speelt Vcl een rol bij het reguleren van celadhesie door focale verklevingen te stabiliseren36. De grootte van focale verklevingen, rijpingsniveau en samenstellingen variëren afhankelijk van de substraatstijfheid, waardoor signalen intracellulair kunnen worden getransduceerd en de cellen kunnen reageren op hun omgevingssignalen37. Vcl wordt dus sterk gerekruteerd voor de focale adhesiecomplexen in cellen die op stijve substraten zijn gekweekt, zoals weerspiegeld door hogere mRNA-niveaus gedetecteerd door RT-qPCR (Figuur 6C).
Cellen gekweekt op zachtere substraten vormen minimale focale adhesiecomplexen, zoals weerspiegeld door lagere mRNA-niveaus van Vcl in de cellen15. In figuur 6Cvertoonden O9-1-cellen een hogere expressie van Vcl op het stijve substraat dan op het zachte substraat. Deze resultaten suggereren een hoger niveau van cel-substraat verklevingen van O9-1 cellen op stijve substraten dan O9-1 cellen op zachtere substraten. Bovendien werd Vcl-expressie kwalitatief gevisualiseerd door IF-kleuring met een anti-Vcl-antilichaam om de RT-qPCR-bevinding verder aan te vullen en te ondersteunen. Consequent was de Vcl-expressie in O9-1-cellen gekweekt op het stijvere substraat hoger dan die gekweekt op het zachtere substraat (Figuur 6A, B), wat verder de eerste bevinding van hoge celhechting en verspreiding op de 40 kPa hydrogel ondersteunde in vergelijking met de 1 kPa hydrogel waargenomen met F-actine falloïdinekleuring en Vcl-expressieniveaus via RT-qPCR.
Figuur 1: Krachtcurven gegenereerd uit de inkeping van de AFM-sonde. Kracht (y-as) geeft de vereiste kracht aan die wordt uitgeoefend in nN, en Z (x-as) geeft de Bruker AFM-sondeafstand tot het monster in μm aan. Voor de 1 kPa hydrogel (A) is de gegenereerde helling zacht versus de steilere helling waargenomen voor de 40 kPa hydrogel (B). De gekleurde curven vertegenwoordigen de beweging van de cantilever op de AFM-sonde als deze nadert (blauw) en zich terugtrekt (rood) van het hydrogelmonster. Het hoogste beginpunt van de curve geeft het stijve contact van de glazen afdekplaat aan. B)De grote dip in de ingeschoven curve in de 40 kPa hydrogel duidt op een hechting tussen de kraal en het monster. Afkorting: AFM = atomic force microscopy. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De gemiddelde stijfheid van hydrogels (in kPa) berekend op basis van de elastische modulus van de Young. De modulus van de Young werd gegenereerd uit de krachtcurven uit figuur 1. De gerefereerde elastische moduli van de hydrogels waren 0,5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa en 40 kPa. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Bright-field beelden van P19- en O9-1-cellen geplateerd op 1 kPa- en 40 kPa-hydrogels van controle- en gemodificeerde gelsystemen om celgroeikenmerken te detecteren. (A-D) P19- en (E-H) O9-1-cellen; dode cellen worden aangegeven met rode pijlen. Schaalbalken = 25 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Immunofluorescentiekleuring van NCC-marker AP-2 in O9-1 NCC's om NCC-compatibiliteit te visualiseren. (A) Een 40 kPa gemodificeerd hydrogelsysteem in vergelijking met (B) een 40 kPa-controle. AP-2 (groen); kernen werden gekleurd met DAPI (blauw). Schaalbalken = 25 μm. (C) Staafdiagram geeft een kwantificering van het AP-2 expressieniveau met significantie (p-waarde = 0,003) (n = 3). Gegevens tonen de relatieve expressie met de meegeleverde foutbalken voor standaarddeviatie. Afkortingen: NCC = neural crest cell; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Fluorescerende falloïdinekleuring van F-actine met stressvezels die goed verspreid zijn in O9-1-cellen op de 40 kPa-hydrogel. O9-1 cellen werden gekweekt op 1 kPa (A) en 40 kPa hydrogels (B). O9-1-cellen werden gekleurd met Alexa Fluor 488 Phalloidin (groen) en de kernen werden gekleurd met DAPI (blauw). Schaalbalken = 25 μm. Afkorting: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Immunofluorescentiebeelden van vinculine in O9-1 cellen. O9-1 cellen werden geplateerd op 1 kPa (A) en 40 kPa (B) hydrogels. Kernen werden gekleurd met DAPI (blauw). Schaalstaven = 25 μm. (C) Real-time kwantitatieve PCR-analyse van het totale mRNA-niveau van Vcl in O9-1-cellen gekweekt op 1 kPa en 40 kPa hydrogels. Het Vcl-expressieniveau op de 1 kPa-hydrogel is aanzienlijk lager dan dat op de 40 kPa-hydrogel (p-waarde = 0,02). Gegevens tonen het gemiddelde met de meegeleverde foutbalken voor standaarddeviatie. Afkorting: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| 500 μL totaal volume | 0,5 kPa | 1 KPa | 10 KPa | 20 KPa | 40 KPa | ||
| 40% acrylamide (μL) | 37.5 | 62.5 | 125 | 100 | 100 | ||
| 20% Bis-acrylamide (μL) | 15 | 7.5 | 25 | 66 | 120 | ||
| H2O (μL) | 447.5 | 430 | 350 | 334 | 280 | ||
| 10% APS (μL) | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | ||
| TEMED (μL) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | ||
Tabel 1: Overeenkomstige volumes van oplossingen om de gewenste stijfheidsniveaus te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van de huidige studie is om een effectief en efficiënt in vitro systeem te bieden om de impact van mechanische signalen in NCC's beter te begrijpen. Naast het volgen van het hierboven genoemde stapsgewijze protocol, moeten onderzoekers in gedachten houden dat de celcultuur van O9-1 NCC's wordt beïnvloed door het type glazen afdekkingsplaten dat wordt gebruikt om hydrogels te bereiden. Er werd bijvoorbeeld opgemerkt dat cellen gezaaid op een specifiek type glazen afdekplaat (zie de tabel met materialen)overleefden en zich goed verspreidden, terwijl gekweekte cellen gezaaid op andere soorten glazen coverslips meer celdood vertoonden. Verder is het belangrijk om de juiste celkweekomstandigheden voor O9-1 NCC's strikt te volgen38. De kwaliteit van de celkweek is optimaal wanneer de hydrogels zo snel mogelijk worden gebruikt of maximaal twee dagen in een steriele incubator van 37 °C worden bewaard.
Vanwege de gevoeligheid van elk onderdeel in het protocol kunnen de elastische moduli variëren tussen experimenten. Naast de punten genoemd in het protocol (stap 1.3.2) met betrekking tot 10% APS, hebben ook andere kritische factoren om rekening mee te houden invloed op de variatie. Een andere factor die ervan verdacht werd grote variaties in AFM-metingen te veroorzaken, was de dikte van de hydrogels. Een eerdere studie had het effect van dikte op de Moduli van de Young onderzocht, variërend van 15 tot 1000 μm, en had ontdekt dat verschillen in dikte de Moduli van de Young niet significant veranderden39. De dikte van de substraten beïnvloedt echter ook de mechanische eigenschappen die de cellen kunnen waarnemen, wat leidt tot verschillende morfologieën40,41,42. Verschillende studies toonden aan dat een significante toename van de dikte van hydrogels leidde tot een afname van het celoppervlak, verspreiding en effectieve stijfheid van hydrogels40,41,42. De fenotypen van cellen veranderen echter ook als reactie op aanzienlijk dunne hydrogels, bijvoorbeeld een hogere verspreiding, zelfs op hydrogels met een lage stijfheid40,41,42. Bij een consistent volume polyacrylamidegels moet de dikte van hydrogels uniform zijn, zodat kleine afwijkingen de elastische modulus in AFM-metingen niet significant beïnvloeden.
Het is beter om coverslips te steriliseren door ze heen en weer in de vlam te sturen met behulp van een alcoholbrander, omdat andere sterilisatiemethoden ingewikkelder kunnen zijn en mogelijke schade aan de glazen afdekplaten kunnen veroorzaken. Verschillende maten glazen afdekplaten kunnen worden gebruikt op basis van experimentele vereisten. Dit protocol maakte gebruik van 12 mm en 25 mm coverslips voor respectievelijk immunohistochemie en RT-qPCR. Het gebruik van gels van de juiste grootte om aan de experimenten te voldoen, stimuleert de efficiëntie en minimaliseert verspilling. Deze modificaties werden kwalitatief en kwantitatief gevalideerd om optimalisatie voor O9-1 NCC's te garanderen in vergelijking met het oorspronkelijke (controle)hydrogelsysteem20. De algehele gezondheid en groei van O9-1 NCC's werden beoordeeld onder een brightfield microscoop voor cellulaire en substraataanhechtingskenmerken.
Bovendien werd de compatibiliteit van O9-1-cellen vergeleken tussen zowel controle- als de gemodificeerde hydrogelsystemen om de wijzigingen in dit protocol verder te valideren door AP-2-expressie kwalitatief te visualiseren met behulp van IF-kleuring. De intensiteit van de signalen werd gekwantificeerd om de representatieve beelden van AP-2-expressie in O9-1-cellen tussen controle versus de gemodificeerde hydrogelsystemen verder te ondersteunen. Hoewel AP-2 een veel voorkomende NCC-marker is, moeten andere bekende markers worden overwogen voor validatie, zoals Sox10 en Pax3, vanwege hun betekenis voor NCC-onderhoud van pluripotentie en overleving28. Bovendien werd de optimalisatie in dit protocol verder bevestigd door de O9-1 NC-cellen te vergelijken met een andere cellijn, P19, om ervoor te zorgen dat dit hydrogelsysteem efficiënt en betrouwbaar is voor NC-cellen. Hoewel P19-cellen onsterfelijke eigenschappen hebben en gemakkelijk kunnen worden gekweekt, gedijden ze niet goed op een van de hydrogelsystemen.
De weerstand tegen de langwerpige kracht die wordt gegenereerd door het substraat of de weefselstijfheid waar de cellen zich hechten, wordt vaak uitgedrukt als Young's elastische modulus45. Met AFM wordt de elastische modulus van de Young verkregen uit de krachtcurve die wordt gegenereerd door de toegepaste verticale kracht26. Tijdens AFM-metingen kunnen grote variaties optreden tussen metingen die kunnen leiden tot onnauwkeurige metingen voor de stijvere hydrogels. De inconsistentie kan worden veroorzaakt door onjuiste sondes die worden gebruikt voor metingen. Voor de meting van hydrogels van 20 kPa en 40 kPa is bijvoorbeeld een stijvere sonde met een hogere veerconstante (k = 0,24 N/m) vereist. Een stijvere sonde zorgt voor een lagere resolutie in vergelijking met een zachtere sonde; er zijn echter redenen om de voorkeur te geven aan de keuze van een stijvere sonde, omdat te zachte cantilevers zich aan de monsters kunnen hechten46. Bovendien zijn te zachte sondes zeer gevoelig, wat bijdraagt aan valse signalen van ongewenste deeltjes en resulteert in kunstmatig lagere of hogere stijfheidswaarden dan de werkelijke stijfheid46. Bovendien moet een nauwkeurige invoer van de verhouding van Poisson worden opgemerkt, afhankelijk van het meetmateriaal; dit kan worden gevonden in gestandaardiseerde studies, omdat dit de gegevensuitvoer aanzienlijk beïnvloedt.
Bovendien werd AFM gebruikt om de dikte van de hydrogels te meten, omdat dikte een andere mechanische eigenschap is die van invloed is op hoe cellen hun omgeving waarnemen47,42. In verschillende gerapporteerde studies worden cellen die worden gekweekt op zachte hydrogels waargenomen als rond van vorm op en voorbij "kritische dikte", die wordt gerapporteerd bij ~ 2-5 μm, afhankelijk van het celtype47,42,48. Er werd echter een veel hogere verspreiding waargenomen wanneer cellen werden verguld op hydrogels met dezelfde stijfheid maar een lagere dikte dan de "kritische dikte"42,48. Een mogelijke verklaring voor deze interessante bevinding is dat de subkritische dikte van hydrogels de cellen in staat stelt om de stijve onderliggende glazen afdekkingslips te voelen terwijl de cellen tractie uitoefenen voor laterale verplaatsing47. De gemiddelde dikte over hydrogels met volledige stijfheid was 342 μm met een standaarddeviatie van 27 μm. De dikte van de hydrogels was hoger dan de voorgestelde "kritische dikte", en binnen het testbereik van minder dan 400 μm, dat werd gerapporteerd in studies en de vervaardigde vooraf gemaakte hydrogels, zodat de cellen de verschillende stijfheid van de hydrogels konden voelen en niet de onderliggende stijve glazen coverslips42,48.
Naast de kwantitatieve analysemethode van de AFM werden de hydrogels ook kwalitatief geanalyseerd door middel van immunohistochemie om de expressie van de markers beïnvloed door de variërende stijfheid in O9-1-cellen te bestuderen en een gezonde groei van de cellen te visualiseren. F-actine in het cytoplasma is verbonden met de membraangebonden integrinen via een set cytoskeletale eiwitten, zoals taline en Vcl, die het focale adhesiecomplex vormen33. Expressie van stressvezels in cellen kan ook worden geanalyseerd door de expressie van andere cytoskeletale genen in cellen te meten, zoals taline en integrine, die samen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van de focale adhesiekleuringskit.
Er waren verschillende gradaties van hydrogelstijfheid die de NCC-morfologie en -respons beïnvloedden, zoals te zien is in de verandering in celadhesie en stressvezels door mechanische signalering. Dit protocol biedt de mogelijkheid om celdifferentiatie in verschillende celtypen te beïnvloeden door de overeenkomstige kweekomstandigheden in vitrote wijzigen , waardoor een handige methode wordt geboden voor manipulatie van mechanische signalen en chemische signalen in NCC's. Zoals eerder vermeld, wordt het lot van NCC-differentiatie grotendeels geleid door mechanische krachten die aanwezig zijn in het omliggende weefsel, inclusief de stijfheid2,3. Hoewel het onmiddellijke doel van dit artikel was om een stapsgewijs protocol te ontwikkelen om hydrogels voor te bereiden op NCC-cultuur, reiken de potentiële voordelen van dit protocol verder dan de methodologie en streven ze naar verdere kennis van mechanische signalering in NCC's. Het is ook vermeldenswaard dat dit in vitro systeem enkele beperkingen heeft. Deze techniek voor het vervaardigen van hydrogels omvat meerdere stappen die mogelijk technische variaties onderweg kunnen introduceren, waaronder heterogeniteit, oneffen oppervlak en onnauwkeurige stijfheid. Daarom moeten gebruikers deze stappen zorgvuldig uitvoeren om technische variaties tijdens experimenten te minimaliseren. Bovendien beperkten polyacrylamidegels in dit systeem studies tot 2D-cultuur vanwege de toxiciteit van acrylamide, waarbij de precieze 3D-biologische omgeving die NCC's bewonen50worden genegeerd .
Ondanks deze beperkingen maakt dit in vitro systeem een goedkope en eenvoudige methode mogelijk die alle niveaus van onderzoek ten goede komt en onderzoekers in staat stelt voldoende en functionele downstream-tests uit te voeren. Zoals te zien is in recente bevindingen, zijn NCC's sterk afhankelijk van zowel mechanische signalering, zoals schuifkracht en substraatstijfheid, als chemische signalering, zoals Wnt- en fibroblastgroeifactorsignalering, in craniofaciale, evenals hartontwikkeling bij gewervelde dieren6,15. Met behulp van dit protocol kunnen de lokale micro-omgevingen voor in vitro experimenten gemakkelijk worden nagebootst voor toekomstige studies over NCC's, waaronder differentiatie, migratie, cellulaire responsen en het potentieel van schadelijke ziekteprogressie. Daarom zal dit in vitro systeem een krachtig hulpmiddel zijn om de rol van mechanische signalering in NCC's en hun interacties met andere signaalroutes te bestuderen, wat het begrip van de moleculaire en genetische mechanismen van NCC-ontwikkeling en gerelateerde ziekten zal verdiepen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken Dr. Ana-Maria Zaske, exploitant van Atomic Force Microscope-UT Core-faciliteit aan het University of Texas Health Sciences Center, voor de bijgedragen expertise in AFM in dit project. We danken ook de financieringsbronnen van de National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 en R01HL142704 aan J. Wang).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
| 50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
| 6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
| AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
| anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
| Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
References
- Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
- Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
- Watt, K. E. N., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. Trainor, P. A. , Academic Press. 361-394 (2014).
- Lavelle, C. L. B. Applied oral physiology. , Butterworth-Heinemann. (1988).
- Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
- Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
- Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
- Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
- Dupont, S., et al.
- Lu, Y. -B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
- Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
- Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10, Unit 10.16 (2010).
- Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
- Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
- Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
- Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
- Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
- Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
- Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
- Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
- Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
- Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
- Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
- Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze'ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
- Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
- Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
- Kuo, J. -C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
- Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
- Lin, Y. -C., et al.
- Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
- Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
- McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
- Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
- Wells, R. G.
- Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
- Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , Academic Press. 363-373 (2017).
