En in vivo musemodell av total intravenøs anestesi under kreftreseksjonskirurgi

Summary

Denne artikkelen beskriver en metode for modellering av total intravenøs anestesi (TIVA) under kreftreseksjonskirurgi hos mus. Målet er å replikere viktige trekk ved anestesilevering til pasienter med kreft. Metoden gjør det mulig å undersøke hvordan anestesiteknikk påvirker tilbakefall av kreft etter reseksjonskirurgi.

Abstract

Anestesi er en rutinemessig komponent i kreftomsorg som brukes til diagnostiske og terapeutiske prosedyrer. Bedøvelsesteknikken har nylig vært involvert i å påvirke langsiktige kreftutfall, muligens gjennom modulering av adrenerge-inflammatoriske responser som påvirker kreftcelleadferd og immuncellefunksjon. Nye bevis tyder på at propofolbasert total intravenøs anestesi (TIVA) kan være gunstig for langsiktige kreftutfall sammenlignet med inhalert flyktig anestesi. De tilgjengelige kliniske funnene er imidlertid inkonsekvente. Prekliniske studier som identifiserer de underliggende mekanismene som er involvert, er kritisk nødvendig for å veilede utformingen av kliniske studier som vil fremskynde innsikt. De fleste prekliniske modeller av anestesi har blitt ekstrapolert fra bruk av anestesi i in vivo forskning og er ikke optimalt designet for å studere virkningen av anestesi i seg selv som det primære endepunktet. Dette papiret beskriver en metode for å levere propofol-TIVA anestesi i en musemodell av brystkreftreseksjon som replikerer viktige aspekter ved klinisk levering hos kreftpasienter. Modellen kan brukes til å studere virkningsmekanismer for anestesi på kreftutfall i ulike krefttyper og kan ekstrapoleres til andre ikke-kreftområder av preklinisk anestesiforskning.

Introduction

Mer enn 60% av pasientene med kreft får anestesi for kirurgisk reseksjon¹. For tiden er det ingen spesifikke kliniske retningslinjer som bestemmer valg av anestesi som brukes hos kreftpasienter. Undersøkelser av anestesileger indikerer en preferanse for flyktig basert anestesi, inkludert under kreftoperasjon ^2,3. Imidlertid er det en økende mengde bevis for at bruk av propofolbasert total intravenøs anestesi (TIVA) under kreftkirurgi kan assosiere med forbedrede postoperative utfall (progresjonsfri overlevelse, total overlevelse) sammenlignet med flyktig anestesi⁴. Senere kliniske studier fortsetter å rapportere motstridende resultater 5,6,7,8. Disse funnene støtter behovet for prekliniske studier for bedre å forstå de mekanistiske effektene av forskjellige bedøvelsesmidler på kreftrelaterte utfall.

Men i in vivo studier som modellerer kreftkirurgi, er anestesi ofte en tilfeldig del av prosedyren. Begrunnelsen for valg av anestesi er ofte ikke fokus for det eksperimentelle designet, og dets innvirkning på kreftrelaterte endepunkter kan ikke evalueres. For eksempel, in vivo studier som krever vedlikehold av anestesi for kreft kirurgi oftest bruker inhalert flyktig anestesi⁹. Når propofol har blitt brukt in vivo studier, har det blitt gitt ved enkel bolusdosering med intraperitoneal levering, som ikke replikerer kliniske onkobedøvelsesprotokoller¹⁰. Denne tilnærmingen til propofoladministrasjon induserer lett anestesi som er egnet for raske prosedyrer. Det tillater imidlertid ikke vedlikehold av anestesi som er nødvendig for kreftreseksjonskirurgi som kan være langvarig. Videre er absorpsjonskinetikken ved intraperitoneal levering forskjellig fra kliniske administrasjonsmetoder.

En modell av propofolbasert TIVA for kreftreseksjonskirurgi ble utviklet for å møte dette behovet. En protokoll for vedvarende vedlikehold av anestesi med titrering av bedøvelsesmiddelet for å tillate respons på kirurgisk stimulus ble utviklet for å replikere viktige aspekter ved bedøvelseslevering til pasienter som har kreftkirurgi. Den resulterende protokollen brukes med en musemodell av kreft for å gi TIVA under kreftreseksjonskirurgi. Effekten på kortsiktige og langsiktige kreftrelaterte utfall evalueres.

Protocol

Alle dyreforsøk ble gjennomført under godkjenning av Institutional Animal Care and Use Committee ved Monash University. I denne studien ble kvinnelige Balb / c-mus i alderen 6-8 uker brukt.

1. Forbered kreftceller

1. Kulturtumorceller i medium. Kultur 66cl4 murine brystkreftceller i alfa-MEM som inneholder 10% FBS og 200 mM glutamin. Celler skal tekste negativt for mykoplasma. VALGFRITT: Bruk celler som er stabilt transdusert for å uttrykke firefly luciferase for bioluminescensavbildning for å muliggjøre overvåking av tilbakefall av kreft etter reseksjonskirurgi¹¹ (se trinn 4).
   MERK: Cellelinjen og mediet nevnt ovenfor ble brukt i denne studien.
2. Dyrk celler ved 37 °C med 5 % CO₂. Passasjeceller aseptisk i en hette ved <80% sammenløp. Bruk celler med lav passasje i den logaritmiske vekstfasen for optimale in vivo-resultater .
3. Løft de tilhørende cellene med 0,5 mg / ml trypsin i PBS med 10 mM EDTA; 2 ml for en T75-kolbe. Når løftet, legg til medium for å inaktivere trypsin, og vask cellene i PBS.
4. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer. Fortynn cellene i PBS til injeksjon. For 66cl4 mammary kreftceller, injiser 1 x 10⁵ celler i 20 μL PBS per mus.
5. Legg cellene på is før injeksjonen.

2. Generer en musemodell av brystkreft

1. Bruk 4% isofluran til å bedøve musen i et induksjonskammer. Deretter opprettholder anestesi med 2% -3% isofluran ved hjelp av en nesekegle. Bekreft riktig bedøvelse ved manglende respons på tåklemme.
2. Forbered injeksjonsstedet ved å tørke av det fjerde venstre brystfettblokkområdet ved hjelp av en engangs alkoholpinne.
3. Trekk opp tumorceller (se trinn 1.4) i en 25 μL Hamilton sprøyte festet til en steril 27 G hypodermisk nål.
4. Injiser cellene i den fjerde venstre brystfettputen. Bruk tang for å sikre og løfte huden. Injiser ca. 1 mm fra brystvorten.
5. VALGFRITT: Hvis celler er merket med luciferase, bekreft vellykket injeksjon av tumorceller ved bioluminescensavbildning. Injiser 100 μL 150 mg/kg D-luciferin i sidehalvenen til de bedøvede musene ved hjelp av en 0,5 ml insulinsprøyte med en 30 G hypodermisk nål.
6. VALGFRITT: Plasser musen i et bioluminescensavbildningssystem med brystfettblokken vendt opp. Vent i 2 minutter fra luciferininjeksjonen for optimalt vevopptak av luciferin, deretter bilde i 10 s.
7. Plasser musen i et rent bur og la det komme seg fra anestesi.
8. Fortsette å overvåke dyrevelferd i henhold til institusjonens dyreetiske retningslinjer.

3. Indusere stabil anestesi med intravenøs levering av propofol

1. Overvåk veksten av den primære svulsten ved hjelp av tykkelsesmåling og beregn tumorvolumet ved hjelp av ligningen: Volum (mm³) = (lengde x (bredde) 2 ÷ ² ).
2. Utfør tumorreseksjonskirurgi på mus når den primære svulsten når ønsket volum (her, 80-90 mm³).
3. Sett opp en automatisert sprøytepumpe med en 30 G 1 ml insulinsprøyte som inneholder propofolformulering (2 % Lipuro propofol) (figur 1A).
4. Induser musebedøvelse i et induksjonskammer med 3 % sevofluran eller isofluran.
   MERK: Her ble sevofluran brukt da dette er den dominerende flyktige som brukes klinisk.
5. Overfør musen til en 37 °C varmepute under hele operasjonen. Oppretthold anestesien kort med 2%-3% sevofluran ved bruk av en nesekegle.
6. Påfør vandig smøremiddel på øynene for å forhindre tørking.
7. Injiser 0,05 mg/kg buprenorfin subkutant for analgesi.
8. For å forberede seg på kirurgi, barber magen og forbered huden på kirurgi med en jod-povidonløsning. Tørk av huden med en alkohol eller steril våtserviett.
9. For å levere propofolbasert TIVA kanyleres laterale halevene ved hjelp av en steril 30 G hypodermisk nål festet til et sterilt polyuretankateter. Bekreft riktig plassering ved blodtilbakeblikk i kateteret (figur 1B). Juster tilførselen av sevofluran etter behov under intravenøs kanylering for å opprettholde en stabil anestesidybde påvist ved tap av hornhinne- og pedalrefleks, og respirasjonsfrekvens < 100 pust per minutt.
10. Start propofol-TIVA ved å administrere 2% propofol som en innledende bolus på 27 mg / kg i over 1 min. Avslutt administrasjonen av sevofluran.
11. Fortsett infusjonen av propofol med en vedlikeholdshastighet på 2,2-4,0 mg/kg/min for å opprettholde en stabil anestesidybde i løpet av operasjonen (figur 1C).

4. Resect den primære svulsten

1. Lag et rett 1 cm snitt dårligere enn svulsten i regionen av venstre fjerde brystfettpute. Resect forsiktig svulsten og venstre inguinal lymfeknute ved hjelp av disseksjon med stump tang.
2. VALGFRITT: Hvis du bruker luciferase-merkede tumorceller, bruk bioluminescensavbildning for å bekrefte klare kirurgiske marginer. Injiser 150 mg / kg D-luciferin i lateral hale vene, vent i 2 min, og deretter bilde i 60 s ved hjelp av en bioluminescens imaging system. Hvis en gjenværende svulst er identifisert, resekter ytterligere vev fra brystfettputen og re-image for å oppnå klare marginer.
3. Sørg for hemostase på operasjonsstedet og lukk huden med 5-0 nylonsuturer. Sørg for at pelsen ikke kommer inn på operasjonsstedet.
4. Ved avslutningen av reseksjonskirurgi, opphøre anestesi. Plasser musen i et rent bur på en 37 °C varmepute og la den komme seg etter anestesi.
5. Overvåk hvert 15. minutt etter anestesi til musen har gått tilbake til normal årvåkenhet. Deretter må du overvåke musen hver 12. time i 48 timer etter operasjonen.
6. Administrer 0,05 mg/kg buprenorfin subkutant hver 12. time i 48 timer etter operasjonen.
7. Etter 7-10 dager, fjern suturer ved hjelp av sterile buede sømkuttere under kort sevofluran eller isofluranbedøvelse.

5. Spor tilbakefall av kreft med in vivo bildebehandling

1. Bruk bioluminescensavbildning for å spore tilbakefall av kreft etter reseksjonskirurgi ikke-invasivt. Bruk et bioluminescensavbildningssystem for å overvåke musene en gang i uken for tegn på primær tumortilbakefall eller fjernt tilbakefall, som begynner uken etter operasjonen.
2. Induser anestesi av musen i et induksjonskammer med 4% isofluran. Overfør deretter musen til en 37 ° C varmepute i løpet av anestesien og opprettholde anestesi med 2% -4% isofluran ved hjelp av en nesekegle.
3. Påfør vandig smøremiddel på øynene for å forhindre tørking.
4. Injiser D-luciferin 150 mg/kg i lateralis halen. Vent i 2 minutter, og mål deretter bioluminescens over en 60 s eksponering for å oppdage tilbakefall av primærtumoren eller fjernmetastase.
5. Hvis den primære svulsten oppstår igjen og blir palpabel, start overvåking av tumorvekst ved hjelp av kalipermålinger.
6. På slutten av forsøket dreper musene humant i henhold til den godkjente protokollen. Her ble CO₂ brukt, etterfulgt av cervikal dislokasjon.

Representative Results

Denne metoden beskriver en modell av total intravenøs anestesi (TIVA) med propofol under kreftreseksjonskirurgi hos mus. Propofol leveres i denne musemodellen gjennom et intravenøst kateter ved hjelp av en sprøytepumpe (figur 1A, B) for å replikere levering av TIVA i den kliniske innstillingen av anestesi for kreftkirurgi. Bruk av sprøytepumpen minimerer eksponering for flyktig anestesi ved å tillate rask konvertering fra første induksjon ved inhalasjonsanestesi til intravenøs levering.

Etter stabil anestesi ble oppnådd ved propofolbasert TIVA, ble den primære brysttumoren resektert. In vivo bioluminescenstomografi ble brukt for å bekrefte fullstendig reseksjon av primærtumor (figur 2). Regelmessig monitorering av mus ved ikke-invasiv in vivo bioluminescensavbildning identifiserte fjernt tilbakefall ved luciferase-merkede tumorceller i lungen (figur 2). Denne metoden er også egnet til å spore lokalt tilbakefall i brystfettblokken.

I tillegg til å spore langsiktige hendelser som tilbakefall, kan modellen brukes til å vurdere hendelser som oppstår i den perioperative perioden. Disse tidlige hendelsene kan gi mekanistisk innsikt i effekten av anestesi og andre kirurgiske faktorer på kreftrelaterte utfall. Tjuefire timer etter kreftoperasjonen under propofol ble det brukt multipleks enzymbundet immunosorbentanalyse for å kvantifisere sirkulerende plasmacytokiner (figur 3). Cytokiner ble evaluert hos 7 mus; Den aktuelle gruppestørrelsen påvirkes av effektstørrelsen for interessepunktet.

Figur 1: Eksperimentelt oppsett for propofolbasert TIVA . (A) En sprøytepumpe brukes til å sikre kontrollert tilførsel av propofol fra en 1 ml insulinsprøyte. (B) Propofol leveres inn i laterale halevenen ved intravenøst kateter, koblet til en sprøytepumpe, via en 30 G nål. Stjernen viser nålestikkpunktet. (C) Skjematisk fremstilling av plasmakonsentrasjonen av propofol oppnådd ved sekvensiell administrering av en bolus etterfulgt av en konstant infusjon ved bruk av sprøytepumpen, sammenlignet med tilførsel kun ved bolus eller infusjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Kreftprogresjon etter kirurgisk reseksjon av primær brysttumor under propofolbasert TIVA. Ikke-invasiv bioluminescensavbildning av luciferase-merkede tumorceller ble brukt til å spore innledende vekst av primærtumorvekst, vellykket kirurgisk reseksjon og påfølgende fjernt tilbakefall til lungen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Sirkulerende cytokinverdier målt etter kreftreseksjon under propofolbasert TIVA. Multiplex enzymbundet immunosorbentanalyse ble brukt til å kvantifisere plasmacytokiner 24 timer etter operasjonen. Hvert datapunkt representerer data fra én mus. Linjer viser middelverdi og standardfeil (N = 4-7). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne studien rapporterer om en protokoll for administrering av total intravenøs anestesi (TIVA) med propofol i en musemodell av brystkreft som replikerer viktige aspekter ved klinisk praksis for TIVA hos pasienter som krever kreftkirurgi. Protokollen tillater undersøkelse av både kortsiktige og langsiktige klinisk relevante utfall etter kreftkirurgi i en musemodell for kreftprogresjon, inkludert måling av cytokinnivåer og tilbakefall av kreft (figur 2 og figur 3). Metoden vil være nyttig for evaluering av effekten av TIVA på kreftrelaterte utfall og dens sammenligning med andre bedøvelsesteknikker som flyktig anestesi.

I motsetning til eksisterende protokoller som leverer en enkelt intraperitoneal bolus av propofol for sedasjon under mindre inngrep som blodprøvelevering¹⁰, tillater denne protokollen langvarig intravenøs tilførsel av propofol for vedlikehold av anestesi under større inngrep som kirurgi. Både induksjons- og vedlikeholdsdosen av propofol ble nøye titrert for å optimalisere anestesidybden egnet for større kirurgiske inngrep, samtidig som dødeligheten av hypotensjon eller hjertestans ble minimert. Det ble funnet at hypotensjon kunne unngås ved bruk av en streng induksjonsdose på 27 mg/kg administrert over 60 s, med samtidig nedtitrering og seponering av inhalert sevofluran. Vedlikehold ble oppnådd ved infusjon av propofol 2,2-4,0 mg/kg/min. Under større kirurgiske inngrep, som kreftreseksjon, var titrering innenfor dette området viktig for å respondere på og dempe omfanget av kirurgisk stimulering. Dette replikerer klinisk praksis og forhindrer enten overdoseringsbedøvelse, noe som kan resultere i hypotensjon eller død, eller underdosering, noe som kan føre til fremvekst fra anestesi, bevegelse eller kirurgisk stress.

En begrensning av modellen er kort bruk av flyktig anestesi for å indusere anestesi før kanylering. Denne tilnærmingen ble valgt på grunn av enkel kanylering etter induksjon av anestesi, slik at rask levering av en terapeutisk dose propofol kan fortsette anestesi. I tillegg ble mus kort bedøvet med flyktig anestesi for tumorcelleinokulasjon, for å fjerne sutur og for avbildning. Sevofluran ble brukt i flyktig anestesi under reseksjonskirurgi, da det ofte brukes i klinisk praksis. Isofluran brukes imidlertid også i klinisk praksis. Fremtidige studier kan bruke et enkelt middel for alle episoder av inhalasjonsanestesi. Med erfaring gikk mindre enn 2 minutter fra tap av rettingsrefleks som respons på flyktig anestesieksponering til oppstart av propofoldosering. Ikke desto mindre, for analyser som har til hensikt å sammenligne propofolbasert TIVA med inhalasjonsflyktige anestesiteknikker, kan tolkningen bli forvirret av selv kortvarig bruk av flyktig anestesi.

En alternativ tilnærming til flyktig anestesiinduksjon er å kanylere den laterale halevenen til en våken mus. Selv om det ikke er egnet for alle situasjoner, kan dette gi et alternativ til induksjon ved inhalasjonsanestesi. Imidlertid kan bevegelse av den våkne musen føre til at kanylen løsner, noe som fører til svikt i anestesiinduksjonen. I tillegg kan bevegelse av nålen resultere i ekstravasering av propofol fra venen, noe som setter halen i fare for vevnekrose. Dette har velferdsmessige implikasjoner for musen, og enhver assosiert adrenerg aktivering som følge av fysiologisk stress kan påvirke gyldigheten av de observerte resultatene¹¹.

En ytterligere potensiell begrensning er bruken av buprenorfrin som postoperativ analgetisk. Opioider kan modulere postoperative inflammatoriske og immunresponser^12,13. Buprenorfin ble valgt for analgesi da effekten på immunresponsen er mindre enn for andre opiater¹³. Likevel kan fremtidige studier vurdere bruk av ikke-opioide analgetika.

Til tross for fremskritt innen onkologisk terapi, kan lokalt og fjernt tilbakefall av kreft oppstå etter operasjonen og er fortsatt en dominerende årsak til dødelighet hos kreftpasienter. Mange pasienter vil bli utsatt for anestesi, ofte flere ganger, under diagnostiske og terapeutiske operative prosedyrer. En økende mengde bevis fra in vivo og in vitro studier impliserer bedøvelsesmidler i å modulere den perioperative responsen på kirurgi og påvirke ulike aspekter av tumorcellebiologi¹⁴. For bedre å forstå virkningen av bedøvelsesmidler på kreftprogresjon, vil modellen for intravenøs propofolabedøvelse utviklet her være viktig i fremtidig mekanistisk preklinisk forskning. Denne modellen kan brukes til å undersøke mekanismene som ligger til grunn for effekten av bedøvelsesmidler på immunmodulering, perioperativ inflammatorisk respons og tumorcellevekst og invasjon. Videre kan denne modellen ekstrapoleres for bruk i ikke-kreftkirurgisk forskning der bedøvelsesmidler kan ha effekter på andre systemer, for eksempel hjertekirurgi, traumeforskning eller kritisk sykdom (f.eks. Sepsis), da propofol er en vanlig sedasjon som brukes i intensivavdelinger.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline	Fresnius Kabi	AUST R 197198
Artery forceps	Proscitech	TS1322-140
Buprenorphine	Temgesic	TEMG I
Heated surgical mat	Custom	-
Hypodermic needle (30 G, 1 mL insulin syringe)	Terumo	NN3013R
IVIS Lumina	PerkinElmer	126274
Luciferin	Promega	P1041/2/3
Polyurethane catheter	Intramedic	427401
Povidone Iodine	Betadine	AUST R 29562
Propofol Lipuro, 2%	Braun	3521490
Sevoflurane	Baxter	ANZ2L9117
Sevoflurane vaporiser	Vetquip	VQ1334
Sterile gauze	Multigate Medical Products	11-600A
Surgical scissors	Proscitech	TS1044
Sutures, 5-0 nylon	Dynek	V504
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringes (1 mL)	Terumo	SS+01T