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Developmental Biology

Un système O9-1/Hydrogel optimisé pour l’étude des signaux mécaniques dans les cellules de la crête neurale

Published: August 13, 2021 doi: 10.3791/62693
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3, 3, 1, 1,2
1Department of Pediatrics, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2The University of Texas MD Anderson Cancer Center UTHealth Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas Health Science Center at Houston, 3SEM AFM Core in the Houston Methodist Hospital Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Des protocoles détaillés étape par étape sont décrits ici pour étudier les signaux mécaniques in vitro à l’aide de cellules de crête neurale O9-1 multipotentes et d’hydrogels de polyacrylamide de rigidité variable.

Abstract

Les cellules de la crête neurale (CCN) sont des cellules embryonnaires multipotentes vertébrées qui peuvent migrer et se différencier en un large éventail de types de cellules qui donnent naissance à divers organes et tissus. La rigidité des tissus produit une force mécanique, un indice physique qui joue un rôle essentiel dans la différenciation des CNC; toutefois, le mécanisme reste flou. La méthode décrite ici fournit des informations détaillées pour la génération optimisée d’hydrogels de polyacrylamide de rigidité variable, la mesure précise de cette rigidité et l’évaluation de l’impact des signaux mécaniques dans les cellules O9-1, une ligne NCC qui imite les CCN in vivo.

La rigidité de l’hydrogel a été mesurée à l’aide de la microscopie à force atomique (AFM) et a indiqué différents niveaux de rigidité en conséquence. Les CCN O9-1 cultivés sur des hydrogels de rigidité variable ont montré une morphologie cellulaire et une expression génique différentes des fibres de stress, ce qui indiquait des effets biologiques variables causés par des changements de signal mécaniques. De plus, cela a établi que la variation de la rigidité de l’hydrogel a abouti à un système in vitro efficace pour manipuler la signalisation mécanique en modifiant la rigidité du gel et en analysant la régulation moléculaire et génétique dans les CCN. Les NCC O9-1 peuvent se différencier en un large éventail de types de cellules sous l’influence des milieux de différenciation correspondants, et il est pratique de manipuler les signaux chimiques in vitro. Par conséquent, ce système in vitro est un outil puissant pour étudier le rôle de la signalisation mécanique dans les CCN et son interaction avec les signaux chimiques, ce qui aidera les chercheurs à mieux comprendre les mécanismes moléculaires et génétiques du développement de la crête neurale et des maladies.

Introduction

Les cellules de la crête neurale (CCN) sont un groupe de cellules souches au cours de l’embryogenèse des vertébrés avec une capacité remarquable à migrer et à contribuer au développement de divers organes et tissus. Les CCN peuvent se différencier en différents types de cellules, y compris les neurones sensoriels, le cartilage, les os, les mélanocytes et les cellules musculaires lisses, en fonction de l’emplacement de l’origine axiale et du guidage environnemental local du CNC1,2. Avec la capacité de se différencier en un large éventail de types cellulaires, les anomalies génétiques qui provoquent un dérèglement à n’importe quel stade du développement de la crête neurale (NC) peuvent conduire à de nombreuses maladies congénitales2. Par exemple, les perturbations au cours de la formation, de la migration et du développement des CCN entraînent des troubles du développement connus collectivement sous le nom de neurocristopathies1,3. Ces maladies vont des défauts craniofaciaux dus à l’échec de la formation des CNC, tels que le syndrome de Treacher Collins, au développement de divers cancers dus à la capacité migratoire métastatique des CNC, comme on le voit dans le mélanome3,4,5,6. Au cours des dernières décennies, les chercheurs ont fait des découvertes remarquables sur les rôles et les mécanismes des CCN dans le développement et les maladies, la majorité des résultats étant axés sur les signaux chimiques7,8. Plus récemment, il a été indiqué que les signaux mécaniques jouaient un rôle critique mais mal compris dans le développement de laCCN 9,10.

Les signaux environnementaux des CCN jouent un rôle essentiel au cours de leur développement, y compris la régulation de la différenciation des CNC en différents types de cellules. Les indices environnementaux, par exemple les indices physiques, influencent les comportements pivots et les réponses cellulaires, telles que la diversification fonctionnelle. La mécanotransduction permet aux cellules de détecter et de répondre à ces signaux pour maintenir divers processus biologiques2. Les CCN sont entourés de cellules voisines et de différents substrats, tels que la matrice extracellulaire (ECM), qui peuvent donner lieu à des stimuli mécaniques pour maintenir l’homéostasie et s’adapter aux changements par la détermination du destin, la prolifération et l’apoptose11. La mécanotransduction commence au niveau de la membrane plasmique où se produit la composante sensorielle des stimuli extracellulaires mécaniques, entraînant la régulation intracellulaire de la cellule12. Les intégrines, les adhérences focales et les jonctions de la membrane plasmique relaient les signaux mécaniques, tels que les forces de cisaillement, les contraintes et la rigidité des substrats environnants, en signaux chimiques pour produire des réponses cellulaires12. Le relais des signaux chimiques de la membrane plasmique à la régulation cellulaire finale est effectué via différentes voies de signalisation pour finaliser les processus vitaux pour l’organisme, tels que la différenciation.

Plusieurs études ont suggéré que la signalisation mécanique de la rigidité du substrat joue un rôle dans la différenciation cellulaire13,14. Par exemple, des études antérieures ont montré que les cellules souches mésenchymateuses (CSM) cultivées sur des substrats mous avec une rigidité similaire à celle du tissu cérébral (de l’ordre de 0,1 à 1,0 kPa) entraînaient une différenciation des cellules neuronales15,16. Cependant, plus de CSM se différencient en cellules de type myocytaire lorsqu’elles sont cultivées sur des substrats de 8 à 17 kPa imitant la rigidité du muscle, tandis qu’une différenciation de type ostéoblaste a été observée lorsque les CSM ont été cultivés sur des substrats rigides (25-40 kPa)15,16. L’importance de la mécanotransduction est mise en évidence par les irrégularités et les anomalies dans la voie de signalisation mécanique qui conduisent potentiellement à de graves défauts de développement et des maladies, y compris le cancer, les maladies cardiovasculaires et l’ostéoporose17,18,19. Dans les cancers, le tissu mammaire normal est mou et le risque de cancer du sein augmente dans le tissu mammaire raide et dense, un environnement qui s’apparente davantage à des tumeurs mammaires15. Grâce à ces connaissances, les effets de la signalisation mécanique sur le développement de la CCN peuvent être étudiés par une simple manipulation de la rigidité du substrat à travers un système in vitro, offrant ainsi d’autres avantages et possibilités pour comprendre les principes fondamentaux de la progression et de l’étiologie de la maladie liée à la NC.

Pour étudier l’impact des signaux mécaniques dans les CCN, nous avons établi un système in vitro efficace pour les CCN basé sur l’optimisation des méthodes précédemment publiées et l’évaluation des réponses des CCN à différents signaux mécaniques20,21. Un protocole détaillé a été fourni pour la préparation de la rigidité variable de l’hydrogel et l’évaluation de l’impact de la signalisation mécanique dans les CCN. Pour ce faire, les CCN O9-1 sont utilisés comme modèle CN pour étudier les effets et les changements en réponse aux hydrogels rigides par rapport aux hydrogels mous. Les NCC O9-1 sont une lignée cellulaire NC stable isolée à partir d’embryons de souris (E) au jour 8,5. Les NCC O9-1 imitent les NCC in vivo parce qu’ils peuvent se différencier en différents types de cellules dérivées de NC dans des milieux de différenciation définis22. Pour étudier la signalisation mécanique des CCN, un substrat matriciel a été fabriqué avec une élasticité accordable à partir de concentrations variables de solutions d’acrylamide et de bis-acrylamide pour obtenir la rigidité souhaitée, en corrélation avec la rigidité biologique du substrat20,21,23. Afin d’optimiser les conditions du substrat matriciel pour les CCN, en particulier les cellules O9-1, des modifications ont été apportées à partir du protocole20précédemment publié. Un changement apporté à ce protocole a été d’incuber des hydrogels dans du collagène I, dilués dans de l’acide acétique à 0,2 % au lieu de 50 mM d’HEPES, à 37 °C pendant la nuit. Le faible pH de l’acide acétique conduit à une distribution homogène et à une incorporation plus élevée de collagène I, permettant ainsi une fixation plus uniforme de la protéine ECM24. En outre, une combinaison de sérum de cheval et de sérum fœtal bovin (FBS) a été utilisée à des concentrations de 10% et 5% dans une solution saline tampon phosphate (PBS), respectivement, avant de stocker les hydrogels dans l’incubateur. Le sérum de cheval a été utilisé comme supplément supplémentaire au FBS en raison de sa capacité à favoriser la prolifération et la différenciation cellulaires à la concentration de 10%25.

Avec cette méthode, un environnement biologique a été imité par le revêtement protéique ECM (par exemple, le collagène I) pour créer un environnement in vitro précis permettant aux CCN de croître et de survivre20,21. La rigidité des hydrogels préparés a été analysée quantitativement par microscopie à force atomique (AFM), une technique bien connue pour représenter le module élastique26. Pour étudier l’effet de différents niveaux de rigidité sur les CCN, des cellules O9-1 de type sauvage ont été cultivées et préparées sur des hydrogels pour la coloration par immunofluorescence (FI) contre l’actine filamenteuse (F-actine) afin de montrer les différences d’adhésion cellulaire et de morphologies en réponse aux changements de rigidité du substrat. En utilisant ce système in vitro, les chercheurs seront en mesure d’étudier les rôles de la signalisation mécanique dans les NCC et son interaction avec d’autres signaux chimiques afin de mieux comprendre la relation entre les NCC et la signalisation mécanique.

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Protocol

1. Préparation de l’hydrogel

REMARQUE: Toutes les étapes doivent être effectuées dans une hotte de culture cellulaire qui a été désinfectée à l’éthanol et stérilisée aux ultraviolets (UV) avant utilisation pour maintenir la stérilité. Les outils, tels que les pinces à épiler et les pipettes, doivent être pulvérisés avec de l’éthanol. Les solutions tampons doivent également être filtrées stériles.

  1. Préparation de couvercles en verre revêtus d’aminosilane
    1. Placez le nombre souhaité de couvercles de verre sur un morceau de lingette de laboratoire.
      REMARQUE: Préparez 3-4 couvercles supplémentaires pour assurer des alimentations de sauvegarde suffisantes car elles se cassent facilement. Différents matériaux de couvercles en verre produiront une compatibilité différente de l’ensemencement et de la fixation des cellules. Il est préférable de déterminer quel type convient le mieux à l’expérience avant de commencer les expériences (voir le tableau des matériaux).
    2. Utilisez un brûleur à alcool ou un brûleur Bunsen pour stériliser chaque couvercle en le faisant passer d’avant en arrière à travers la flamme (30 s pour les expériences de dosage des protéines). Placez chaque couvercle en verre sur une lingette de laboratoire pour refroidir.
    3. Une fois les couvercles en verre refroidis, transférez-les sur une boîte de Petri recouverte de parafilm pour éviter tout glissement.
      REMARQUE: Si les couvercles ne sont pas assez froids, la chaleur résiduelle fera fondre le parafilm sur les glissières, les rendant inutilisables.
    4. Couvrir les couvercles avec environ 200 μL et 800 μL de NaOH de 0,1 M NaOH pour un couvercle de 12 mm et un couvercle de 25 mm, respectivement, et les laisser reposer pendant 5 min. Ensuite, aspirez le NaOH de 0,1 M et laissez les couvercles sécher à l’air libre pendant encore 5 minutes pour former un film uniforme.
    5. Une fois les couvercles séchés, pipettez environ 80 μL et 150 μL de triéthoxysilane de 3-aminopropyle (APTS) pour des couvercles de 12 mm et 25 mm, respectivement. Veillez à ne pas renverser la solution sur le parafilm. Laissez reposer la solution pendant 5 min.
    6. Aspirer autant d’APTS en excès que possible et laisser sécher les APTS résiduels pendant 5 min. Rincez bien les couvercles en les immergeant dans du H2O stérile et désionisé (DI) trois fois pendant 5 min à chaque fois.
      REMARQUE: Si les couvercles en verre ne sont pas bien rincés, l’APTS résiduel provoque des réactions indésirables avec le glutaraldéhyde, provoquant la formation d’un précipité blanc et entraînant des glissements de couverture inutilisables.
    7. Déplacez les couvercles vers une nouvelle boîte de Petri avec le côté réactif vers le haut. Ajouter suffisamment de glutaraldéhyde à 0,5% dans la boîte de Petri pour couvrir entièrement les couvercles et laisser reposer les couvercles pendant 30 minutes.
    8. Aspirer le glutaraldéhyde à 0,5% et rincer à nouveau les couvercles dans DI H2O une fois pendant 3 min. Placez les couvercles côté réactif sur une lingette de laboratoire ou une boîte de Petri propre pour qu’ils sèchent complètement à l’air libre avant de les utiliser.
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici; Les couvercles doivent être placés dans du DI H2O stérile jusqu’à leur utilisation.
  2. Préparation de couvercles siliconés
    1. Placez le même nombre de couvercles que les couvercles recouverts d’aminosilane (étape 1.1.1) dans une boîte de Petri recouverte de parafilm.
    2. Pipette 40 μL ou 150 μL pour des couvercles de 12 mm et 25 mm, respectivement, de dichlorométhylsilane (DCMS) sur un côté du couvercle et laisser reposer la solution pendant 5 min.
    3. Aspirer toute solution restante de la glissière de couverture, laver dans le DI H2O stérile une fois pendant 1 min et placer les lèvres réactives face vers le haut sur une lingette de laboratoire pour sécher complètement à l’air avant de passer à l’étape suivante.
  3. Préparation d’hydrogels
    1. Mélanger l’acrylamide, le bis-acrylamide et le DIH2O dans un tube centrifuge de 1,5 mL pour préparer 500 μL de solutions avec des rigidités variables (voir tableau 1). Vortex la solution pendant 30 s pour bien mélanger.
    2. En travaillant rapidement, ajoutez la solution de persulfate d’ammonium (APS) à 10% et la tétraméthyléthylènediamine (TEMED) dans le tube et vortexez à nouveau les solutions pour mélanger les solutions.
      REMARQUE: Préparez un APS frais à 10% et laissez-le sur de la glace ou congelez-le dans des aliquotes à usage unique en raison de son cycle sensible de congélation / décongélation.
    3. Pipeter environ 33 μL ou 100 μL de la solution sur les couvercles séchés de 12 mm ou 25 mm recouverts d’aminosilane (section 1.1), respectivement.
    4. À l’aide d’une pince à épiler incurvée, placez immédiatement le couvercle traité par DCMS sur le dessus de la solution de gel avec le côté traité touchant la solution de gel, prenant ainsi en sandwich la solution de gel entre le couvercle traité par DCMS et le couvercle enduit d’aminosilane.
    5. Laisser la solution de gel polymériser pendant 5 à 15 minutes, tout en surveillant activement la polymérisation en gel de la solution restante dans le tube.
    6. Une fois le gel polymérisé, séparez le couvercle traité DCMS par une pince à épiler incurvée ou une lame de rasoir, en laissant le gel attaché au couvercle d’origine recouvert d’aminosilane.
    7. Placez immédiatement le couvercle avec l’hydrogel attaché dans une plaque prédéterminée de 4 puits/24 puits et 6 puits recouverte de 500 μL et 2 mL de PBS stérile ou de DI H2O pour des couvercles de 12 mm et 25 mm, respectivement, pour éviter que le gel ne se dessèche.
    8. Répétez les étapes 1.3.4 à 1.3.7 pour tous les couvercles.
    9. Immergez les hydrogels dans du PBS stérile ou du DIH2Opendant 30 min pour éliminer l’excès de solution d’acrylamide. Conserver les hydrogels dans du PBS stérile ou du DIH2Oà 4 °C pour un arrêt procédural ici.
    10. Dans une pièce sombre, préparer le mélange d’hexanoate de sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) (sulfo-SANPAH) en mélangeant 2,5 mL de 50 mM d’acide 2-[4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-yl]éthanesulfonique (HEPES) (pH = 8,5) avec 25 μL de sulfo-SANPAH de 50 μg/mL dans un tube conique, enveloppé dans du papier d’aluminium pour protéger de la lumière. Utilisez une pipette pour bien mélanger la solution avant de l’utiliser.
      REMARQUE: Un volume de 2,5 mL de solution de sulfo-SANPAH est suffisant pour environ vingt-cinq hydrogels de 12 mm ou cinq hydrogels de 25 mm.
    11. Aspirer PBS ou DI H2O à partir de la plaque de puits. Ajouter environ 100 μL ou 500 μL pour des couvercles de 12 mm et 25 mm, respectivement, de solution de sulfo-SANPAH (étape 1.3.10) pour couvrir le gel. Assurez-vous que la solution recouvre entièrement le gel.
      REMARQUE: Ajustez la force d’aspiration sous vide pour empêcher la forte force de déchirer ou de perturber les hydrogels.
    12. Placez les gels avec la solution sous une lumière UV de 15 W, 365 nm pendant 10 min, à découvert pour minimiser toute interférence de la lumière UV réagissant avec le sulfo-SANPAH.
    13. Aspirer l’excès de sulfo-SANPAH en inclinant la plaque pour recueillir autant de solution que possible. Lavez le gel avec 50 mM HEPES deux à trois fois.
    14. Ajouter 500 μL et 2 mL pour les gels de 12 mm et 25 mm, respectivement, de collagène I de 50 mg/mL dilué dans de l’acide acétique à 0,2 % à chaque puits contenant l’hydrogel. Laisser les gels incuber pendant la nuit dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2.
      REMARQUE: Diluer le collagène I dans de l’acide acétique à 0,2% au lieu de 50 mM HEPES pour favoriser une distribution et une fixation homogènes du collagène I.
    15. Aspirer le collagène I et laver les gels avec du PBS stérile trois fois pour éliminer l’excès de collagène I pendant 5 min chaque lavage. Incuber les hydrogels dans du PBS avec 10% de sérum de cheval, 5% de FBS pendant 2 h dans l’incubateur à 37 °C, 5% de CO2.
      REMARQUE: L’ajout de 10% de sérum de cheval favorise une prolifération plus élevée par rapport à l’utilisation de FBS comme cela a été fait dans la publication précédente.
    16. Aspirer le milieu. Ajouter 500 mL de milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco filtré stérile avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine (P/S) à chaque puits. Conservez les gels dans l’incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour la culture cellulaire.
    17. Une fois prêt, déposer environ 1,5 × 10 cellules4 O9-1/cm2 en milieu basal dans les boîtes de culture. Incuber les cellules pendant 2 jours dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO2. Vérifiez la confluence des cellules pour s’assurer que les cellules sont suffisamment attachées aux gels et que le nombre de cellules est suffisant avant de les collecter pour analyse.
      REMARQUE : Voir le protocole publié précédemment pour les étapes de récupération, de passage et de collecte des cellules O9-120.
    18. Passez aux sections 2, 3 ou 4 pour une analyse plus approfondie des hydrogels.

2. Analyse quantitative de la rigidité via AFM

  1. Démarrez l’ordinateur système AFM, suivi du contrôleur AFM (voir la table des matériaux).
  2. Montez le porte-à-faux AFM sur le porte-sonde AFM. Utilisez un porte-à-faux sphérique avec une bille de silice de 0,5 μm montée à l’extrémité du porte-à-faux (porte-à-faux avec perle sphérique).
    REMARQUE: Pour les hydrogels plus rigides, tels que 10 kPa, 20 kPa et 40 kPa, une sonde plus rigide a été utilisée avec la constante de ressort de 0,24 N / m. Une sonde plus douce a été utilisée pour les hydrogels plus mous, tels que 0,5 kPa et 1 kPa, avec une constante de ressort de 0,059 N/m.
  3. Réglez le logiciel AFM en mode contact.
  4. Montez la plaquette de silicium sur l’étage d’échantillonnage AFM pour collecter les courbes de force en cliquant sur Engager pour que le porte-à-faux touche le substrat de silicium, générant ainsi les courbes de force.
  5. Utilisez les courbes de force ci-dessus (2.4) pour l’étalonnage, cliquez sur Calibrer dans le logiciel de contrôle pour obtenir une constante de ressort moyenne du porte-à-faux dans des conditions de réglage thermique et enregistrez les valeurs étalonnées dans le logiciel de contrôle.
  6. Montez les échantillons en plaçant le couvercle avec l’hydrogel attaché dans une boîte de Petri de 60 mm sur l’étage de balayage AFM. Ajouter 3 mL de PBS dans le plat avant d’effectuer des mesures pour éviter que le gel ne se dessèche.
  7. Réglez l’AFM pour qu’il fonctionne en mode contact (fluide) pour démarrer la mesure. Engagez la perle sphérique pour toucher et soulever continuellement de l’échantillon de gel.
  8. Réglez le porte-à-faux de sorte que son seuil de déviation reste à 10 nm. Maintenez la taille de rampe de la sonde à 10 μm. Ensuite, enregistrez les courbes de force comme à l’étape 2.4.
  9. Acquérir au moins 20 courbes de force d’au moins 3 à 10 points différents sur la surface de l’hydrogel.
  10. Calculez le module de Young moyen d’environ 20 courbes de force pour chaque point avec un logiciel d’imagerie et d’analyse AFM. Utilisez des courbes de force de rampe d’extension et un modèle linéarisé (sphérique). Calculez la moyenne de tous les points pour chaque échantillon afin d’obtenir la rigidité finale.
    REMARQUE : Le module de Young et les données connexes(c.-à-d. les écarts-types) sont automatiquement enregistrés sous forme de feuille de calcul.
  11. Répétez les étapes 2.6 à 2.10 pour tous les échantillons.

3. Analyse moléculaire de la rigidité par coloration par immunofluorescence

  1. Utilisez une pince à épiler pour transporter le couvercle vers une nouvelle plaque afin de minimiser les faux signaux provenant de cellules cultivées directement sur la plaque. Lavez les cellules avec 500 μL de PBS stérile trois fois pour éliminer les cellules mortes et tout milieu de culture restant.
  2. Fixez les cellules à l’aide de 500 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant 10 min à température ambiante, sans être dérangé. Ensuite, lavez à nouveau les cellules trois fois en utilisant 500 μL de PBS / puits pendant 2 minutes chacune.
    REMARQUE: Conserver à 4 °C pour un arrêt de procédure.
  3. Traiter les cellules avec 500 μL de Triton X-100 à 0,1 % pendant 15 min à température ambiante. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec 500 μL de PBS / puits.
  4. Bloquer les cellules avec 250 μL de sérum d’âne à 10% (dilué dans du PBS et 0,1% de Tween 20) par puits pendant 30 min à température ambiante.
  5. Incuber les cellules avec 250 μL d’anticorps primaires pendant 2 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 °C. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec 500 μL de PBS / puits pendant 5 minutes chacune.
    REMARQUE: Anti-Vinculine (Vcl) (1:250) et anti-AP2 alpha (1:250) ont été utilisés dans cette expérience et ont été dilués dans 10% de sérum d’âne.
  6. Incuber les cellules avec les anticorps secondaires correspondants et/ou la phalloïdine utilisée pour la coloration de la F-actine à une dilution de 1:400 dans 250 μL de sérum d’âne à 10% pendant 30 min à température ambiante. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec PBS pendant 5 minutes chacune.
    REMARQUE: La phalloïdine 568 nm peut être co-incubée avec des anticorps secondaires de 488 nm ou 647 nm ou seule.
  7. Incuber les cellules avec du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, dilution 1:1000) dans 250 μL de PBS pendant 10 min suivi d’un dernier lavage de PBS pendant 2 min.
  8. Ajouter 3-4 gouttes de support de montage à chaque puits. Conservez les échantillons à 4 °C pour les régler pendant au moins 2 h avant l’imagerie afin de vous assurer que le support de montage est correctement réglé.
  9. Capturez des images d’au moins 3 images aléatoires par échantillon d’hydrogel avec un microscope à fluorescence, en produisant des canaux individuels et fusionnés.

4. PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR)

  1. Transférez les hydrogels avec les cellules adhérentes pour la collecte d’ARN dans une nouvelle plaque afin de minimiser l’ARN indésirable des cellules attachées à la plaque cellulaire. Lavez les cellules avec du PBS trois fois pour éliminer les cellules mortes et le milieu de culture.
  2. Extrayez l’ARNm total à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN. Effectuer la transcription inverse de l’ARN en ADNc à l’aide d’un supermélange de transcription inverse en suivant les instructions du fabricant.
  3. Effectuez la RT-qPCR avec des amorces pour Vcl comme marqueur de rigidité de choix et analysez à l’aide de la méthode2 -ΔΔCT.
    REMARQUE: Séquence d’amorce de Vcl: Forward 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; inverser 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.

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Representative Results

Préparation de l’hydrogel et évaluation de la rigidité par AFM et le modèle Hertz
Ici, un protocole détaillé est fourni pour générer des hydrogels de polyacrylamide de rigidité variable en régulant le rapport entre l’acrylamide et le bis-acrylamide. Cependant, les hydrogels de polyacrylamide ne sont pas prêts pour l’adhésion des cellules en raison du manque de protéines ECM. Ainsi, le sulfo-SANPAH, agissant comme un liant, se lie de manière covalente aux hydrogels et réagit avec les amines primaires des protéines ECM pour permettre l’adhésion des protéines ECM aux surfaces des hydrogels via l’ester N-hydroxysuccinimide dans le sulfo-SANPAH après activation UV. Le collagène de type I a été utilisé comme protéine ECM de choix pour favoriser efficacement l’attachement des cellules O9-1. Pour garantir des valeurs de rigidité précises de différents hydrogels, une évaluation de la rigidité a été effectuée à l’aide de l’AFM, une technique bien connue pour représenter le module d’élasticité.

Après la formation et la fixation réussies de l’hydrogel de polyacrylamide au couvercle en verre, le gel est resté adhérent au couvercle avec une surface uniforme et une déchirure minimale. La rigidité a été mesurée par AFM sur la base du principe de la technique d’indentation, dans laquelle un pénétrateur rigide a été appliqué à l’échantillon avec la force requise pour atteindre une profondeur d’indentation26. Avec cette mesure, le module d’élasticité de Young a été calculé sur la base de l’indentation de la profondeur et de la force dans le modèle de Hertz, une théorie élastique26. Cependant, en raison de la grande variation des résultats par AFM, une méthode statistique supplémentaire a été appliquée pour obtenir un résultat quantitatif avec un impact minimal des surfaces inégales et une homogénéité imparfaite des solutions de gel26. Pour produire une mesure quantitative à l’aide de l’AFM, une compilation d’au moins 50 courbes de force et de distance de chaque emplacement sur l’échantillon de gel a été prélevée pour une rigidité moyenne de l’échantillon. La force appliquée au gel à haute rigidité était plus élevée que celle appliquée au gel plus mou, ce qui indique qu’un substrat plus rigide a donné une pente plus raide dans le graphique Force vs Z, dans lequel la force est mesurée en nN, et Z indique la profondeur d’indentation entre le pénétrateur et l’échantillon.

Sur les hydrogels mous, la pente de la courbe de force générée était douce car la force requise de la sonde AFM était moindre(Figure 1A). Cependant, sur les hydrogels rigides, tels que ceux avec le module de 40 kPa, la pente générée était beaucoup plus raide car la force appliquée était plus élevée que pour les gels plus mous(Figure 1B). À mesure que la séparation entre la sonde et l’échantillon d’hydrogel diminue, la courbe augmente considérablement à mesure que la pointe de la sonde touche le couvercle en verre. Cependant, à mesure que la distance de séparation augmente, la courbe se rapproche simplement de 0 car il n’y a pas de force appliquée présente.

Comme le montre la figure 1A,le porte-à-faux de la sonde AFM s’est approché du gel, indiqué par la ligne bleue, et la sonde a mesuré la force appliquée nécessaire pour pénétrer dans l’échantillon de gel et éventuellement atteindre le couvercle en verre, provoquant une augmentation soudaine de la force. En raison d’éventuelles erreurs procédurales et instrumentales, telles que la qualité des solutions requises, la rigidité réelle des échantillons d’hydrogel varie largement et loin de la rigidité souhaitée. Ainsi, l’AFM est un outil utile pour valider et confirmer la méthodologie tout en empêchant la présentation de fausses données dans d’autres expériences.

Dans cette évaluation AFM, les cinq échantillons d’hydrogel préparés ont été mesurés par l’approche quantitative. Le protocole s’est concentré sur des niveaux de rigidité de l’hydrogel de 0,5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa et 40 kPa, qui imitent l’étendue des niveaux de rigidité du substrat biologique rapportés pour la différenciation de divers types de cellules. Les courbes de force obtenues à partir des mesures AFM ont été utilisées pour générer le module d’élasticité de Young en kilopascals à l’aide d’un logiciel d’algorithme d’analyse AFM (Figure 2).

Comparaison des systèmes d’hydrogel de polyacrylamide et des types de cellules
Cette adaptation du protocole original par Tse et ses collègues fournit une approche efficace et efficiente pour étudier les aspects mécanosensibles de la CCN à l’aide de cellules O9-120. Les modifications apportées au protocole précédent comprennent la modification de l’incubation de la protéine ECM: remplacement de 50 mM HEPES par 0,2% d’acide acétique et ajout de 10% de sérum de cheval et de FBS pour la culture cellulaire (étape 1.3.14-1.3.15). Ces modifications ont été validées en comparant la croissance et le maintien des CCN O9-1 sur ce système de gel modifié avec ceux du protocole original (de contrôle). Ici, nous avons cultivé des cellules O9-1 de type sauvage sur les deux systèmes d’hydrogel avec le module élastique de 1 kPa et 40 kPa pour chaque système en milieu basal. L’état global de croissance cellulaire et le développement ont été visualisés à l’aide d’un microscope optique à fond vif pour les caractéristiques apoptotiques, la morphologie stressée et l’attachement cellulaire aux hydrogels. Les cellules O9-1 cultivées sur le système de gel d’origine ont entraîné un nombre plus élevé de cellules mortes indiquées par un excès de cellules rondes(Figure 3E,F)pour les hydrogels de 1 kPa et de 40 kPa.

En revanche, les cellules O9-1 cultivées sur le système de gel modifié présentaient une croissance cellulaire saine et une fixation suffisante au substrat de l’hydrogel(Figure 3G,H). De plus, la compatibilité des CCN avec le système d’hydrogel modifié a été évaluée en effectuant une coloration IF du marqueur NCC, Tcfap2α (AP-2). AP-2 est un facteur de transcription exprimé dans les lignées NC pour réguler le développement chez les embryons de souris, ce qui le rend approprié pour évaluer la compatibilité27. Bien que les cellules O9-1 cultivées sur des systèmes d’hydrogel témoins et modifiés aient toutes deux exprimé AP-2, il y a eu une augmentation significative de l’expression d’AP-2 dans les cellules O9-1 plaquées sur le système d’hydrogel modifié, comme l’indiquent le signal de fluorescence plus fort et la quantification correspondante(Figure 4A,B).

En outre, les cellules P19 ont été utilisées pour valider davantage les avantages du système d’hydrogel modifié pour la croissance des cellules. P19 est une lignée cellulaire de carcinome embryonnaire qui a été dérivée d’un tératocarcinome dérivé d’embryons chez la souris28. En utilisant le protocole de culture correspondant, les cellules P19 ont été cultivées sur des systèmes d’hydrogel témoins et modifiés pour surveiller les caractéristiques de survie et de croissance. L’imagerie en champ clair a révélé que les cellules P19 plaquées sur les deux systèmes d’hydrogel présentaient un excès de cellules flottantes rondes et un manque de fixations cellule-substrat(Figure 3A-D). Cette observation suggérait que le protocole modifié était plus approprié pour les NCC O9-1 pour étudier la signalisation mécanique dans les NCC.

Visualisation de l’expression des fibres à haute contrainte sur des substrats rigides
L’hydrogel modifié a permis une analyse quantitative et qualitative des différences de morphologie des cellules cultivées sur des gels de différents niveaux de rigidité et d’autres effecteurs. Une fois que les hydrogels étaient prêts pour l’ensemencement cellulaire, les cellules O9-1 de type sauvage ont été passées sur des hydrogels de différents niveaux de rigidité. Les cellules ont été surveillées pour leur santé et leur croissance en observant leur forme, leur propagation spatiale et même leur attachement sur l’hydrogel avec un minimum de cellules mortes. Certaines études ont montré une augmentation des fibres de contrainte et de l’adhérence cellulaire pour les CSM sur des substrats à haute rigidité, suggérant que les CCN cultivés sur un substrat plus rigide présenteraient également des résultats similaires à ceux des CCN cultivés sur des substrats plus mous29,30.

La F-actine ainsi que la myosine II, la α-actinine et d’autres protéines du cytosquelette sont connues collectivement sous le nom de fibres de stress31. Des études antérieures ont observé une augmentation de l’assemblage des fibres de contrainte en réponse à une force mécanique accrue31. À une ou aux deux extrémités des fibres de contrainte, les fixations au complexe d’adhésion focale permettent aux cellules de migrer et d’adhérer à l’ECM31. La coloration à la phalloïdine pour visualiser l’expression et l’organisation de la F-actine dans les CCN a démontré une croissance cellulaire saine en réponse à la signalisation mécanique (Figure 5). De plus, les cellules O9-1 cultivées sur des hydrogels à faible ou haute rigidité présentaient des morphologies différentes grâce à des quantités variables de fibres de stress(Figure 5). Semblable aux observations des études rapportées réalisées à l’aide de CSM, il a été observé que les cellules O9-1 cultivées sur un substrat plus rigide, 40 kPa, présentaient plus de fibres de stress et étaient bien réparties par rapport aux cellules cultivées sur un hydrogel plus doux, indiquée par une rigidité de 1 kPa29,30.

Évaluation des adhérences cellulaires
Pour confirmer davantage l’hypothèse selon laquelle le changement de rigidité du substrat a un impact sur l’adhérence des CNC, les changements dans l’expression de Vcl ont été mesurés quantitativement via RT-qPCR dans les CCN répondant à différents niveaux de rigidité de l’hydrogel. Vcl est l’une des nombreuses protéines du cytosquelette présentes dans le complexe d’adhésion focale au cours du processus de la cellule établissant des contacts avec le substrat et détectant les propriétés ECM32. Les adhérences focales sont les points de contact des cellules avec l’ECM via les récepteurs de l’intégrine, qui s’ancrent au cytosquelette d’actine cytoplasmique, F-actine33 Le niveau d’expression du gène Vcl suggère les changements dans les adhérences focales et les adhérences cellulaires des cellules O9-1 en réponse à la rigidité du substrat.

Des études antérieures ont montré l’effet de Vcl sur l’adhésion cellulaire dans les cellules souches embryonnaires et les fibroblastes par des différences dans son expression. En réponse à l’expression élevée de Vcl, le nombre et la taille des adhérences focales ont également augmenté mais ont diminué lorsque Vcl a été renversé34. De manière constante, les cellules déficientes en Vclont également montré une diminution significative de l’adhésion cellulaire et de la propagation35. De plus, Vcl joue un rôle dans la régulation de l’adhésion cellulaire en stabilisant les adhérences focales36. La taille des adhérences focales, le niveau de maturation et les compositions varient en fonction de la rigidité du substrat, permettant ainsi aux signaux d’être transduits intracellulairement et aux cellules de répondre à leurs signaux environnementaux37. Ainsi, Vcl est fortement recruté pour les complexes d’adhésion focale dans les cellules cultivées sur des substrats rigides, comme en témoignent les niveaux d’ARNm plus élevés détectés par la RT-qPCR(Figure 6C).

Les cellules cultivées sur des substrats plus mous forment des complexes d’adhésion focale minimale, comme en témoignent les niveaux d’ARNm inférieurs de Vcl dans les cellules15. Dans la figure 6C,les cellules O9-1 présentaient une expression plus élevée de Vcl sur le substrat rigide que sur le substrat mou. Ces résultats suggèrent un niveau plus élevé d’adhérences cellule-substrat des cellules O9-1 sur des substrats rigides que des cellules O9-1 sur des substrats plus mous. En outre, l’expression de Vcl a été visualisée qualitativement par coloration IF avec un anticorps anti-Vcl pour compléter et soutenir davantage la découverte de RT-qPCR. De manière constante, l’expression de Vcl dans les cellules O9-1 cultivées sur le substrat plus rigide était plus élevée que celles cultivées sur le substrat plus mou(Figure 6A,B),ce qui a également soutenu la découverte initiale d’une adhésion cellulaire élevée et d’une propagation sur l’hydrogel de 40 kPa par rapport à l’hydrogel de 1 kPa observé avec la coloration à la phalloïdine F-actine et les niveaux d’expression Vcl via RT-qPCR.

Figure 1
Figure 1: Courbes de force générées par l’indentation de la sonde AFM. La force (axe y) indique la force requise appliquée en nN, et Z (axe x) indique la distance de la sonde Bruker AFM par rapport à l’échantillon en μm. Pour l’hydrogel de 1 kPa (A), la pente générée est douce par rapport à la pente plus raide observée pour l’hydrogel de 40 kPa (B). Les courbes colorées représentent le mouvement du porte-à-faux sur la sonde AFM lorsqu’il s’approche (bleu) et se rétracte (rouge) de l’échantillon d’hydrogel. Le point de départ le plus élevé de la courbe indique le contact rigide de la glissière de verre. (B) Le grand creux dans la courbe rétractée dans l’hydrogel de 40 kPa indique une adhérence entre la bille et l’échantillon. Abréviation : AFM = microscopie à force atomique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Rigidité moyenne des hydrogels (en kPa) calculée à partir du module d’élasticité de Young. Le module de Young a été généré à partir des courbes de force de la figure 1. Les modules élastiques référencés des hydrogels étaient de 0,5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa et 40 kPa. Les barres d’erreur indiquent un écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Images en champ lumineux de cellules P19 et O9-1 plaquées sur des hydrogels de 1 kPa et 40 kPa de systèmes de contrôle et de gel modifié pour détecter les caractéristiques de croissance cellulaire. (A-D) P19 et (E-H) cellules O9-1; les cellules mortes sont indiquées par des flèches rouges. Barres d’échelle = 25 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Coloration par immunofluorescence du marqueur NCC AP-2 dans les NCC pour visualiser la compatibilité NCC. (A) Un système d’hydrogel modifié de 40 kPa par rapport à (B) un contrôle de 40 kPa. AP-2 (vert); les noyaux ont été colorés avec du DAPI (bleu). Barres d’échelle = 25 μm. (C) Le graphique à barres fournit une quantification du niveau d’expression AP-2 montrant la signification (p-valeur = 0,003) (n = 3). Les données montrent l’expression relative avec les barres d’erreur d’écart type fournies. Abréviations : CNC = cellule de la crête neurale; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Coloration fluorescente à la phalloïdine de la F-actine montrant des fibres de stress bien étalées dans les cellules O9-1 sur l’hydrogel de 40 kPa. Les cellules O9-1 ont été cultivées sur des hydrogels de 1 kPa(A)et 40 kPa(B). Les cellules O9-1 ont été colorées à l’aide d’Alexa Fluor 488 Phalloidin (vert), et les noyaux ont été colorés avec DAPI (bleu). Barres d’échelle = 25 μm. Abréviation : DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Images d’immunofluorescence de la vinculine dans les cellules O9-1. Les cellules O9-1 ont été plaquées sur des hydrogels de 1 kPa(A)et 40 kPa(B). Les noyaux ont été colorés avec du DAPI (bleu). Barres d’échelle = 25 μm. (C) Analyse PCR quantitative en temps réel du niveau total d’ARNm de Vcl dans des cellules O9-1 cultivées sur des hydrogels de 1 kPa et 40 kPa. Le niveau d’expression de Vcl sur l’hydrogel de 1 kPa est significativement inférieur à celui de l’hydrogel de 40 kPa(p-value = 0,02). Les données montrent la moyenne avec les barres d’erreur d’écart-type fournies. Abréviation : DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Volume total de 500 μL 0,5 kPa 1 kPa 10 kPa 20 kPa 40 kPa
40 % d’acrylamide (μL) 37.5 62.5 125 100 100
20 % de bis-acrylamide (μL) 15 7.5 25 66 120
H2O (μL) 447.5 430 350 334 280
10 % APS (μL) 5 5 5 5 5
TEMED (μL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Tableau 1 : Volumes correspondants de solutions pour obtenir les niveaux de rigidité souhaités.

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Discussion

L’objectif de la présente étude est de fournir un système in vitro efficace et efficient pour mieux comprendre l’impact des signaux mécaniques dans les CCN. En plus de suivre le protocole étape par étape mentionné ci-dessus, les chercheurs doivent garder à l’esprit que la culture cellulaire des CCN O9-1 est affectée par le type de couvercles en verre utilisés pour préparer les hydrogels. Par exemple, il a été noté que les cellules ensemencées sur un type spécifique de couvercle en verre (voir la table des matériaux)ont survécu et proliféré bien, tandis que les cellules cultivées ensemencées sur d’autres types de couvercles en verre ont montré plus de mort cellulaire. De plus, il est important de suivre strictement les conditions de culture cellulaire correctes pour les NCCO9-1 38. La qualité de la culture cellulaire est optimale lorsque les hydrogels sont utilisés dès que possible ou stockés dans un incubateur stérile à 37 °C pendant deux jours maximum.

En raison de la sensibilité de chaque composant du protocole, les modules élastiques peuvent varier d’une expérience à l’autre. En plus des points mentionnés dans le protocole (étape 1.3.2) concernant 10% APS, d’autres facteurs critiques à garder à l’esprit affectent également la variation. Un autre facteur soupçonné de provoquer de grandes variations dans les mesures AFM était l’épaisseur des hydrogels. Une étude précédente avait étudié l’effet de l’épaisseur sur les modules de Young, allant de 15 à 1000 μm, et avait constaté que les différences d’épaisseur ne modifiaient pas significativement les modules de Young39. Cependant, l’épaisseur des substrats affecte également les propriétés mécaniques que les cellules peuvent détecter, conduisant à différentes morphologies40,41,42. Diverses études ont montré qu’une augmentation significative de l’épaisseur des hydrogels entraînait une diminution de la surface cellulaire, de l’étalement et de la rigidité effective des hydrogels40,41,42. Cependant, les phénotypes des cellules changent également en réponse à des hydrogels significativement minces, par exemple, une propagation plus élevée même sur des hydrogels de faible rigidité40,41,42. Avec un volume constant de gels de polyacrylamide, l’épaisseur des hydrogels doit être uniforme afin que de légers écarts n’affectent pas de manière significative le module d’élasticité dans les mesures AFM.

Il est préférable de stériliser les couvercles en les passant d’avant en arrière dans la flamme à l’aide d’un brûleur à alcool, car d’autres méthodes de stérilisation peuvent être plus compliquées et causer des dommages potentiels aux couvercles en verre. Différentes tailles de couvercles en verre peuvent être utilisées en fonction des exigences expérimentales. Ce protocole utilisait des couvercles de 12 mm et 25 mm pour l’immunohistochimie et la RT-qPCR, respectivement. L’utilisation de gels de taille appropriée pour s’adapter aux expériences encourage l’efficacité et minimise les déchets. Ces modifications ont été validées qualitativement et quantitativement afin d’assurer l’optimisation des NCC O9-1 par rapport au système d’hydrogel original (de contrôle)20. La santé globale et la croissance des NCC O9-1 ont été évaluées au microscope à fond clair pour les caractéristiques de fixation cellulaire et de substrat.

De plus, la compatibilité des cellules O9-1 a été comparée entre les systèmes témoins et les systèmes d’hydrogel modifiés afin de valider davantage les modifications de ce protocole en visualisant qualitativement l’expression de l’AP-2 à l’aide de la coloration IF. L’intensité des signaux a été quantifiée pour soutenir davantage les images représentatives de l’expression de l’AP-2 dans les cellules O9-1 entre le contrôle et les systèmes d’hydrogel modifiés. Bien que l’AP-2 soit un marqueur NCC commun, d’autres marqueurs bien connus doivent être pris en compte pour validation, tels que Sox10 et Pax3, en raison de leur importance pour le maintien de la pluripotence et de la survie28par NCC. En outre, l’optimisation de ce protocole a été confirmée en comparant les cellules CN O9-1 avec une autre lignée cellulaire, P19, afin de s’assurer que ce système d’hydrogel est efficace et fiable pour les cellules NC. Bien que les cellules P19 aient des caractéristiques immortelles et soient faciles à cultiver, elles ne se sont pas bien développées sur l’un ou l’autre des systèmes d’hydrogel.

La résistance à la force d’allongement générée par la rigidité du substrat ou du tissu où les cellules se fixent est souvent exprimée sous la forme du module élastique45de Young. Avec l’AFM, le module d’élasticité de Young est obtenu à partir de la courbe de force générée à partir de la force verticale appliquée26. De grandes variations peuvent se produire lors de la mesure AFM, entre les mesures qui peuvent conduire à des lectures inexactes pour les hydrogels plus rigides. L’incohérence peut être causée par des sondes incorrectes utilisées pour la mesure. Par exemple, la mesure d’hydrogels de 20 kPa et 40 kPa nécessite l’utilisation d’une sonde plus rigide avec une constante de ressort plus élevée (k = 0,24 N/m). Une sonde plus rigide permet une résolution inférieure à celle d’une sonde plus douce ; cependant, il y a des raisons de privilégier le choix d’une sonde plus rigide car des porte-à-faux trop souples pourraient adhérer aux échantillons46. De plus, les sondes trop molles sont très sensibles, contribuant aux faux signaux provenant de particules indésirables et entraînant des valeurs de rigidité artificiellement inférieures ou supérieures à la rigidité réelle46. En outre, une entrée précise du rapport de Poisson doit être notée, en fonction du matériau de mesure; cela pourrait être trouvé dans des études standardisées, car cela affecte considérablement la production de données.

En outre, l’AFM a été utilisé pour mesurer l’épaisseur des hydrogels, car l’épaisseur est une autre propriété mécanique affectant la façon dont les cellules détectent leur environnement47,42. Dans diverses études rapportées, les cellules cultivées sur des hydrogels mous sont de forme ronde à et au-delà de « l’épaisseur critique », qui est rapportée à ~ 2-5 μm, selon le type de cellule47,42,48. Cependant, une propagation beaucoup plus élevée a été observée lorsque les cellules étaient plaquées sur des hydrogels de même rigidité mais d’épaisseur inférieure à « l’épaisseur critique »42,48. Une explication possible de cette découverte intéressante est que l’épaisseur sous-critique des hydrogels permet aux cellules de détecter les couvercles de verre sous-jacents rigides lorsque les cellules exercent une traction pour le déplacement latéral47. L’épaisseur moyenne des hydrogels toutes rigidités était de 342 μm avec un écart-type de 27 μm. L’épaisseur des hydrogels était supérieure à l'"épaisseur critique » suggérée, et dans la plage d’essai inférieure à 400 μm, qui a été rapportée dans les études et les hydrogels préfabriqués fabriqués, de sorte que les cellules pouvaient détecter la rigidité différente des hydrogels et non les revêtements en verre rigide sous-jacents42,48.

En plus de la méthode d’analyse quantitative AFM, les hydrogels ont également été analysés qualitativement par immunohistochimie pour étudier l’expression des marqueurs affectés par la rigidité variable dans les cellules O9-1 et pour visualiser la croissance saine des cellules. La F-actine dans le cytoplasme est reliée aux intégrines liées à la membrane via un ensemble de protéines cytosquelettiques, telles que la taline et la Vcl, formant le complexe d’adhésion focale33. L’expression des fibres de stress dans les cellules pourrait également être analysée en mesurant l’expression d’autres gènes du cytosquelette dans les cellules, tels que la taline et l’intégrine, qui pourraient être visualisés ensemble à l’aide du kit de coloration par adhérence focale.

Il y avait différents degrés de rigidité de l’hydrogel qui influençaient la morphologie et la réponse du CNC, comme en témoigne le changement de l’adhérence cellulaire et des fibres de contrainte par signalisation mécanique. Ce protocole offre la possibilité d’influencer la différenciation cellulaire en différents types de cellules en modifiant les conditions de culture correspondantes in vitro,fournissant ainsi une méthode pratique de manipulation des signaux mécaniques et chimiques dans les NCC. Comme mentionné précédemment, le sort de la différenciation NCC est largement guidé par les forces mécaniques présentes dans le tissu environnant, y compris sa rigidité2,3. Bien que l’objectif immédiat de cet article était d’élaborer un protocole étape par étape pour préparer des hydrogels pour la culture de CNC, les avantages potentiels de ce protocole vont au-delà de la méthodologie, poursuivant des connaissances supplémentaires sur la signalisation mécanique dans les CCN. Il convient également de noter que ce système in vitro présente certaines limites. Cette technique de fabrication d’hydrogels comprend plusieurs étapes qui peuvent potentiellement introduire des variations techniques en cours de route, notamment l’hétérogénéité, la surface inégale et la rigidité inexacte. Par conséquent, les utilisateurs doivent effectuer ces étapes avec soin pour minimiser les variations techniques pendant les expériences. De plus, les gels de polyacrylamide dans ce système ont limité les études à la culture 2D en raison de la toxicité de l’acrylamide, ignorant l’environnement biologique 3D précis que les CCN habitent50.

Malgré ces contraintes, ce système in vitro permet une méthode simple et peu coûteuse qui profite à tous les niveaux de recherche et permet aux chercheurs d’effectuer des tests en aval suffisants et fonctionnels. Comme on l’a vu dans des découvertes récentes, les CCN s’appuient fortement à la fois sur la signalisation mécanique, telle que la force de cisaillement et la rigidité du substrat, et sur la signalisation chimique, telle que la signalisation Wnt et le facteur de croissance des fibroblastes, dans le craniofacial,ainsique sur le développement cardiaque chez les vertébrés 6,15. En utilisant ce protocole, les microenvironnements locaux pour les expériences in vitro peuvent être facilement imités pour de futures études sur les CCN, y compris la différenciation, la migration, les réponses cellulaires et le potentiel de progression néfaste de la maladie. Par conséquent, ce système in vitro sera un outil puissant pour étudier les rôles de la signalisation mécanique dans les CCN et leurs interactions avec d’autres voies de signalisation, ce qui approfondira la compréhension des mécanismes moléculaires et génétiques du développement des CNC et des maladies connexes.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions la Dre Ana-Maria Zaske, opératrice de l’installation Atomic Force Microscope-UT Core au Centre des sciences de la santé de l’Université du Texas, pour l’expertise apportée en AFM dans ce projet. Nous remercions également J. Wang les sources de financement des National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 et R01HL142704).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip Chemglass Life Sciences CLS-1763-012
2% Bis-Acrylamide Sigma Aldrich M1533
24-well plate Greiner Bio-one 662165
25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip Chemglass Life Sciences CLS-1763-025
3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) Sigma Aldrich A3648
4-well cell culture plate Thermo Scientific 179830
4% Paraformaldehyde Sigma Aldrich J61899-AP
40% Acrylamide Sigma Aldrich A4058
50% glutaraldehyde Sigma Aldrich G7651
6-well cell culture plate Greiner Bio-one 657160
AFM cantilever (spherical bead) Novascan
AFM software Catalyst NanoScope Model: 8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher A12379
Ammonium Persulfate (APS) Sigma Aldrich 248614 Powder
anti-AP-2α Antibody Santa Cruz sc-12726
anti-Vinculin antibody Abcam ab129002
Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst Bruker Corporation
Collagen type I (100mg) Corning 354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher D1306
Dichloromethylsilane (DCMS) Sigma Aldrich 440272
Donkey serum Sigma Aldrich D9663
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Corning 10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV
Fluorescence microscope Leica Model DMi8
Fluoromount-G mounting medium SouthernBiotech 0100-35
HEPES Sigma Aldrich H3375 Powder
Horse serum Corning 35-030-CI
iScript Reverse Transcription Supermix Bio-Rad 1708841
Penicillin-Streptomycin antibiotic Thermo Fisher 15140148
RNeasy micro kit Qiagen 74004
Sterile 1x PBS Hyclone SH30256.02
Sterile deionized water Hardy Diagnostics U284
sulfo-SANPAH Thermo Fisher 22589
SYBR green Applied Biosystems 4472908
TEMED Sigma Aldrich T9281
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Tween 20 Sigma Aldrich P9416

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References

  1. Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
  2. Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
  3. Watt, K. E. N., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. Trainor, P. A. , Academic Press. 361-394 (2014).
  4. Lavelle, C. L. B. Applied oral physiology. , Butterworth-Heinemann. (1988).
  5. Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
  6. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  7. Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
  8. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
  9. Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
  10. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  11. Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
  12. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
  13. Lu, Y. -B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
  14. Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
  15. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  16. Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
  17. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  18. Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
  19. Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
  20. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10, Unit 10.16 (2010).
  21. Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
  22. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  23. Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
  24. Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
  25. Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
  26. Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
  27. Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
  28. Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
  29. Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
  30. Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
  31. Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
  32. Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
  33. Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
  34. Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze'ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
  35. Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
  36. Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
  37. Kuo, J. -C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
  38. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
  39. Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
  40. Lin, Y. -C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review E. 82 (4), 041918 (2010).
  41. Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
  42. Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
  43. McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
  44. Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
  45. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  46. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  47. Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  48. Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
  49. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  50. Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , Academic Press. 363-373 (2017).

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Biologie du développement numéro 174 cellules de la crête neurale signaux mécaniques cellules O9-1 microscopie à force atomique
Un système O9-1/Hydrogel optimisé pour l’étude des signaux mécaniques dans les cellules de la crête neurale
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Le, T. P., Zhao, X., Erhardt, S.,… More

Le, T. P., Zhao, X., Erhardt, S., Gu, J., Wang, H., Findley, T. O., Wang, J. An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells. J. Vis. Exp. (174), e62693, doi:10.3791/62693 (2021).

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