Summary
Lavori recenti scoprono l'impatto neuronale sulle cellule di glioma pediatrico di alto grado (pHGG) e le loro interazioni reciproche. Il presente lavoro mostra lo sviluppo di un modello in vitro che co-coltiva cellule pHGG e neuroni glutamatergici e registra le loro interazioni elettrofisiologiche per imitare tali interattività.
Abstract
I gliomi pediatrici di alto grado (pHGG) rappresentano tumori cerebrali infantili e adolescenziali che portano una prognosi rapida e triste. Poiché è necessario superare la resistenza ai trattamenti attuali e trovare un nuovo modo di curare, è molto impegnativo modellare la malattia il più vicino possibile in un ambiente in vitro per testare nuovi farmaci e procedure terapeutiche. Studiare i loro processi patobiologici fondamentali, compresa l'ipereccitabilità dei neuroni glutammatergici, sarà un vero progresso nella comprensione delle interazioni tra il cervello ambientale e le cellule pHGG. Pertanto, per ricreare le interazioni neuroni/cellule pHGG, questo lavoro mostra lo sviluppo di un modello funzionale in vitro che co-coltiva i neuroni glutamatergici corticali derivati dall'uomo (hiPS) in cellule pHGG in dispositivi microfluidici compartimentati e un processo per registrare le loro modifiche elettrofisiologiche. Il primo passo è stato quello di differenziare e caratterizzare i neuroni glutamatergici umani. In secondo luogo, le cellule sono state coltivate in dispositivi microfluidici con linee cellulari derivate da pHGG. Il microambiente cerebrale e l'attività neuronale sono stati quindi inclusi in questo modello per analizzare l'impatto elettrico delle cellule pHGG su questi neuroni micro-ambientali. Le registrazioni elettrofisiologiche sono accoppiate utilizzando array multielettrodi (MEA) a questi dispositivi microfluidici per imitare le condizioni fisiologiche e registrare l'attività elettrica dell'intera rete neurale. Un aumento significativo dell'eccitabilità neuronale è stato sottolineato in presenza di cellule tumorali.
Introduction
I gliomi pediatrici di alto grado (pHGG) presentano un'estesa diversità genotipica e fenotipica a seconda dell'età del paziente, della posizione e dell'estensione anatomica del tumore e dei driver molecolari1. Sono tumori cerebrali aggressivi che sono scarsamente controllati con le opzioni di trattamento attualmente disponibili e sono la principale causa di morte correlata ai tumori cerebrali nei bambini e negli adolescenti2. Quindi, oltre l'80% dei pazienti recidiva entro 2 anni dalla diagnosi e la loro sopravvivenza mediana è di 9-15 mesi, a seconda delle posizioni cerebrali e delle mutazioni del conducente. L'assenza di trattamenti curativi è l'urgenza primaria per la ricerca di laboratorio ed evidenzia l'immediata necessità di nuovi approcci terapeutici innovativi. A tale scopo, sono state sviluppate linee cellulari derivate dal paziente (PDCL) con la speranza di fornire la diversità pHGG3 in linee bidimensionali (2D) e / o neurosfere tridimensionali (3D). Tuttavia, quelle colture cellulari in vitro derivate dal paziente non imitano tutte le situazioni variabili del cervello. Questi modelli non considerano gli ambienti neuro-anatomici macroscopici e microscopici tipicamente descritti in pHGG.
Di solito, il pHGG nei bambini più piccoli si sviluppa principalmente nelle regioni pontine e talamiche, mentre l'HGG adolescenziale e del giovane adulto si concentra nelle aree corticali, specialmente nei lobi frontotemporali1. Queste specificità di localizzazione in tutte le età pediatriche sembrano coinvolgere ambienti diversi che portano alla gliomagenesi e a una rete intricata tra le cellule tumorali e l'attività neuronale specifica4,5,6. Sebbene i meccanismi non siano ancora identificati, il pHGG si sviluppa principalmente da cellule precursori neurali lungo la traiettoria di differenziazione dei lignaggi astrogliali e oligodendrogliali. Mentre il ruolo di questi lignaggi gliali è stato a lungo limitato al semplice supporto strutturale per i neuroni, ora è chiaramente stabilito che si integrano interamente nei circuiti neurali e mostrano complesse interazioni bidirezionali gliale-neuronale in grado di riorganizzare le regioni strutturali del cervello e rimodellare i circuiti neuronali4,7,8 . Inoltre, l'aumento di brandelli di prove indica che il sistema nervoso centrale (SNC) svolge un ruolo critico nell'inizio e nella progressione del cancro al cervello. Lavori recenti si sono concentrati sull'attività neuronale, che sembra guidare la crescita e la mitosi delle neoplasie gliali attraverso fattori di crescita secreti e comunicazioni sinaptiche elettrochimiche dirette6,9. Reciprocamente, le cellule di glioma di alto grado sembrano influenzare la funzione neuronale con una crescente attività neuronale glutamatergica e modulare il funzionamento dei circuiti in cui sono strutturalmente ed elettricamente integrate9. Quindi, gli studi che utilizzano modelli derivati dal paziente e nuovi strumenti di neuroscienza che controllano l'azione dei neuroni hanno dimostrato un effetto specifico del circuito dell'attività neuronale sulla posizione, la crescita e la progressione del glioma. La maggior parte di queste proiezioni neuronali coinvolte nei gliomi sono glutamatergiche e comunicano attraverso le secrezioni di glutammato. Biomarcatori glutamatergici specifici come mGluR2 o vGlut1/2 sono comunemente descritti6.
È interessante notare che, nonostante la loro eterogeneità molecolare, i gliomi pediatrici e adulti di alto grado mostrano una tipica risposta proliferativa all'attività neuronale glutammatergica e ad altri fattori secreti come la neuroligina-3 o bdNF (fattore neurotrofico derivato dal cervello)4,6,10,11,12,13 . Nelle regioni corticali, gli HHG pediatrici e adulti possono indurre ipereccitabilità neuronale attraverso un aumento della secrezione di glutammato e inibire gli interneuroni GABA che portano a gliomi associati all'attività della rete epilettica14,15. Inoltre, i circuiti neurali possono essere rimodellati dai gliomi spingendo specifici compiti neurologici, ad esempio il linguaggio, e possono richiedere un'ulteriore attività neuronale organizzata9.
Sulla base di questo razionale, l'avanzamento della comprensione delle comunicazioni bidirezionali tra cellule di glioma e neuroni deve essere completamente chiarito e integrato con le prime fasi degli approcci pHGG in vitro. Tale modellazione innovativa è fondamentale per comprendere e misurare l'impatto dell'attività elettrica neuronale durante i test antidroga e anticipare la risposta pHGG nei circuiti cerebrali. I recenti sviluppi negli strumenti di neuroscienza, come i dispositivi microfluidici e i lavori di ricerca pHGG, sono il terreno per sviluppare nuovi approcci di modellazione ed essere ora in grado di integrare il microambiente cerebrale in modelli pHGG in vitro3,16,17,18,19. Accoppiati con registrazioni elettrofisiologiche che utilizzano array multielettrodi (MEA), i dispositivi microfluidici20,21,22 offrono la possibilità di imitare le condizioni fisiologiche registrando l'attività elettrica dell'intera rete neurale ed estrarre i parametri di connettività di rete in diverse condizioni. Questo dispositivo23,24 permette innanzitutto la deposizione precisa delle cellule in una camera direttamente su MEA. Questa tecnologia consente il controllo della densità e dell'omogeneità della semina cellulare su MEA e il controllo fine dello scambio di media, che è un passo fondamentale per la differenziazione del progenitore neurale umano direttamente nei dispositivi. Inoltre, l'attuale camera di deposizione può essere seminata con più cellule in diversi punti temporali.
Quindi, questo studio mirava a sviluppare un modello funzionale in vitro che co-coltivasse neuroni glutamatergici corticali derivati da stelo pluripotente umano (hiPS) e cellule derivate da pHGG in dispositivi microfluidici e registrasse la loro attività elettrica per valutare le interazioni elettriche tra entrambe le popolazioni cellulari. In primo luogo, i neuroni glutamatergici corticali derivati da hiPS sono stati ottenuti e caratterizzati in dispositivi microfluidici in diversi stadi di coltura [giorno 4 (D4), come cellule hiPS, e giorno 21 (D21) e giorno 23 (D23), come neuroni maturi glutamatergici]. Per la seconda fase della co-coltura, sono stati utilizzati due modelli di pHGG: linea UW479 pediatrica commercializzata e cellule pHGG avviate da un tumore del paziente (BT35)3, portatore di una mutazione driver H3.3 K27M. Infine, abbiamo eseguito registrazioni elettrofisiologiche di cellule glutamatergiche a D21 prima della semina delle cellule pHGG e D23 dopo 48 ore di co-coltura nello stesso dispositivo microfluidico. Le interazioni tra neuroni glutamatergici e cellule pHGG sono state caratterizzate da un aumento significativo dell'attività elettrofisiologica registrata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Per questo protocollo, il numero di accreditamento relativo all'uso di materiali umani è DC-2020-4203.
1. Fabbricazione, preparazione e trattamento di dispositivi microfluidici
- Fabbricare stampi SU-8 utilizzando tecniche di fotolitografia convenzionali18.
NOTA: A tale scopo, sono state progettate due maschere fotolitografiche per costruire due strati di strutture fotoresistenti su substrato di wafer di silicio e un sottile strato di fotoresist su SU-8 2005 (alto 3,2 μm e largo 6 ± 1 μm) che definisce microgroove asimmetriche sotto la modellazione dei canali principali realizzati in SU-8 2100 (200 μm di altezza, 1 mm di larghezza, e 13 mm di lunghezza) (vedi Figura supplementare S1). - Attivare il wafer utilizzando un detergente al plasma (5.00e-1 torr, livello ad alta radiofrequenza (RF)) per 1 minuto e silanizzarlo utilizzando 1 mL di (tricloro (1H,1H,2H,2H-perfluoroottil)silano in una cartella di alluminio in un essiccatore per 30 min.
- Preparare un rapporto 10:1 di polidimetilsilossano (PDMS), mescolare il prepolimero con il catalizzatore, passarlo in un essiccatore sottovuoto per rimuovere le bolle intrappolate e gettarlo lentamente sullo stampo prima di essere indurito in forno a 80 °C per 40 minuti.
- Taglialo dopo usando un rasoio alla dimensione desiderata prima di staccare lo stampo. Perforare le zone di ingresso e di uscita per ottenere fori larghi 3 mm, pulire il PDMS e proteggerlo con nastro adesivo.
NOTA: lo spessore del dispositivo PDMS finale è di circa 5 mm. - Trattare il dispositivo utilizzando un detergente al plasma (5.00e-1 torr, Alto livello RF durante 1 minuto), assemblarlo con una capsula di Petri in polistirolo ed esporre il vuoto sotto la luce UV per 30 minuti.
- Riempire con una pipetta l'ingresso del dispositivo microfluidico prima dell'uso con etanolo al 70% e svuotarlo mediante aspirazione di pipettaggio.
- Lavare il dispositivo microfluidico aggiungendo serbatoi di ingresso Dulbecco Fosfato Tamponato Saline (D-PBS) e svuotarlo mediante aspirazione di pipettaggio per tre volte consecutive.
- Rivestire il dispositivo utilizzando 0,05 mg/mL di poli-D-lisina e metterlo in un incubatore (37 °C, 5% CO2). Dopo 24 ore, sciacquare il dispositivo aggiungendo nel serbatoio di ingresso il mezzo neurobasale e svuotarlo mediante pipettaggio dell'aspirazione per tre volte consecutive.
- Riempire il chip microfluidico con il terreno di coltura cellulare e lasciarlo rimanere a temperatura ambiente fino all'uso per un massimo di 2 ore.
2. Preparazione cellulare e semina nel dispositivo microfluidico
- Coltura, semina e caratterizzazione immunofluorescente di neuroni glutamatergici corticali umani derivati da hiPS
NOTA: Effettuare esperimenti con neuroni glutamatergici corticali derivati da hiPS commercializzati (Figura 1A). Preservare i materiali di derivazione umana e maneggiarli con l'approvazione e secondo le linee guida della legislazione.- Svuotare i serbatoi di ingresso e di uscita del dispositivo microfluidico mediante aspirazione a pipetta prima della semina, lasciando che solo i canali del dispositivo vengano riempiti con il mezzo.
- Seminare le cellule hiPS al giorno 0 (D0) mettendo 10 μL di una sospensione di 6,5 x 106 cellule hiPS/mL (ad esempio, concentrazione di 900 cellule/mm2 ) con il mezzo, la cui composizione è riportata nella Tabella 1, e lasciare che il dispositivo sia sotto il cofano (a temperatura ambiente) per 15 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi.
- Dopo 15 minuti, riempire sia i serbatoi di ingresso che di uscita con 50 μL di terreno di coltura D4, la cui intera composizione è riportata nella Tabella 1, e trasferire il dispositivo nell'incubatore (37 °C, 5% CO2).
- Mantenere la differenziazione neuronale glutamatergica per 23 giorni (Figura 1A(1), microscopia) in ambiente controllato (37 °C, 5% CO2) e con uno specifico terreno di coltura cellulare, la cui composizione è descritta nella Tabella 1. Sostituire regolarmente il mezzo come descritto nel passaggio successivo 5. appena sotto e seguire i passaggi come nella Figura 1B.
- Sostituire il mezzo ogni 3 o 4 giorni dopo la composizione della Tabella 1 . Utilizzare il mezzo di semina fino a D4, D4 medio fino a D7, D7 medio fino a D11 e D11 medio per il tempo rimanente della coltura.
- Scatta foto microscopiche a D4, D21 e D23 utilizzando un microscopio a contrasto di fase standard per valutare la vitalità cellulare e consentire il conteggio delle cellule.
- Per la caratterizzazione, fissare i neuroni glutamatergici differenziati in paraformaldeide al 4% (PFA) per 30 minuti a temperatura ambiente dopo l'aspirazione del mezzo e seguire il protocollo per la colorazione a immunofluorescenza.
- Lavare le cellule tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e permeabilizzarle per 10 minuti con 0,1% di Triton-X seguito da 30 minuti con il 3% di albumina sierica bovina (BSA). Aggiungere anticorpi primari e incubare il dispositivo durante la notte a 4 °C.
- Risciacquare le cellule tre volte con PBS e incubare ulteriormente con gli anticorpi secondari corrispondenti per 2 ore a temperatura ambiente.
NOTA: Gli anticorpi immunofluorescenti utilizzati nello studio sono elencati nella Tabella 2. - Risciacquare le cellule tre volte con PBS e controcolorare con DAPI (4',6-diamino-2-fenilindolo) per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Acquisire immagini con un microscopio a epifluorescenza invertita dotato di una telecamera CMOS (Complementary metal-oxide-semiconductor) e analizzarle utilizzando un software di analisi delle immagini appropriato.
- Aprire le immagini macchiate DAPI e binariizzare con la routine di soglia nel software. Per fare ciò, fare clic su Immagine > Regola > soglia e impostare i parametri appropriati per distinguere il nucleo dallo sfondo. Quindi, fare clic su Applica processo > > spartiacque per dividere il nucleo aggregato.
- Successivamente, utilizzare la funzione del software innato Analyze Particles per interpretare le immagini binarie. Per fare ciò, fare clic su Analizza e quindi su Analizza particelle e impostare i parametri appropriati dopo questo: filtro di dimensione e circolarità (escludere dall'analisi oggetti più piccoli di 7 μm, più grandi di 20 μm o con una circolarità inferiore a 0,1 μm).
- Unire le immagini di contorno ottenute dall'analisi DAPI alle immagini immunofluorescenti corrispondenti per convalidare la colorazione corretta.
- Infine, salvare i dati associati (numero di oggetti, area media, % di copertura, ecc.) per i diversi biomarcatori e quantificare l'espressione a D4 e/o D21 utilizzando un software di quantificazione appropriato.
- Coltura cellulare della linea pHGG commercializzata, UW479, e della linea cellulare derivata dal paziente, BT353
- Coltivare entrambe le linee cellulari in DMEM/F-12 GlutaMAX integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) in un pallone di coltura cellulare. Attendere la confluenza dell'80% di ciascuna linea cellulare come presentato nella Figura 1C.
- Mantenere queste cellule pHGG in un ambiente controllato a 37 °C in condizioni normossiche durante gli esperimenti.
3. Protocollo di co-coltura
- Regolare il giorno di semina e la concentrazione per le linee cellulari UW479 e BT35 per raggiungere l'80% delle cellule confluenti quando dovrebbe iniziare la co-coltura, corrispondenti a 21 giorni di coltura per i neuroni glutamatergici.
- Tripsinizzare le cellule UW479 e BT35 e seminarle sulla parte superiore dei neuroni glutamatergici in ciascun dispositivo microfluidico dedicato (con una densità target di 900 cellule / mm2 per ciascun tipo di cellula) prima di seminare le cellule pHGG nel dispositivo microfluidico contenente neuroni glutamatergici maturi.
- Mantenere le co-colture per 2 giorni in un ambiente controllato (37 °C, 5% CO2) con neurone glutamatergico D11 e mezzo successivo dettagliato nella Tabella 1.
- Conta le cellule pHGG utilizzando le immagini microscopiche analizzate con un software di analisi delle immagini per valutarne la fattibilità. Calcolare la percentuale di celle.
NOTA: utilizzare la seguente formula: 100 - ((numero di celle in D23 / numero di celle in D21) x 100).
4. Registrazione elettrofisiologica
- Eseguire la registrazione elettrofisiologica con un sistema commerciale e software disponibile in commercio.
NOTA: Gli esperimenti sono stati condotti con un MEA che consisteva in elettrodi di 30 μm di diametro distanziati di 100 μm. - Eseguire una prima registrazione elettrofisiologica sui neuroni glutamatergici a D21 prima della semina delle cellule pHGG. Utilizzare i neuroni glutamatergici differenziati come controllo e coltivarli da soli in parallelo alla co-coltura. Eseguire una seconda registrazione per entrambe le condizioni come descritto nel passaggio successivo numerato 3.
- Eseguire una seconda registrazione elettrofisiologica al D23 (dopo 2 giorni di co-coltura).
5. Trattamento elettrofisiologico dei dati
- Filtrare i dati grezzi con un filtro Butterworth passa-banda di 2° ordine (con frequenze passband di 100 Hz e 2500 Hz).
- Per il rilevamento dei picchi, calcolare il quadrato medio della radice del segnale durante la registrazione di 10 minuti per ciascun elettrodo e impostare una soglia di ampiezza corrispondente a otto volte il valore quadrato di questa media radice.
- Applicare un algoritmo PTSD (Precision Timing Spike Detection25), considerando una durata massima di 2 ms per un potenziale d'azione.
- Considera come un elettrodo attivo, ogni elettrodo che rileva almeno 5 picchi / min. Continuare il test se almeno il 10% degli elettrodi di registrazione sono attivi.
- Dividere il numero di picchi rilevati per il periodo di tempo di registrazione per calcolare la velocità media di accensione di ciascun elettrodo attivo. Calcola una velocità media di sparo per ogni esperimento indipendente. In definitiva, calcola una media per condizione (±SEM) ed esprimila come funzione il giorno della registrazione.
- Calcola un grafico raster per ogni esperimento che rappresenta gli eventi rilevati per ciascun elettrodo attivo in funzione del tempo. Quindi, calcola le velocità di sparo a livello di array temporale (o velocità di accensione istantanea) di tutti gli elettrodi attivi, consentendo di monitorare la sincronicità dell'attività della rete neurale.
- Infine, genera grafici a barre utilizzando il software di quantificazione ed esegui confronti utilizzando i test kruskal Wallis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prima di studiare le interazioni elettriche tra neuroni glutamatergici e cellule di glioma, i neuroni glutamatergici corticali derivati da hiPS sono stati caratterizzati per convalidare la fattibilità di coltivarli in dispositivi microfluidici (Figura 1A). La loro caratterizzazione è stata valutata utilizzando Nestin, Sox2, mGlurR2 (metabotropic Glutamate Receptors 2) e vGLUT1 immunocolore, rappresentati nella Figura 1A (2-7) . Poiché la nestina è una proteina del filamento intermedio necessaria per la sopravvivenza, il rinnovamento e la proliferazione stimolata dai mitogeni delle cellule progenitrici neurali, è quindi espressa in cellule del SNC indifferenziate durante lo sviluppo. Sox2 è un membro della famiglia di fattori di trascrizione del gene HMG-box (SOX) SRY-like coinvolto nella regolazione dello sviluppo embrionale ed è prevalentemente espresso in cellule immature e indifferenziate dell'epitelio neurale nel SNC. mGluR2 è ampiamente distribuito in tutto il cervello, con alta espressione nella corteccia e nell'ippocampo. Di solito, definisce le cellule presinaptiche con la loro eccitabilità neuronale e trasmissione sinaptica (ad esempio, i neuroni glutamatergici). vGLUT1 è anche usato come biomarcatore glutamatergico. Pertanto, la Figura 1 si concentra sui neuroni glutamatergici con espressioni di Nestin e Sox2 a D4 e D21 per convalidare la loro progressiva differenziazione nelle condizioni di coltura (Figura 1A (2-4). La percentuale di cellule nestine positive è diminuita dal 5,4 ± dello 0,4% a D4 a 0,69 ± dello 0,3% a D21 (p < 0,01, Figura 1A5). Allo stesso modo, confermando lo stato differenziato dei neuroni glutamatergici, la percentuale di cellule Sox2 positive è diminuita da 12,2 ± 2,1% a D4 a 5,5 ± 1,7% a D21 (p < 0,05, vedi Figura 1A6). L'espressione di mGluR2 è stata rilevata nel 45,4 ± 4,7% delle cellule glutamatergiche a D21 (dati non mostrati) e un immunocolore vGLUT1 più grande è stato osservato durante la differenziazione glutamatergica a D21. Questi risultati hanno dimostrato che la proporzione di progenitori neurali è rimasta bassa e che la maggior parte delle cellule era ben differenziata dopo una coltura di 21 giorni nei dispositivi microfluidici. Nella Figura 1B, un protocollo generale delle co-colture multistep e della registrazione elettrofisiologica descrive la semina cellulare UW479 o BT35 nei dispositivi microfluidici a D21. Queste linee cellulari (Figura 1C) erano già state descritte e sono paragonabili alle precedenti osservazioni fatte da noi3,19. Alla fine, sono state ottenute due registrazioni elettrofisiologiche: una a D21 prima della co-coltura e l'altra a D23 dopo 48 ore di semina della linea cellulare pHGG.
Per comprendere e seguire la mobilità e la vitalità di BT35, UW479 e dei neuroni glutamatergici durante le co-colture, le valutazioni microscopiche sono state regolarmente eseguite durante il periodo di registrazione elettrofisiologica da D21 a D23 e sono presentate nella Figura 2. Le immagini microscopiche hanno rivelato una progressiva estensione e una particolare distribuzione dei neuroni glutammatergici attraverso dispositivi microfluidici (Figura 2A). Le cellule glutamatergiche formano alcuni aggregati progressivamente in modo simile in co-coltura e quando coltivate da sole fino a D23 (esperimento di controllo). Nella Figura 2B,C, quando si aggiungono BT35 e UW479, è stato osservato che le cellule galleggianti presenti immediatamente dopo la semina delle cellule di glioma a D21 sono progressivamente scomparse fino a D23 e sono diventate cellule pHGG aderenti nel dispositivo. Ciò è stato particolarmente notevole per la linea UW479.
Inoltre, non c'è stato alcun aumento delle celle galleggianti dopo tutte le registrazioni elettrofisiologiche a D23 (dati non mostrati). Tuttavia, le percentuali di cellule vitali nella Figura 2D sono state stimate rispettivamente all'83,02% e all'85,16% per BT35 e UW479. Entrambe le viabilità di linea erano comparabili e sottolineavano il fatto che le linee cellulari derivate dal paziente possono essere utilizzate in modo appropriato. La preparazione tecnica di dispositivi microfluidici accoppiati a MEA e manipolazioni cellulari non altera le loro capacità di adesione. Non sembra indurre la morte cellulare o modificare i loro aspetti microscopici. Le cellule BT35 e UW479 sembrano mappare le posizioni esatte dei neuroni glutamatergici nel dispositivo, migrando da vicino verso i neuroni eccitatori.
La Figura 3 descrive come esempio le co-colture di neuroni UW479/glutamatergici con il loro rilevamento di picchi lungo il tempo di registrazione in Figura 3A e il suo grafico raster a D23 in Figura 3B, mostrando una maggiore attività elettrica quando si aggiungono cellule pHGG. La Figura 3C presenta la velocità di attivazione a livello di array temporale in co-colture di neuroni BT35/glutammatergici. Le differenze tra l'esperimento di controllo (coltura di neuroni glutamatergici) e le co-colture di neuroni glutammatergici con cellule pHGG sono significative quando si registra l'attività elettrica D23, come mostrato nella Figura 3D, che indica un impatto del pHGG sull'eccitabilità dei neuroni.
| Componenti | Mezzo di semina | D4 medio | D7 medio | D11 e successivi medi |
| DMEM/F-12 Medio | 0,5x | 0,25x | 0,125x | Ø |
| Mezzo Neurobasale | 0,5x | 0,25x | 0,125x | Ø |
| BrainPhys Medio | Ø | 0,5x | 0,75x | 1x |
| Supplemento SM1 | 1x | 1x | 1x | 1x |
| N2 Supplemento-A | 1x | 1x | 1x | 1x |
| Ala-Gln (GlutaMax) | 0,5 mM | 0,5 mM | 0,5 mM | 0,5 mM |
| BDNF · | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml |
| GDNF · | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml |
| TGF-β1 | 1 ng/mL | 1 ng/mL | 1 ng/mL | 1 ng/mL |
| Geltrex · | 30 μg/mL | Ø | Ø | Ø |
| Supplemento di semina | 1x | Ø | Ø | Ø |
| Supplemento Giorno 4 | Ø | 1x | Ø | Ø |
Tabella 1: Composizione dei terreni di coltura per i neuroni glutamatergici derivati da hiPS.
| Anticorpi | Concentrazioni di stock | Diluizioni di lavoro |
| Nestin · | 0,5 mg/mL | 1:500 |
| (1 μg/mL) | ||
| Sox2 · | 1 mg/ml | 1:500 |
| (2 μg/mL) | ||
| mGluR2 | 0,2 mg/ml | 1:50 |
| (4 μg/mL) | ||
| vGlut1 | 0,25 mg/ml | 1:50 |
| (5 μg/ml) | ||
| Asino anti-coniglio IgG H&L (AF 647) | 2 mg/ml | da 1:1000 a 1:2000 |
| (da 1 a 2 μg/mL) | ||
| Asino anti-mouse IgG H&L (AF 555) | 2 mg/ml | 1:1000 |
| (2 μg/mL) |
Tabella 2: Elenco degli anticorpi immunofluorescenti.
Figura 1: Caratterizzazione cellulare e protocollo di co-coltura di neuroni glutamatergici e linee di glioma pediatrico di alto grado (pHGG). (A) Caratterizzazione microscopica e immunofluorescente prerequisito dei neuroni glutamatergici. (1) Immagini microscopiche al giorno 21 (D21) e al giorno 23 (D23) dei neuroni glutamatergici. (2) Etichettatura Nestin in verde e DAPI in blu a D4 (riga superiore) e D21 (riga inferiore). (3) Etichettatura Sox2 in verde e DAPI in blu a D4 (riga superiore) e D21 (riga inferiore). (4) Etichettatura mGluR2 in verde e DAPI in blu a D21. (5 e 6) Confronti statistici tra Nestin e Sox2 che etichettano a D4 e D21 di coltura, dimostrando la differenziazione cellulare. (7) vGlut1 colorazione in verde e DAPI in arancione a D21. (B) Protocollo generale per la registrazione elettrofisiologica per studiare le interazioni durante la co-coltura di neuroni glutammatergici e cellule di glioma su dispositivi. (C) Aspetti microscopici prerequisiti delle linee cellulari BT35 e UW479. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini microscopiche di cellule glutamatergiche e glioma coltivate in dispositivi microfluidici accoppiati a array multielettrodi (MEA). I neuroni glutamatergici sono differenziati e coltivati da soli nel dispositivo microfluidico fino al giorno 21 (D21). (A) Per questo controllo sperimentale, solo il mezzo è stato aggiunto alle cellule glutamatergiche a D21, mentre le linee cellulari BT35 (B) o UW479 (C) sono state aggiunte nelle rispettive condizioni. Le immagini a D22 e D23 sono state eseguite prima delle registrazioni elettrofisiologiche per ciascuna condizione. Tutte le immagini sono state ottenute utilizzando un classico microscopio a contrasto di fase. (D) La vitalità delle cellule tumorali per BT35 e UW479 a D23 è stata stimata utilizzando un conteggio automatizzato con software di analisi delle immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Registrazione elettrofisiologica. (A) Rilevamento di picchi lungo il tempo di registrazione in co-colture neuronali UW479/glutamatergici. (B) Un esempio del grafico raster calcolato a D23 rappresenta gli eventi rilevati per ciascun elettrodo attivo in funzione del tempo nelle co-colture neuronali UW479/glutamatergici. (C) Velocità di sparo temporale a livello di array (o velocità di sparo istantanea) di tutti gli elettrodi attivi che registrano l'attività elettrica in co-colture neuronali BT35/glutammatergiche, consentendo di monitorare la sincronicità dell'attività della rete neurale. (D) Grafici a barre della velocità media di attivazione nella condizione di controllo (ad esempio, la coltura di neuroni glutammatergici) e quando si aggiunge la linea cellulare tumorale UW479 (in verde) e la linea cellulare BT35 (in rosso). I dati sono indicati come ± sem. (* p < 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare S1: Rappresentazione 3D (3-dimensionale) di stampi SU-8. (A) Creazione e creazione di stampi SU-8 con software AutoCAD. (B) Immagine degli stampi SU con i due strati di strutture fotoresistenti e quattro fori di 3 mm di larghezza. Fare clic qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo lavoro descrive un accurato modello funzionale in vitro per valutare l'interazione tra neuroni glutamatergici corticali umani derivati da hiPS e cellule tumorali cerebrali in dispositivi microfluidici. Uno dei passaggi cruciali del presente protocollo è stata la differenziazione hiPS nei neuroni glutamatergici, che è stata confermata dalla diminuzione della colorazione immunofluorescente Nestin e Sox2 e dalla comparsa simultanea della colorazione mGluR2 e vGLUT1. Tuttavia, pochi progenitori neurali sono rimasti poiché solo la metà delle cellule glutamatergiche esprimeva mGluR2, il che significa una popolazione eterogenea di cellule neuronali. Complessivamente, questi risultati sottolineano che particolare attenzione deve essere dedicata alla crescita delle cellule glutamatergiche in tali dispositivi. Inoltre, il passo successivo studiando il comportamento elettrico dei neuroni in presenza di cellule pHGG è stato relativamente laborioso per impostare l'elaborazione dei dati per ottimizzare il rilevamento e l'interpretazione dei picchi. Tuttavia, come previsto e descritto in altri lavori pubblicati di recente4,5,6,9,10, la presenza di pHGG e neuroni glutammatergici migliora l'attività elettrica confermando la caratteristica eccitatoria di quei neuroni.
Il principale limite di questa modellazione potrebbe essere la distribuzione eterogenea dei neuroni sul MEA stesso che può avere un impatto sulle registrazioni elettrofisiologiche. Richiederebbe il mantenimento di colture ad alta densità nel dispositivo microfluidico. Per seminare un tipo di cellula secondaria sul dispositivo, è fondamentale mantenere una rapida proliferazione e migrazione inizialmente per 48 ore e ottenere come per i neuroni una distribuzione omogenea nella tecnica di 48 ore per la registrazione. Un'altra limitazione è la differenziazione visiva dei diversi tipi di popolazioni cellulari in tali dispositivi, ma nuovi approcci che utilizzano nanoparticelle fluorescenti potrebbero aiutare a seguire entrambi i tipi di cellule26. Infine, le prestazioni di questo approccio microfluidico sono state fatte solo in due tipi di linee phGG e dovrebbero essere estese a più linee cellulari derivate dal paziente con diversi driver molecolari. Valutazioni complementari potrebbero essere fatte per comprendere questo effetto eccitatorio quando si co-coltivano quelle cellule. Tuttavia, è fattibile con cellule pHGG portatrici di una mutazione del driver H3.3 K27M, come nella linea BT353.
Il metodo generale sviluppato in questo lavoro è uno dei nuovi approcci per esplorare l'impatto elettrico. Ha dimostrato la capacità dell'analisi della rete neurale di trasdurre l'interazione tra i neuroni glutamatergici derivati da hiPS e le linee cellulari tumorali pHGG in condizioni di coltura microfluidica. Questo metodo è utile per molte applicazioni, in particolare per studi funzionali e meccanicistici e per analizzare gli effetti di agenti farmacologici che possono bloccare la migrazione cellulare pHGG e l'interazione con i neuroni. Sottolinea l'uso di dispositivi microfluidici, ma in particolare quando gli esperimenti potrebbero registrare l'attività elettrofisiologica e possono essere aggiunti a un MEA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AB, MG, JR, LM, ML, JV, DD sono impiegati da NETRI, FL è Chief Technology Officer presso NETRI e TH è Chief Scientific Officer presso NETRI. Gli altri autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del programma Satt Conectus, Fondation de l'Université de Strasbourg, «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Franck, Rayon de Soleil» e «Semeurs d'Etoile». Ringraziamo i bambini e le famiglie colpite dagli HHG per il loro contributo a questa ricerca e il loro sostegno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
| Cortical Glutamatergic Neurons | BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | - | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
References
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Ostrom, Q. T., et al. Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro-Oncology. 16, Suppl 10 1-36 (2015).
- Blandin, A. F., et al. Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity. Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).
- Monje, M.
- Mount, C. W., Yalçın, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity. eLife. 18 (8), 49291 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders. Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Neftel, C., et al. An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Krishna, S., et al. Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival. BioRxiv. , (2021).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).
- Wang, X., et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression. Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).
- Venkatesh, H. S., et al. Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma. Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).
- Venkatesh, H. S., et al. Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion. Cell. 161 (4), 803-816 (2015).
- Buckingham, S. C., et al. Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity. Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).
- Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks. Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).
- Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks. BioRxiv. , (2021).
- Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings. Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).
- Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks. Scientific Reports. 6, 28384 (2016).
- Nguyen, A., et al. Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1α axis inhibition. Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Cerea, A., et al. Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors. Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).
- Bruno, G., et al. Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Maisonneuve, B. G. C., et al. Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework. BioRxiv. , (2021).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Andreiuk, B., et al. Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo. Small. 13 (38), (2017).
