Summary
تكشف الأعمال الحديثة عن تأثير الخلايا العصبية على خلايا الورم الدبقي للأطفال عالية الجودة (pHGG) وتفاعلاتها المتبادلة. يظهر العمل الحالي تطور نموذج في المختبر يشارك في زراعة خلايا pHGG والخلايا العصبية الغلوتاماترجية وسجل تفاعلاتها الكهربية لمحاكاة تلك التفاعلات.
Abstract
تمثل الأورام الدبقية عالية الجودة لدى الأطفال (pHGG) سرطان الدماغ في مرحلة الطفولة والمراهقة التي تحمل تشخيصا كئيبا سريعا. نظرا لوجود حاجة للتغلب على مقاومة العلاجات الحالية وإيجاد طريقة جديدة للعلاج ، فإن نمذجة المرض في أقرب وقت ممكن في وضع المختبر لاختبار أدوية جديدة وإجراءات علاجية أمر صعب للغاية. دراسة العمليات البيولوجية المرضية الأساسية، بما في ذلك فرط حساسية الخلايا العصبية الغلوتاماترجية، سيكون تقدما حقيقيا في فهم التفاعلات بين الدماغ البيئي وخلايا pHGG. لذلك، لإعادة التفاعلات الخلية الخلايا العصبية / pHGG، وهذا العمل يظهر تطوير نموذج وظيفي في المختبر المشاركة في زراعة الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPS) المستمدة من الخلايا العصبية القشرية الجلوتاماترجية خلايا pHGG في أجهزة microfluidic مجزأة وعملية لتسجيل التعديلات الكهربية. كانت الخطوة الأولى هي التمييز وتوصيف الخلايا العصبية الجلوتاماترجية البشرية. ثانيا، تم استزراع الخلايا في أجهزة ميكروفلويديك مع خطوط الخلايا المشتقة من pHGG. ثم تم تضمين البيئة الدقيقة في الدماغ ونشاط الخلايا العصبية في هذا النموذج لتحليل التأثير الكهربائي لخلايا pHGG على هذه الخلايا العصبية البيئية الدقيقة. وتقترن التسجيلات الكهربية باستخدام صفائف متعددة الأقطاب (MEA) لهذه الأجهزة microfluidic لمحاكاة الظروف الفسيولوجية وتسجيل النشاط الكهربائي للشبكة العصبية بأكملها. تم التأكيد على زيادة كبيرة في استثارة الخلايا العصبية في وجود الخلايا السرطانية.
Introduction
الأطفال جليوما عالية الجودة (pHGG) معرض التنوع الجيني الموسعة و phenotypic اعتمادا على عمر المريض, موقع الورم التشريحية وتمديد, والسائقين الجزيئية1. وهي أورام الدماغ العدوانية التي يتم التحكم فيها بشكل سيئ مع خيارات العلاج المتاحة حاليا، وهي السبب الرئيسي للوفاة المتعلقة بسرطان الدماغ في الأطفال والمراهقين2. لذلك ، أكثر من 80 ٪ من المرضى يندبون في غضون عامين بعد تشخيصهم ، ومتوسط بقائهم على قيد الحياة هو 9-15 شهرا ، اعتمادا على مواقع الدماغ والطفرات السائق. غياب العلاج العلاجي هو الدافع الرئيسي للبحوث المختبرية ويسلط الضوء على الحاجة الفورية لنهج علاجية مبتكرة جديدة. لهذا الغرض، تم تطوير خطوط الخلايا المشتقة من المريض (PDCL) على أمل توفير التنوع pHGG3 في خطوط ثنائية الأبعاد (2D) و / أو ثلاثي الأبعاد (3D) الأعصاب. ومع ذلك، فإن تلك الثقافات المشتقة من المريض في الخلايا المختبرية لا تحاكي جميع الحالات المتغيرة في الدماغ. لا تأخذ هذه النماذج في الاعتبار البيئات التشريحية العصبية المجهرية والمجهرية الموصوفة عادة في pHGG.
عادة، يتطور pHGG في الأطفال الأصغر سنا بشكل رئيسي في مناطق بونتين والثالامي، في حين يركز HGG للمراهقين والشباب في المناطق القشرية، وخاصة في الفصوص الجبهية الصدغية1. هذه الخصائص الموقع عبر أعمار الأطفال ويبدو أن تنطوي على بيئات مختلفة تؤدي إلى تكوين الدبقية وشبكة علاج بين الخلايا السرطانية ونشاط الخلايا العصبية محددة4,5,6. على الرغم من أن الآليات لا تزال غير محددة، يتطور pHGG بشكل رئيسي من الخلايا السليفة العصبية على طول مسار التمايز من الأنساب الفلكية والأوليغوديندروغليال. في حين أن دور هذه الأنساب الدبقية كان لفترة طويلة يقتصر على الدعم الهيكلي البسيط للخلايا العصبية ، فمن الواضح الآن أنها تتكامل تماما في الدوائر العصبية وتظهر تفاعلات معقدة ثنائية الاتجاه بين الخلايا العصبية الدبقية القادرة على إعادة تنظيم المناطق الهيكلية للدماغ وإعادة تشكيل الدوائر العصبية4،7،8 . وعلاوة على ذلك، تشير قطع متزايدة من الأدلة إلى أن الجهاز العصبي المركزي (CNS) يلعب دورا حاسما في بدء سرطان الدماغ وتطوره. ركزت الأعمال الأخيرة على نشاط الخلايا العصبية ، والذي يبدو أنه يدفع نمو وداء العث من الأورام الخبيثة الدبقية من خلال عوامل النمو المفرزة والاتصالات الكهروكيميائية المباشرة6،9. على نحو متبادل، يبدو أن الخلايا الدبقية عالية الجودة تؤثر على وظيفة الخلايا العصبية مع زيادة نشاط الخلايا العصبية الغلوتاماترجية وتعديل تشغيل الدوائر التي يتم دمجها فيها هيكليا وكهربائيا9. لذا، أظهرت الدراسات التي تستخدم نماذج مشتقة من المريض وأدوات علم الأعصاب الجديدة التي تتحكم في عمل الخلايا العصبية تأثيرا خاصا بالدائرة لنشاط الخلايا العصبية على موقع الورم الدبقي والنمو والتقدم. معظم هذه التوقعات العصبية المشاركة في الأورام الدبقية هي الجلوتاماترجية والتواصل من خلال إفرازات الغلوتامات. المؤشرات الحيوية الجلوتاماترجية المحددة مثل mGluR2 أو vGlut1/2 توصف عادة6.
ومن المثير للاهتمام، على الرغم من عدم التجانس الجزيئي، الأطفال والكبار جليوماس عالية الجودة تظهر استجابة التكاثر نموذجية لنشاط الخلايا العصبية الغلوتاماترجية وغيرها من العوامل المفرزة مثل neuroligin-3 أو BDNF (عامل العصبية المشتقة من الدماغ)4،6،10،11،12،13 . في المناطق القشرية, الأطفال والكبار HGGs يمكن أن تحفز فرط الخلايا العصبية من خلال زيادة إفراز الغلوتامات وتمنع الخلايا الداخلية GABA مما يؤدي إلى الأورام الدبقية المرتبطة نشاط شبكة الصرع14,15. وعلاوة على ذلك، يمكن إعادة تشكيل الدوائر العصبية من قبل الأورام الدبقية دفع مهام عصبية محددة، على سبيل المثال، اللغة، ويمكن الاستيلاء على نشاط الخلايا العصبية المنظمة إضافية9.
وبناء على هذا الأساس المنطقي، يجب توضيح وتعزيز فهم الاتصالات ثنائية الاتجاه بين خلايا الورم الدبقي والخلايا العصبية بشكل كامل ودمجها مع المراحل المبكرة من نهج pHGG في المختبر. مثل هذه النمذجة المبتكرة أمر بالغ الأهمية في فهم وقياس تأثير النشاط الكهربائي العصبي أثناء اختبار المخدرات وتوقع استجابة pHGG في دوائر الدماغ. التطورات الأخيرة في أدوات علم الأعصاب، مثل الأجهزة microfluidic وأعمال البحوث pHGG، هي السرير لتطوير نهج النمذجة الجديدة وتكون قادرة الآن على دمج البيئة الدقيقة في الدماغ في نماذج pHGG المختبر3،16،17،18،19. إلى جانب التسجيلات الكهربية باستخدام صفائف متعددة الإلكترونات (MEA) ، توفر الأجهزة الدقيقة 20،21،22 إمكانية محاكاة الظروف الفسيولوجية أثناء تسجيل النشاط الكهربائي للشبكة العصبية بأكملها واستخراج معلمات اتصال الشبكة في ظل عدة ظروف. يسمح هذا الجهاز23,24 أولا بالترسب الدقيق للخلايا في غرفة مباشرة على MEA. تمكن هذه التكنولوجيا من التحكم في كثافة وبذر الخلايا والتجانس على MEA والتحكم الدقيق في تبادل الوسائط ، وهي خطوة حاسمة لتمايز السلف العصبي البشري مباشرة إلى أجهزة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون البذور غرفة الترسيب الحالية مع خلايا متعددة في نقاط زمنية مختلفة.
لذلك، تهدف هذه الدراسة إلى تطوير نموذج وظيفي في المختبر يشارك في زراعة الخلايا العصبية القشرية المشتقة من الجلوتاماترجية البشرية (hiPS) والخلايا المشتقة من pHGG في أجهزة microfluidic وتسجيل نشاطها الكهربائي لتقييم التفاعلات الكهربائية بين مجموعتي الخلايا. أولا، تم الحصول على الخلايا العصبية الغلوتاماترجية القشرية المشتقة من hiPS وتتميز في الأجهزة الدقيقة فلوريدية في مراحل مختلفة من الثقافة [اليوم 4 (D4)، كخلايا hiPS، واليوم 21 (D21) واليوم 23 (D23)، والخلايا العصبية نضجت الجلوتاماترجية]. للخطوة الثانية من الثقافة المشتركة، تم استخدام نموذجين pHGG: خط UW479 الأطفال التجارية وخلايا pHGG بدأت من ورم المريض (BT35)3، تحمل طفرة سائق K27M H3.3. وأخيرا، قمنا بإجراء تسجيلات كهربية للخلايا الجلوتاماترجية في D21 قبل بذر خلايا pHGG وD23 بعد 48 ساعة من الثقافة المشتركة في نفس الجهاز microfluidic. تميزت التفاعلات بين الخلايا العصبية الغلوتاماترجية وخلايا pHGG بزيادة كبيرة في النشاط الكهربي المسجل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بالنسبة لهذا البروتوكول، فإن رقم الاعتماد المتعلق باستخدام المواد البشرية هو DC-2020-4203.
1. تصنيع الجهاز microfluidic، وإعداد والعلاج
- تصنيع قوالب SU-8 باستخدام تقنيات التصوير الضوئي التقليدية18.
ملاحظة: لهذا الغرض، تم تصميم قناعين للليثوغرافيا الضوئية لبناء طبقتين من هياكل واقية ضوئية على ركيزة رقاقة السيليكون وطبقة رقيقة SU-8 2005 واقية ضوئية (3.2 ميكرومتر وارتفاع 6 ± 1 ميكرومتر) التي تحدد microgrooves غير المتماثلة تحت نقش القنوات الرئيسية المصنوعة في SU-8 2100 (200 ميكرومتر عالية، 1 مم، وطوله 13 مم) (انظر الشكل التكميلي S1). - تنشيط رقاقة باستخدام منظف البلازما (5.00e-1 تور، عالية التردد الراديوي (RF) مستوى) لمدة 1 دقيقة وsilanize ذلك باستخدام 1 مل من (trichloro (1H، 1H، 2H، 2H-perfluorooctyl)السيلان في مجلد الألومنيوم في مجفف لمدة 30 دقيقة.
- إعداد نسبة 10:1 من Polydimethylsiloxane (PDMS)، مزيج prepolymer مع محفز، وتمريره في مجفف فراغ لإزالة الفقاعات المحاصرين، ويلقي ببطء على القالب قبل أن يتم علاجه في فرن في 80 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
- قطع عليه بعد ذلك باستخدام شفرة حلاقة في الحجم المطلوب قبل تقشير قبالة القالب. لكمة من مدخل ومناطق منفذ للحصول على ثقوب 3 ملم واسعة، وتنظيف PDMS، وحمايتها باستخدام شريط لاصق.
ملاحظة: سمك الجهاز PDMS النهائي هو 5 ملم تقريبا. - علاج الجهاز باستخدام منظف البلازما (5.00e-1 تور، وارتفاع مستوى RF خلال 1 دقيقة)، وتجميعه مع طبق بيتري البوليسترين، وفضح الفراغ تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
- ملء مع ماصة مدخل الجهاز microfluidic قبل الاستخدام مع الإيثانول 70٪ وتفريغه عن طريق الطموح pipetting.
- غسل الجهاز microfluidic عن طريق إضافة الخزانات مدخل دولبيكو الفوسفات العازلة المالحة (D-PBS) وتفريغه عن طريق الأنابيب الطموح ثلاث مرات متتالية.
- معطف الجهاز باستخدام 0.05 ملغم / مل بولي مد ليسين ووضعه في حاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2). بعد 24 ساعة، شطف الجهاز عن طريق إضافة إلى خزان مدخل المتوسطة العصبية وإفراغه عن طريق الأنابيب الطموح ثلاث مرات متتالية.
- ملء رقاقة microfluidic مع خلية ثقافة المتوسطة والسماح لها البقاء في درجة حرارة الغرفة حتى استخدامها لمدة أقصاها 2 ساعة.
2. إعداد الخلية وبذر في الجهاز microfluidic
- الثقافة، البذر، وتوصيف المناعة من الخلايا العصبية القشرية المشتقة من hiPS الإنسان
ملاحظة: إجراء تجارب مع الخلايا العصبية القشرية المشتقة من hiPS التجارية الجلوتاماترجية (الشكل 1 أ). الحفاظ على المواد المشتقة من الإنسان والتعامل معها بموافقة وبموجب المبادئ التوجيهية للتشريع.- إفراغ مدخل ومنفذ خزانات الجهاز microfluidic عن طريق الطموح ماصة قبل البذر، والسماح فقط قنوات الجهاز لتكون مليئة المتوسطة.
- قم بزرع خلايا hiPS في اليوم 0 (D0) عن طريق وضع 10 ميكرولتر من 6.5 × 106 خلايا hiPS / تعليق مل (على سبيل المثال ، تركيز 900 خلية / مم2 ) مع الوسط ، الذي يتم إعطاء تكوينه في الجدول 1 ، والسماح للجهاز أن يكون تحت غطاء محرك السيارة (في درجة حرارة الغرفة) لمدة 15 دقيقة للسماح للخلايا نعلق.
- بعد 15 دقيقة، قم بتعبئة كل من الخزانات المدخلة والمنفذ ب 50 ميكرولتر من متوسط ثقافة D4، الذي يتم إعطاء تكوينه بالكامل في الجدول 1، ونقل الجهاز إلى الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون).
- الحفاظ على تمايز الخلايا العصبية الجلوتاماترجية لمدة 23 يوما (الشكل 1A (1) ، المجهر) تحت بيئة خاضعة للرقابة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) ومع وسيط معين لثقافة الخلية ، والذي يتم وصف تكوينه في الجدول 1. استبدال المتوسطة بانتظام كما هو مفصل في الخطوة التالية 5. أسفل واتبع الخطوات كما في الشكل 1B.
- استبدل الوسط كل 3 إلى 4 أيام بعد تكوين الجدول 1 . استخدام البذور المتوسطة حتى D4، D4 المتوسطة حتى D7، D7 المتوسطة حتى D11، وD11 المتوسطة للوقت المتبقي من الثقافة.
- التقاط صور مجهرية في D4 و D21 و D23 باستخدام مجهر معياري على النقيض من المراحل لتقييم صلاحية الخلية والسماح بحساب الخلايا.
- لتوصيف, إصلاح الخلايا العصبية الغلوتاماترجية المتمايزة في 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد الطموح المتوسط واتبع بروتوكول لتلطيخ immunofluorescence.
- غسل الخلايا ثلاث مرات مع الفوسفات العازلة المالحة (PBS) و permeabilize لهم لمدة 10 دقيقة مع 0.1٪ تريتون-X تليها 30 دقيقة مع 3٪ البومين مصل البقر (BSA). إضافة الأجسام المضادة الأولية واحتضان الجهاز بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- شطف الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني واحتضان مزيد من الأجسام المضادة الثانوية المقابلة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يتم سرد الأجسام المضادة المناعية المستخدمة في الدراسة في الجدول 2. - شطف الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني و counterstain مع DAPI (4'،6-diamino-2-phenylindole) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- الحصول على الصور مع المجهر epifluorescence مقلوب مزودة CMOS (التكميلية أكسيد المعادن أشباه الموصلات) الكاميرا وتحليل باستخدام برنامج تحليل الصور المناسبة.
- فتح الصور الملون DAPI وbinarize مع روتين العتبة في البرنامج. للقيام بذلك، انقر فوق صورة > ضبط عتبة >، وتعيين المعلمات المناسبة لتمييز النواة من الخلفية. ثم انقر على تطبيق > عملية > مستجمعات المياه لتقسيم النواة الكلية.
- بعد ذلك، استخدم وظيفة برنامج تحليل الجسيمات الفطرية لتفسير الصور الثنائية. للقيام بذلك، انقر على تحليل ثم على تحليل الجسيمات وتعيين المعلمات المناسبة بعد ذلك: حجم وتصفية دائرية (استبعاد من تحليل الكائنات أصغر من 7 ميكرومتر، أكبر من 20 ميكرومتر، أو مع دائرية أصغر من 0.1 ميكرومتر).
- دمج الصور كفاف التي تم الحصول عليها من تحليل DAPI لمراسل الصور immunofluorescent للتحقق من صحة تلطيخ الصحيح.
- وأخيرا، حفظ البيانات المرتبطة (عدد الكائنات، متوسط المنطقة، ٪ من التغطية، الخ) لمختلف المؤشرات الحيوية وقياس التعبير في D4 و / أو D21 باستخدام برنامج القياس الكمي المناسب.
- ثقافة الخلية من خط pHGG التجارية، UW479، وخط الخلية المشتقة من المريض، BT353
- ثقافة كل من خطوط الخلية في DMEM/F-12 GlutaMAX تكملها مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) في قارورة ثقافة الخلية. انتظر التقاء 80٪ من كل خط خلية كما هو معروض في الشكل 1C.
- الحفاظ على هذه الخلايا pHGG تحت بيئة تسيطر عليها في 37 درجة مئوية في ظروف normoxic طوال التجارب.
3. بروتوكول الثقافة المشتركة
- ضبط يوم البذر والتركيز لUW479 و BT35 خطوط الخلية للوصول إلى 80٪ من الخلايا الالتقاء عندما ينبغي أن تبدأ الثقافة المشتركة، المقابلة ل21 يوما من الثقافة للخلايا العصبية الغلوتاماترجية.
- جرب UW479 و BT35 الخلايا والبذور لهم على رأس الخلايا العصبية الغلوتاماترجية في كل جهاز microfluidic مخصصة (مع كثافة مستهدفة من 900 خلية / mm2 لكل نوع من الخلايا) قبل بذر خلايا pHGG في الجهاز microfluidic التي تحتوي على الخلايا العصبية الغلوتاماترجية نضجت.
- الحفاظ على الثقافات المشتركة لمدة 2 أيام في ظل بيئة تسيطر عليها (37 درجة مئوية، 5٪ CO2) مع الخلايا العصبية الجلوتاماترجية D11 والمتوسطة فصاعدا مفصلة في الجدول 1.
- عد خلايا pHGG باستخدام الصور المجهرية التي تم تحليلها باستخدام برنامج تحليل الصور لتقييم جدواها. حساب النسبة المئوية للخلايا.
ملاحظة: استخدم الصيغة التالية: 100 - ((عدد الخلايا في D23 / عدد الخلايا في D21) × 100).
4. التسجيل الكهروفيزيولوجي
- إجراء التسجيل الكهربي مع نظام تجاري وبرامج متاحة تجاريا.
ملاحظة: أجريت التجارب باستخدام أقطاب كهربائية قطرها 30 ميكرومترا متباعدة بمقدار 100 ميكرومتر. - إجراء أول تسجيل كهربي على الخلايا العصبية الجلوتاماترجية في D21 قبل بذر خلايا pHGG. استخدام الخلايا العصبية الغلوتاماترجية المتمايزة والسيطرة والثقافة لهم وحدها بالتوازي مع الثقافة المشتركة. قم بتسجيل ثاني لكلا الشرطين كما هو موضح في الخطوة التالية المرقم 3.
- إجراء تسجيل كهربي ثان في D23 (بعد يومين من الثقافة المشتركة).
5. معالجة البيانات الكهربية
- تصفية البيانات الخام مع 2nd النظام باند تمرير بتروورث مرشح (مع ترددات النطاق من 100 هرتز و 2500 هرتز).
- للكشف عن الارتفاع، احسب مربع الوسط الجذر للإشارة على التسجيل لمدة 10 دقائق لكل قطب كهربائي وحدد عتبة سعة مطابقة لثمانية أضعاف القيمة المربعة لهذا المتوسط الجذر.
- تطبيق خوارزمية اضطراب ما بعد الصدمة (الدقة توقيت الكشف عن سبايك25) ، مع الأخذ في الاعتبار مدة قصوى قدرها 2 مللي ثانية لإمكانات إجراء واحد.
- النظر كقطب نشط، كل قطب الكشف عن ما لا يقل عن 5 مسامير / دقيقة. استمر في الفحص إذا كان 10٪ على الأقل من أقطاب التسجيل نشطة.
- تقسيم عدد المسامير المكتشفة حسب الفترة الزمنية للتسجيل لحساب متوسط معدل إطلاق كل قطب كهربائي نشط. حساب متوسط معدل إطلاق النار لكل تجربة مستقلة. في نهاية المطاف، حساب متوسط حسب الشرط (±SEM) والتعبير عن ذلك كدالة في يوم التسجيل.
- حساب مؤامرة النقطية لكل تجربة تمثل الأحداث التي تم الكشف عنها لكل قطب كهربائي نشط كدالة للوقت. ثم، حساب معدلات إطلاق النار على نطاق الصفيف الزمني (أو معدلات إطلاق فورية) لجميع الأقطاب النشطة، مما يسمح بمراقبة تزامن نشاط الشبكة العصبية.
- وأخيرا، قم بإنشاء رسوم بيانية شريطية باستخدام برنامج القياس الكمي وإجراء مقارنات باستخدام اختبارات Kruskal Wallis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قبل دراسة التفاعلات الكهربائية بين الخلايا العصبية الغلوتاماترجية وخلايا الورم الدبقي، تم وصف الخلايا العصبية القشرية المشتقة من hiPS للتحقق من جدوى زراعة هذه الخلايا في الأجهزة الدقيقة (الشكل 1A). تم تقييم توصيفها باستخدام نستين، Sox2، mGlurR2 (مستقبلات الغلوتامات ميتابوتروبيك 2)، وvGLUT1 المناعية، ممثلة في الشكل 1A (2-7). كما نستين هو بروتين خيوط وسيطة المطلوبة للبقاء على قيد الحياة, تجديد وانتشار الخلايا السلف العصبية التي تحفز ميتوجين, ومن ثم يتم التعبير عنها في خلايا CNS غير متمايزة أثناء التنمية. Sox2 هو عضو في الجين HMG-box (SOX) الشبيه ب SRY عائلة عامل النسخ المشاركة في تنظيم النمو الجنيني ، ويتم التعبير عنه في الغالب في خلايا غير ناضجة وغير متمايزة من الظهارة العصبية في CNS. mGluR2 موزعة على نطاق واسع في جميع أنحاء الدماغ، مع التعبير عالية في القشرة والحصين. عادة، فإنه يحدد الخلايا presynaptic مع استثارة الخلايا العصبية وانتقال متشابك (على سبيل المثال، الخلايا العصبية الجلوتاماترجية). vGLUT1 يستخدم أيضا باعتبارها العلامة الحيوية الجلوتاماترجية. لذلك، يركز الشكل 1 على الخلايا العصبية الجلوتاماترجية مع تعبيرات Nestin و Sox2 في D4 و D21 للتحقق من تمايزها التدريجي في ظروف الثقافة (الشكل 1A (2-4)). وانخفضت نسبة خلايا نيستين الإيجابية من 5.4 ± 0.4 في المائة في D4 إلى 0.69 ± 0.3 في المائة في D21 (p < 0.01، الشكل 1A5). وبالمثل، وتأكيدا لحالة الخلايا العصبية الغلوتاماترجية المتمايزة، انخفضت نسبة خلايا سوكس2 الإيجابية من 12.2 ± 2.1٪ عند D4 إلى 5.5 ± 1.7٪ في D21 (p < 0.05، انظر الشكل 1A6). تم الكشف عن التعبير عن mGluR2 في 45.4 ± 4.7٪ من الخلايا الجلوتاماترجية في D21 (البيانات غير مبينة)، ولوحظ وجود مناعة أكبر vGLUT1 أثناء التمايز الجلوتاماترجي في D21. وأظهرت هذه النتائج أن نسبة السلف العصبية ظلت منخفضة وأن معظم الخلايا كانت متباينة بشكل جيد بعد ثقافة لمدة 21 يوما في الأجهزة الدقيقة. في الشكل 1B، يصف بروتوكول عام للثقافات المشتركة متعددة الخطوات والتسجيل الكهربي بذر الخلايا UW479 أو BT35 في أجهزة microfluidic في D21. وقد سبق وصف خطوط الخلايا هذه (الشكل 1C) وهي مماثلة للملاحظات السابقة التي قدمها 19 3 منا. في النهاية، تم الحصول على تسجيلين كهربيين: واحد في D21 قبل الزرع المشترك والآخر في D23 بعد 48 ساعة من بذر خط الخلية pHGG.
لفهم وبعد التنقل والبقاء من BT35، UW479، والخلايا العصبية الجلوتاماترجية خلال الثقافات المشتركة، تم إجراء التقييمات المجهرية بانتظام خلال فترة التسجيل الكهربي من D21 إلى D23 ويتم تقديمها في الشكل 2. كشفت الصور المجهرية عن امتداد تدريجي وتوزيع خاص للخلايا العصبية الغلوتاماترجية عبر الأجهزة الدقيقة (الشكل 2A). تشكل الخلايا الجلوتاماترجية بعض المجاميع تدريجيا بطريقة مماثلة في الثقافة المشتركة وعندما يتم استزراعها بمفردها حتى D23 (تجربة التحكم). في الشكل 2B، C، عند إضافة BT35 و UW479، لوحظ أن الخلايا العائمة الموجودة مباشرة بعد بذر الخلايا الدبقية في D21 اختفت تدريجيا حتى D23 وأصبحت خلايا pHGG الملتصقة في الجهاز. وكان هذا ملحوظا بشكل خاص لخط UW479.
وعلاوة على ذلك، لم تكن هناك زيادة في الخلايا العائمة بعد جميع التسجيلات الكهربية في D23 (البيانات غير مبينة). ومع ذلك، قدرت النسب المئوية للخلايا القابلة للحياة في الشكل 2D بنسبة 83.02٪ و 85.16٪ ل BT35 و UW479 على التوالي. وكان كلا الخطين قابلين للمقارنة وأكدا على حقيقة أنه يمكن استخدام خطوط الخلايا المشتقة من المريض بشكل مناسب. لا يغير التحضير التقني للأجهزة الدقيقة المفلورة إلى جانب MEA والتلاعب بالخلايا من قدراتها على التصاق. لا يبدو للحث على موت الخلية أو تعديل جوانبها المجهرية. يبدو أن خلايا BT35 و UW479 ترسم خريطة للمواقع الدقيقة للخلايا العصبية الجلوتاماترجية في الجهاز ، وتهاجر عن كثب إلى الخلايا العصبية المثيرة.
ويصف الشكل 3 كمثال UW479/glutamatergic الثقافات العصبية المشتركة مع الكشف عن ارتفاع على طول وقت التسجيل في الشكل 3A ومؤامرة النقطية في D23 في الشكل 3B، مما يدل على زيادة النشاط الكهربائي عند إضافة خلايا pHGG. الشكل 3C يقدم معدل إطلاق النار على نطاق الصفيف الزمني في الثقافات المشتركة BT35/glutamatergic الخلايا العصبية. الاختلافات بين تجربة التحكم (ثقافة الخلايا العصبية الجلوتاماترجية) والثقافات المشتركة للخلايا العصبية الجلوتاماترجية مع خلايا pHGG كبيرة عند تسجيل النشاط الكهربائي D23 ، كما هو موضح في الشكل 3D ، مما يشير إلى تأثير pHGG على استثارة الخلايا العصبية.
| مكونات | متوسط البذر | متوسط D4 | متوسط D7 | D11 والمتوسطة فصاعدا |
| متوسط DMEM/F-12 | 0.5x | 0.25x | 0.125x | Ø |
| متوسطة عصبية | 0.5x | 0.25x | 0.125x | Ø |
| BrainPhys المتوسطة | Ø | 0.5x | 0.75x | 1x |
| SM1 الملحق | 1x | 1x | 1x | 1x |
| N2 الملحق-A | 1x | 1x | 1x | 1x |
| علاء غلن (غلوتاماكس) | 0.5 مليون متر | 0.5 مليون متر | 0.5 مليون متر | 0.5 مليون متر |
| BDNF | 10 نانوغرام/مل | 10 نانوغرام/مل | 10 نانوغرام/مل | 10 نانوغرام/مل |
| GDNF | 10 نانوغرام/مل | 10 نانوغرام/مل | 10 نانوغرام/مل | 10 نانوغرام/مل |
| TGF-β1 | 1 نانوغرام/مل | 1 نانوغرام/مل | 1 نانوغرام/مل | 1 نانوغرام/مل |
| جيلتريكس | 30 ميكروغرام/مل | Ø | Ø | Ø |
| ملحق البذر | 1x | Ø | Ø | Ø |
| ملحق اليوم الرابع | Ø | 1x | Ø | Ø |
الجدول 1: تكوين وسائل الإعلام الثقافية للخلايا العصبية الغلوتاماترجية المشتقة من hiPS.
| الاجسام المضاده | تركيزات المخزون | تخفيف العمل |
| نيستين | 0.5 ملغم/مل | 1:500 |
| (1 ميكروغرام/مل) | ||
| سوكس2 | 1 ملغم/مل | 1:500 |
| (2 ميكروغرام/مل) | ||
| mGluR2 | 0.2 ملغم/مل | 1:50 |
| (4 ميكروغرام/مل) | ||
| vGlut1 | 0.25 ملغم/مل | 1:50 |
| (5 ميكروغرام/مل) | ||
| حمار المضادة الأرنب IgG H &؛ L (AF 647) | 2 ملغم/مل | من 1:1000 إلى 1:2000 |
| (1 إلى 2 ميكروغرام/مل) | ||
| حمار المضادة للفأرة IgG H &؛ L (AF 555) | 2 ملغم/مل | 1:1000 |
| (2 ميكروغرام/مل) |
الجدول 2: قائمة الأجسام المضادة المناعية.
الشكل 1: توصيف الخلايا وبروتوكول الثقافة المشتركة للخلايا العصبية الغلوتاماترجية والورم الدبقي للأطفال عالي الجودة (pHGG) خطوط. (أ) الوصف المجهري والمناعي المسبق للخلايا العصبية الغلوتاماترجية. (1) صور مجهرية في اليوم 21 (D21) واليوم 23 (D23) من الخلايا العصبية الجلوتاماترجية. (2) وضع العلامات نستين باللون الأخضر وDAPI باللون الأزرق في D4 (الصف العلوي) و D21 (الصف السفلي). (3) Sox2 وضع العلامات باللون الأخضر وDAPI باللون الأزرق في D4 (الصف العلوي) و D21 (الصف السفلي). (4) mGluR2 وضع العلامات باللون الأخضر وDAPI باللون الأزرق في D21. (5 و 6) المقارنات الإحصائية بين نيستين وSox2 وضع العلامات في D4 و D21 للثقافة ، مما يدل على تمايز الخلية. (7) vGlut1 تلطيخ باللون الأخضر وDAPI باللون البرتقالي في D21. (ب) البروتوكول العام للتسجيل الكهربي لدراسة التفاعلات عند المشاركة في زراعة الخلايا العصبية الغلوتاماترجية وخلايا الورم الدبقي على الأجهزة. (ج) الجوانب المجهرية المسبقة لخطوط الخلايا BT35 وUW479. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الصور المجهرية لخلايا الجلوتاماترجية والورم الدبقي المستزرعة في الأجهزة الدقيقة المفلورة إلى جانب صفائف متعددة الأقطاب (MEA). يتم تمييز الخلايا العصبية الغلوتاماترجية وتزرع وحدها في الجهاز microfluidic حتى اليوم 21 (D21). (أ) بالنسبة لهذه السيطرة التجريبية، أضيفت الوسيلة فقط إلى خلايا الجلوتاماترجية في D21، في حين تمت إضافة خطوط خلايا BT35 (B) أو UW479 (C) في ظروف كل منها. تم إجراء الصور في D22 و D23 قبل السجلات الكهربية لكل حالة. تم الحصول على جميع الصور باستخدام المجهر الكلاسيكي على النقيض من المرحلة. (د) قدرت صلاحية الخلايا السرطانية ل BT35 و UW479 في D23 باستخدام العد الآلي مع برنامج تحليل الصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تسجيل كهربيولوجي. (أ) الكشف عن سبايك على طول وقت التسجيل في UW479/glutamatergic الثقافات العصبية المشتركة. (ب) مثال على مؤامرة النقطية محسوبة في D23 يمثل الأحداث التي تم الكشف عنها لكل قطب نشط كدالة من الزمن في UW479/glutamatergic الثقافات المشتركة الخلايا العصبية. (ج) معدل إطلاق النار الزمني على نطاق الصفيف (أو معدل إطلاق النار الفوري) لجميع الأقطاب النشطة التي تسجل النشاط الكهربائي في الثقافات المشتركة للخلايا العصبية BT35/glutamatergic ، مما يسمح بمراقبة تزامن نشاط الشبكة العصبية. (د) المخططات الشريطية لمعدل إطلاق متوسط في حالة التحكم (على سبيل المثال، ثقافة الخلايا العصبية الغلوتاماترجية) وعند إضافة خط الخلية الورمي UW479 (باللون الأخضر) وخط الخلية BT35 (باللون الأحمر). تظهر البيانات على أنها متوسط ± SEM. (* p < 0.05). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي S1: تمثيل ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) لقالب SU-8. (أ) إنشاء وتصوير قوالب SU-8 مع برنامج أوتوكاد. (ب) صورة قوالب SU مع طبقتين من هياكل الكواتر الضوئية وأربعة ثقوب بعرض 3 ملم. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا العمل نموذجا وظيفيا دقيقا في المختبر لتقييم التفاعل بين الخلايا العصبية القشرية المشتقة من hiPS البشرية والخلايا السرطانية في الدماغ في الأجهزة الدقيقة. واحدة من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول كان التمايز hiPS في الخلايا العصبية الجلوتاماترجية، والتي أكدت من خلال انخفاض تلطيخ نستين وSox2 immunofluorescent والمظهر المتزامن للتلطيخ mGluR2 و vGLUT1. ومع ذلك، بقي عدد قليل من السلف العصبية كما أعرب نصف فقط من الخلايا الجلوتاماترجية mGluR2، وهو ما يعني مجموعة خلايا عصبية غير متجانسة. وإجمالا، تؤكد هذه النتائج أنه يجب تكريس عناية خاصة لنمو الخلايا الجلوتاماترجية في مثل هذه الأجهزة. وعلاوة على ذلك، كانت الخطوة التالية دراسة السلوك الكهربائي للخلايا العصبية في وجود خلايا pHGG كثيفة العمالة نسبيا لإعداد معالجة البيانات لتحسين الكشف عن ارتفاع وتفسير. ومع ذلك، كما هو متوقع وموصف في أعمال أخرى نشرت مؤخرا4،5،6،9،10، وجود pHGGs والخلايا العصبية الجلوتاماترجية يعزز النشاط الكهربائي مما يؤكد ميزة مثير لتلك الخلايا العصبية.
قد يكون القيد الرئيسي لهذا النمذجة هو التوزيع غير المتجانس للخلايا العصبية على MEA نفسها التي يمكن أن تؤثر على التسجيلات الكهربية. وسوف يتطلب الحفاظ على ثقافة عالية الكثافة في الجهاز microfluidic. لزرع نوع خلية ثانوية على الجهاز، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على الانتشار السريع والهجرة في البداية لمدة 48 ساعة والحصول على أما بالنسبة للخلايا العصبية توزيع متجانسة في تقنية 48 ح للتسجيل. وثمة قيد آخر هو التمييز بين الأنواع المختلفة من مجموعات الخلايا في مثل هذه الأجهزة بصريا، ولكن النهج الجديدة باستخدام الجسيمات النانوية الفلورية قد تساعد في اتباع كلا النوعين من الخلايا26. وأخيرا، فإن أداء هذا النهج microfluidic لم يتم إلا في نوعين من خطوط phGG وينبغي أن تمتد إلى خطوط الخلايا المشتقة من المريض أكثر تحمل محركات الجزيئية المختلفة. ويمكن إجراء تقييمات تكميلية لفهم هذا التأثير المثير عند المشاركة في زراعة تلك الخلايا. ومع ذلك، فمن الممكن مع خلايا pHGG تحمل طفرة سائق K27M H3.3، كما هو الحال في خط BT353.
الطريقة الشاملة التي تم تطويرها في هذا العمل هي واحدة من النهج الجديدة لاستكشاف التأثير الكهربائي. وقد أظهرت قدرة تحليل الشبكة العصبية على نقل التفاعل بين الخلايا العصبية الغلوتاماترجية المشتقة من hiPS وخطوط الخلايا السرطانية pHGG في ظروف الثقافة الدقيقة. هذه الطريقة مفيدة للعديد من التطبيقات، وخاصة بالنسبة للدراسات الوظيفية والميكانسية وتحليل آثار العوامل الدوائية التي يمكن أن تمنع هجرة خلايا pHGG والتفاعل مع الخلايا العصبية. وهو يؤكد على استخدام أجهزة microfluidic ، ولكن على وجه التحديد عندما التجارب قد تسجل النشاط الكهربي ويمكن إضافتها إلى MEA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AB، MG، JR، LM، ML، JV، DD يعملون من قبل NETRI، FL هو الرئيس التنفيذي للتكنولوجيا في NETRI، وTH هو الرئيس العلمي في NETRI. وليس لدى المؤلفين الآخرين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل من خلال منح من برنامج سات كونيكوس، ومؤسسة جامعة ستراسبورغ، و«J'ai demandé la lune»، و«Une roulade pour Charline»، و«LifePink»، و«فرانك، وريون دي سوليه» و«Semeurs d'Etoile». نشكر الأطفال والأسر المتضررة من مجموعات HG على مساهماتهم في هذا البحث ودعمهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
| Cortical Glutamatergic Neurons | BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | - | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
References
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Ostrom, Q. T., et al. Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro-Oncology. 16, Suppl 10 1-36 (2015).
- Blandin, A. F., et al. Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity. Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).
- Monje, M.
- Mount, C. W., Yalçın, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity. eLife. 18 (8), 49291 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders. Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Neftel, C., et al. An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Krishna, S., et al. Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival. BioRxiv. , (2021).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).
- Wang, X., et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression. Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).
- Venkatesh, H. S., et al. Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma. Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).
- Venkatesh, H. S., et al. Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion. Cell. 161 (4), 803-816 (2015).
- Buckingham, S. C., et al. Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity. Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).
- Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks. Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).
- Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks. BioRxiv. , (2021).
- Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings. Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).
- Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks. Scientific Reports. 6, 28384 (2016).
- Nguyen, A., et al. Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1α axis inhibition. Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Cerea, A., et al. Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors. Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).
- Bruno, G., et al. Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Maisonneuve, B. G. C., et al. Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework. BioRxiv. , (2021).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Andreiuk, B., et al. Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo. Small. 13 (38), (2017).
