Summary
Protocolli dettagliati passo-passo sono descritti qui per studiare i segnali meccanici in vitro utilizzando cellule multipotenti della cresta neurale O9-1 e idrogel di poliacrilammide di varia rigidità.
Abstract
Le cellule della cresta neurale (NCC) sono cellule multipotenti embrionali vertebrate che possono migrare e differenziarsi in una vasta gamma di tipi di cellule che danno origine a vari organi e tessuti. La rigidità dei tessuti produce forza meccanica, un segnale fisico che svolge un ruolo fondamentale nella differenziazione NCC; tuttavia, il meccanismo rimane poco chiaro. Il metodo qui descritto fornisce informazioni dettagliate per la generazione ottimizzata di idrogel di poliacrilammide di varia rigidità, la misurazione accurata di tale rigidità e la valutazione dell'impatto dei segnali meccanici nelle celle O9-1, una linea NCC che imita gli NCC in vivo.
La rigidità dell'idrogel è stata misurata utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM) e ha indicato diversi livelli di rigidità di conseguenza. Gli NCC O9-1 coltivati su idrogel di varia rigidità hanno mostrato una diversa morfologia cellulare e l'espressione genica delle fibre da stress, che indicavano diversi effetti biologici causati da cambiamenti meccanici del segnale. Inoltre, questo ha stabilito che la variazione della rigidità dell'idrogel ha portato a un efficiente sistema in vitro per manipolare la segnalazione meccanica alterando la rigidità del gel e analizzando la regolazione molecolare e genetica negli NCC. Gli NCC O9-1 possono differenziarsi in una vasta gamma di tipi di cellule sotto l'influenza dei corrispondenti mezzi di differenziazione ed è conveniente manipolare i segnali chimici in vitro. Pertanto, questo sistema in vitro è un potente strumento per studiare il ruolo della segnalazione meccanica nelle NCC e la sua interazione con i segnali chimici, che aiuterà i ricercatori a comprendere meglio i meccanismi molecolari e genetici dello sviluppo e delle malattie della cresta neurale.
Introduction
Le cellule della cresta neurale (NCC) sono un gruppo di cellule staminali durante l'embriogenesi dei vertebrati con una notevole capacità di migrare e contribuire allo sviluppo di vari organi e tessuti. Le NCC possono differenziarsi in diversi tipi di cellule, tra cui neuroni sensoriali, cartilagine, ossa, melanociti e cellule muscolari lisce, a seconda della posizione di origine assiale e della guida ambientale locale dell'NCC1,2. Con la capacità di differenziarsi in una vasta gamma di tipi di cellule, le anomalie genetiche che causano la disregolazione in qualsiasi fase dello sviluppo della cresta neurale (NC) possono portare a numerose malattie congenite2. Ad esempio, le perturbazioni durante la formazione, la migrazione e lo sviluppo di NCC portano a disturbi dello sviluppo noti collettivamente come neurocristopatie1,3. Queste malattie vanno dai difetti craniofacciali dovuti al fallimento nella formazione di NCC, come la sindrome di Treacher Collins, allo sviluppo di vari tumori dovuti alla capacità migratoria metastatica dell'NCC, come si vede nel melanoma3,4,5,6. Negli ultimi decenni, i ricercatori hanno fatto notevoli scoperte sui ruoli e i meccanismi delle NCC nello sviluppo e nelle malattie, con la maggior parte dei risultati focalizzati sui segnalichimici 7,8. Più recentemente, i segnali meccanici sono stati indicati per svolgere un ruolo critico ma poco compreso nello sviluppo NCC9,10.
I segnali ambientali degli NCC svolgono un ruolo fondamentale durante il loro sviluppo, compresa la regolazione della differenziazione NCC in vari tipi di cellule. I segnali ambientali, ad esempio i segnali fisici, influenzano i comportamenti cardine e le risposte cellulari, come la diversificazione funzionale. La meccanotrasduzione consente alle cellule di percepire e rispondere a tali segnali per mantenere vari processi biologici2. Gli NCC sono circondati da cellule vicine e diversi substrati, come la matrice extracellulare (ECM), che può dare origine a stimoli meccanici per mantenere l'omeostasi e adattarsi ai cambiamenti attraverso la determinazione del destino, la proliferazione e l'apoptosi11. La meccanotrasduzione inizia alla membrana plasmatica dove si verifica la componente sensoriale degli stimoli meccanici extracellulari, con conseguente regolazione intracellulare della cellula12. Integrine, aderenze focali e giunzioni della membrana plasmatica relè segnali meccanici, come forze di taglio, stress e rigidità dei substrati circostanti, in segnali chimici per produrre risposte cellulari12. La trasmissione di segnali chimici dalla membrana plasmatica alla regolazione cellulare finale viene effettuata attraverso diverse vie di segnalazione per finalizzare i processi vitali per l'organismo, come la differenziazione.
Diversi studi hanno suggerito che la segnalazione meccanica dalla rigidità del substrato gioca un ruolo nella differenziazione cellulare13,14. Ad esempio, studi precedenti hanno dimostrato che le cellule staminali mesenchimali (MSC) cresciute su substrati molli con una rigidità simile a quella del tessuto cerebrale (nell'intervallo di 0,1-1,0 kPa) hanno determinato la differenziazione delle cellule neuronali15,16. Tuttavia, più MSC si differenziano in cellule simili ai miociti quando cresciute su substrati di 8-17 kPa che imitano la rigidità del muscolo, mentre la differenziazione simile agli osteoblasti è stata osservata quando le MSC sono state coltivate su substrati rigidi (25-40 kPa)15,16. Il significato della meccanotrasduzione è evidenziato dalle irregolarità e dalle anomalie nella via di segnalazione meccanica che potenzialmente portano a gravi difetti e malattie dello sviluppo, tra cui cancro, malattie cardiovascolari e osteoporosi17,18,19. Nei tumori, il tessuto mammario normale è morbido e il rischio di cancro al seno aumenta nel tessuto mammario rigido e denso, un ambiente che è più simile ai tumori al seno15. Con queste conoscenze, gli effetti della segnalazione meccanica sullo sviluppo di NCC possono essere studiati attraverso la semplice manipolazione della rigidità del substrato attraverso un sistema in vitro, fornendo ulteriori vantaggi e possibilità nella comprensione dei fondamenti della progressione della malattia correlata alla NC e dell'eziologia.
Per studiare l'impatto dei segnali meccanici negli NCC, abbiamo istituito un efficiente sistema in vitro per NCC basato sull'ottimizzazione di metodi precedentemente pubblicati e sulla valutazione delle risposte degli NCC a diversi segnali meccanici20,21. È stato fornito un protocollo dettagliato per la preparazione della rigidità dell'idrogel variabile e la valutazione dell'impatto della segnalazione meccanica negli NCC. Per raggiungere questo obiettivo, gli NCC O9-1 vengono utilizzati come modello NC per studiare gli effetti e i cambiamenti in risposta agli idrogel rigidi rispetto a quelli morbidi. Gli NCC O9-1 sono una linea cellulare NC stabile isolata dall'embrione di topo (E) al giorno 8.5. Gli NCC O9-1 imitano gli NCC in vivo perché possono differenziarsi in vari tipi di cellule derivate da NC in mezzi di differenziazione definiti22. Per studiare la segnalazione meccanica degli NCC, è stato fabbricato un substrato a matrice con elasticità sintonizzabile da concentrazioni variabili di soluzioni di acrilammide e bis-acrilammide per ottenere la rigidità desiderata, correlata alla rigidità del substrato biologico20,21,23. Per ottimizzare le condizioni del substrato matriciale per NCC, in particolare le celle O9-1, sono state apportate modifiche dal protocollo20precedentemente pubblicato. Una modifica apportata a questo protocollo è stata quella di incubare idrogel nel collagene I, diluito in acido acetico allo 0,2% invece di 50 mM HEPES, a 37 °C durante la notte. Il basso pH dell'acido acetico porta ad una distribuzione omogenea e ad una maggiore incorporazione di collagene I, consentendo così un attaccamento più uniforme della proteina ECM24. Inoltre, una combinazione di siero equino e siero bovino fetale (FBS) è stata utilizzata alle concentrazioni del 10% e del 5% rispettivamente nella soluzione salina tampone fosfato (PBS), prima di conservare gli idrogel nell'incubatrice. Il siero di cavallo è stato utilizzato come supplemento aggiuntivo a FBS grazie alla sua capacità di promuovere la proliferazione e la differenziazione cellulare alla concentrazione del 10%25.
Con questo metodo, un ambiente biologico è stato imitato dal rivestimento proteico ECM (ad esempio, Collagen I) per creare un ambiente in vitro accurato per far crescere e sopravvivere20,21. La rigidità degli idrogel preparati è stata analizzata quantitativamente tramite microscopia a forza atomica (AFM), una tecnica ben nota per rappresentare il modulo elastico26. Per studiare l'effetto di diversi livelli di rigidità sugli NCC, le cellule O9-1 wild-type sono state coltivate e preparate su idrogel per la colorazione di immunofluorescenza (IF) contro l'actina filamentosa (F-actina) per mostrare le differenze nell'adesione cellulare e nelle morfologie in risposta ai cambiamenti nella rigidità del substrato. Utilizzando questo sistema in vitro, i ricercatori saranno in grado di studiare i ruoli della segnalazione meccanica negli NCC e la sua interazione con altri segnali chimici per ottenere una comprensione più profonda della relazione tra NCC e segnalazione meccanica.
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Protocol
1. Preparazione dell'idrogel
NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti in una cappa di coltura cellulare che è stata disinfettata con etanolo e ultravioletto (UV) sterilizzato prima dell'uso per mantenere la sterilità. Gli strumenti, come pinzette e pipette, devono essere spruzzati con etanolo. Anche le soluzioni tampone devono essere filtrate sterili.
- Preparazione di coperture in vetro rivestite di aminosilano
- Posizionare il numero desiderato di coperture in vetro su un pezzo di salvietta da laboratorio.
NOTA: preparare altri 3-4 coverslip per garantire forniture di backup sufficienti quando si rompono facilmente. Diversi materiali di coperture in vetro produrranno una diversa compatibilità di semina e fissaggio delle cellule. È meglio determinare quale tipo si adatta meglio all'esperimento prima di iniziare gli esperimenti (vedi la Tabella dei materiali). - Utilizzare un bruciatore ad alcool o un bruciatore Bunsen per sterilizzare ogni coverslip facendolo passare avanti e indietro attraverso la fiamma (30 s per esperimenti di analisi proteica). Posizionare ogni coverlip di vetro su una salvietta da laboratorio per raffreddare.
- Una volta raffreddate le coperture in vetro, trasferirle su una capsula di Petri rivestita di parafilm per evitare lo slittamento.
NOTA: Se i coperchi non sono abbastanza freddi, il calore residuo scioglierà il parafilm sugli scivoli, rendendoli inutilizzabili. - Coprire i coverslip con circa 200 μL e 800 μL di 0,1 M NaOH per un coverslip di 12 mm e un coverslip da 25 mm, rispettivamente, e lasciarli riposare per 5 min. Quindi, aspirare il NaOH 0,1 M e lasciare asciugare all'aria i coperchi per altri 5 minuti per formare un film uniforme.
- Una volta asciugati i coverslip, pipettare circa 80 μL e 150 μL di 3-aminopropil trietossisilano (APTS) per 12 mm e 25 mm, rispettivamente. Fare attenzione a non versare la soluzione sul parafilm. Lasciare riposare la soluzione per 5 minuti.
- Aspirare il più possibile APTS in eccesso e lasciare asciugare l'APTS residuo per 5 minuti. Risciacquare bene le coverslip immergendole in sterile, deionizzato (DI) H2O tre volte per 5 minuti ogni volta.
NOTA: Se le coperture in vetro non vengono risciacquate bene, l'APTS residuo provoca reazioni indesiderate con glutaraldeide, causando la formazione di un precipitato bianco e causando coperture inutilizzabili. - Spostare le coperture in una nuova capsula di Petri con il lato reattivo rivolto verso l'alto. Aggiungi abbastanza glutaraldeide allo 0,5% alla capsula di Petri per coprire interamente le coperture e lasciare riposare le coperture per 30 minuti.
- Aspirare la glutaraldeide allo 0,5% e risciacquare nuovamente le coverslips in DI H2O una volta per 3 min. Impostare i coverslips lato reattivo su una salvietta da laboratorio o una capsula di Petri pulita per asciugare completamente all'aria prima dell'uso.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui; I coperchi devono essere posti in DI H2O sterili fino all'uso.
- Posizionare il numero desiderato di coperture in vetro su un pezzo di salvietta da laboratorio.
- Preparazione di coverslip siliconati
- Posizionare lo stesso numero di coverslip delle coverslip rivestite di aminosilano (punto 1.1.1) in una capsula di Petri rivestita di parafilm.
- Pipettare 40 μL o 150 μL per coperchi da 12 mm e 25 mm, rispettivamente, di diclorometilsilano (DCMS) su un lato del coperchio e lasciare riposare la soluzione per 5 minuti.
- Aspirare qualsiasi soluzione rimanente dal coperchio, lavare in DI H2O sterile una volta per 1 minuto e posizionare le coperture reattive rivolte verso l'alto su una salvietta da laboratorio per asciugare completamente all'aria prima di passare alla fase successiva.
- Preparazione di idrogel
- Mescolare acrilammide, bis-acrilammide e DI H2O in un tubo centrifugo da 1,5 mL per preparare 500 μL di soluzioni con rigidità variabili (vedere Tabella 1). Vortice la soluzione per 30 s per mescolarla accuratamente.
- Lavorando rapidamente, aggiungere la soluzione di persolfato di ammonio al 10% (APS) e la tetrametiletilendiammina (TEMED) al tubo e ruotare nuovamente le soluzioni per miscelare le soluzioni.
NOTA: Preparare un APS fresco al 10% e lasciarlo sul ghiaccio o congelarlo in aliquote monouso a causa del suo delicato ciclo di congelamento/scongelamento. - Pipettare circa 33 μL o 100 μL della soluzione sui coperchi essiccati da 12 mm o 25 mm rivestiti di aminosilano (rispettivamente punto 1.1).
- Utilizzando una pinzetta curva, posizionare immediatamente il coverslip trattato con DCMS sopra la soluzione di gel con il lato trattato che tocca la soluzione gel, inserendo così la soluzione gel tra il coverslip trattato con DCMS e il coverslip rivestito con aminosilano.
- Lasciare polimerizzare la soluzione di gel per 5-15 minuti, monitorando attivamente la polimerizzazione su gel della soluzione rimanente nel tubo.
- Una volta che il gel è polimerizzato, separare il coverslip trattato con DCMS con una pinzetta curva o una lama di rasoio, lasciando il gel attaccato alla coverslip originale rivestita di aminosilano.
- Posizionare immediatamente il coverslip con l'idrogel attaccato in una piastra predeterminata a 4 pozzetti/24 pozzetti e 6 pozzetti ricoperta da 500 μL e 2 mL di PBS sterile o DI H2O per coperture da 12 mm e 25 mm, rispettivamente, per evitare che il gel si secchi.
- Ripetere i passaggi 1.3.4-1.3.7 per tutti i coverslip.
- Immergere gli idrogel in PBS sterile o DI H2O per 30 minuti per rimuovere la soluzione di acrilammide in eccesso. Conservare gli idrogel in PBS sterile o DI H2O a 4 °C per una sosta procedurale qui.
- In una stanza buia, preparare la miscela di esanoato di esatanoato (sulfo-SANPAH) di sulfosuccinimidile 6-(4'-azido-2'-azido-2'-azido-2'-azido-2'-idrossietil) piperazin-1-il] (HEPES) (pH = 8,5) con 25 μL di 50 μl di sulfo-SANPAH da 50 μg / mL in un tubo conico, avvolto in un foglio di alluminio per proteggere dalla luce. Utilizzare una pipetta per mescolare bene la soluzione prima dell'uso.
NOTA: Un volume di 2,5 mL di soluzione di sulfo-SANPAH è sufficiente per circa venticinque idrogel da 12 mm o cinque idrogel da 25 mm. - Aspirare PBS o DI H2O dalla piastra del pozzo. Aggiungere circa 100 μL o 500 μL per coperture da 12 mm e 25 mm, rispettivamente, di soluzione di sulfo-SANPAH (fase 1.3.10) per coprire il gel. Assicurarsi che la soluzione copra interamente il gel.
NOTA: Regolare la forza di aspirazione del vuoto per evitare che la forte forza strappi o disturbi gli idrogel. - Posizionare i gel con la soluzione sotto una luce UV da 15 W, 365 nm per 10 minuti, scoperta per ridurre al minimo qualsiasi interferenza della luce UV che reagisce con il sulfo-SANPAH.
- Aspirare il sulfo-SANPAH in eccesso inclinando la piastra per raccogliere il più possibile la soluzione. Lavare il gel con 50 mM HEPES due o tre volte.
- Aggiungere 500 μL e 2 mL per gel da 12 mm e 25 mm, rispettivamente, di collagene I da 50 mg/mL diluiti in acido acetico allo 0,2% in ciascun pozzetto contenente l'idrogel. Lasciare incubare i gel durante la notte in un incubatore a CO2 a 37 °C, 5%.
NOTA: Diluire il collagene I in acido acetico allo 0,2% invece di 50 mM HEPES per promuovere la distribuzione omogenea e l'attaccamento del collagene I. - Aspirare il collagene I e lavare i gel con PBS sterile tre volte per rimuovere il collagene in eccesso I per 5 minuti ogni lavaggio. Incubare gli idrogel in PBS con 10% siero equino, 5% FBS per 2 ore nell'incubatore a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: L'aggiunta del 10% di siero equino promuove una maggiore proliferazione rispetto al solo utilizzo di FBS come fatto nella pubblicazione precedente. - Aspirare il mezzo. Aggiungere 500 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) filtrato sterile con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina (P/S) a ciascun pozzetto. Conservare i gel nell'incubatore a 37 °C, 5% CO2 fino a quando non sono pronti per la coltura cellulare.
- Una volta pronto, impiattare circa 1,5 × 104 cellule O9-1 / cm2 in mezzo basale nei piatti di coltura. Incubare le cellule per 2 giorni in un incubatore a 37 °C, 5% CO2. Controllare la confluenza delle cellule per assicurarsi che le cellule siano sufficientemente attaccate ai gel e che il numero di cellule sia sufficiente prima di raccogliere per l'analisi.
NOTA: vedere il protocollo pubblicato in precedenza per le fasi di recupero, passaggio e raccolta delle celle O9-120. - Procedere alle sezioni 2, 3 o 4 per un'ulteriore analisi degli idrogel.
2. Analisi quantitativa della rigidità tramite AFM
- Avviare il computer del sistema AFM, seguito dal controller AFM (vedere la tabella dei materiali).
- Montare il cantilever AFM sul portasonda AFM. Utilizzare un cantilever sferico con una perla di silice da 0,5 μm montata all'estremità del cantilever (cantilever con perla sferica).
NOTA: per idrogel più rigidi, come 10 kPa, 20 kPa e 40 kPa, è stata utilizzata una sonda più rigida con la costante della molla di 0,24 N/m. Una sonda più morbida è stata utilizzata per idrogel più morbidi, come 0,5 kPa e 1 kPa, con una costante di molla di 0,059 N / m. - Impostare il software AFM in modalità contatto.
- Montare il wafer di silicio sullo stadio campione AFM per raccogliere le curve di forza facendo clic su Engage affinché il cantilever tocchi il substrato di silicio, generando così le curve di forza.
- Utilizzare le curve di forza sopra (2.4) per la calibrazione, fare clic su Calibra nel software di controllo per ottenere una costante media della molla del cantilever in condizioni di regolazione termica e salvare i valori calibrati nel software di controllo.
- Montare i campioni posizionando il coperchio con l'idrogel collegato in una capsula di Petri da 60 mm sullo stadio di scansione AFM. Aggiungere 3 ml di PBS nella piastra prima di effettuare misurazioni per evitare che il gel si secchi.
- Impostare l'AFM in modo che funzioni in modalità contatto (fluido) per avviare la misurazione. Impegnare il tallone sferico per toccare e sollevare continuamente dal campione di gel.
- Impostare il cantilever in modo che la sua soglia di deflessione rimanga a 10 nm. Mantenere la dimensione di rampa della sonda a 10 μm. Quindi, registrate le curve di forza come nel passaggio 2.4.
- Acquisire almeno 20 curve di forza da almeno 3 a 10 punti diversi sulla superficie dell'idrogel.
- Calcola il modulo medio di Young di ~ 20 curve di forza per ogni punto con il software di imaging e analisi AFM. Utilizzate le curve di forza di rampa di estensione e un modello linearizzato (sferico). Calcola la media di tutti i punti per ciascun campione per ottenere la rigidità finale.
NOTA: il modulo di Young e i dati correlati (adesempio, deviazioni standard) vengono automaticamente salvati come foglio di calcolo. - Ripetere i passaggi 2.6-2.10 per tutti i campioni.
3. Analisi molecolare della rigidità mediante colorazione ad immunofluorescenza
- Utilizzare una pinzetta per trasportare il coverslip su una nuova piastra per ridurre al minimo i falsi segnali provenienti dalle cellule cresciute direttamente sulla piastra. Lavare le cellule con 500 μL di PBS sterile tre volte per rimuovere le cellule morte e qualsiasi terreno di coltura rimanente.
- Fissare le celle utilizzando 500 μL di paraformaldeide al 4% (PFA) per 10 minuti a temperatura ambiente, indisturbati. Quindi, lavare nuovamente le cellule tre volte utilizzando 500 μL di PBS / pozzetto per 2 minuti ciascuna.
NOTA: Conservare a 4 °C per un arresto procedurale. - Trattare le cellule con 500 μL di 0,1% Triton X-100 per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare le cellule tre volte con 500 μL di PBS / pozzetto.
- Bloccare le cellule con 250 μL di siero d'asino al 10% (diluito in PBS e 0,1% Tween 20) per pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Incubare le cellule con 250 μL di anticorpi primari per 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C. Quindi, lavare le cellule tre volte con 500 μL di PBS / pozzetto per 5 minuti ciascuna.
NOTA: Anti-Vinculin (Vcl) (1:250) e anti-AP2 alfa (1:250) sono stati utilizzati in questo esperimento e sono stati diluiti in siero d'asino al 10%. - Incubare le cellule con corrispondenti anticorpi secondari e/o falloidina utilizzati per la colorazione di F-actina ad una diluizione di 1:400 in 250 μL di siero d'asino al 10% per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare le celle tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna.
NOTA: 568 nm Di falloidina può essere co-incubata con anticorpi secondari a 488 nm o 647 nm o da sola. - Incubare le cellule con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, diluizione 1:1000) in 250 μL di PBS per 10 min seguito da un ultimo lavaggio di PBS per 2 min.
- Aggiungere 3-4 gocce di mezzo di montaggio a ciascun pozzetto. Conservare i campioni a 4 °C per impostare per almeno 2 ore prima dell'imaging per assicurarsi che il supporto di montaggio sia impostato correttamente.
- Cattura immagini di almeno 3 fotogrammi casuali per campione di idrogel con un microscopio a fluorescenza, producendo canali singoli e uniti.
4. PCR quantitativa in tempo reale (RT-qPCR)
- Trasferire gli idrogel con le cellule aderenti per la raccolta dell'RNA in una nuova piastra per ridurre al minimo l'RNA indesiderato dalle cellule attaccate alla piastra cellulare. Lavare le cellule con PBS tre volte per rimuovere le cellule morte e il terreno di coltura.
- Estrarre l'mRNA totale utilizzando un kit di estrazione dell'RNA. Eseguire la trascrizione inversa dell'RNA in cDNA utilizzando un supermix a trascrizione inversa seguendo le istruzioni del produttore.
- Eseguire RT-qPCR con primer per Vcl come marcatore di rigidità di scelta e analizzare utilizzando il metodo 2-ΔΔCT.
NOTA: Sequenza di primer di Vcl: Forward 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; inverso 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.
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Representative Results
Preparazione dell'idrogel e valutazione della rigidità tramite AFM e modello Hertz
Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per generare idrogel di poliacrilammide di rigidità variabile regolando il rapporto tra acrilammide e bis-acrilammide. Tuttavia, gli idrogel di poliacrilammide non sono pronti per l'adesione delle cellule a causa della mancanza di proteine ECM. Pertanto, il sulfo-SANPAH, agendo come un linker, si lega covalentemente agli idrogel e reagisce con le ammine primarie delle proteine ECM per consentire l'adesione delle proteine ECM alle superfici degli idrogel attraverso l'estere N-idrossisuccinimide nel sulfo-SANPAH dopo l'attivazione UV. Il collagene di tipo I è stato utilizzato come proteina ECM di scelta per promuovere efficacemente l'attaccamento delle cellule O9-1. Per garantire valori di rigidità accurati di diversi idrogel, è stata eseguita una valutazione della rigidità utilizzando AFM, una tecnica ben nota per rappresentare il modulo elastico.
Dopo aver completato con successo la formazione e l'attaccamento dell'idrogel di poliacrilammide al coperchio di vetro, il gel è rimasto aderente al coverslip con una superficie uniforme e uno strappo minimo. La rigidità è stata misurata da AFM sulla base del principio della tecnica di rientro, in cui un penetratore rigido è stato applicato al campione con la forza richiesta per raggiungere una profondità di rientro26. Con questa misurazione, il modulo elastico di Young è stato calcolato in base alla rientranza di profondità e forza nel modello di Hertz, una teoria elastica26. Tuttavia, a causa della grande variazione dei risultati da parte di AFM, è stato applicato un ulteriore metodo statistico per ottenere un risultato quantitativo con un impatto minimo di superfici irregolari e omogeneità imperfetta delle soluzioni di gel26. Per produrre una misurazione quantitativa utilizzando aFM, è stata prelevata una compilazione di almeno 50 curve di forza e distanza da ciascuna posizione sul campione di gel per una rigidità media del campione. La forza applicata al gel ad alta rigidità era superiore a quella applicata al gel più morbido, indicando che un substrato più rigido produceva una pendenza più ripida nel grafico Force vs Z, in cui la forza è misurata in nN e Z indica la profondità di rientranza tra il penetratore e il campione.
Sugli idrogel morbidi, la pendenza della curva di forza generata era delicata poiché la forza richiesta dalla sonda AFM era inferiore (Figura 1A). Tuttavia, su idrogel rigidi, come quelli con il modulo di 40 kPa, la pendenza generata era molto più ripida in quanto la forza applicata era superiore a quella dei gel più morbidi (Figura 1B). Man mano che la separazione tra la sonda e il campione di idrogel diminuisce, la curva aumenta in modo significativo quando la punta della sonda tocca il coperchio di vetro. Tuttavia, all'aumentare della distanza di separazione, la curva si avvicina semplicemente a 0 poiché non è presente alcuna forza applicata.
Come mostrato in Figura 1A,il cantilever sulla sonda AFM si è avvicinato al gel, indicato dalla linea blu, e la sonda ha misurato la forza applicata necessaria per penetrare nel campione di gel e alla fine raggiungere il coperchio di vetro, causando un improvviso aumento di forza. A causa di possibili errori procedurali e strumentali, come la qualità delle soluzioni richieste, la vera rigidità dei campioni di idrogel varia ampiamente e lontano dalla rigidità desiderata. Pertanto, aFM è uno strumento utile per convalidare e confermare la metodologia, prevenendo al contempo la presentazione di dati falsi in ulteriori esperimenti.
In questa valutazione AFM, i cinque campioni di idrogel preparati sono stati misurati attraverso l'approccio quantitativo. Il protocollo si è concentrato sui livelli di rigidità dell'idrogel di 0,5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa e 40 kPa, che imitano l'ampiezza dei livelli di rigidità del substrato biologico riportati per la differenziazione di vari tipi di cellule. Le curve di forza ottenute dalle misurazioni AFM sono state utilizzate per generare il modulo elastico di Young in kilopascal utilizzando un software di algoritmo di analisi AFM (Figura 2).
Confronto tra sistemi di idrogel di poliacrilammide e tipi di cellule
Questo adattamento del protocollo originale da parte di Tse e colleghi fornisce un approccio efficiente ed efficace per studiare gli aspetti meccanosensibili di NCC utilizzando le cellule O9-120. Le modifiche al protocollo precedente includono la modifica dell'incubazione della proteina ECM: sostituzione di 50 mM HEPES con acido acetico allo 0,2% e aggiunta del 10% di siero equino e FBS per la coltura cellulare (fase 1.3.14-1.3.15). Queste modifiche sono state convalidate confrontando la crescita e il mantenimento degli NCC O9-1 su questo sistema di gel modificato con quello del protocollo originale (di controllo). Qui, abbiamo coltivato cellule O9-1 wild-type su entrambi i sistemi idrogel con il modulo elastico di 1 kPa e 40 kPa per ciascun sistema in mezzo basale. Lo stato generale di crescita e lo sviluppo delle cellule sono stati visualizzati utilizzando un microscopio a luce a campo luminoso per le caratteristiche apoptotiche, la morfologia stressata e l'attaccamento cellulare agli idrogel. Le cellule O9-1 cresciute sul sistema gel originale hanno determinato un numero maggiore di cellule morte indicate da un eccesso di cellulerotonde (Figura 3E,F)sia per gli idrogel da 1 kPa che per quelli da 40 kPa.
Al contrario, le cellule O9-1 cresciute sul sistema gel modificato hanno mostrato una crescita cellulare sana e un attaccamento sufficiente al substrato dell'idrogel(Figura 3G,H). Inoltre, la compatibilità degli NCC con il sistema di idrogel modificato è stata valutata eseguendo la colorazione IF del marcatore NCC, Tcfap2α (AP-2). AP-2 è un fattore di trascrizione espresso nei lignaggi NC per regolare lo sviluppo negli embrioni di topo, rendendolo così adatto a valutare la compatibilità27. Sebbene le cellule O9-1 cresciute su sistemi di idrogel di controllo e modificati esprimessero entrambe AP-2, c'è stato un aumento significativo dell'espressione di AP-2 nelle cellule O9-1 placcate sul sistema idrogel modificato, come indicato dal segnale di fluorescenza più forte e dalla corrispondente quantificazione (Figura 4A,B).
Inoltre, le cellule P19 sono state utilizzate per convalidare ulteriormente i benefici del sistema idrogel modificato per la crescita delle cellule. P19 è una linea cellulare di carcinoma embrionale derivata dal teratocarcinoma derivato dall'embrione nel topo28. Utilizzando il protocollo di coltura corrispondente, le cellule P19 sono state coltivate sia su sistemi di controllo che su idrogel modificati per monitorare le caratteristiche di sopravvivenza e crescita. L'imaging a campo luminoso ha rivelato che le cellule P19 placcate su entrambi i sistemi idrogel mostravano un eccesso di celle rotonde fluttuanti e una mancanza di attacchi cellula-substrato (Figura 3A-D). Questa osservazione ha suggerito che il protocollo modificato era più adatto per gli NCC O9-1 per studiare la segnalazione meccanica negli NCC.
Visualizzazione dell'espressione di fibre ad alto stress su substrati rigidi
L'idrogel modificato ha permesso l'analisi quantitativa e qualitativa delle differenze nella morfologia delle cellule coltivate su gel di diversi livelli di rigidità e altri effettori. Una volta che gli idrogel erano pronti per la semina cellulare, le cellule O9-1 wild-type venivano passate su idrogel di diversi livelli di rigidità. Le cellule sono state monitorate per la loro salute e crescita osservando la loro forma, la diffusione spaziale e persino l'attaccamento sull'idrogel con cellule morte minime. Alcuni studi hanno dimostrato un aumento delle fibre di stress e dell'adesione cellulare per le MSC su substrati ad alta rigidità, suggerendo che gli NCC cresciuti su un substrato più rigido mostrerebbero anche risultati simili rispetto agli NCC coltivati su substrati più morbidi29,30.
La F-actina insieme alla miosina II, alla α-actinina e ad altre proteine citoscheletriche sono conosciute collettivamente come fibre da stress31. Studi precedenti hanno osservato un aumento dell'assemblaggio delle fibre di stress in risposta all'aumento della forza meccanica31. A una o entrambe le estremità delle fibre di sollecitazione, gli attacchi al complesso di adesione focale consentono alle cellule di migrare e aderire all'ECM31. La colorazione della falloidina per visualizzare l'espressione e l'organizzazione della F-actina nei NCC ha dimostrato una crescita cellulare sana in risposta alla segnalazione meccanica (Figura 5). Inoltre, le cellule O9-1 cresciute su idrogel a bassa o alta rigidità hanno mostrato morfologie diverse attraverso quantità variabili di fibre di stress (Figura 5). Simile alle osservazioni degli studi riportati eseguiti utilizzando MSC, è stato osservato che le cellule O9-1 cresciute su un substrato più rigido, 40 kPa, mostravano più fibre di stress ed erano ben diffuse rispetto alle cellule cresciute su un idrogel più morbido, indicato da una rigidità di 1 kPa29,30.
Valutazione delle aderenze cellulari
Per confermare ulteriormente l'ipotesi che il cambiamento nella rigidità del substrato influisca sull'adesione NCC, i cambiamenti nell'espressione di Vcl sono stati misurati quantitativamente tramite RT-qPCR in NCC che rispondono a diversi livelli di rigidità dell'idrogel. Vcl è una delle numerose proteine citoscheletriche presenti nel complesso di adesione focale durante il processo della cellula che stabilisce contatti con il substrato e rileva le proprietà ECM32. Le aderenze focali sono i punti di contatto delle cellule all'ECM tramite recettori dell'integrina, che si ancorano al citoscheletro citoscheletrico dell'actina, F-actina33 Il livello di espressione genica Vcl suggerisce i cambiamenti nelle aderenze focali e nelle aderenze cellulari delle cellule O9-1 in risposta alla rigidità del substrato.
Studi precedenti hanno mostrato l'effetto di Vcl sull'adesione cellulare nelle cellule staminali embrionali e nei fibroblasti per differenze nella sua espressione. In risposta all'alta espressione di Vcl,anche il numero e le dimensioni delle aderenze focali sono aumentati ma sono diminuiti quando Vcl è stato abbattuto34. Coerentemente, le cellule carenti di Vclhanno anche mostrato una significativa diminuzione dell'adesione cellulare e della diffusione35. Inoltre, Vcl svolge un ruolo nella regolazione dell'adesione cellulare stabilizzando le aderenze focali36. La dimensione delle aderenze focali, il livello di maturazione e le composizioni variano a seconda della rigidità del substrato, consentendo così di trasdurre i segnali intracellulari e alle cellule di rispondere ai loro segnali ambientali37. Pertanto, Vcl è altamente reclutato per i complessi di adesione focale in cellule cresciute su substrati rigidi, come riflesso da livelli più elevati di mRNA rilevati da RT-qPCR (Figura 6C).
Le cellule cresciute su substrati più morbidi formano complessi di adesione focale minimi, come riflesso da livelli più bassi di mRNA di Vcl nelle cellule15. Nella Figura 6C,le cellule O9-1 hanno mostrato una maggiore espressione di Vcl sul substrato rigido rispetto al substrato morbido. Questi risultati suggeriscono un livello più elevato di aderenze cellula-substrato di cellule O9-1 su substrati rigidi rispetto alle cellule O9-1 su substrati più morbidi. Inoltre, l'espressione di Vcl è stata visualizzata qualitativamente attraverso la colorazione IF con un anticorpo anti-Vcl per integrare ulteriormente e supportare la scoperta RT-qPCR. Coerentemente, l'espressione di Vcl nelle cellule O9-1 cresciute sul substrato più rigido era superiore a quelle coltivate sul substrato più morbido (Figura 6A,B), il che ha ulteriormente supportato la scoperta iniziale di un'elevata adesione cellulare e diffusione sull'idrogel da 40 kPa rispetto all'idrogel da 1 kPa osservato con colorazione F-actina falloidina e livelli di espressione Vcl tramite RT-qPCR.
Figura 1: Curve di forza generate dall'indentazione della sonda AFM. La forza (asse y) indica la forza richiesta applicata in nN e Z (asse x) indica la distanza della sonda Bruker AFM dal campione in μm. Per l'idrogel da 1 kPa (A), la pendenza generata è dolce rispetto alla pendenza più ripida osservata per l'idrogel da 40 kPa (B). Le curve colorate rappresentano il movimento del cantilever sulla sonda AFM mentre si avvicina (blu) e si ritrae (rosso) dal campione di idrogel. Il punto di partenza più alto della curva indica il contatto rigido del coperchio di vetro. (B) Il grande tuffo nella curva retratta nell'idrogel da 40 kPa indica l'adesione tra il tallone e il campione. Abbreviazione: AFM = microscopia a forza atomica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La rigidità media degli idrogel (in kPa) calcolata dal modulo elastico di Young. Il modulo di Young è stato generato dalle curve di forza della Figura 1. I moduli elastici di riferimento degli idrogel erano 0,5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa e 40 kPa. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini in campo luminoso di cellule P19 e O9-1 placcate su idrogel da 1 kPa e 40 kPa di sistemi di controllo e gel modificati per rilevare le caratteristiche di crescita cellulare. (A-D) P19 e (E-H) O9-1 cellule; le cellule morte sono indicate da frecce rosse. Barre della scala = 25 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Colorazione immunofluorescenza del marcatore NCC AP-2 in NCC NCC per visualizzare la compatibilità NCC. (A) Un sistema di idrogel modificato a 40 kPa rispetto a (B) un controllo a 40 kPa. AP-2 (verde); i nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). Barre di scala = 25 μm. (C) Il grafico a barre fornisce la quantificazione del livello di espressione AP-2 mostrando la significatività (p-value = 0,003) (n = 3). I dati mostrano l'espressione relativa con le barre di errore di deviazione standard fornite. Abbreviazioni: NCC = cellula della cresta neurale; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Colorazione fluorescente della falloidina di F-actina che mostra fibre di stress che sono ben distribuite nelle cellule O9-1 sull'idrogel da 40 kPa. Le cellule O9-1 sono state coltivate su idrogel da 1 kPa(A)e 40 kPa(B). Le cellule O9-1 sono state colorate usando Alexa Fluor 488 Phalloidin (verde) e i nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). Barre di scala = 25 μm. Abbreviazione: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Immagini di immunofluorescenza di vinculina in cellule O9-1. Le cellule O9-1 sono state placcate su idrogel da 1 kPa(A)e 40 kPa(B). I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). Barre di scala = 25 μm. (C) Analisi PCR quantitativa in tempo reale del livello totale di mRNA di Vcl in cellule O9-1 coltivate su idrogel da 1 kPa e 40 kPa. Il livello di espressione di Vcl sull'idrogel da 1 kPa è significativamente inferiore a quello dell'idrogel da 40 kPa (p-value = 0,02). I dati mostrano la media con le barre di errore di deviazione standard fornite. Abbreviazione: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| 500 μL volume totale | 0,5 kPa | 1 kPa | 10 kPa | 20 Kb | 40 Kb | ||
| 40% acrilammide (μL) | 37.5 | 62.5 | 125 | 100 | 100 | ||
| 20% Bis-acrilammide (μL) | 15 | 7.5 | 25 | 66 | 120 | ||
| H2O (μL) | 447.5 | 430 | 350 | 334 | 280 | ||
| 10% APS (μL) | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | ||
| TEMED (μL) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | ||
Tabella 1: Volumi corrispondenti di soluzioni per ottenere i livelli di rigidità desiderati.
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Discussion
L'obiettivo del presente studio è quello di fornire un sistema in vitro efficace ed efficiente per comprendere meglio l'impatto dei segnali meccanici negli NCC. Oltre a seguire il protocollo passo-passo sopra menzionato, i ricercatori devono tenere presente che la coltura cellulare di NCC O9-1 è influenzata dal tipo di coverslip di vetro utilizzati per preparare gli idrogel. Ad esempio, è stato notato che le cellule seminate su un tipo specifico di coverslip di vetro (vedi la Tabella dei materiali)sono sopravvissute e proliferate bene, mentre le cellule coltivate seminate su altri tipi di coverslip di vetro hanno mostrato più morte cellulare. Inoltre, è importante seguire rigorosamente le corrette condizioni di coltura cellulare per O9-1 NCCs38. La qualità della coltura cellulare è ottimale quando gli idrogel vengono utilizzati il prima possibile o conservati in un incubatore sterile a 37 °C per un massimo di due giorni.
A causa della sensibilità di ciascun componente del protocollo, i moduli elastici potrebbero variare tra gli esperimenti. Oltre ai punti citati nel protocollo (step 1.3.2) riguardanti l'APS al 10%, anche altri fattori critici da tenere a mente influenzano la variazione. Un altro fattore che si sospettava causasse grandi variazioni nelle misurazioni AFM era lo spessore degli idrogel. Uno studio precedente aveva studiato l'effetto dello spessore sui moduli di Young, che vanno da 15 a 1000 μm, e aveva scoperto che le differenze di spessore non cambiavano significativamente i moduli di Young39. Tuttavia, lo spessore dei substrati influisce anche sulle proprietà meccaniche che le cellule possono percepire, portando a diverse morfologie40,41,42. Vari studi hanno dimostrato che un aumento significativo dello spessore degli idrogel ha portato ad una diminuzione dell'area cellulare, alla diffusione e alla rigidità effettiva degli idrogel40,41,42. Tuttavia, i fenotipi delle cellule cambiano anche in risposta a idrogel significativamente sottili, ad esempio, una maggiore diffusione anche su idrogel a bassa rigidità40,41,42. Con un volume costante di gel di poliacrilammide, lo spessore degli idrogel deve essere uniforme in modo che lievi deviazioni non influenzino in modo significativo il modulo elastico nelle misurazioni AFM.
È meglio sterilizzare i coverslip passandoli avanti e indietro nella fiamma usando un bruciatore di alcol perché altri metodi di sterilizzazione possono essere più complicati e causare potenziali danni ai coverslip di vetro. È possibile utilizzare diverse dimensioni di coperture in vetro in base alle esigenze sperimentali. Questo protocollo utilizzava coverslip da 12 mm e 25 mm per l'immunoistochimica e RT-qPCR, rispettivamente. L'uso di gel di dimensioni adeguate per adattarsi agli esperimenti incoraggia l'efficienza e riduce al minimo gli sprechi. Queste modifiche sono state convalidate qualitativamente e quantitativamente per garantire l'ottimizzazione per gli NCC O9-1 rispetto al sistema di idrogel originale (di controllo)20. La salute generale e la crescita degli NCC O9-1 sono state valutate al microscopio a campo luminoso per le caratteristiche di attaccamento cellulare e del substrato.
Inoltre, la compatibilità delle cellule O9-1 è stata confrontata tra il controllo e i sistemi di idrogel modificati per convalidare ulteriormente le modifiche in questo protocollo visualizzando qualitativamente l'espressione di AP-2 utilizzando la colorazione IF. L'intensità dei segnali è stata quantificata per supportare ulteriormente le immagini rappresentative dell'espressione di AP-2 nelle cellule O9-1 tra il controllo e i sistemi di idrogel modificati. Mentre AP-2 è un marcatore NCC comune, altri marcatori ben noti devono essere considerati per la convalida, come Sox10 e Pax3, a causa del loro significato per il mantenimento NCC della pluripotenza e della sopravvivenza28. Inoltre, l'ottimizzazione in questo protocollo è stata ulteriormente confermata confrontando le celle NC O9-1 con un'altra linea cellulare, P19, per garantire che questo sistema di idrogel sia efficiente e affidabile per le celle NC. Sebbene le cellule P19 abbiano caratteristiche immortali e siano facilmente coltivabili, non hanno prosperato bene su nessuno dei sistemi idrogel.
La resistenza alla forza di allungamento generata dal substrato o dalla rigidità del tessuto in cui le cellule si attaccano è spesso espressa come modulo elastico di Young45. Con AFM, il modulo elastico di Young è ottenuto dalla curva di forza generata dalla forza verticale applicata26. Grandi variazioni possono verificarsi durante la misurazione AFM, tra le misurazioni che possono portare a letture imprecise per gli idrogel più rigidi. L'incoerenza può essere causata da sonde improprie utilizzate per la misurazione. Ad esempio, la misurazione di idrogel da 20 kPa e 40 kPa richiede l'uso di una sonda più rigida con una costante di molla più elevata (k = 0,24 N/m). Una sonda più rigida consente una risoluzione inferiore rispetto a una sonda più morbida; tuttavia, ci sono motivi per favorire la scelta di una sonda più rigida in quanto i cantilever troppo morbidi potrebbero aderire ai campioni46. Inoltre, le sonde troppo morbide sono altamente sensibili, contribuendo a falsi segnali da particelle indesiderate e risultando in valori di rigidità artificialmente inferiori o superiori rispetto alla vera rigidità46. Inoltre, è necessario annotare l'input accurato del rapporto di Poisson, a seconda del materiale di misura; questo potrebbe essere trovato in studi standardizzati in quanto ciò influisce in modo significativo sull'output dei dati.
Inoltre, aFM è stato utilizzato per misurare lo spessore degli idrogel, poiché lo spessore è un'altra proprietà meccanica che influenza il modo in cui le cellule percepiscono il loro ambiente47,42. In vari studi riportati, le cellule che vengono coltivate su idrogel morbidi sono osservate essere di forma rotonda a e oltre "spessore critico", che è riportato a ~ 2-5 μm, a seconda del tipo di cellula47,42,48. Tuttavia, una diffusione molto più elevata è stata osservata quando le cellule sono state placcate su idrogel della stessa rigidità ma di spessore inferiore rispetto allo "spessore critico"42,48. Una potenziale spiegazione per questa interessante scoperta è che lo spessore subcritico degli idrogel consente alle cellule di rilevare i rigidi coperchi di vetro sottostanti mentre le celle esercitano trazione per lo spostamento laterale47. Lo spessore medio tra gli idrogel a rigidità totale era di 342 μm con una deviazione standard di 27 μm. Lo spessore degli idrogel era superiore allo "spessore critico" suggerito, e all'interno del campo di prova inferiore a 400 μm, che è stato riportato negli studi e negli idrogel prefabbricati fabbricati, in modo tale che le cellule potessero percepire la diversa rigidità degli idrogel e non i coperchi di vetro rigido sottostanti42,48.
Oltre al metodo di analisi quantitativa AFM, gli idrogel sono stati analizzati anche qualitativamente attraverso l'immunoistochimica per studiare l'espressione dei marcatori interessati dalla rigidità variabile nelle cellule O9-1 e per visualizzare la crescita sana delle cellule. La F-actina nel citoplasma è collegata alle integrine legate alla membrana tramite un insieme di proteine citoscheletriche, come talina e Vcl, che formano il complesso di adesione focale33. L'espressione delle fibre da stress nelle cellule potrebbe anche essere analizzata misurando l'espressione di altri geni citoscheletrici nelle cellule, come talina e integrina, che potrebbero essere visualizzati insieme utilizzando il kit di colorazione dell'adesione focale.
Ci sono stati vari gradi di rigidità dell'idrogel che hanno influenzato la morfologia e la risposta dell'NCC, come si è visto nel cambiamento nell'adesione cellulare e nelle fibre di stress attraverso la segnalazione meccanica. Questo protocollo offre la possibilità di influenzare la differenziazione cellulare in vari tipi di cellule modificando le corrispondenti condizioni di coltura in vitro, fornendo così un metodo conveniente di manipolazione di segnali meccanici e segnali chimici in NCC. Come accennato in precedenza, il destino della differenziazione NCC è in gran parte guidato dalle forze meccaniche presenti nel tessuto circostante, compresa la sua rigidità2,3. Mentre l'obiettivo immediato di questo documento era quello di sviluppare un protocollo passo-passo per preparare idrogel per la coltura NCC, i potenziali benefici di questo protocollo si estendono oltre la metodologia, perseguendo ulteriori conoscenze della segnalazione meccanica negli NCC. Vale anche la pena notare che questo sistema in vitro ha alcune limitazioni. Questa tecnica di fabbricazione di idrogel comprende più passaggi che possono potenzialmente introdurre variazioni tecniche lungo il percorso, tra cui eterogeneità, superficie irregolare e rigidità imprecisa. Pertanto, gli utenti devono eseguire attentamente questi passaggi per ridurre al minimo le variazioni tecniche durante gli esperimenti. Inoltre, i gel di poliacrilammide in questo sistema hanno limitato gli studi alla coltura 2D a causa della tossicità dell'acrilammide, ignorando il preciso ambiente biologico 3D che gli NCC abitano50.
Nonostante questi vincoli, questo sistema in vitro consente un metodo economico e semplice a beneficio di tutti i livelli di ricerca e consente ai ricercatori di eseguire test a valle sufficienti e funzionali. Come visto in recenti scoperte, gli NCC si basano fortemente sia sulla segnalazione meccanica, come la forza di taglio e la rigidità del substrato, sia sulla segnalazione chimica, come la segnalazione del fattore di crescita Wnt e fibroblasti, nel craniofacciale, così come lo sviluppo cardiaco nei vertebrati6,15. Utilizzando questo protocollo, i microambienti locali per esperimenti in vitro possono essere facilmente imitati per studi futuri su NCC, tra cui differenziazione, migrazione, risposte cellulari e potenziale di progressione dannosa della malattia. Pertanto, questo sistema in vitro sarà un potente strumento per studiare i ruoli della segnalazione meccanica nelle NCC e le loro interazioni con altre vie di segnalazione, che approfondiranno la comprensione dei meccanismi molecolari e genetici dello sviluppo di NCC e delle malattie correlate.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Ringraziamo la dott.ssa Ana-Maria Zaske, operatore della struttura Atomic Force Microscope-UT Core presso l'Università del Texas Health Sciences Center, per l'esperienza apportata in AFM in questo progetto. Ringraziamo anche le fonti di finanziamento del National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 e R01HL142704 a J. Wang).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
| 50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
| 6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
| AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
| anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
| Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
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