Summary
Bu protokol, perikard ve içeriğini korurken farelerde miyokard enfarktüsünü indükleme adımlarını özetlemektedir.
Abstract
Bu protokol, perikardın ve içeriğinin iskemik kemirgen modelinde (miyokard hasarını indüklemek için koroner ligasyon) önemli bir anti-fibrotik rol oynadığını göstermiştir. Klinik öncesi miyokard enfarktüsü modellerinin çoğu, homeostatik hücresel ortamın kaybıyla perikardiyal bütünlüğün bozulmasını gerektirir. Bununla birlikte, son zamanlarda, perikardiyal hasarı en aza indiren ve kalbin yerleşik bağışıklık hücresi popülasyonunu koruyan miyokard enfarktüsünü indüklemek için tarafımızdan bir metodoloji geliştirilmiştir. Koroner ligasyonu takiben sağlam bir perikardiyal boşluğa sahip farelerde iyileşmiş bir kardiyak fonksiyonel iyileşme gözlenmiştir. Bu yöntem, miyokard enfarktüsünü takiben perikardiyal boşluktaki enflamatuar yanıtları incelemek için bir fırsat sağlar. Etiketleme tekniklerinin daha da geliştirilmesi, fibroz da dahil olmak üzere kalpte yeniden şekillenmeyi sağlayan enflamatuar mekanizmaların düzenlenmesinde perikardiyal bağışıklık hücrelerinin kaderini ve işlevini anlamak için bu modelle birleştirilebilir.
Introduction
Bugüne kadar, kardiyovasküler hastalık (KVH) dünya çapında önde gelen ölüm nedeni olarak kabul edilmekte ve bu da önemli bir mali yüke ve hastanın yaşam kalitesinde azalmaya neden olmaktadır1. Koroner arter hastalığı (KAH), KVH'nin bir alt tipidir ve mortaliteye başlıca katkıda bulunan miyokard enfarktüsünün (MI) gelişiminde önemli bir rol oynar. Tanım olarak, MI, uzun süreli iskemi ve hipoksi koşullarına bağlı olarak miyokard dokusunda geri dönüşümsüz yaralanmadan kaynaklanır. Miyokard dokusu rejenerasyon kapasitesinden yoksundur, bu nedenle yaralanmalar kalıcıdır ve kalp kasının başlangıçta koruyucu olabilen fibrotik bir yara izi ile değiştirilmesine neden olur, ancak sonuçta olumsuz kardiyak yeniden yapılanmaya ve nihai kalp yetmezliğine katkıda bulunur2.
KAH hastalarının yönetimi son birkaç on yılda dramatik bir şekilde iyileşmiş olsa da, iskemiye sekonder kronik kalp yetmezliği (CHF) dünya çapında birçok hastayı etkilemektedir. Bu salgının önlenmesi ve yönetilmesi için altta yatan mekanizmaların daha kapsamlı anlaşılması ve yeni tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesi gerekmektedir. Ayrıca, geçmiş bulgular sistemik tedavinin sınırlılıklarını ve kesin alternatiflerin geliştirilmesinin gerekliliğini vurgulamaktadır. İnsanlarda MI'nin moleküler sekellerinin araştırılmasının enfarktüs dokusuna erişme yeteneğinden etkilendiği göz önüne alındığında, insan MI ve CHF'nin KVH ile ilgili özelliklerini ve gelişimini özetleyen hayvan modelleri vazgeçilmezdir.
İdeal hayvan modelleri, yapısal ve fonksiyonel özellikler açısından bir insan bozukluğuna çok benzediğinden, hastalık etiyolojisi anlayışlarına rehberlik etmelidir. KAH'da koroner arterlerin kronik aterosklerotik darlığı veya akut trombotik tıkanıklıktır. Koroner arter daralması veya tıkanmasını indüklemek için çeşitli laboratuvar hayvanı türlerinde farklı yöntemler geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Bu tür stratejiler genel olarak iki gruba ayrılabilir: (1) bir MI'yi indüklemek için bir koroner arterin mekanik manipülasyonu ve (2) bir MI'ye yol açan koroner daralmayı kolaylaştırmak için aterosklerozun hızlandırılması. İlk strateji genellikle bir koroner arterin bağlanmasını veya arter içine bir stent yerleştirilmesini içerir. İkinci yaklaşım, hayvanın diyetini yüksek yağlı / kolesterollü yiyecekleri içerecek şekilde değiştirmeye dayanma eğilimindedir. Bu ikinci yaklaşımın sınırlamalarından bazıları, koroner oklüzyonların zamanlaması ve yeri üzerinde kontrol eksikliğini içerir.
Buna karşılık, bir hayvan modelinde MI veya iskeminin cerrahi indüksiyonu, daha tekrarlanabilir sonuçlara yol açan konum, kesin zamanlama ve koroner olayın kapsamı gibi çeşitli avantajlara sahiptir. En sık kullanılan yöntem sol ön inen koroner arterin (LAD) cerrahi ligasyonudur. Bu tür modeller, akut iskemik hasara karşı insan tepkilerini ve CHF3'e ilerlemeyi özetlemektedir. Başlangıçta daha büyük hayvanlarda geliştirilen LAD ameliyatı, kemirgenler gibi küçük hayvanlar üzerinde teknolojideki ilerlemelerle daha uygulanabilir hale gelmiştir4. Bu tür modellerin oluşturulmasında, fareler göreceli mevcudiyetleri, konuttaki düşük masrafları ve genetik manipülasyon kapasiteleri de dahil olmak üzere çeşitli nedenlerle tercih edilmiştir.
LAD oklüzyonu kullanan iskemik kalp hastalığının çağdaş cerrahi modelleri, araştırmacının arteri geçici veya kalıcı olarak bağlamak için perikardın açılmasını gerektirir5. Bu tür stratejiler, uygun kalp fonksiyonunu sağlamak için esasen mekanik ve yağlama fonksiyonu oynayan perikardiyal boşluğun bozulmasına neden olur. Perikardın açılmasının bir diğer dezavantajı, hayvanın doğal perikardiyal sıvısını çeşitli hücresel ve protein bileşenleri ile kaybetmektir 6,7. Buna cevaben, perikardı sağlam tutarken MI'yi indüklemek için bir yöntem tarafımızdan geliştirilmiştir. Bu homeostatik ortamın bozulmasını en aza indirmenin yanı sıra, bu yaklaşım bir MI'ye neden olduktan sonra belirli hücrelerin etiketlenmesine ve izlenmesine izin verir. Ek olarak, bu yaklaşım insan ortamında miyokard iskemik hasarını daha iyi temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu deneyler için 8-14 haftalık erkek ve dişi C57BL/6J fareler kullanıldı. Bu protokol, Calgary Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi'nden etik onay almıştır ve tüm hayvan bakım kurallarına uymaktadır.
1. Fare hazırlığı ve ameliyatı
- Cerrahi aletleri sterilize edin (boncuk sterilizatörü veya otoklav yoluyla).
- Ameliyat öncesi ağırlık ve analjezik doz için fareyi tartın.
- Fareyi% 4 izofluran ve 800 mL / dak oksijen içeren bir indüksiyon kutusuna yerleştirin. Ayak parmaklarını sıkıştırarak ve hayvanı refleks eksikliği açısından gözlemleyerek anestezi düzlemini onaylayın.
- Analjezik subkutan olarak enjekte edin (0.1 mg / kg Buprenorfin) (bakınız Malzeme Tablosu).
- Ameliyat sırasında fareyi ısıtılmış bir cerrahi pedin üzerine yerleştirin ve burun konisi yoluyla verilen% 3 izofluran ile anesteziyi sürdürün. Her göze kuru gözlerden kaçınmak için oftalmik merhem uygulayın.
- Göğüs ve boyun cerrahi bölgelerindeki saçları tıraş edin.
- Farenin pençelerini kısıtlayın ve ameliyat masasına yerleştirin.
- Ağız ve farenks yoluyla trakeaya pürüzsüz uçlu 23 G kateter yerleştirerek fareyi entübe edin.
- Entübasyonu takiben fareyi, 110 nefes/dak hızında, 250 μL'lik bir gelgit hacminde ve 4 mmHg'lik pozitif ekspiratuar basınç (PEEP) olarak ayarlanmış ticari bir Vantilatör ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak taşıyıcı gaz olarak %2 izofluran ve %100 oksijen ile havalandırın.
- Ameliyat için göğsün sol tarafını konumlandırmak için fareyi% 30 sağ tarafına yuvarlayın.
- Cerrahi bölgeyi dairesel bir hareketle% 70 etanol ve betadin içeren 3 alternatif ovma ile temizleyin(bkz. Steril cerrahi örtüleri cerrahi alanın etrafına yerleştirin.
- Sol taraftaki pektoralis kaslarını görselleştirmek için göğüs derisinde 2-3 cm'lik bir yanal kesi yapın. Üçüncü ve dördüncü kaburgalar arasındaki interkostal kasları görselleştirmek için orta hattan dışa doğru 1 cm'lik bir kesi kullanarak pektoralis majör ve minörünü kesin.
NOT: Kanayan damarların koterizasyonu yoluyla pektoralis kasından aşırı kanamayı önlemek için özen gösterilmelidir. - Kalbin ve akciğerlerin cerrahi kesiden uzaklaşmasına izin vermek için göğüs boşluğuna hava (pasif hava hareketi ile) sokmak için sol interkostal kasta 2 cm'lik bir kesi yapın. Ayrıca, interkostal kesip kanamayı önlemek için bir koter cihazı yardımıyla açıklığı genişletin (bakınız Malzeme Tablosu)
NOT: Oksijenle patlayıcı reaksiyonları önlemek için koterizasyon döneminde ventilatör geçici olarak durdurulmalıdır. Perikardiyal keseye zarar vermemeye özen gösterilir. - Retraktörleri kullanarak, kalbi açığa çıkarmak için kaburgaları geri çekin.
- Perikardın ve altta yatan kalbin stereomikroskop altında gözlemlenmesini sağlayın.
NOT: Fare perikardi, kalbin vaskülatürünü görselleştirmek için yeterince incedir. - Hareketini ve altta yatan kalbin hareketini azaltmak için perikardın yüzeyine nazikçe forseps yerleştirin.
- Sol ön inen (LAD) koroner arteri, sol uzantının altından çıkışını izleyerek görsel olarak işaret eder.
- Mikro iğne sürücüsünü kullanarak, LAD ve perikardın diğer tarafında ortaya çıkan sütür ile LAD'nin altındaki perikard boyunca uygun bir sütürü ( Malzeme Tablosuna bakınız) yönlendirin. Koroner arterden kan akışını kısıtlamak için sütürü bağlayın ve fazla sütürü makas yardımıyla kesin (Şekil 1A).
NOT: Koroner artere kan akışını kısıtladıktan sonra, sol ventrikülün ön kısmının ağartılması görünür olmalıdır. Bu prosedür kalıcı bir ligasyon modelini temsil eder. Ancak bu aşamada farklı iskemi dönemlerine sahip geçici bir ligasyon yaklaşımı da uygulanabilir. - Steril bölgedeki kesi yerinin altında, göğsün içine perkütan olarak 24 G'lık bir kateter sürün (göğüs boşluğuna girdikten sonra kılavuz iğneyi çıkarın). Daha sonra, kaburgaları ve ardından kas katmanlarını ve cildi uygun bir dikiş (kas için konik bir iğne, cilt için geleneksel kesme iğnesi) kullanarak kapatın.
- Göğüs kapandıktan sonra, kalan havayı göğüs boşluğundan 24 G kateter aracılığıyla 3 mL'lik bir şırınga ve göğüs kompresyonları ile nazik bir emme kullanarak boşaltın. Hava çıkarıldıktan sonra, 24 G kateteri geri çekin.
- İzofluranı% 1'e düşürün.
- Farenin anesteziden kurtulmasını sağlamak için oksijenle havalandırmayı sürdürürken izofluranı kapatın. Hayvan bağımsız olarak nefes alma belirtileri gösterdiğinde, 23 G trakea tüpünü ağızdan çıkarın ve fareyi normal solunumun yeniden başlaması için izlenecek bir kurtarma kafesine yerleştirin.
- Harici bir ısı kaynağı sağlamak için kafesin bir kısmı bir ısıtma pedine yerleştirilerek farenin kafeste iyileşmesine izin verin.
- Ameliyat sonrası 72 saat boyunca her 12 saatte bir analjezik (Buprenorfin 0.1 mg / kg, deri altından) bakım enjeksiyonları sağlayın.
- Farelerin sağlık durumunu 7 gün boyunca günlük olarak izleyin, bu da insizyonları ve hayvan rahatsızlıklarını değerlendirmeyi içerir.
NOT: Bu prosedürün invazivliği nedeniyle (torakotomi), antibiyotik uygulaması gerekli olabilir.
2. Ekokardiyografi (EKG) ile kardiyak fonksiyonun fonksiyonel değerlendirilmesi
- Fareyi genel anestezi altında %1.5-2 izofluran ve 800 mL/dk oksijen ile indükleyin ve bakımını yapın.
- Fareyi ısıtılmış bir sahne platformunda sırtüstü konuma getirin ve pençeleri EKG uçlarına takın.
- Farenin göğsünü tıraş edin.
- 40 MHz lineer transdüser probu ve temas jeli kullanarak ekokardiyografi görüntüleri elde edin ve uygun yazılımla analiz edin (bkz.
- İzofluranı kapatın ve kafesi aktif bir duruma döndürmeden önce farenin ısıtma platformunda iyileşmesine izin verin.
NOT: Ekokardiyografi değerlendirmesi non-invazivdir ve bu nedenle koroner ligasyon öncesi ve sonrası değişiklikleri belirlemek için deney boyunca uzunlamasına yapılabilir.
3. Fibroz boyama için kalp dokusu toplama
- Fareleri% 100 CO2 soluyarak feda edin ve kalbi dikkatlice diseke edin.
NOT: Makas ve forseps kullanılarak bu, torasik boşluktaki dolaşım sisteminden serbest bırakmak için kalbe giren (vena kava, pulmoner ven) ve çıkan (pulmoner arter, aort) büyük damarların kesilmesiyle elde edilir. - Kalbi en az 24 saat boyunca% 10 formalin'de sabitleyin.
- Sağ ventrikül, interventriküler septum ve sol ventrikülden düz bir tıraş bıçağı kullanarak örnekleri kesin ve insizyonun enfarktüs bölgesinin merkezinden geçmesini sağlayın. Numuneler daha sonra parafin gömme için çekirdek tesise gönderilir.
- 5 μm kalınlığındaki doku kesitlerini bir mikrotomla kesin ve boyama için cam slaytlara yerleştirin.
- Ticari ksilen ve derecelendirilmiş alkol kullanarak deparafinize deparinize deiyonize su ile yıkayın (2x 99%, 1x95%, 1x 70%) ve daha sonra rehidrat.
- Oda sıcaklığında 2 saat boyunca pikrik asit içinde% 0.1 Sirius kırmızısı ile leke.
- Bölümleri 3 dakika boyunca %0,5 asetik asitle yıkayın ve 1 dakika boyunca %70 etanol ile durulayın.
- 3.4'te belirtilen ters yıkama sırasını kullanarak bölümleri kurutun, artan ve derecelendirilmiş etanol konsantrasyonları ve ardından ksilen.
- Mikroskobik değerlendirme için doku kesitlerini bir montaj çözeltisi ile monte edin (bkz.
4. Kalp ve perikardiyal kavite lavajının akış sitometrisi
- Fareleri% 100 CO2 inhalasyonu ile feda edin.
- Fareyi sırtına yerleştirin ve kolları ve bacakları bant kullanarak bir cerrahi tahtaya sabitleyin.
- Göğüs boşluğunun sol tarafını (deneyci görüşünden sağ taraf) dikkatlice açın, diyaframı yaklaşık orta noktaya kadar keserek başlayın ve daha sonra dış kaburgaları sternuma doğru kesin.
NOT: Büyük kan damarlarını, özellikle sternuma paralel olarak çalışanları çentiklemekten kaçının. - Altta yatan kalbi ve perikardı açığa çıkarmak için bir hemostat kullanarak kaburgaları geri çekin.
NOT: Perikard çok kırılgandır, bu nedenle kesim sırasında makasla yakalamadığınızdan emin olun. - Sol atriyum ve sol ventrikülün birleşme noktasına yakın perikardiyal boşluğa yerleştirilen bir PE-10 tüp ( bakınız Malzeme Tablosu) kateter kullanarak, perikardiyal boşluğa 100 μL steril salin enjekte edin.
- Tuzlu suyun kalbin arka tarafından birikmesine ve toplanmasına izin verin, işlem sırasında perikardın delinmemesine veya yırtılmamasına dikkat edin. Bu adımı iki kez tekrarlayın ve kalbi işlerken lavaj sıvısını buzun üzerine yerleştirin.
- Kalbe giren ve çıkan ana damarları (aort, pulmoner arter, ven ve vena kava) keserek kalbi tüketin. Sağ ve sol atriyumu çıkarın ve ventriküler kalp dokusunu tartın.
- Makas kullanarak dokuyu küçük 1mm2 parçalar halinde doğrayın ve 450 U/mL kollajenaz I, 125 U/mL kollajenaz XI, 60 U/mL DNaz I ve PBS'de 60 U/mL hyaluronidaz içeren 10 mL sindirim tamponuna orbital çalkalayıcı üzerinde 37 °C'de 1 saat boyunca yerleştirin.
- Kalp dokusu homojenlerini 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve kardiyak parankimal hücreleri çıkarmak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 60 x g'de aşağı doğru döndürün.
- Süper natantı toplayın, tek bir hücre süspansiyonu için 40 μm'lik bir hücre süzgecinden (Malzeme Tablosuna bakınız) geçin ve hücreleri peletlemek için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de aşağı doğru döndürün.
- Daha önce tarif edildiği gibi perikardiyal ve kardiyak hücreler üzerinde hücresel belirteçlerin fragman kristalize edilebilir (Fc) reseptör blokajını ve boyanmasını gerçekleştirin8.
- Örnekleri bir akış sitometresinde çalıştırın.
5. Perikard makrofajının plevral boşluğa interkostal yaklaşım (ICAPS) yöntemi kullanılarak etiketlenmesi9
- Cerrahi aletleri sterilize edin (boncuk sterilizatörü veya otoklav yoluyla) ve başlamadan önce% 70 etanol püskürtün.
- Fareyi genel anestezi altında %1.5-2 izofluran ve 800 mL/dk oksijen ile indükleyin ve bakımını yapın. Ayak parmaklarını sıkıştırarak ve hayvanı refleks eksikliği açısından gözlemleyerek anestezi düzlemini onaylayın.
- Analjezik subkutan olarak enjekte edilir (Buprenorfin 0.1 mg / Kg).
- Ameliyat sırasında fareyi ısıtılmış bir cerrahi pedin üzerine yerleştirin.
- Sağ anterolateral torasik bölgeyi tıraş edin.
- Cerrahi bölgeyi etanol ve betadin ile temizleyin.
- Deride 3 cm uzunluğunda bir kesi yapın ve forseps ile göğüs kafesini açığa çıkarın.
- 5 μL floresan boncuk (ticari olarak temin edilebilen floresan mikrosferler, 1 μm, bakınız Malzeme Tablosu) ve 45 μL salin, eğimli uçlu bir PE-10 tüp şırınga kateterine yükleyin.
- Kateteri daha önce tarif edildiği gibi interkostal boşluğa yönlendirin9, boncuk çözeltisini yavaşça enjekte edin ve kateteri tek bir hareketle çıkarın.
- Zımbaları kullanarak cildi kapatın.
NOT: Kesinin potansiyel olarak yeniden açılmasını en aza indirmek için dikiş yerine zımbalar kullanılır. - İzofluranı kapatın, fareyi kurtarma kafesine yerleştirin ve ilk 24 saat boyunca komplikasyonları izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu modifiye koroner ligasyon modeli, tekrarlanabilirlik ve hayvan hayatta kalma sağlamak için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, kalpte indüklenen önemli yaralanma nedeniyle, beklenen bazı intraoperatif ve postoperatif mortalite prosedürle ilişkilidir. Standart mortalite tipik olarak erkeklerde (~% 25-35) kadınlardan (~% 10-15) daha yüksektir.
Bir MI'nin modifiye koroner ligasyon ile başarılı bir şekilde indüklenmesi, kalbin fonksiyonel parametrelerindeki ve yapısal özelliklerindeki değişikliklerle açıkça görülmelidir. Fonksiyon için, ekokardiyografi ile değerlendirilen sol ventrikül (LV) ejeksiyon fraksiyonu gibi parametrelerdeki azalmalar, MI sonrası 3-4 hafta içinde fark edilecektir (Şekil 1A). Bu fonksiyonel değişikliklere, pikrosirius kırmızısı (PR) gibi histolojik boyama ile değerlendirildiği gibi, LV'nin serbest duvarının belirgin fibrozisi eşlik etmelidir (Şekil 1B). Bu analiz için, enfarktüs yoluyla uzunlamasına kesitlerin kullanılması, enfarktüslü bölgenin, peri-enfarktüsün ve kalbin uzak bölgelerinin temsiline izin vermelidir.
İşlem boyunca sağlam bir perikardın korunması, perikardiyal boşluktaki eşzamanlı enflamatuar yanıtı incelemek için bir fırsat sağlar. Ayrıca, bu bölmedeki bağışıklık hücrelerinin devam eden yeniden yapılanma süreçlerine nasıl katkıda bulunabileceğini belirlemeye de izin verir. Floresan boncuk etiketleme yöntemini akış sitometrisi analizi ile birleştirmek, yüksek seçiciliğe sahip yerleşik Gata6 + perikardiyal makrofajlar (GPCM'ler) ile izlemek için bir yaklaşım sağlar. Bu prosedür, boncukların doğrudan plevral boşluğa enjekte edilmesini içerir. Bunlar, bu iki boşluk arasındaki iletişim nedeniyle hem plevral hem de perikardiyal boşluklarda yerleşik Gata6 makrofajları tarafından eşit olarak alınır (Şekil 2A)10. Önemli olarak, kalpte veya kanda çok az veya hiç etiketleme tespit edilmemelidir (Şekil 2A). Etiketlendikten sonra, MI gibi enflamatuar zorlukları takiben hücrelerin yer değiştirmesi, akış sitometrisi (Şekil 2B) ve / veya görüntüleme ile izlenebilir. ICAPS prosedüründen kaynaklanan potansiyel enflamatuar etkilerden kaçınmak için, bu etiketleme sonraki müdahalelerden bir hafta önce yapılmalıdır.
Şekil 1: Sağlam perikardiyal koroner ligasyon modeli kalpte fonksiyonel ve yapısal değişikliklere neden olur. (A) Şematik zaman çizelgesi ve AG ejeksiyon fraksiyonu başlangıçta veya koroner ligasyondan 4 hafta sonra bozulmuş veya bozulmamış perikardlı hayvanlar için nicelleştirme. Veriler ortalama ± SD olarak gösterilir. ***= p < 0.001, *= p < 0.05 vs taban çizgisi, tek yönlü ANOVA. Deniset JF ve arkadaşlarından Elsevier8'in izniyle uyarlanmıştır. (B) Enfarktüsten 4 hafta sonra fare kalp kesitlerinde pikrosirius kırmızı fibroz boyamasının temsili görüntüleri ve miktarı, bozulmuş veya bozulmamış perikardiyal koroner ligasyon modelleri ile. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: MI'yi takiben perikardiyal kavite makrofajlarının etiketlenmesi ve izlenmesi . (A) ICAPS yöntemi kullanılarak lokal floresan boncuk enjeksiyonundan 7 gün sonra plevral boşluktan, perikardiyal boşluktan, kalp dokusundan ve kandan miyeloid hücreler içeren floresan boncuğun temsili akış sitometri grafikleri. Alt paneller - Perikard boşluğundaki boncuk ve hücrelerin ağırlıklı olarak Gata6 + perikardiyal makrofajlar (GPCM'ler) olarak karakterizasyonu. (B) MI'li veya MI'siz perikardiyal boşluk ve kalpteki floresan boncuk etiketli perikardiyal miyeloid hücrelerin akış sitometrisi analizi ve miktarı. *= p < 0.05, ** = p < 0.01. Deniset JF ve arkadaşlarından Elsevier8'in izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kemirgenlerde kapalı bir perikardda bir MI'yi indüklemek benzersizdir ve potansiyel olarak önemli uygulamalara sahip olabilir. Prosedür, cerrahın kemirgen modeline ve kemirgen kalp anatomisine aşinalığına büyük ölçüde dayanır. Başarı aynı zamanda üç kritik adımda verilen bakıma da bağlıdır: interkostal kas insizyonu ve kaburga retraksiyonu (Adım 1.11-1.13), enfarktüsün oluşturulması (Adım 1.17) ve hayvan iyileşmesi (Adım 1.22-1.24).
Torakotomi, perikardın delinmesini veya yırtılmasını önlemek için özenle yapılmalıdır. Bu protokolün en önemli adımı, enfarktüsü indüklemek için LAD'nin dikilmesidir. Tüm LAD ligasyon modellerinde olduğu gibi, ligasyon sütürünün LAD üzerine uygun şekilde yerleştirilmesi kritik öneme sahiptir: proksimal ligasyon ölümcül bir MI ile sonuçlanabilirken, distal ligasyon fonksiyonel olarak ilgili bir MI'ye neden olmayabilir. LAD ligasyonu kalp atışı ile yapıldığından, kalbin forseps ile hafifçe stabilize edilmesi, hareketi en aza indirmeye yardımcı olabilir ve LAD'nin zarar görmeden dikilmesine izin verebilir. Bu işlem sırasında epikarddaki küçük damar yırtılmaları meydana gelebilir. Küçük kanamalar 2-3 gün içinde çözülecek ve perikardiyal sıvıyı kirletmeyecek. Kemirgen perikard, özellikle farelerde, çok incedir ve cerrah dikkatli olmazsa kolayca yırtılabilir. Son olarak, operatör prosedür sonrası (yani iyileşme) aşamada hayvana çok dikkat etmelidir. İzofluranın durdurulması ve endotrakeal tüpün çıkarılmasının zamanlaması, kemirgenin kendi kendine havalandırılabilmesini sağlamak için metodik olarak yapılmalıdır. Fare, ameliyat sonrası komplikasyonların hayvan barınma tesislerine yerleştirilmeden önce derhal müdahale gerektirmediğinden emin olmak için iyileşmeden sonra da izlenmelidir. Bu komplikasyonlara örnek olarak hemotoraks, pnömotoraks ve anestezi sonrası bilincin yeniden kazanılamaması verilebilir.
MI'nin en güncel fare modelleri, LAD'yi bağlamak için perikardın açılmasını gerektirir ve bu da bozulmamış bir perikard ile sonuçlanır. Mevcut model, enfarktüs sırasında perikardiyal boşluğun homeostatik yönünü koruduğu için benzersizdir, bu nedenle bir MI'nin klinik olarak daha alakalı bir temsilini sağlar. perikardiyal boşluğun korunması, perikardın bölünmesini sağlayan prosedürlere kıyasla fare kalbinin fonksiyonel özelliklerinin iyileştirilmesine neden olur. Doğal perikardiyal sıvının korunması, enfarktüs iyileşmesinin yanı sıra araştırma olanaklarına da önemli faydalar sağlar. İntra-perikardiyal basınç anlamlı11,12 iken, perikardiyal sıvı fibrotik olmayan iyileşme yollarını destekleyen proteinler içerir13. Son zamanlarda yapılan araştırmalar, perikardiyal sıvıda bulunan makrofajların da kalp dokusu onarımı ve iyileşmesinde önemli bir rol oynadığını ortaya koymuştur8. Geçerli protokol, MI'yi takip eden bu makrofajların kaderini izlemek için belirli bir etiketleme yöntemi sağlar. Perikard boşluğundaki diğer hücreler, kardiyak yeniden şekillenmedeki rollerini değerlendirmek için benzer şekilde etiketlenebilir. Perikardın korunmasını sağlayan hayvan modelleri, bu önemli yolları daha iyi koruyabilir ve bu da onları hastaların patofizyolojisinin ve iyileşme süreçlerinin daha doğru bir temsili haline getirebilir.
Bu model, kullanıcının tüm perikardiyal alanı incelemesine ve manipüle etmesine izin vererek, perikardiyal hücrelerin aracılık ettiği karmaşık iyileşme ve enflamatuar yolları araştıran araştırmaları güçlendirir. Bu model aynı zamanda perikardiyal alana odaklanmayan araştırmalar için geliştirilmiş bir kemirgen enfarktüs modeli sağlar. Korunmuş perikardiyal yaralanma yolakları, enfarktüslerin daha fazla insan ilgisine sahip olmasını sağlar. Bu modelin önemli sınırlamaları, teknik doğası nedeniyle kullanıcı becerisinde yatmaktadır. Cerrah doku kullanımı ve cerrahi tekniklerde uzman değilse, hatalar yırtık bir perikard veya mortaliteye neden olabilir. Son olarak, bu protokolün avantajlarından yararlanmak için, kullanıcılar ekokardiyografi ve mikroskopi gibi yerleşik ve gelişmiş görüntüleme yöntemlerini kullanabilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklanacak herhangi bir çatışması yoktur.
Acknowledgments
Hiç kimse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Steri-350 Bead Sterilizer | Inotech | NC9449759 | |
| 10% Formalin | Millipore Sigma | HT501128-4L | |
| 40 µm Cell strainer | VWR | CA21008-949 | Falcon, 352340 |
| 70 µm Cell strainer | VWR | CA21008-952 | Falcon, 352350 |
| ACK Lysis Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| BD Insyte-W Catheter Needle 24 G X 3/4" | CDMV Inc | 108778 | |
| Betadine (10% povidone-iodine topical solution) | CDMV Inc | 104826 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11000-12 | |
| BNP Ophthalmic Ointment | CDMV Inc | 17909 | |
| Castroviejo Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12061-01 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| Collagenase I | Millipore Sigma | SCR103 | |
| Collagenase XI | Millipore Sigma | C7657 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture - CV-11 taper needle | Medtronic Canada | GL-890 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture - PC-13 cutting needle | Medtronic Canada | SL-1659 | |
| Curved Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11009-13 | |
| Dako Mounting Medium | Agilen | CS70330-2 | |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | |
| Ethanol, 100% | Millipore Sigma | MFCD00003568 | |
| Ethicon 8-0 Ethilon Suture - BV-130-4 taper needle | Johnson & Johnson Inc. | 2815G | |
| Fiber-Optic Light | Nikon | 2208502 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | FST 11150-10 | |
| Fluoresbrite® YG Carboxylate Microspheres 1.00 µm | Polysciences, Inc. | 15702 | |
| Geiger Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments | 501293 | Model 150-ST |
| Hyaluronidase | Millipore Sigma | H4272 | |
| Isofluorane Vaporizer | Harvard Apparatus | 75-0951 | |
| Isoflurane USP, 250 mL | CDMV Inc | 108737 | |
| Magnetic Fixator Retraction System | Fine Science Tools | 18200-20 | |
| MX550D- 40 MHz probe | Fujifilm- Visual Sonics | ||
| Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12002-12 | |
| PE-10 Tubing | Braintree Scienctific, Inc. | PE10 50 FT | |
| Scissors | Fine Science Tools | FST 14184-09 | |
| SMZ-1B Stereo Microscope | Nikon | SMZ1-PS | |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | |
| Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorphine)) | CDMV Inc | 124918 | controlled drug |
| Vevo 2100 Software | Fujifilm-Visual Sonics |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141, 139 (2020).
- Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3 (6), eCollection 2018 (2018).
- Bayat, H., et al. Progressive heart failure after myocardial infarction in mice. Basic Research in Cardiology. 97 (3), 206-213 (2002).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. 52, 2581 (2011).
- De Villiers, C., Riley, P. R. Mouse models of myocardial infarction: comparing permanent ligation and ischaemia-reperfusion. Disease Models & Mechanisms. 13 (11), (2020).
- Borlaug, B. A., Reddy, Y. N. V. The role of the pericardium in heart failure: Implications for pathophysiology and treatment. JACC Heart Failure. 7 (7), 574-585 (2019).
- Pfaller, M. R., et al. The importance of the pericardium for cardiac biomechanics: from physiology to computational modeling. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 18 (2), 503-529 (2019).
- Deniset, J. F., et al. Gata6(+) Pericardial Cavity Macrophages Relocate to the Injured Heart and Prevent Cardiac Fibrosis. Immunity. 51 (1), 131-140 (2019).
- Weber, G. F. Immune targeting of the pleural space by intercostal approach. BMC Pulmonary Medicine. 15, 14 (2015).
- Nakatani, T., Shinohara, H., Fukuo, Y., Morisawa, S., Matsuda, T. Pericardium of rodents: pores connect the pericardial and pleural cavities. The Anatomical Record. 220, 132-137 (1988).
- Tyberg, J. V., et al. The relationship between pericardial pressure and right atrial pressure: an intraoperative study. Circulation. 73, 428-432 (1986).
- Hamilton, D. R., Sas, R., Semlacher, R. A., Kieser Prieur, T. M., Tyberg, J. V. The relationship between left and right pericardial pressures in humans: an intraoperative study. The Canadian Journal of Cardiology. 27, 346-350 (2011).
- Park, D. S. J., et al. Human pericardial proteoglycan 4 (lubricin): Implications for postcardiotomy intrathoracic adhesion formation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 156 (4), 1598-1608 (2018).
