Summary
Trabalhos recentes revelam o impacto neuronal em células de glioma pediátrico de alto grau (pHGG) e suas interações recíprocas. O presente trabalho mostra o desenvolvimento de um modelo in vitro co-culminando células pHGG e neurônios glutamatergicos e registrou suas interações eletrofisiológicas para imitar essas interatividades.
Abstract
gliomas pediátricos de alto grau (pHGG) representam cânceres cerebrais infantis e adolescentes que carregam um rápido prognóstico sombrio. Uma vez que há a necessidade de superar a resistência aos tratamentos atuais e encontrar uma nova forma de cura, modelar a doença o mais próximo possível em um ambiente in vitro para testar novas drogas e procedimentos terapêuticos é altamente exigente. Estudar seus processos patobiológicos fundamentais, incluindo a hiperexcitabilidade do neurônio glutamtergógico, será um verdadeiro avanço na compreensão das interações entre o cérebro ambiental e as células pHGG. Portanto, para recriar as interações de neurônios/células pHGG, este trabalho mostra o desenvolvimento de um modelo in vitro funcional co-culturando tronco pluripotente induzido por humano (hiPS) neurônios glutamatericos derivados pHGG células pHGG em dispositivos microfluidos compartimentalizados e um processo para registrar suas modificações eletrofisiológicas. O primeiro passo foi diferenciar e caracterizar neurônios glutamatericos humanos. Em segundo lugar, as células foram cultivadas em dispositivos microfluidos com linhas celulares derivadas pHGG. O microambiente cerebral e a atividade neuronal foram então incluídos neste modelo para analisar o impacto elétrico das células pHGG nesses neurônios microambientes. Gravações eletrofisiológicas são acopladas usando matrizes multielerodas (MEA) a esses dispositivos microfluidos para imitar condições fisiológicas e registrar a atividade elétrica de toda a rede neural. Um aumento significativo da excitabilidade dos neurônios foi sublinhado na presença de células tumorais.
Introduction
Os gliomas pediátricos de alto grau (pHGG) apresentam uma diversidade genotípica e fenotípica estendida, dependendo da idade do paciente, localização e extensão anatômicas do tumor e drivers moleculares1. São tumores cerebrais agressivos que são mal controlados com as opções de tratamento disponíveis atualmente e são a principal causa de morte relacionada a cânceres cerebrais em crianças e adolescentes2. Assim, mais de 80% dos pacientes estão recaídas dentro de 2 anos após seu diagnóstico, e sua sobrevida mediana é de 9 a 15 meses, dependendo das localizações cerebrais e mutações do motorista. A ausência de tratamento curativo é o principal impulso para pesquisas laboratoriais e destaca a necessidade imediata de novas abordagens terapêuticas inovadoras. Para isso, as linhas celulares derivadas do paciente (PDCL) foram desenvolvidas com a esperança de fornecer a diversidade pHGG3 em linhas bidimensionais (2D) e/ou neuroesferas tridimensionais (3D). No entanto, essas culturas celulares in vitro derivadas do paciente não imitam todas as situações variáveis cerebrais. Esses modelos não consideram os ambientes neuroscópicos e microscópicos macroscópicos tipicamente descritos no pHGG.
Normalmente, o pHGG em crianças mais jovens está se desenvolvendo principalmente em regiões pontinas e talámicas, enquanto o HGG de adolescentes e jovens adultos se concentra nas áreas corticais, especialmente nos lobos frontotemporâneos1. Essas especificidades de localização em idades pediátricas parecem envolver diferentes ambientes que levam à gliomagênese e a uma rede metiço entre células tumorais e atividade neuronal específica4,5,6. Embora os mecanismos ainda não sejam identificados, o pHGG desenvolve-se principalmente a partir de células precursoras neurais ao longo da trajetória de diferenciação das linhagens astroglial e oligodendroglial. Embora o papel dessas linhagens gliais tenha sido por muito tempo restrito ao simples suporte estrutural para os neurônios, agora está claramente estabelecido que eles se integram inteiramente em circuitos neurais e exibem complexas interações gliais-neuronais complexas capazes de reorganizar regiões estruturais do cérebro e remodelar circuitos neuronais4,7,8 . Além disso, o aumento de fragmentos de evidências indica que o sistema nervoso central (SNC) desempenha um papel crítico na iniciação e progressão do câncer cerebral. Trabalhos recentes se concentraram na atividade neuronal, que parece impulsionar o crescimento e a mitose das malignidades gliais através de fatores de crescimento secretados e comunicações sinápticas eletroquímicas diretas6,9. Reciprocamente, as células de glioma de alto grau parecem influenciar a função neuronal com uma atividade neuronal glutamatergic crescente e modular o funcionamento dos circuitos nos quais estão estruturalmente e eletricamente integrados9. Assim, estudos usando modelos derivados do paciente e novas ferramentas de neurociência que controlam a ação dos neurônios demonstraram um efeito específico do circuito da atividade neuronal na localização, crescimento e progressão do glioma. A maioria dessas projeções neuronais envolvidas em gliomas são glutamatergicas e se comunicam através de secreções de glutamato. Biomarcadores glutamérgicos específicos, como mGluR2 ou vGlut1/2, são comumente descritos6.
Curiosamente, apesar de sua heterogeneidade molecular, gliomas pediátricos e adultos de alto grau mostram uma resposta proliferativa típica à atividade neuronal glutamatergica e outros fatores secretados como neuroligina-3 ou BDNF (fator neurotrófico derivado do cérebro)4,6,10,11,12,13 . Nas regiões corticais, os HGGs pediátricos e adultos podem induzir a hiperexcitabilidade neuronal através de uma secreção de glutamato aumentada e inibir interneurônios GABA que levam a gliomas associados à atividade da rede epiléptica14,15. Além disso, circuitos neurais podem ser remodelados por gliomas empurrando tarefas neurológicas específicas, por exemplo, linguagem, e podem requisitar atividades neuronais organizadas adicionais9.
Com base nessa lógica, o avanço da compreensão das comunicações bidirecionais entre células glioma e neurônios deve ser totalmente elucidado e integrado com os estágios iniciais das abordagens in vitro pHGG. Tal modelagem inovadora é crucial para entender e medir o impacto da atividade elétrica neuronal durante o teste de drogas e antecipar a resposta do PHGG em circuitos cerebrais. Desenvolvimentos recentes em ferramentas de neurociência, como dispositivos microfluidos e trabalhos de pesquisa pHGG, são o leito para desenvolver novas abordagens de modelagem e agora ser capaz de integrar o microambiente cerebral em modelos in vitro pHGG3,16,17,18,19. Juntamente com gravações eletrofisiológicas usando matrizes multieletrônicas (MEA), dispositivos microfluidos20,21,22 oferecem a possibilidade de imitar condições fisiológicas ao registrar a atividade elétrica de toda a rede neural e extrair parâmetros de conectividade de rede em várias condições. Este dispositivo23,24 permite primeiro a deposição precisa de células em uma câmara diretamente no MEA. Esta tecnologia permite o controle da densidade de semeadura celular e homogeneidade no MEA e o controle fino da troca de mídia, que é um passo crítico para a diferenciação de progenitores neurais humanos diretamente em dispositivos. Além disso, a atual câmara de deposição pode ser semeada com múltiplas células em diferentes pontos de tempo.
Assim, este estudo teve como objetivo desenvolver um modelo in vitro funcional co-culminando neurônios glutamatergicos derivados do padrão pluripotente (hiPS) derivados de neurônios glutamatergicos derivados e células derivadas do pHGG em dispositivos microfluidos e registrando sua atividade elétrica para avaliar interações elétricas entre ambas as populações celulares. Primeiro, os neurônios glutamatericos cortical derivados do hiPS foram obtidos e caracterizados em dispositivos microfluidos em diferentes estágios da cultura [dia 4 (D4), como células hiPS, e dia 21 (D21) e dia 23 (D23), como neurônios amadurecidos glutamater]. Para a segunda etapa da cocultura, foram utilizados dois modelos pHGG: a linha UW479 pediátrica comercializada e as células pHGG iniciadas a partir de um tumor do paciente (BT35)3, com uma mutação do driver H3.3 K27M. Finalmente, realizamos gravações eletrofisiológicas de células glutamatergicas em D21 antes da semeadura celular pHGG e D23 após 48 h de co-cultura no mesmo dispositivo microfluido. As interações entre neurônios glutamatergicos e células pHGG foram caracterizadas por um aumento significativo na atividade eletrofisiológica registrada.
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Protocol
Para este protocolo, o número de credenciamento relacionado ao uso de materiais humanos é DC-2020-4203.
1. Fabricação, preparação e tratamento de dispositivos microfluidos
- Fabricar moldes SU-8 utilizando técnicas de fotolitografia convencionais18.
NOTA: Para isso, duas máscaras fotolitografia foram projetadas para construir duas camadas de estruturas fotoresististas no substrato de wafer de silício e uma fina camada fotoresista SU-8 2005 (3,2 μ m alto e 6 ± 1 μm de largura) que define microrressométricas sob a padronização dos principais canais feitos em SU-8 2100 (200 μm de altura, 1 mm de largura, e 13 mm de comprimento) (ver Figura Suplementar S1). - Ative o wafer usando um limpador de plasma (5.00e-1 torr, alto nível de radiofrequência (RF) por 1 min e silanize-o usando 1 mL de (tricloro(1S,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano em uma pasta de alumínio em um desiccador por 30 minutos.
- Prepare uma proporção de 10:1 de Polidimtilsiloxano (PDMS), misture o prepolímero com catalisador, passe-o em um dessector de vácuo para remover bolhas presas e lance-o lentamente sobre o molde antes de ser curado em um forno a 80 °C por 40 min.
- Corte-o depois disso usando uma navalha no tamanho desejado antes de descascar o molde. Bata a entrada e as zonas de saída para obter furos de 3 mm de largura, limpe o PDMS e proteja-o usando fita adesiva.
NOTA: A espessura do dispositivo PDMS final é de aproximadamente 5 mm. - Trate o dispositivo usando um limpador de plasma (5.00e-1 torr, alto nível de RF durante 1 min), monte-o com uma placa de Petri de poliestireno e exponha o vácuo sob luz UV por 30 minutos.
- Encha com uma pipeta a entrada do dispositivo microfluido antes do uso com 70% de etanol e esvazie-o por aspiração de tubulação.
- Lave o dispositivo microfluido adicionando reservatórios de entrada O Soro tampão tampão de fosfato (D-PBS) de Dulbecco e esvazie-o por aspiração de tubulação três vezes consecutivas.
- Cubra o dispositivo usando 0,05 mg/mL Poly-D-Lysine e coloque-o em uma incubadora (37 °C, 5% DE CO2). Após 24 horas, enxágue o dispositivo adicionando no reservatório de entrada o meio neurobásal e esvazie-o por aspiração de tubulação três vezes consecutivas.
- Encha o chip microfluido com o meio de cultura celular e deixe-o permanecer em temperatura ambiente até que seja usado por um máximo de 2 h.
2. Preparação celular e semeadura no dispositivo microfluido
- Cultura, semeadura e caracterização imunofluorescente de neurônios glutamatergicos derivados do hiPS humano
NOTA: Realizar experimentos com neurônios glutamatergicos cortical derivados de hiPS (Figura 1A). Preservar materiais derivados do homem e manuseá-los com a aprovação e sob as diretrizes da legislação.- Esvazie os reservatórios de entrada e saída do dispositivo microfluido por aspiração de pipeta antes da semeadura, permitindo que apenas os canais do dispositivo sejam preenchidos com meio.
- Semente as células hiPS no dia 0 (D0) colocando 10 μL de uma suspensão de células hiPS/mL de 6,5 x 106 (por exemplo, concentração de 900 células/mm2 ) com o meio, cuja composição é dada na Tabela 1, e deixe o dispositivo ficar sob o capô (à temperatura ambiente) por 15 minutos para permitir que as células se conectem.
- Após 15 min, encha tanto os reservatórios de entrada quanto de saída com 50 μL de meio de cultura D4, cuja composição inteira é dada na Tabela 1, e transfira o dispositivo para a incubadora (37 °C, 5% DE CO2).
- Manter a diferenciação de neurônio glutamatergic por 23 dias (Figura 1A(1), microscopia) em ambiente controlado (37 °C, 5% CO2) e com um meio de cultura celular específico, cuja composição está descrita na Tabela 1. Substitua o meio regularmente conforme detalhado na próxima etapa 5. logo abaixo e siga os passos como na Figura 1B.
- Substitua o meio a cada 3 a 4 dias após a composição da Tabela 1 . Utilize o meio de semeadura até D4, D4 médio até D7, D7 médio até D11 e meio D11 para o tempo restante da cultura.
- Tire fotos microscópicas em D4, D21 e D23 usando um microscópio padrão de contraste de fase para avaliar a viabilidade celular e permitir a contagem de células.
- Para caracterização, fixar os neurônios glutamatergicos diferenciados em 4% de paraformaldeído (PFA) por 30 minutos à temperatura ambiente após aspiração média e seguir o protocolo de coloração de imunofluorescência.
- Lave as células três vezes com Salina Tamponada de Fosfato (PBS) e permeabiliza-as por 10 minutos com 0,1% Triton-X seguida por 30 min com 3% de Albumina de Soro Bovino (BSA). Adicione anticorpos primários e incubar o dispositivo durante a noite a 4 °C.
- Enxágüe as células três vezes com PBS e incuba ainda mais com os anticorpos secundários correspondentes por 2 h à temperatura ambiente.
NOTA: Os anticorpos imunofluorescentes utilizados no estudo estão listados na Tabela 2. - Enxágüe as células três vezes com PBS e contraten com DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole) por 10 minutos à temperatura ambiente.
- Adquira imagens com um microscópio de epifluorescência invertida equipado com uma câmera CMOS (Complementary metal-óxido-semicondutor) e analise usando um software de análise de imagem apropriado.
- Abra as imagens manchadas do DAPI e binarize com a rotina de limiar no software. Para fazer isso, clique em Imagem > Ajuste > Limiar e defina os parâmetros apropriados para distinguir o núcleo do plano de fundo. Em seguida, clique em Aplicar > Processo > Bacia hidrográfica para dividir o núcleo agregado.
- Depois disso, use a função do software Analyze Particles inata para interpretar as imagens binárias. Para fazer isso, clique em Analisar partículas e, em seguida, em Analisar partículas e definir os parâmetros apropriados após isso: filtro de tamanho e circularidade (exclua de objetos de análise menores que 7 μm, maiores que 20 μm, ou com uma circularidade menor que 0,1 μm).
- Mescle as imagens de contorno obtidas da análise da DAPI às imagens imunofluorescentes correspondentes para validar a coloração correta.
- Finalmente, salve os dados associados (número de objetos, área média, % de cobertura, etc.) para os diferentes biomarcadores e quantifique a expressão em D4 e/ou D21 usando software de quantificação apropriado.
- Cultura celular da linha pHGG comercializada, UW479, e linha celular derivada do paciente, BT353
- Cultura ambas as linhas celulares em DMEM/F-12 GlutaMAX suplementadas com 10% de Soro Bovino Fetal (FBS) em um frasco de cultura celular. Aguarde 80% de confluência de cada linha celular apresentada na Figura 1C.
- Mantenha essas células pHGG sob um ambiente controlado a 37 °C em condições normóxias durante os experimentos.
3. Protocolo de co-cultura
- Ajuste o dia de semeadura e a concentração das linhas celulares UW479 e BT35 para atingir 80% das células confluentes quando a co-cultura deve começar, correspondendo a 21 dias de cultura para neurônios glutamatergicos.
- Experimentpsinize as células UW479 e BT35 e semeá-las no topo dos neurônios glutamatergicos em cada dispositivo microfluido dedicado (com uma densidade alvo de 900 células/mm2 para cada tipo de célula) antes de semear as células pHGG no dispositivo microfluido contendo neurônios glutamatergicos maduros.
- Manter as coculturas por 2 dias em ambiente controlado (37 °C, 5% CO2) com neurônio glutamatergic D11 e meio em diante detalhado na Tabela 1.
- Conte células pHGG usando as imagens microscópicas analisadas com um software de análise de imagem para avaliar sua viabilidade. Calcule a porcentagem de células.
NOTA: Use a seguinte fórmula: 100 - ((número de células em D23 / número de células em D21) x 100).
4. Gravação eletrofisiológica
- Realize a gravação eletrofisiológica com um sistema comercial e software comercialmente disponível.
NOTA: Os experimentos foram realizados com um MEA que consistia de eletrodos de 30 μm de diâmetro espaçados por 100 μm. - Realize um primeiro registro eletrofisiológico em neurônios glutamatericos em D21 antes da semeadura de células pHGG. Use os neurônios glutamatericos diferenciados como controlá-los e cultuá-los sozinhos em paralelo à cocultura. Faça uma segunda gravação para ambas as condições, conforme descrito no próximo passo numerado 3.
- Realize uma segunda gravação eletrofisiológica na D23 (após 2 dias de co-cultura).
5. Processamento de dados eletrofisiológicos
- Filtre os dados brutos com um filtro Butterworth de 2ª ordem (com frequências de banda de passagem de 100 Hz e 2500 Hz).
- Para detecção de picos, calcule o quadrado médio raiz do sinal ao longo da gravação de 10 minutos para cada eletrodo e defina um limiar de amplitude correspondente a oito vezes o valor quadrado desta raiz.
- Aplique um algoritmo PTSD (Precision Timing Spike Detection25), considerando uma duração máxima de 2 ms para um potencial de ação.
- Considere como um eletrodo ativo, cada eletrodo detectando pelo menos 5 picos/min. Continue o ensaio se pelo menos 10% dos eletrodos de gravação estiverem ativos.
- Divida o número de picos detectados pelo período de tempo de gravação para calcular a taxa média de disparo de cada eletrodo ativo. Calcule uma taxa média média de disparo para cada experimento independente. Em última análise, calcule uma média por condição (±SEM) e expresse-a como uma função no dia da gravação.
- Calcule um gráfico raster para cada experimento representando os eventos detectados para cada eletrodo ativo em função do tempo. Em seguida, calcule as taxas de disparo em toda a matriz temporal (ou taxas de disparo instantâneas) de todos os eletrodos ativos, permitindo monitorar a sincronicidade da atividade da rede neural.
- Finalmente, gere gráficos de barras usando o software de quantificação e realize comparações usando testes kruskal Wallis.
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Representative Results
Antes de estudar as interações elétricas entre neurônios glutamatergicos e células glioma, os neurônios glutamatergicos cortical derivados do hiPS foram caracterizados para validar a viabilidade de culminá-los em dispositivos microfluidos (Figura 1A). Sua caracterização foi avaliada utilizando Nestin, Sox2, mGlurR2 (receptores metabotrópicos de glutamato 2), e imunostaining vGLUT1, representado na Figura 1A(2-7). Como o Nestin é uma proteína de filamento intermediário necessária para a sobrevivência, renovação e proliferação estimulada por mitogênios de células progenitoras neurais, é assim expressa em células CNS indiferenciadas durante o desenvolvimento. Sox2 é um membro da família de fatores de transcrição do gene HMG-box (SOX) semelhante ao SRY envolvido na regulação do desenvolvimento embrionário, e é predominantemente expresso em células imaturas e indiferenciadas do epitélio neural no CNS. MGluR2 é amplamente distribuído por todo o cérebro, com alta expressão no córtex e hipocampo. Normalmente, define as células pré-sinápticas com sua excitabilidade neuronal e transmissão sináptica (por exemplo, os neurônios glutamatericos). vGLUT1 também é usado como um biomarcador glutamterágico. Portanto, a Figura 1 concentra-se em neurônios glutamatericos com expressões de Nestin e Sox2 em D4 e D21 para validar sua diferenciação progressiva nas condições culturais (Figura 1A(2-4). O percentual de células positivas nestins diminuiu de 5,4± 0,4% na D4 para 0,69 ± 0,3% na D21 (p < 0,01, Figura 1A5). Da mesma forma, confirmando o estado diferenciado dos neurônios glutamtericos, o percentual de células positivas Sox2 diminuiu de 12,2 ± 2,1% em D4 para 5,5 ± 1,7% em D21 (p < 0,05, ver Figura 1A6). A expressão de mGluR2 foi detectada em 45,4 ± 4,7% das células glutamatergicas em D21 (dados não mostrados), e observou-se uma imunostaining vGLUT1 maior durante a diferenciação glutamtergica em D21. Esses resultados demonstraram que a proporção de progenitores neurais permaneceu baixa e que a maioria das células foi bem diferenciada após uma cultura de 21 dias nos dispositivos microfluidos. Na Figura 1B, um protocolo geral das co-culturas multicamadas e gravação eletrofisiológica descreve a semeadura de células UW479 ou BT35 nos dispositivos microfluidos em D21. Essas linhas celulares (Figura 1C) já foram descritas e são comparáveis às observações anteriores feitas por us3,19. No final, foram obtidas duas gravações eletrofisiológicas: uma em D21 antes da co-cultura e outra em D23 após 48 h de semeadura da linha celular pHGG.
Para compreender e seguir a mobilidade e viabilidade dos neurônios BT35, UW479 e glutamatergic durante coculturas, as avaliações microscópicas foram realizadas regularmente durante o período de gravação eletrofisiológica de D21 a D23 e são apresentadas na Figura 2. As imagens microscópicas revelaram uma extensão progressiva e distribuição particular de neurônios glutamatergicos através de dispositivos microfluidos (Figura 2A). As células glutamatergicas formam alguns agregados progressivamente de forma semelhante na cocultura e quando cultivadas sozinhas até d23 (experimento de controle). Na Figura 2B,C, ao adicionar BT35 e UW479, observou-se que as células flutuantes presentes imediatamente após a semeadura das células glioma em D21 desapareceram progressivamente até d23 e se tornaram células pHGG aderentes no dispositivo. Isso foi particularmente notável para a linha UW479.
Além disso, não houve aumento de células flutuantes após todos os registros eletrofisiológicos em D23 (dados não mostrados). No entanto, os percentuais de células viáveis na Figura 2D foram estimados em 83,02% e 85,16% para BT35 e UW479, respectivamente. Ambas as viabilidades de linha foram comparáveis e sublinharam o fato de que as linhas celulares derivadas do paciente podem ser usadas adequadamente. A preparação técnica de dispositivos microfluidos acoplado ao MEA e às manipulações celulares não altera suas capacidades de adesão. Não parece induzir a morte celular ou modificar seus aspectos microscópicos. As células BT35 e UW479 parecem mapear os locais exatos dos neurônios glutamatericos no dispositivo, migrando intimamente para os neurônios excitatórios.
A Figura 3 descreve como exemplo as coculturas de neurônios UW479/glutamatergic com sua detecção de picos ao longo do tempo de gravação na Figura 3A e seu enredo raster na D23 na Figura 3B, mostrando aumento da atividade elétrica ao adicionar células pHGG. A Figura 3C apresenta a taxa de disparo temporal em toda a matriz em co-culturas de neurônios BT35/glutamatergic. As diferenças entre o experimento de controle (cultura de neurônios glutamatericos) e as co-culturas de neurônios glutamatericos com células pHGG são significativas ao registrar atividade elétrica D23, como mostrado na Figura 3D, o que indica um impacto do pHGG na excitabilidade do neurônio.
| Componentes | Meio de semeadura | Meio D4 | Meio D7 | D11 e meio em diante |
| Meio DMEM/F-12 | 0,5x | 0,25x | 0,125x | Ø |
| Meio Neurobásal | 0,5x | 0,25x | 0,125x | Ø |
| BrainPhys Medium | Ø | 0,5x | 0,75x | 1x |
| Suplemento SM1 | 1x | 1x | 1x | 1x |
| Suplemento N2-A | 1x | 1x | 1x | 1x |
| Ala-Gln (GlutaMax) | 0,5 mM | 0,5 mM | 0,5 mM | 0,5 mM |
| BDNF | 10 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| GDNF | 10 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| TGF-β1 | 1 ng/mL | 1 ng/mL | 1 ng/mL | 1 ng/mL |
| Geltrex | 30 μg/mL | Ø | Ø | Ø |
| Suplemento de semeadura | 1x | Ø | Ø | Ø |
| Suplemento do 4º Dia | Ø | 1x | Ø | Ø |
Tabela 1: Composição da mídia cultural para neurônios glutamatericos derivados de hiPS.
| Anticorpos | Concentrações de estoque | Diluições de trabalho |
| Nestin | 0,5 mg/mL | 1:500 |
| (1 μg/mL) | ||
| Sox2 | 1 mg/mL | 1:500 |
| (2 μg/mL) | ||
| mGluR2 | 0,2 mg/mL | 1:50 |
| (4 μg/mL) | ||
| vGlut1 | 0,25 mg/mL | 1:50 |
| (5 μg/mL) | ||
| Burro anti-coelho IgG H&L (AF 647) | 2 mg/mL | 1:1000 a 1:2000 |
| (1 a 2 μg/mL) | ||
| Burro anti-mouse IgG H&L (AF 555) | 2 mg/mL | 1:1000 |
| (2 μg/mL) |
Tabela 2: Lista de anticorpos imunofluorescentes.
Figura 1: Caracterização celular e protocolo de cocultura de neurônios glutamatericos e linhas de glioma pediátrico de alto grau (pHGG). (1) Imagens microscópicas nos dias 21 (D21) e dia 23 (D23) de neurônios glutamatericos. (2) Rotulagem nestin em verde e DAPI em azul em D4 (linha superior) e D21 (linha inferior). (3) Rotulagem Sox2 em verde e DAPI em azul em D4 (linha superior) e D21 (linha inferior). (4) rotulagem mGluR2 em verde e DAPI em azul em D21. (5 e 6) Comparações estatísticas entre a rotulagem nestin e sox2 na D4 e D21 da cultura, demonstrando diferenciação celular. (7) mancha vGlut1 em verde e DAPI em laranja em D21. (B) Protocolo geral para gravação eletrofisiológica para estudar interações ao co-culminar neurônios glutamatericos e células glioma em dispositivos. (C) Aspectos microscópicos pré-requisitos das linhas celulares BT35 e UW479. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens microscópicas de células glutamatergicas e glioma cultivadas em dispositivos microfluidos acoplado a matrizes multieletrídricas (MEA). Os neurônios glutamatericos são diferenciados e cultivados sozinhos no dispositivo microfluido até o dia 21 (D21). (A) Para este controle experimental, apenas o meio foi adicionado às células glutamatergicas em D21, enquanto as linhas celulares BT35 (B) ou UW479 (C) foram adicionadas em suas respectivas condições. As imagens em D22 e D23 foram realizadas antes dos registros eletrofisiológicos para cada condição. Todas as imagens foram obtidas utilizando um microscópio clássico de contraste de fase. (D) A viabilidade celular tumoral para BT35 e UW479 em D23 foi estimada usando uma contagem automatizada com software de análise de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Gravação eletrofisiológica. (A) Detecção de picos ao longo do tempo de gravação em co-culturas de neurônios UW479/glutamatergic. (B) Um exemplo do enredo de rasterizador computado em D23 representa os eventos detectados para cada eletrodo ativo em função do tempo em co-culturas de neurônios UW479/glutamatergic. (C) Taxa de disparo temporal (ou taxa de disparo instantânea) de todos os eletrodos ativos que registram atividade elétrica em co-culturas de neurônios BT35/glutamatergic, permitindo monitorar a sincronicidade da atividade da rede neural. (D) Gráficos de barras da taxa média de disparo na condição de controle (por exemplo, a cultura dos neurônios glutamatericos) e ao adicionar linha celular tumoral UW479 (em verde) e linha celular BT35 (em vermelho). Os dados são apresentados como média ± SEM. (* p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura Suplementar S1: representação 3D (tridimensional) dos moldes SU-8. (A) Criação e móvel de moldes SU-8 com software AutoCAD. (B) Imagem dos moldes de SU com as duas camadas de estruturas fotoresististas e quatro orifícios de largura de 3 mm. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Este trabalho descreve um modelo in vitro funcional preciso para avaliar a interação entre neurônios glutamatergicos cortical derivados do hiPS humano e células tumorais cerebrais em dispositivos microfluidos. Um dos passos cruciais no presente protocolo foi a diferenciação hiPS em neurônios glutamatericos, o que foi confirmado pela diminuição da coloração imunofluorescente Nestin e Sox2 e aparência simultânea da coloração mGluR2 e vGLUT1. No entanto, poucos progenitores neurais permaneceram como apenas metade das células glutamatergicas expressas mGluR2, o que significa uma população heterogênea de células neurônios. Ao todo, esses resultados enfatizam que o cuidado particular deve ser dedicado ao crescimento de células glutamtergicas nesses dispositivos. Além disso, o próximo passo que estuda o comportamento elétrico dos neurônios na presença de células pHGG foi relativamente trabalhoso para configurar o processamento de dados para otimizar a detecção e interpretação do pico. No entanto, como esperado e descrito em outros trabalhos recém-publicados4,5,6,9,10, a presença de pHGGs e neurônios glutamatericos aumenta a atividade elétrica confirmando a característica excitatória desses neurônios.
A maior limitação dessa modelagem pode ser a distribuição heterogênea de neurônios no próprio MEA que podem impactar gravações eletrofisiológicas. Exigiria a manutenção da cultura de alta densidade no dispositivo microfluido. Para semear um tipo de célula secundária no dispositivo, é fundamental manter uma rápida proliferação e migração inicialmente por 48 h e obter como para neurônios uma distribuição homogênea na técnica de 48 h para gravação. Outra limitação é diferenciar os diferentes tipos de populações celulares em tais dispositivos visualmente, mas novas abordagens usando nanopartículas fluorescentes podem ajudar a seguir ambos os tipos de células26. Finalmente, o desempenho dessa abordagem microfluidica só foi feito em dois tipos de linhas phGG e deve ser estendido para linhas celulares mais derivadas do paciente com diferentes drivers moleculares. Avaliações complementares podem ser feitas para entender esse efeito excitatório ao co-culminar essas células. No entanto, é viável com células pHGG com uma mutação de driver H3.3 K27M, como na linha BT353.
O método global desenvolvido neste trabalho é uma das novas abordagens para explorar o impacto elétrico. Mostrou a capacidade de análise da rede neural para transduzir a interação entre neurônios glutamatericos derivados do hiPS e linhas de células tumorais pHGG em condições de cultura microfluidica. Este método é útil para muitas aplicações, particularmente para estudos funcionais e mecanicistas e para analisar os efeitos de agentes farmacológicos que podem bloquear a migração celular pHGG e a interação com os neurônios. Enfatiza o uso de dispositivos microfluidos, mas especificamente quando experimentos podem registrar a atividade eletrofisiológica e podem ser adicionados a um MEA.
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Disclosures
AB, MG, JR, LM, ML, JV, DD são empregados pela NETRI, fl é Chief Technology Officer da NETRI e TH é Chief Scientific Officer da NETRI. Os outros autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios do programa Satt Conectus, Fondation de l'Université de Strasbourg, «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», "Franck, Rayon de Soleil" e "Semeurs d'Etoile". Agradecemos às crianças e famílias afetadas pelos HGGs por suas contribuições para esta pesquisa e seu apoio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
| Cortical Glutamatergic Neurons | BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | - | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
References
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