Summary
Nyere arbeider avdekker nevronal innvirkning på høyverdige pediatriske gliomceller (pHGG) og deres gjensidige interaksjoner. Det nåværende arbeidet viser utviklingen av en in vitro-modell som kokulturerer pHGG-celler og glutamatergeiske nevroner og registrerte deres elektrofysiologiske interaksjoner for å etterligne disse interaktivitetene.
Abstract
Pediatriske høygradede gliomer (pHGG) representerer hjernekreft i barndommen og ungdommen som bærer en rask dyster prognose. Siden det er behov for å overvinne motstanden mot dagens behandlinger og finne en ny måte å kurere på, er det svært krevende å modellere sykdommen så nært som mulig i en in vitro-setting for å teste nye legemidler og terapeutiske prosedyrer. Å studere deres grunnleggende patologiske prosesser, inkludert glutamatergic neuron hyperexcitability, vil være et reelt fremskritt i å forstå interaksjoner mellom miljøhjernen og pHGG-cellene. Derfor, for å gjenskape nevroner / pHGG celleinteraksjoner, viser dette arbeidet utviklingen av en funksjonell in vitro-modell som kokulturerer menneskeskapte Pluripotent Stem (hiPS)-avledede kortikale glutamatergiske nevroner pHGG-celler i inndelte mikrofluidiske enheter og en prosess for å registrere deres elektrofysiologiske modifikasjoner. Det første trinnet var å skille og karakterisere menneskelige glutamatergiske nevroner. For det andre ble cellene dyrket i mikrofluidiske enheter med pHGG-avledede cellelinjer. Hjernemikromiljø og nevronaktivitet ble deretter inkludert i denne modellen for å analysere den elektriske effekten av pHGG-celler på disse mikro-miljømessige nevronene. Elektrofysiologiske opptak kombineres ved hjelp av multielektrorode arrays (MEA) til disse mikrofluidiske enhetene for å etterligne fysiologiske forhold og for å registrere den elektriske aktiviteten til hele nevralnettverket. En betydelig økning i nevron spenning ble understreket i nærvær av tumorceller.
Introduction
Pediatriske høygradige gliomer (pHGG) viser et utvidet genotypisk og fenotypisk mangfold avhengig av pasientalder, tumoranatomisk plassering og forlengelse og molekylære drivere1. De er aggressive hjernesvulster som er dårlig kontrollert med de tilgjengelige behandlingsalternativene og er den ledende dødsårsaken relatert til hjernekreft hos barn og ungdom2. Så, mer enn 80% av pasientene går tilbake innen 2 år etter diagnosen, og deres median overlevelse er 9-15 måneder, avhengig av hjerneplasseringer og drivermutasjoner. Fraværet av kurativ behandling er den primære trangen til laboratorieforskning og fremhever det umiddelbare behovet for nye innovative terapeutiske tilnærminger. Til dette formål ble pasientavledede cellelinjer (PDCL) utviklet med håp om å gi pHGG-mangfoldet3 i todimensjonale (2D) linjer og / eller tredimensjonale (3D) nevrosfærer. Likevel etterligner de pasientavledede in vitro-cellekulturene ikke alle hjernevariable situasjoner. Disse modellene anser ikke de makroskopiske og mikroskopiske nevroanatomiske miljøene som vanligvis er beskrevet i pHGG.
Vanligvis utvikler pHGG hos yngre barn hovedsakelig i pontin- og thalamic-regioner, mens ungdom og unge voksnes HGG konsentrerer seg i de kortikale områdene, spesielt i frontotemporale lobes1. Disse stedsspesifiktitetene på tvers av barnealder ser ut til å innebære forskjellige miljøer som fører til gliomagenese og et intricating nettverk mellom tumorceller og spesifikk nevronal aktivitet4,5,6. Selv om mekanismer fortsatt ikke er identifisert, utvikler pHGG hovedsakelig fra nevrale forløperceller langs differensieringsbanen til astrogliale og oligodendrogliale avledninger. Mens rollen til disse glial avstamningene lenge har vært begrenset til enkel strukturell støtte for nevroner, er det nå klart fastslått at de integreres helt i nevrale kretser og viser komplekse toveis glial-neuronale interaksjoner som er i stand til å omorganisere strukturelle regioner i hjernen og omdanne nevronale kretser4,7,8 . Videre indikerer økende mengder bevis at sentralnervesystemet (CNS) spiller en kritisk rolle i hjernekreftinitiering og progresjon. Nyere arbeider fokusert på nevronaktivitet, som ser ut til å drive vekst og mitose av glial malignitet gjennom utskilte vekstfaktorer og direkte elektrokjemisk synaptisk kommunikasjon6,9. Reciprocally, høyverdige gliomaceller ser ut til å påvirke nevronfunksjonen med en økende glutamatergisk nevronaktivitet og modulere driften av kretsene de er strukturelt og elektrisk integrert9. Så studier ved hjelp av pasientavledede modeller og nye nevrovitenskapelige verktøy som kontrollerer nevronvirkning viste en kretsspesifikk effekt av nevronaktivitet på gliomaplassering, vekst og progresjon. De fleste av disse nevronale projeksjonene involvert i gliomer er glutamatergiske og kommuniserer gjennom glutamatsekretjoner. Spesifikke glutamatergiske biomarkører som mGluR2 eller vGlut1/2 er ofte beskrevet6.
Interessant, til tross for deres molekylære heterogenitet, viser pediatriske og voksne høyverdige gliomer en typisk proliferativ respons på glutamatergisk nevronaktivitet og andre utskilte faktorer som nevroligin-3 eller BDNF (hjerneavledet nevrotrofisk faktor)4,6,10,11,12,13 . I kortikale regioner kan pediatriske og voksne HGG-er indusere nevronal hypereksitabilitet gjennom økt glutamatsekresjon og hemme GABA-internuroner som fører til gliomer forbundet med epileptisk nettverksaktivitet14,15. På toppen av det kan nevrale kretser ombygges av gliomer som skyver spesifikke nevrologiske oppgaver, for eksempel språk, og kan rekvirere ytterligere organisert nevronaktivitet9.
Basert på denne begrunnelsen må det å fremme forståelsen av toveis kommunikasjon mellom gliomaceller og nevroner være fullt belyst og integrert med de tidlige stadiene av in vitro pHGG-tilnærminger. Slik innovativ modellering er avgjørende for å forstå og måle den nevronale elektriske aktivitetspåvirkningen under legemiddeltesting og forutse pHGG-respons i hjernekretser. Den siste utviklingen innen nevrovitenskapelige verktøy, som mikrofluidiske enheter og pHGG-forskningsarbeider, er sengen for å utvikle nye modelleringsmetoder og nå kunne integrere hjernemikromiljø i in vitro pHGG-modeller3,16,17,18,19. Kombinert med elektrofysiologiske opptak ved hjelp av multielektrorode arrays (MEA), tilbyr mikrofluidiske enheter20,21,22 muligheten til å etterligne fysiologiske forhold mens du registrerer den elektriske aktiviteten til hele nevrale nettverket og trekker ut nettverkstilkoblingsparametere under flere forhold. Denne enheten23,24 tillater først presis avsetning av celler i et kammer direkte på MEA. Denne teknologien muliggjør kontroll av cellesåingstetthet og homogenitet på MEA og den fine kontrollen av medieutveksling, noe som er et kritisk skritt for menneskelig nevral forfederdifferensiering direkte i enheter. Videre kan det nåværende avsetningskammeret bli sådd med flere celler på forskjellige tidspunkter.
Så denne studien hadde som mål å utvikle en funksjonell in vitro-modell som kokulturerer menneskelige Pluripotent Stem (hiPS)-avledede kortikale glutamatergiske nevroner og pHGG-avledede celler i mikrofluidiske enheter og registrerer deres elektriske aktivitet for å evaluere elektriske interaksjoner mellom begge cellepopulasjonene. For det første ble hiPS-avledede kortikale glutamaterge nevroner oppnådd og karakterisert i mikrofluidiske enheter på forskjellige stadier av kulturen [dag 4 (D4), som hiPS-celler, og dag 21 (D21) og dag 23 (D23), som glutamatergic modne nevroner]. For det andre trinnet i co-kultur ble to pHGG-modeller brukt: kommersialisert pediatrisk UW479-linje og pHGG-celler initiert fra en pasientsvulst (BT35)3, med en H3.3 K27M drivermutasjon. Til slutt utførte vi elektrofysiologiske opptak av glutamatergiske celler ved D21 før pHGG cellesåing og D23 etter 48 h medkultur i samme mikrofluidiske enhet. Interaksjonene mellom glutamatergeiske nevroner og pHGG-celler var preget av en betydelig økning i den registrerte elektrofysiologiske aktiviteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For denne protokollen er akkrediteringsnummeret knyttet til bruk av menneskelige materialer DC-2020-4203.
1. Mikrofluidisk enhet fabrikasjon, forberedelse og behandling
- Fabriker SU-8-former ved hjelp av konvensjonelle fotolittografiteknikker18.
MERK: For dette formålet, to fotolitografimasker er designet for å konstruere to lag med fotoresiststrukturer på silisiumskiveunderlag og et tynt SU-8 2005 fotoresistlag (3,2 μm høyt og 6 ± 1 μm bredt) som definerer asymmetriske mikrogroover under mønsteret av hovedkanaler laget i SU-8 2100 (200 μm høy, 1 mm bred, og 13 mm lang) (se supplerende figur S1). - Aktiver skiven ved hjelp av en plasmarenser (5,00e-1 torr, høyt radiofrekvensnivå (RF) i 1 min og silaniser den ved hjelp av 1 ml (trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silan i en aluminiumsmappe i en desiccator i 30 min.
- Forbered et 10:1-forhold mellom polydimetylsiloksan (PDMS), bland prepolymeren med katalysator, send den i en vakuumdesiccator for å fjerne fanget bobler, og kast den sakte på formen før den blir herdet i en ovn ved 80 °C i 40 minutter.
- Klipp den deretter ved hjelp av en barberhøvel i ønsket størrelse før du skreller av formen. Stans ut innløpet og utløpssonene for å få 3 mm brede hull, rengjør PDMS og beskytt det med tape.
MERK: Tykkelsen på den endelige PDMS-enheten er ca. 5 mm. - Behandle enheten ved hjelp av en plasmarenser (5,00e-1 torr, høyt RF-nivå i løpet av 1 min), monter den med en polystyren Petri-tallerken, og utsett vakuumet under UV-lys i 30 minutter.
- Fyll med en pipette innløpet til den mikrofluidiske enheten før bruk med 70% etanol og tøm den ved pipetteringsaspirasjon.
- Vask den mikrofluidiske enheten ved å tilsette innløpsreservoarer Dulbeccos fosfat bufret saltvann (D-PBS) og tøm den ved pipetteringsaspirasjon tre ganger på rad.
- Belegge enheten med 0,05 mg/ml Poly-D-Lysine og legg den i en inkubator (37 °C, 5 % CO2). Etter 24 timer, skyll enheten ved å legge til nevrobasalmediet i innløpsbeholderen og tøm det ved pipetteringsaspirasjon tre ganger på rad.
- Fyll mikrofluidbrikken med cellekulturmediet og la den forbli ved romtemperatur til den brukes i maksimalt 2 timer.
2. Celleforberedelse og såing i mikrofluidisk enhet
- Kultur, såing og immunfluorescerende karakterisering av human hiPS-avledet kortikale glutamatergiske nevroner
MERK: Utfør eksperimenter med kommersialiserte hiPS-avledede kortikale glutamaterge nevroner (Figur 1A). Bevar menneskeskapte materialer og håndter dem med godkjenning og i henhold til lovgivningens retningslinjer.- Tøm innløps- og utløpsreservoarene til den mikrofluidiske enheten ved pipetteaspirasjon før sådd, slik at bare enhetens kanaler kan fylles med medium.
- Frø hiPS-cellene på dag 0 (D0) ved å sette 10 μL av en 6,5 x 106 hiPS-celler / ml suspensjon (f.eks. 900 celle / mm2 konsentrasjon) med mediet, hvis sammensetning er gitt i tabell 1, og la enheten være under hetten (ved romtemperatur) i 15 minutter for å tillate celler å feste.
- Etter 15 min, fyll både innløps- og utløpsreservoarer med 50 μL D4 kulturmedium, hvis hele sammensetningen er gitt i tabell 1, og overfør enheten til inkubatoren (37 °C, 5 % CO2).
- Opprettholde glutamatergisk nevrondifferensiering i 23 dager (figur 1A(1), mikroskopi) under et kontrollert miljø (37 °C, 5 % CO2) og med et bestemt cellekulturmedium, hvis sammensetning er beskrevet i tabell 1. Skift ut mediet regelmessig som beskrevet i neste trinn 5. rett nedenfor og følg trinnene som i figur 1B.
- Bytt ut mediet hver 3 til 4 dager etter tabell 1-sammensetningen . Bruk såingsmedium til D4, D4 middels til D7, D7 middels til D11 og D11 medium for den gjenværende tiden av kulturen.
- Ta mikroskopiske bilder på D4, D21 og D23 ved hjelp av et standard fasekontrastmikroskop for å vurdere celle levedyktighet og tillate celletelling.
- For karakterisering, fikse de differensierte glutamatergiske nevronene i 4% paraformaldehyd (PFA) i 30 min ved romtemperatur etter middels aspirasjon og følg protokollen for immunfluorescensfarging.
- Vask celler tre ganger med fosfatbufret saltvann (PBS) og permeabiliser dem i 10 min med 0,1% Triton-X etterfulgt av 30 min med 3% Bovine Serum Albumin (BSA). Tilsett primære antistoffer og inkuber enheten over natten ved 4 °C.
- Skyll cellene tre ganger med PBS og inkuber videre med de tilsvarende sekundære antistoffene i 2 timer ved romtemperatur.
MERK: Immunfluoreserende antistoffer som brukes i studien er listet opp i tabell 2. - Skyll cellene tre ganger med PBS og forsenk med DAPI (4',6-diamino-2-fenylindole) i 10 min ved romtemperatur.
- Skaff bilder med et invertert epifluorescence-mikroskop utstyrt med et CMOS-kamera (Complementary metal-oxide-semiconductor) og analyser ved hjelp av passende bildeanalyseprogramvare.
- Åpne DAPI-fargede bilder og binarize med terningsrutinen i programvaren. For å gjøre dette, klikk på Bilde > Juster > threshold, og angi de riktige parametrene for å skille kjernen fra bakgrunnen. Klikk deretter på Bruk > Process > Watershed for å dele den samlede kjernen.
- Deretter bruker du funksjonen Analyser partikler medfødt programvare for å tolke de binære bildene. For å gjøre dette, klikk på Analyser og deretter på Analyser partikler og angi de riktige parametrene etter dette: størrelse og sirkularitetsfilter (unntatt fra analyseobjekter mindre enn 7 μm, større enn 20 μm, eller med en sirkularitet mindre enn 0,1 μm).
- Slå sammen konturbildene hentet fra DAPI-analyse til korrespondent immunfluoreserende bilder for å validere riktig farging.
- Til slutt lagrer du de tilknyttede dataene (antall objekter, gjennomsnittsområde, % av dekning osv.) for de forskjellige biomarkørene og kvantifiserer uttrykket ved D4 og/eller D21 ved hjelp av passende kvantifiseringsprogramvare.
- Cellekultur av kommersialisert pHGG-linje, UW479 og pasientavledet cellelinje, BT353
- Kultur begge cellelinjene i DMEM / F-12 GlutaMAX supplert med 10% Fetal Bovine Serum (FBS) i en cellekulturflaske. Vent på 80 % sammenløp av hver cellelinje som presentert i figur 1C.
- Vedlikehold disse pHGG-cellene under et kontrollert miljø ved 37 °C under normoksiske forhold gjennom forsøkene.
3. Samkulturprotokoll
- Juster sådddagen og konsentrasjonen for UW479- og BT35-cellelinjer for å nå 80% av konfluenteceller når samkulturen skal starte, tilsvarende 21 dagers kultur for glutamatergiske nevroner.
- Trypsinize UW479 og BT35 celler og frø dem på toppen av glutamatergic nevroner i hver dedikert mikrofluidisk enhet (med en måltetthet på 900 celle / mm2 for hver celle type) før såing pHGG celler inn i den mikrofluidiske enheten som inneholder modne glutamatergic nevroner.
- Oppretthold samkulturene i 2 dager under et kontrollert miljø (37 °C, 5 % CO2) med glutamatergisk nevron D11 og videre middels beskrevet i tabell 1.
- Tell pHGG-celler ved hjelp av mikroskopiske bilder analysert med en bildeanalyseprogramvare for å vurdere deres levedyktighet. Beregne prosentandelen av celler.
MERK: Bruk følgende formel: 100 - ((antall celler ved D23 / antall celler ved D21) x 100).
4. Elektrofysiologisk opptak
- Utfør det elektrofysiologiske opptaket med et kommersielt system og kommersielt tilgjengelig programvare.
MERK: Forsøkene ble utført med en MEA som besto av elektroder med 30 μm diameter fordelt på 100 μm. - Utfør en første elektrofysiologisk registrering på glutamatergiske nevroner ved D21 før såing av pHGG-celler. Bruk de differensierte glutamatergiske nevronene som kontroll og kultur dem alene parallelt med samkulturen. Gjør en ny innspilling for begge betingelsene som beskrevet i neste trinn nummerert 3.
- Utfør et nytt elektrofysiologisk opptak ved D23 (etter 2 dager med samkultur).
5. Elektrofysiologisk databehandling
- Filtrer rådataene med et 2. bestillings Band-pass Butterworth-filter (med passbåndfrekvenser på 100 Hz og 2500 Hz).
- For spikerdeteksjon beregner du rotgjennomsnittet for signalet over 10 min-registreringen for hver elektrode og angir en amplitudeterskel som tilsvarer åtte ganger denne rotgjennomsnittets kvadratiske verdi.
- Bruk en PTSD-algoritme (Precision Timing Spike Detection25), med tanke på en maksimal varighet på 2 ms for ett handlingspotensial.
- Vurder som en aktiv elektrode, hver elektrode som oppdager minst 5 pigger / min. Fortsett analysen hvis minst 10 % av opptakselektrodene er aktive.
- Del antall oppdagede pigger etter registreringsperioden for å beregne gjennomsnittlig avfyringshastighet for hver aktive elektrode. Beregn en gjennomsnittlig gjennomsnittlig avfyringshastighet for hvert uavhengig eksperiment. Til syvende og sist beregner du et gjennomsnitt etter betingelse (±SEM) og uttrykker det som en funksjon på innspillingsdagen.
- Beregn en rasterplott for hvert eksperiment som representerer hendelsene som oppdages for hver aktive elektrode som en tidsfunksjon. Beregn deretter de temporale skuddhastighetene for hele rekken (eller øyeblikkelige avfyringshastigheter) for alle aktive elektroder, slik at du kan overvåke synkroniteten til nevral nettverksaktiviteten.
- Til slutt genererer du stolpediagrammer ved hjelp av kvantifiseringsprogramvaren og utfører sammenligninger ved hjelp av Kruskal Wallis-tester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før du studerte elektriske interaksjoner mellom glutamatergiske nevroner og gliomaceller, ble hiPS-avledede kortikale glutamatergiske nevroner karakterisert for å validere muligheten for å dyrke dem i mikrofluidiske enheter (figur 1A). Karakteriseringen ble vurdert ved hjelp av Nestin, Sox2, mGlurR2 (metabotrope glutamatreseptorer 2) og vGLUT1-immunisering, representert i figur 1A(2-7). Siden Nestin er et mellomliggende filamentprotein som kreves for overlevelse, fornyelse og mitogen-stimulert spredning av nevrale stamceller, uttrykkes det dermed i uavklarte CNS-celler under utvikling. Sox2 er medlem av den SRY-lignende HMG-box genet (SOX) transkripsjon faktor familie involvert i regulering av embryonal utvikling, og det er overveiende uttrykt i umodne og undifferentiated celler av nevral epitel i CNS. mGluR2 er utbredt i hele hjernen, med høyt uttrykk i cortex og hippocampus. Vanligvis definerer den presynaptiske celler med nevronal spenning og synaptisk overføring (f.eks. glutamatergiske nevroner). vGLUT1 brukes også som en glutamatergisk biomarkør. Derfor fokuserer figur 1 på glutamatergiske nevroner med Nestin- og Sox2-uttrykk ved D4 og D21 for å validere deres progressive differensiering i kulturforholdene (figur 1A(2-4). Nestin positive cellers prosentandel gikk ned fra 5,4 ± 0,4 % ved D4 til 0,69 ± 0,3 % ved D21 (p < 0,01, figur 1A5). Tilsvarende, bekrefter differensiert tilstand av glutamatergic nevroner, prosentandelen av Sox2 positive celler redusert fra 12,2 ± 2,1% ved D4 til 5,5 ± 1,7% ved D21 (p < 0,05, se figur 1A6). Uttrykket av mGluR2 ble påvist hos 45,4 ± 4,7% av glutamatergiske celler ved D21 (data ikke vist), og en større vGLUT1 immunostaining ble observert under glutamatergisk differensiering ved D21. Disse resultatene viste at andelen nevrale forfedre forble lav og at de fleste celler var godt differensiert etter en 21-dagers kultur i mikrofluidiske enheter. I figur 1B beskriver en generell protokoll for multistep-kokulturer og elektrofysiologisk opptak UW479- eller BT35-cellesåingen i mikrofluidiske enheter ved D21. Disse cellelinjene (figur 1C) er allerede beskrevet og kan sammenlignes med tidligere observasjoner gjort av oss3,19. Til slutt ble to elektrofysiologiske opptak oppnådd: en ved D21 før kokulturering og den andre ved D23 etter 48 timer pHGG cellelinjesåing.
For å forstå og følge mobiliteten og levedyktigheten til BT35, UW479 og glutamatergiske nevroner under samkulturer, ble mikroskopiske vurderinger regelmessig utført i løpet av den elektrofysiologiske opptaksperioden fra D21 til D23 og presenteres i figur 2. De mikroskopiske bildene avslørte en progressiv utvidelse og spesiell fordeling av glutamatergiske nevroner på tvers av mikrofluidiske enheter (figur 2A). De glutamatergiske cellene danner noen aggregater gradvis på en lignende måte i samkultur og når de dyrkes alene til D23 (kontrolleksperiment). I figur 2B,C, når du legger til BT35 og UW479, ble det observert at de flytende cellene som var tilstede umiddelbart etter gliomacellens sådd ved D21 gradvis forsvant til D23 og ble tilhenger pHGG-celler i enheten. Dette var spesielt kjent for UW479-linjen.
Videre var det ingen økning i flytende celler etter alle elektrofysiologiske opptak ved D23 (data ikke vist). Likevel ble prosentandelen av levedyktige celler i figur 2D anslått til henholdsvis 83,02 % og 85,16 % for BT35 og UW479. Begge linje viabilities var sammenlignbare og understreket det faktum at pasientavledede cellelinjer kan brukes på riktig måte. Den tekniske forberedelsen av mikrofluidiske enheter koblet til MEA og cellemanipulasjoner endrer ikke vedheftskapasiteten. Det ser ikke ut til å indusere celledød eller modifisere deres mikroskopiske aspekter. BT35- og UW479-celler ser ut til å kartlegge de nøyaktige plasseringene av glutamatergiske nevroner i enheten, og migrerer tett til de eksitatoriske nevronene.
Figur 3 beskriver som et eksempel på UW479/glutamatergic neuron co-kulturer med sin spike deteksjon langs opptakstid i figur 3A og dens rasterplott ved D23 i figur 3B, som viser økt elektrisk aktivitet når du legger til pHGG-celler. Figur 3C presenterer den tidsmessige skuddhastigheten i BT35/glutamatergic neuron co-kulturer. Forskjellene mellom kontrolleksperimentet (kultur av glutamatergiske nevroner) og samkulturer av glutamatergiske nevroner med pHGG-celler er signifikante ved registrering av D23 elektrisk aktivitet, som vist i figur 3D, noe som indikerer en innvirkning av pHGG på nevron spenning.
| Komponenter | Såing medium | D4-medium | D7-medium | D11 og fremover medium |
| DMEM/F-12 Middels | 0,5x | 0,25x | 0,125x | Ø |
| Neurobasal Medium | 0,5x | 0,25x | 0,125x | Ø |
| Hjernefysium middels | Ø | 0,5x | 0,75x | 1x |
| SM1 Supplement | 1x | 1x | 1x | 1x |
| N2 tillegg A | 1x | 1x | 1x | 1x |
| Ala-Gln (GlutaMax) | 0,5 mM | 0,5 mM | 0,5 mM | 0,5 mM |
| BDNF | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml |
| GDNF | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml |
| TGF-β1 | 1 ng/ml | 1 ng/ml | 1 ng/ml | 1 ng/ml |
| Geltrex | 30 μg/ml | Ø | Ø | Ø |
| Seeding Supplement | 1x | Ø | Ø | Ø |
| Dag 4 Tillegg | Ø | 1x | Ø | Ø |
Tabell 1: Kulturmediesammensetning for hiPS-avledede glutamatergiske nevroner.
| Antistoffer | Lagerkonsentrasjoner | Arbeidsfortynning |
| Nestin | 0,5 mg/ml | 1:500 |
| (1 μg/ml) | ||
| Sox2 | 1 mg/ml | 1:500 |
| (2 μg/ml) | ||
| mGluR2 | 0,2 mg/ml | 1:50 |
| (4 μg/ml) | ||
| vGlut1 | 0,25 mg/ml | 1:50 |
| (5 μg/ml) | ||
| Esel anti-kanin IgG H&L (AF 647) | 2 mg/ml | 1:1000 til 1:2000 |
| (1 til 2 μg/ml) | ||
| Esel antimus IgG H&L (AF 555) | 2 mg/ml | 1:1000 |
| (2 μg/ml) |
Tabell 2: Liste over immunfluorescerende antistoffer.
Figur 1: Cellekarakterisering og samkulturprotokoll av glutamatergiske nevroner og høyverdige pediatriske gliomlinjer (pHGG). (A) Forutsetning mikroskopisk og immunfluorescerende karakterisering av glutamatergiske nevroner. (1) Mikroskopiske bilder på dag 21 (D21) og dag 23 (D23) av glutamatergiske nevroner. (2) Nestin-merking i grønt og DAPI i blått ved D4 (øvre rad) og D21 (nederste rad). (3) Sox2 merking i grønt og DAPI i blått ved D4 (øvre rad) og D21 (nederste rad). (4) mGluR2 merking i grønt og DAPI i blått ved D21. (5 og 6) Statistiske sammenligninger mellom Nestin- og Sox2-merking ved D4 og D21 av kultur, som viser celledifferensiering. (7) vGlut1 farging i grønt og DAPI i oransje ved D21. (B) Generell protokoll for elektrofysiologisk opptak for å studere interaksjoner ved kokulturerende glutamaterge nevroner og gliomaceller på enheter. (C) Forutsetning mikroskopiske aspekter ved BT35 og UW479 cellelinjer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mikroskopiske bilder av glutamatergic- og gliomaceller dyrket i mikrofluidiske enheter koblet til multielektrode arrays (MEA). Glutamatergiske nevroner differensieres og dyrkes alene i mikrofluidisk enhet til dag 21 (D21). (A) For denne eksperimentelle kontrollen ble bare mediet lagt til glutamatergiske celler ved D21, mens enten BT35 (B) eller UW479 (C) cellelinjer ble lagt til under deres respektive forhold. Bilder ved D22 og D23 ble utført før de elektrofysiologiske journalene for hver tilstand. Alle bildene ble hentet ved hjelp av et klassisk fasekontrastmikroskop. (D) Tumorcelle levedyktighet for BT35 og UW479 ved D23 ble estimert ved hjelp av et automatisert antall med bildeanalyseprogramvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Elektrofysiologisk opptak. (A) Spike deteksjon langs opptakstid i UW479/glutamatergic neuron co-kulturer. (B) Et eksempel på den beregnede rasterplottet ved D23 representerer hendelsene som oppdages for hver aktive elektrode som en funksjon av tid i UW479/glutamatergic neuron co-kulturer. (C) Temporal array-wide avfyringshastighet (eller øyeblikkelig avfyringshastighet) av alle aktive elektroder som registrerer elektrisk aktivitet i BT35 / glutamatergic neuron co-kulturer, slik at de kan overvåke synkroniteten til nevral nettverksaktiviteten. (D) Søylediagrammer med gjennomsnittlig avfyringshastighet i kontrolltilstanden (f.eks. kulturen av glutamatergeiske nevroner) og når du legger til tumoral UW479 cellelinje (i grønt) og BT35 cellelinje (i rødt). Data vises som gjennomsnittlige ± SEM. (* p < 0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur S1: 3D (3-dimensjonal) representasjon av SU-8 former. (A) Opprettelse og bilde av SU-8 former med AutoCAD programvare. (B) Bilde av SU-formene med de to lagene av fotoresistiske strukturer og fire hull med 3 mm bredde. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbeidet beskriver en nøyaktig funksjonell in vitro-modell for å evaluere samspillet mellom humane hiPS-avledede kortikale glutamatergeiske nevroner og hjernesvulstceller i mikrofluidiske enheter. Et av de avgjørende trinnene i den nåværende protokollen var hiPS-differensiering i glutamatergiske nevroner, som ble bekreftet av nedgangen i Nestin og Sox2 immunfluorescent farging og samtidig utseende av mGluR2 og vGLUT1 farging. Likevel forble få nevrale forfedre som bare halvparten av glutamatergiske celler uttrykt mGluR2, noe som betyr en heterogen nevroncellepopulasjon. Til sammen understreker disse resultatene at spesiell omsorg må vies til glutamatergisk cellevekst i slike enheter. Videre var det neste trinnet som studerte den elektriske oppførselen til nevroner i nærvær av pHGG-celler relativt arbeidskrevende å sette opp databehandlingen for å optimalisere piggdeteksjon og tolkning. Likevel, som forventet og beskrevet i andre nylig publiserte verk4,5,6,9,10, forbedrer tilstedeværelsen av pHGG og glutamatergiske nevroner elektrisk aktivitet som bekrefter den eksitatoriske egenskapen til disse nevronene.
Den største begrensningen i denne modelleringen kan være den heterogene fordelingen av nevroner på MEA selv som kan påvirke elektrofysiologiske opptak. Det ville kreve vedlikehold av høy tetthet kultur i mikrofluidisk enhet. For såing av en sekundær celletype på enheten, er det viktig å opprettholde en rask spredning og migrasjon i utgangspunktet i 48 timer og oppnå som for nevroner en homogen fordeling i 48 h-teknikken for opptak. En annen begrensning er å differensiere de forskjellige typene cellepopulasjoner i slike enheter visuelt, men nye tilnærminger ved hjelp av fluorescerende nanopartikler kan bidra til å følge begge celletypene26. Til slutt ble ytelsen til denne mikrofluidiske tilnærmingen bare gjort i to typer phGG-linjer og bør utvides til mer pasientavledede cellelinjer som bærer forskjellige molekylære drivere. Komplementære vurderinger kan gjøres for å forstå denne eksitatoriske effekten når man kokulturerer disse cellene. Likevel er det mulig med pHGG-celler som bærer en H3.3 K27M drivermutasjon, for eksempel i BT35-linjen3.
Den overordnede metoden utviklet i dette arbeidet er en av de nye tilnærmingene for å utforske den elektriske effekten. Det har vist kapasiteten til nevral nettverksanalyse for å transdusere samspillet mellom hiPS-avledede glutamatergiske nevroner og pHGG tumorale cellelinjer i mikrofluidiske kulturforhold. Denne metoden er nyttig for mange applikasjoner, spesielt for funksjonelle og mekanistiske studier og for å analysere effekten av farmakologiske midler som kan blokkere pHGG cellemigrasjon og interaksjon med nevroner. Det understreker bruken av mikrofluidiske enheter, men spesielt når eksperimenter kan registrere den elektrofysiologiske aktiviteten og kan legges til en MEA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AB, MG, JR, LM, ML, JV, DD er ansatt i NETRI, FL er chief technology officer ved NETRI, og TH er chief scientific officer ved NETRI. De andre forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Satt Conectus-programmet Fondation de l'Université de Strasbourg, «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Franck, Rayon de Soleil» og «Semeurs d'Etoile»-foreninger. Vi takker barna og familiene som er berørt av HGG-er for deres bidrag til denne forskningen og deres støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
| Cortical Glutamatergic Neurons | BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | - | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
References
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Ostrom, Q. T., et al. Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro-Oncology. 16, Suppl 10 1-36 (2015).
- Blandin, A. F., et al. Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity. Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).
- Monje, M.
- Mount, C. W., Yalçın, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity. eLife. 18 (8), 49291 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders. Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Neftel, C., et al. An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Krishna, S., et al. Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival. BioRxiv. , (2021).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).
- Wang, X., et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression. Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).
- Venkatesh, H. S., et al. Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma. Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).
- Venkatesh, H. S., et al. Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion. Cell. 161 (4), 803-816 (2015).
- Buckingham, S. C., et al. Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity. Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).
- Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks. Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).
- Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks. BioRxiv. , (2021).
- Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings. Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).
- Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks. Scientific Reports. 6, 28384 (2016).
- Nguyen, A., et al. Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1α axis inhibition. Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Cerea, A., et al. Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors. Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).
- Bruno, G., et al. Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Maisonneuve, B. G. C., et al. Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework. BioRxiv. , (2021).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Andreiuk, B., et al. Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo. Small. 13 (38), (2017).
