Summary
עבודות אחרונות לחשוף את ההשפעה העצבית על גליומה ילדים ברמה גבוהה (pHGG) תאים ואינטראקציות הדדיות שלהם. העבודה הנוכחית מראה את ההתפתחות של מודל אין ויטרו פולחן תאי pHGG cohGG נוירונים גלוטמטרגיים ותיעדה את האינטראקציות האלקטרופיזיולוגיות שלהם כדי לחקות את האינטראקטיביות האלה.
Abstract
גליומות ילדים ברמה גבוהה (pHGG) מייצגות סרטן מוח בילדות ובמתבגרים הנושאים פרוגנוזה עגומה מהירה. מכיוון שיש צורך להתגבר על ההתנגדות לטיפולים הנוכחיים ולמצוא דרך חדשה לריפוי, מידול המחלה קרוב ככל האפשר במסגרת מבישה לבדיקת תרופות חדשות והליכים טיפוליים הוא תובעני מאוד. לימוד התהליכים הפתוביולוגיים הבסיסיים שלהם, כולל רגישות יתר של נוירונים גלוטמטרגיים, יהיה התקדמות אמיתית בהבנת אינטראקציות בין המוח הסביבתי לתאי pHGG. לכן, כדי לשחזר נוירונים / אינטראקציות תא pHGG, עבודה זו מראה את ההתפתחות של מודל במבחנה פונקציונלי פולחן שיתוף פולחן גזע Pluripotent המושרה על ידי האדם (hiPS) נגזר נוירונים גלוטמטרגיים קליפת המוח pHGG תאים לתוך התקנים microfluidic ממודר ותהליך כדי לתעד את השינויים האלקטרופיזיולוגיים שלהם. הצעד הראשון היה להבדיל ולאפיין נוירונים גלוטמטרגיים אנושיים. שנית, התאים היו בתרבית במכשירים מיקרופלואידיים עם קווי תאים נגזרים pHGG. מיקרו-סביבה מוחית ופעילות עצבית נכללו אז במודל זה כדי לנתח את ההשפעה החשמלית של תאי pHGG על הנוירונים המיקרו-סביבתיים האלה. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מצמידות באמצעות מערכים רב-אלקטרוניים (MEA) למכשירים מיקרופלואידיים אלה כדי לחקות תנאים פיזיולוגיים ולתעד את הפעילות החשמלית של הרשת העצבית כולה. עלייה משמעותית בעירור הנוירונים הודגשה בנוכחות תאים סרטניים.
Introduction
גליומות ילדים ברמה גבוהה (pHGG) מציגות מגוון גנוטיפי ופנוטיפי מורחב בהתאם לגיל המטופל, מיקום גידול אנטומי והרחבה, ונהגים מולקולריים1. הם גידולים אגרסיביים במוח הנשלטים בצורה גרועה עם אפשרויות הטיפול הקיימות כיום והם הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן המוח אצל ילדים ומתבגרים2. אז, יותר מ -80% מהחולים מתדרדרים בתוך 2 שנים לאחר האבחון שלהם, וההישרדות החציונית שלהם היא 9-15 חודשים, בהתאם למיקומים במוח ולמוטציות הנהג. היעדר טיפול מרפא הוא הדחף העיקרי למחקר במעבדה ומדגיש את הצורך המיידי בגישות טיפוליות חדשניות חדשות. לשם כך פותחו קווי תאים שמקורם במטופלים (PDCL) בתקווה לספק את מגוון ה-pHGG3 בקווים דו-ממדיים (דו-ממדיים) ו/או נוירוספרות תלת-ממדיות. עם זאת, תרביות תאי ההחמקה שמקורן בחולה אינן מחקות את כל מצבי משתני המוח. מודלים אלה אינם מתייחסים לסביבות הנוירו-אנטומיות המקרוסקופיות והמיקרוסקופיות המתוארות בדרך כלל ב- pHGG.
בדרך כלל, pHGG אצל ילדים צעירים מתפתח בעיקר באזורים פונטין ותלמיים, בעוד HGG של מתבגרים וצעירים להתרכז באזורים קליפת המוח, במיוחד באונה הקדמית1. נראה כי מיקומים ספציפיים אלה בגילאי ילדים כוללים סביבות שונות המובילות לגלומות ורשת מורכבת בין תאים סרטניים ופעילות עצבית ספציפית4,5,6. למרות מנגנונים עדיין לא מזוהים, pHGG מתפתח בעיקר מתאי מבשר עצבי לאורך מסלול הבידול של שושלות אסטרוגליות ואוליגודנדרוגליות. בעוד שתפקידן של שושלות גליה אלה הוגבל במשך זמן רב לתמיכה מבנית פשוטה עבור נוירונים, כעת נקבע בבירור כי הם משתלבים לחלוטין במעגלים עצביים ומציגים אינטראקציות גליה-נוירונית דו-כיווניות מורכבות המסוגלות לארגן מחדש אזורים מבניים במוח ולעצב מחדש מעגלים עצביים4,7,8 . יתר על כן, פיסות הולכות וגדלות של ראיות מצביעות על כך שמערכת העצבים המרכזית (CNS) ממלאת תפקיד קריטי בייזום והתקדמות סרטן המוח. עבודות אחרונות התמקדו בפעילות עצבית, אשר נראה להניע צמיחה ומיטוזה של ממאירות גליה באמצעות גורמי גדילה מופרשים ותקשורת סינפטית אלקטרוכימית ישירה6,9. באופן הדדי, תאי גליומה בדרגה גבוהה נראה להשפיע על תפקוד עצבי עם פעילות עצבית גלוטמטרגית גוברת לווסת את הפעולה של המעגלים שבהם הם משולבים מבנית וחשמלית9. לכן, מחקרים שהשתמשו במודלים שמקורם במטופל ובכלים חדשניים למדעי המוח השולטים בפעולה של נוירונים הדגימו השפעה ספציפית למעגל של פעילות עצבית על מיקום גליומה, צמיחה והתקדמות. רוב התחזיות העצביות המעורבות גליומות הן גלוטמטרגיות ומתקשרות באמצעות הפרשות גלוטמט. סמנים ביולוגיים גלוטמטריים ספציפיים כגון mGluR2 או vGlut1/2 מתוארים בדרך כלל6.
מעניין, למרות ההטרוגניות המולקולרית שלהם, גליומות ילדים ומבוגרים בדרגה גבוהה מראות תגובה נפוצה טיפוסית לפעילות עצבית גלוטמטרגית וגורמים מופרשים אחרים כגון נוירוליגין-3 או BDNF (גורם נוירוטרופי המופק מהמוח)4,6,10,11,12,13 . באזורים קליפת המוח, HGGs ילדים ומבוגרים יכול לגרום hyperexcitability עצבית באמצעות הפרשת גלוטמט מוגברת לעכב אינטראורונים גאבא המוביל gliomas הקשורים לפעילות רשת אפילפטית14,15. נוסף על כך, מעגלים עצביים יכולים להיות משופצים על ידי gliomas דוחף משימות נוירולוגיות ספציפיות, למשל, שפה, והוא יכול לפקיע פעילות עצבית מאורגנת נוספת9.
בהתבסס על רציונל זה, קידום ההבנה של תקשורת דו-כיוונית בין תאי גליומה נוירונים חייב להיות מואר לחלוטין בשילוב עם השלבים המוקדמים של גישות pHGG במבחנה. מידול חדשני כזה חיוני להבנת ומדידת השפעת הפעילות החשמלית העצבית במהלך בדיקות סמים וחיזוי תגובת pHGG למעגלים מוחיים. ההתפתחויות האחרונות בכלי מדעי המוח, כגון מכשירים מיקרופלואידיים ועבודות מחקר pHGG, הן המיטה לפתח גישות מידול חדשות ולהיות מסוגל עכשיו לשלב מיקרו-סביבה במוח במודלים של pHGG במבחנה3,16,17,18,19. יחד עם הקלטות אלקטרופיזיולוגיות באמצעות מערכים multielectrode (MEA), התקנים microfluidic20,21,22 מציעים את האפשרות לחקות תנאים פיזיולוגיים תוך רישום הפעילות החשמלית של הרשת העצבית כולה לחלץ פרמטרי קישוריות רשת במספר תנאים. מכשיר זה 23,24 מאפשר תחילה את התצהיר המדויק של תאים בתא ישירות על MEA. טכנולוגיה זו מאפשרת שליטה על צפיפות זריעת תאים והומוגניות על MEA ושליטה עדינה של חילופי מדיה, המהווה צעד קריטי לבידול צאצא עצבי אנושי ישירות למכשירים. יתר על כן, תא התצהיר הנוכחי יכול להיות זרע עם תאים מרובים בנקודות זמן שונות.
לכן, מחקר זה נועד לפתח מודל במבחנה מודל co-culturing גזע Pluripotent אנושי (hiPS) נגזר גלוטמטרגי תאים שמקורם pHGG לתוך מכשירים microfluidic ותיעוד הפעילות החשמלית שלהם כדי להעריך אינטראקציות חשמליות בין שתי אוכלוסיות התא. ראשית, נוירונים גלוטמטרגיים בקליפת המוח הושגו ואופיינו במכשירים מיקרופלואידיים בשלבים שונים של תרבית [יום 4 (D4), כתאי hiPS, וביום 21 (D21) וביום 23 (D23), כמו נוירונים התבגר גלוטמטרגי]. עבור השלב השני של תרבות משותפת, נעשה שימוש בשני דגמי pHGG: קו UW479 ילדים ממוסחר ותאי pHGG יזם מגידול חולה (BT35)3, נושא מוטציה נהג H3.3 K27M. לבסוף, ביצענו הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של תאים גלוטמטרגיים ב- D21 לפני זריעת תאי pHGG ו- D23 לאחר 48 שעות של תרבית משותפת לאותו מכשיר מיקרופלואידי. האינטראקציות בין נוירונים גלוטמטרגיים לתאי pHGG התאפיינו בעלייה משמעותית בפעילות האלקטרופיזיולוגית המתועדת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עבור פרוטוקול זה, מספר ההסמכה הקשור לשימוש בחומרים אנושיים הוא DC-2020-4203.
1. ייצור, הכנה וטיפול של מכשיר מיקרופלואידי
- פברק תבניות SU-8 בטכניקות פוטוליתוגרפיה קונבנציונליות18.
הערה: למטרה זו, שתי מסכות פוטוליתוגרפיה תוכננו לבנות שתי שכבות של מבנים פוטוארסיסטיים על מצע רקיק סיליקון ושכבה פוטורסיסטית דקה SU-8 2005 (גובה 3.2 מיקרומטר ו 6 ± 1 מיקרומטר רוחב) המגדיר מיקרוגרובים אסימטריים תחת דפוס של ערוצים ראשיים שנעשו SU-8 2100 (200 מיקרומטר גבוה, 1 מ"מ רוחב, ובאורך 13 מ"מ) (ראו איור משלים S1). - הפעל את הוופל באמצעות מנקה פלזמה (5.00e-1 torr, תדר רדיו גבוה (RF) רמה) במשך 1 דקות וסילאניזציה אותו באמצעות 1 מ"ל של (טריכלורו(1H,1H,2H,2H,2H-perfluorooctyl)סילאן בתיקיית אלומיניום לתוך דיסקלור במשך 30 דקות.
- הכן יחס של 10:1 של Polydimethylsiloxane (PDMS), לערבב את preפולימר עם זרז, להעביר אותו בחיטוי ואקום כדי להסיר בועות לכודות, ולהטיל אותו לאט על התבנית לפני נרפא בתנור ב 80 °C (40 דקות).
- חותכים אותו לאחר מכן באמצעות סכין גילוח בגודל הרצוי לפני קילוף התבנית. חבטו את המפרצון ואת אזורי השקע כדי להשיג חורים ברוחב 3 מ"מ, לנקות את ה-PDMS ולהגן עליו באמצעות סרט הדבקה.
הערה: עובי התקן PDMS הסופי הוא כ 5 מ"מ. - לטפל במכשיר באמצעות מנקה פלזמה (5.00e-1 טור , רמת RF גבוהה במהלך 1 דקות), להרכיב אותו עם צלחת פטרי פוליסטירן, ולחשוף את הוואקום תחת אור UV במשך 30 דקות.
- מלאו בפיפטה את חדירת המכשיר המיקרופלואידי לפני השימוש ב-70% אתנול ורוקנו אותו על ידי שאיפה.
- לשטוף את המכשיר microfluidic על ידי הוספת מאגרי מפרצון של פוספט אגירה מלוחה (D-PBS) ולרוקן אותו על ידי שאיפה צנרת שלוש פעמים ברציפות.
- מצפים את המכשיר באמצעות 0.05 מ"ג /מ"ל פולי-D-ליסין ומניחים אותו לתוך אינקובטור (37 °C (37 °C,5% CO2). לאחר 24 שעות, לשטוף את המכשיר על ידי הוספת לתוך מאגר הכניסה המדיום neurobasal ולרוקן אותו על ידי שאיפה צנרת שלוש פעמים ברציפות.
- מלא את השבב microfluidic עם המדיום תרבית התא ולתת לו להישאר בטמפרטורת החדר עד לשימוש לכל היותר של 2 שעות.
2. הכנת תאים וזריעה במכשיר המיקרופלואידי
- תרבות, זריעה ואפיון חיסוני של נוירונים גלוטמטרגיים קורטליים שמקורם בקליפת המוח
הערה: בצע ניסויים עם נוירונים גלוטמטרגיים קליפת המוח ממוסחרים שמקורם ב- HIPS (איור 1A). לשמר חומרים שמקורם בבני אדם ולטפל בהם באישור ובהנחיות החקיקה.- רוקנו את מאגרי הכניסה והשקע של המכשיר המיקרופלואידי על ידי שאיפת פיפטה לפני זריעה, ואפשרו רק לערוצי המכשיר להתמלא במדיום.
- זרע את תאי hiPS ביום 0 (D0) על ידי הצבת 10 μL של 6.5 x 106 תאי hiPS / השעיה mL (למשל, 900 תא / ריכוז mm2 ) עם המדיום, שהרכבו ניתן בטבלה 1, ולתת למכשיר להיות מתחת למכסה המנוע (בטמפרטורת החדר) במשך 15 דקות כדי לאפשר לתאים להתחבר.
- לאחר 15 דקות, מלאו הן את מאגרי הכניסה והן את מאגרי השקע ב-50 מיקרו-אל של מדיום תרבות D4, שכל הרכבו ניתן בטבלה 1, והעבירו את המכשיר לחממה (37 °C (37 °C(5%, 5% CO2).
- שמור על בידול נוירונים גלוטמטרגיים למשך 23 ימים (איור 1A(1), מיקרוסקופיה) תחת סביבה מבוקרת (37 °C (37 °C,5% CO2) ועם מדיום מסוים של תרבית תאים, שהרכבו מתואר בטבלה 1. החלף את המדיום באופן קבוע כמפורט בשלב הבא 5. ממש מתחת ובצע את השלבים כמו באיור 1B.
- החלף את המדיום כל 3 עד 4 ימים לאחר הרכב טבלה 1 . יש להשתמש במדיום זריעה עד D4, D4 בינוני עד D7, D7 בינוני עד D11 ו-D11 בינוני למשך הזמן הנותר של התרבות.
- צלם תמונות מיקרוסקופיות ב- D4, D21 ו- D23 באמצעות מיקרוסקופ רגיל של ניגודיות פאזה כדי להעריך את כדאיות התא ולאפשר ספירת תאים.
- לאפיון, לתקן את נוירונים גלוטמטרגיים מובחנים ב 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לאחר שאיפה בינונית ופעל לפי הפרוטוקול להכתמת immunofluorescence.
- לשטוף תאים שלוש פעמים עם תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) ולחלחל אותם במשך 10 דקות עם 0.1% טריטון-X ואחריו 30 דקות עם 3% סרומין בקר (BSA). הוסף נוגדנים ראשוניים ודגר את המכשיר למשך הלילה ב 4 °C (7 °F).
- לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS ודגור עוד יותר עם נוגדנים משניים המתאימים במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
הערה: נוגדנים אימונופלואורסצנטיים המשמשים במחקר מפורטים בטבלה 2. - לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS ו counterstain עם DAPI (4', 6-דיאמינו-2-פנילינדול) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לרכוש תמונות עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיות הפוכה המצויד במצלמת CMOS (מוליך למחצה משלימה של תחמוצת מתכת) ולנתח באמצעות תוכנת ניתוח תמונה מתאימה.
- פתח את התמונות המוכתמות של DAPI ולהפוך ל- binarize עם שגרת הסף בתוכנה. כדי לעשות זאת, לחץ על תמונה > התאם את סף >, והגדר את הפרמטרים המתאימים כדי להבחין בין הגרעין לרקע. לאחר מכן, לחץ על החל תהליך > > קו פרשת המים כדי לפצל את גרעין הצבירה.
- לאחר מכן, השתמש בפונקציית התוכנה המולדת של Analyze Particles כדי לפרש את התמונות הבינאריות. כדי לעשות זאת, לחץ על נתח ולאחר מכן על לנתח חלקיקים ולהגדיר את הפרמטרים המתאימים לאחר מכן: גודל ומסנן מעגליות (לא לכלול אובייקטים ניתוח קטן מ 7 מיקרומטר, גדול מ 20 מיקרומטר, או עם מעגליות קטנה מ 0.1 מיקרומטר).
- מזג את תמונות קווי המתאר שהתקבלו מניתוח DAPI לתמונות אימונופלואורסצנטיות של כתב כדי לאמת את הכתמים הנכונים.
- לבסוף, שמור את הנתונים המשויכים (מספר האובייקטים, האזור הממוצע, % הכיסוי וכו ') עבור סמנים ביולוגיים שונים וכמת את הביטוי ב- D4 ו/ או D21 באמצעות תוכנת כימות מתאימה.
- תרבית תאים של קו pHGG ממוסחר, UW479 וקו תאים שמקורו במטופל, BT353
- תרבית שני קווי התא ב- DMEM /F-12 גלוטמקס בתוספת סרום בקר עוברי 10% (FBS) בבקבוק תרבית תאים. המתינו למפגש של 80% מכל קו סלולרי כפי שמוצג באיור 1C.
- שמור על תאי pHGG אלה תחת סביבה מבוקרת בטמפרטורה של 37 °C (37 °F) בתנאים נורמוקסיים לאורך כל הניסויים.
3. פרוטוקול תרבות משותפת
- התאם את יום הזריעה והריכוז עבור UW479 ו- BT35 קווי תאים כדי להגיע ל -80% מהתאים המשוחחים כאשר התרבות המשותפת אמורה להתחיל, המתאימה ל -21 ימים של תרבות עבור נוירונים גלוטמטרגיים.
- Trypsinize UW479 ו- BT35 וזרע אותם על גבי נוירונים גלוטמטריים בכל מכשיר מיקרופלואידי ייעודי (עם צפיפות יעד של 900 תאים / mm2 עבור כל סוג תא) לפני זריעת תאי pHGG לתוך המכשיר microfluidic המכיל נוירונים גלוטמטרגיים בוגרים.
- שמור על תרביות משותפות במשך יומיים תחת סביבה מבוקרת (37 °C (37 °C,5% CO2) עם נוירון גלוטמטרגי D11 ומדיום ואילך מפורט בטבלה 1.
- ספירת תאי pHGG באמצעות התמונות המיקרוסקופיות שניתחו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה כדי להעריך את הכדאיות שלהם. חשב את אחוז התאים.
הערה: השתמש בנוסחה הבאה: 100 - ((מספר התאים ב- D23 / מספר תאים ב- D21) x 100).
4. הקלטה אלקטרופיזיולוגית
- בצע את ההקלטה האלקטרופיזיולוגית עם מערכת מסחרית ותוכנה זמינה מסחרית.
הערה: הניסויים בוצעו עם MEA שכלל אלקטרודות בקוטר 30 מיקרומטר במרווח של 100 מיקרומטר. - בצע הקלטה אלקטרופיזיולוגית ראשונה על נוירונים גלוטמטרגיים ב- D21 לפני זריעת תאי pHGG. השתמש נוירונים גלוטמטרגיים מובחנים כמו שליטה ותרבות אותם לבד במקביל לתרבות המשותפת. בצע הקלטה שנייה עבור שני התנאים כמתואר בשלב הבא ממוספר 3.
- בצע הקלטה אלקטרופיזיולוגית שנייה ב- D23 (לאחר יומיים של תרבות משותפת).
5. עיבוד נתונים אלקטרופיזיולוגיים
- סנן את הנתונים הגולמיים באמצעות מסנן באטרוורת' מסדר שני (עם תדרי פס של 100 הרץ ו-2500 הרץ).
- לזיהוי ספייק, חשב את ריבוע הממוצע השורש של האות מעל ההקלטה של 10 דקות עבור כל אלקטרודה והגדר סף משרעת המתאים לפי שמונה מהערך הריבועי של ממוצע השורש.
- החל אלגוריתם PTSD (זיהוי ספייק תזמון מדויק25), בהתחשב במשך מרבי של 2 אלפיות שניים עבור פוטנציאל פעולה אחד.
- שקול כאלקטרודה פעילה, כל אלקטרודה מזהה לפחות 5 קוצים / דקה. המשך את ההסתה אם לפחות 10% מהאלקטרודות ההקלטה פעילות.
- חלק את מספר הקוצים שזוהו לפי פרק הזמן של ההקלטה כדי לחשב את קצב הירי הממוצע של כל אלקטרודה פעילה. חשב שיעור ירי ממוצע ממוצע עבור כל ניסוי עצמאי. בסופו של דבר, חשב ממוצע לפי תנאי (±SEM) והבע אותו כפונקציה ביום ההקלטה.
- חשב עלילת רסטר עבור כל ניסוי המייצג את האירועים שזוהו עבור כל אלקטרודה פעילה כפונקציה של זמן. לאחר מכן, לחשב את שיעורי הירי במערך הזמן (או שיעורי ירי מיידיים) של כל האלקטרודות הפעילות, ומאפשר לפקח על סינכרוניות של פעילות הרשת העצבית.
- לבסוף, ליצור גרפי עמודות באמצעות תוכנת הכימות ולבצע השוואות באמצעות בדיקות Kruskal Wallis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לפני לימוד אינטראקציות חשמליות בין נוירונים גלוטמטריים לתאי גליומה, תאי עצב גלוטמטרגיים בקליפת המוח ממקור HIPS התאפיינו כדי לאמת את ההיתכנות של פולחן שלהם במכשירים מיקרופלואידיים (איור 1A). האפיון שלהם הוערך באמצעות נסטין, Sox2, mGlurR2 (קולטני גלוטמט מטאבוטרופיים 2), ו vGLUT1 חיסוני, המיוצג באיור 1A(2-7). כמו נסטין הוא חלבון חוט ביניים הנדרש להישרדות, חידוש והתפשטות מגורה מיטוגן של תאי אבות עצביים, זה בא לידי ביטוי בתאי מערכת העצבים לא מובחן במהלך הפיתוח. Sox2 הוא חבר של SRY דמוי HMG-box גן גורם גורם (SOX) גורם המשפחה המעורבת ברגולציה של התפתחות עוברית, וזה בא לידי ביטוי בעיקר בתאים לא בוגרים ולא מובחנים של האפיתל העצבי ב- CNS. mGluR2 מופץ באופן נרחב ברחבי המוח, עם ביטוי גבוה בקליפת המוח ובהיפוקמפוס. בדרך כלל, הוא מגדיר את התאים presynaptic עם עירור עצבי שלהם שידור סינפטי (למשל, נוירונים גלוטמטרגיים). vGLUT1 משמש גם כסמן ביולוגי גלוטמטרגי. לכן, איור 1 מתמקד בנוירונים גלוטמטריים עם ביטויי נסטין ו-Sox2 ב-D4 וב-D21 כדי לאמת את ההבחנה המתקדמת שלהם לתנאי התרבות (איור 1A(2-4). אחוז התאים החיוביים של Nestin ירד מ-5.4 ± 0.4% ב-D4 ל-0.69 ± 0.3% ב-D21 (p < 0.01, איור 1A5). באופן דומה, המאשר את המצב המובחן של נוירונים גלוטמטרגיים, אחוז התאים החיוביים של Sox2 ירד מ-12.2 ± 2.1% ב-D4 ל-5.5 ± 1.7% ב-D21 (p < 0.05, ראו איור 1A6). הביטוי של mGluR2 זוהה ב 45.4 ± 4.7% של תאים גלוטמטרגיים ב D21 (נתונים לא הראו), וחיסון vGLUT1 גדול יותר נצפתה במהלך בידול גלוטמטרגי ב- D21. תוצאות אלה הראו כי שיעור האבות העצביים נותר נמוך וכי רוב התאים היו מובחנים היטב לאחר תרבית של 21 יום במכשירים מיקרופלואידיים. באיור 1B, פרוטוקול כללי של תרביות שיתוף multistep והקלטה אלקטרופיזיולוגית מתאר את UW479 או BT35 זרעים של תאים במכשירים microfluidic ב D21. קווי תאים אלה (איור 1C) כבר תוארו והם דומים לתצפיות הקודמות שביצעו 3,19. בסופו של דבר הושגו שתי הקלטות אלקטרופיזיולוגיות: אחת ב-D21 לפני פולחן משותף והשנייה ב-D23 לאחר 48 שעות של זריעת קו תא pHGG.
להבנה ולעקבות אחר הניידות והכדאיות של BT35, UW479 ונוירונים גלוטמטריים במהלך תרביות משותפות, הערכות מיקרוסקופיות בוצעו באופן קבוע במהלך תקופת ההקלטה האלקטרופיזיולוגית מ-D21 עד D23 ומוצגות באיור 2. התמונות המיקרוסקופיות חשפו הרחבה מתקדמת והפצה מסוימת של נוירונים גלוטמטרגיים במכשירים מיקרופלואידיים (איור 2A). התאים גלוטמטרגיים יוצרים כמה אגרגטים בהדרגה באופן דומה בתרבות משותפת וכאשר תרבית לבד עד D23 (ניסוי בקרה). באיור 2B,C, בעת הוספת BT35 ו- UW479, נצפתה כי התאים הצפים הנמצאים מיד לאחר זריעת תאי גליומה ב- D21 נעלמו בהדרגה עד D23 והפכו לתאי pHGG דבקים לתוך המכשיר. זה היה בולט במיוחד עבור קו UW479.
יתר על כן, לא הייתה עלייה בתאים צפים לאחר כל ההקלטות האלקטרופיזיולוגיות ב- D23 (נתונים לא הוצגו). עם זאת, אחוזי התאים בני קיימא באיור 2D הוערכו ב-83.02% וב-85.16% עבור BT35 ו-UW479, בהתאמה. שתי יכולות הקו היו דומות והדגישו את העובדה שניתן להשתמש כראוי בקווי תאים שמקורם במטופלים. ההכנה הטכנית של מכשירים מיקרופלואידיים בשילוב MEA ומניפולציות תא אינו משנה את יכולות ההידבקות שלהם. זה לא נראה לגרום למוות תאים או לשנות את ההיבטים המיקרוסקופיים שלהם. נראה שתאי BT35 ו- UW479 ממפים את המיקומים המדויקים של נוירונים גלוטמטריים במכשיר, נודדים קרוב לנוירונים מעוררים.
איור 3 מתאר כדוגמה תרביות UW479/גלוטמטרגיות של נוירונים עם זיהוי הספייק שלהם לאורך זמן ההקלטה באיור 3A ועלילת הרסטר שלו ב-D23 באיור 3B, המציגה פעילות חשמלית מוגברת בעת הוספת תאי pHGG. איור 3C מציג את קצב הירי הזמני בכל מערך בתרבויות BT35/גלוטמטרגיות של נוירונים. ההבדלים בין ניסוי הבקרה (תרבית של נוירונים גלוטמטריים) לבין תרביות משותפות של נוירונים גלוטמטרגיים עם תאי pHGG הם משמעותיים בעת הקלטת פעילות חשמלית D23, כפי שמוצג באיור 3D, מה שמצביע על השפעה של pHGG על עירור נוירונים.
| רכיבים | מדיום זריעה | בינוני D4 | בינוני D7 | D11 ואילך בינוני |
| בינוני DMEM/F-12 | 0.5x | 0.25x | 0.125x | Ø |
| בינונית עצבית | 0.5x | 0.25x | 0.125x | Ø |
| המוחפייז בינוני | Ø | 0.5x | 0.75x | 1x |
| תוספת SM1 | 1x | 1x | 1x | 1x |
| תוספת N2-A | 1x | 1x | 1x | 1x |
| עלא-גלן (גלוטמקס) | 0.5 מ"מ | 0.5 מ"מ | 0.5 מ"מ | 0.5 מ"מ |
| BDNF | 10 ננוגרם לונג/מ"ל | 10 ננוגרם לונג/מ"ל | 10 ננוגרם לונג/מ"ל | 10 ננוגרם לונג/מ"ל |
| GDNF | 10 ננוגרם לונג/מ"ל | 10 ננוגרם לונג/מ"ל | 10 ננוגרם לונג/מ"ל | 10 ננוגרם לונג/מ"ל |
| TGF-β1 | 1 ננוגרם/מ"ל | 1 ננוגרם/מ"ל | 1 ננוגרם/מ"ל | 1 ננוגרם/מ"ל |
| גלטרקס | 30 מיקרוגרם/מ"ל | Ø | Ø | Ø |
| תוספת זריעה | 1x | Ø | Ø | Ø |
| תוספת ליום 4 | Ø | 1x | Ø | Ø |
טבלה 1: הרכב מדיה תרבותית עבור נוירונים גלוטמטרגיים שמקורם hiPS.
| נוגדנים | ריכוזי מניות | דילול עבודה |
| Nestin | 0.5 מ"ג/מ"ל | 1:500 |
| (1 מיקרוגרם/מ"ל) | ||
| סוקס2 | 1 מ"ג/מ"ל | 1:500 |
| (2 מיקרוגרם/מ"ל) | ||
| mGluR2 | 0.2 מ"ג/מ"ל | 1:50 |
| (4 מיקרוגרם/מ"ל) | ||
| vGlut1 | 0.25 מ"ג/מ"ל | 1:50 |
| (5 מיקרוגרם/מ"ל) | ||
| חמור נגד ארנב IgG H&L (AF 647) | 2 מ"ג/מ"ל | 1:1000 עד 1:2000 |
| (1 עד 2 מיקרוגרם/מ"ל) | ||
| חמור נגד עכבר IgG H&L (AF 555) | 2 מ"ג/מ"ל | 1:1000 |
| (2 מיקרוגרם/מ"ל) |
טבלה 2: רשימת נוגדנים חיסוניים.
איור 1: אפיון תאים ופרוטוקול תרבית משותפת של נוירונים גלוטמטרגיים וקווי גליומה ילדים בדרגה גבוהה (pHGG). (A) אפיון מיקרוסקופי ואימונופלואורסצנטי של נוירונים גלוטמטרגיים. (1) תמונות מיקרוסקופיות ביום 21 (D21) וביום 23 (D23) של נוירונים גלוטמטרגיים. (2) סימון נסטין בירוק וב- DAPI בכחול ב- D4 (שורה עליונה) ו- D21 (שורה תחתונה). (3) סימון Sox2 בירוק וב- DAPI בכחול ב- D4 (שורה עליונה) ו- D21 (שורה תחתונה). (4) תיוג mGluR2 בירוק ו- DAPI בכחול ב- D21. (5 ו-6) השוואות סטטיסטיות בין תיוג נסטין ו- Sox2 ב- D4 ו- D21 של תרבות, המדגים הבחנה בין תאים. (7) vGlut1 מכתים בירוק ו DAPI בכתום ב D21. (B) פרוטוקול כללי להקלטה אלקטרופיזיולוגית כדי לחקור אינטראקציות כאשר שיתוף פולחן נוירונים גלוטמטרגיים ותאי גליומה במכשירים. (ג) היבטים מיקרוסקופיים מוקדמים של קווי תאים BT35 ו- UW479. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות מיקרוסקופיות של תאי גלוטמטרג וגליומה בתרבית במכשירים מיקרופלואידיים בשילוב עם מערכים רב-אלקטרוניים (MEA). נוירונים גלוטמטרגיים מובחנים ומתרבתים לבדם במכשיר המיקרופלואידי עד היום 21 (D21). (A) עבור בקרה ניסיונית זו, רק המדיום נוסף לתאי גלוטמטרג ב- D21, בעוד שקווי תאים BT35 (B) או UW479 (C) נוספו בתנאים המתאימים שלהם. תמונות ב- D22 ו- D23 בוצעו לפני הרשומות האלקטרופיזיולוגיות עבור כל תנאי. כל התמונות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ קלאסי של ניגודיות פאזה. (D) הכדאיות של תאי הגידול עבור BT35 ו- UW479 ב- D23 הוערכה באמצעות ספירה אוטומטית עם תוכנת ניתוח תמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הקלטה אלקטרופיזיולוגית. (A) זיהוי ספייק לאורך זמן ההקלטה בתרבויות שיתוף של UW479/גלוטמטרגי. (ב) דוגמה לתווית הרסטר המחושבת ב- D23 מייצגת את האירועים שזוהו עבור כל אלקטרודה פעילה כפונקציה של זמן בתרבויות UW479/גלוטמטרגיות של נוירונים. (C) קצב ירי במערך זמני (או קצב ירי מיידי) של כל האלקטרודות הפעילות המתעדות פעילות חשמלית בתרביות של נוירונים BT35/גלוטמטרגיים, ומאפשרות לנטר סינכרוניות של פעילות הרשת העצבית. (D) תרשימי עמודות של קצב ירי ממוצע במצב הבקרה (למשל, התרבות של נוירונים גלוטמטרגיים) וכאשר מוסיפים קו תאים UW479 גידולי (בירוק) וקו התא BT35 (באדום). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. (* p < 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים S1: ייצוג תלת-ממדי (תלת-ממדי) של תבניות SU-8. (A) יצירה וצילום של תבניות SU-8 עם תוכנת AutoCAD. (B) תמונה של תבניות SU עם שתי שכבות של מבנים פוטוארסיסטים וארבעה חורים ברוחב 3 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבודה זו מתארת מודל במבחנה תפקודית מדויקת כדי להעריך את האינטראקציה בין נוירונים גלוטמטרגיים קליפת המוח נגזר hiPS אנושי ותאים סרטניים במוח במכשירים מיקרופלואידיים. אחד הצעדים המכריעים בפרוטוקול הנוכחי היה בידול hiPS נוירונים גלוטמטרגיים, אשר אושר על ידי הירידה של כתמים אימונופלואורסצנטיים נסטין ו Sox2 ומראה בו זמנית של mGluR2 ו vGLUT1 כתמים. עם זאת, מעט אבות עצביים נותרו מכיוון שרק מחצית מהתאים הגלוטמטריים הביעו mGluR2, כלומר אוכלוסיית תאי נוירון הטרוגניים. בסך הכל, תוצאות אלה מדגישות כי טיפול מסוים חייב להיות מוקדש צמיחת תאים גלוטמטרגיים במכשירים כאלה. יתר על כן, השלב הבא בחקר ההתנהגות החשמלית של נוירונים בנוכחות תאי pHGG היה יחסית עתיר עבודה כדי להגדיר את עיבוד הנתונים כדי לייעל את זיהוי ספייק ופרשנות. עם זאת, כצפוי ומתואר בעבודות אחרות שפורסמו לאחרונה4,5,6,9,10, נוכחות של pHGGs נוירונים גלוטמטרגיים משפרת את הפעילות החשמלית המאשרת את התכונה המעוררת של נוירונים אלה.
המגבלה העיקרית של מידול זה עשויה להיות ההפצה ההטרוגנית של נוירונים על MEA עצמו שיכול להשפיע על הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. זה ידרוש תחזוקה של תרבות בצפיפות גבוהה במכשיר המיקרופלואידי. עבור זריעת סוג תא משני על המכשיר, זה קריטי כדי לשמור על התפשטות מהירה ונדידה בתחילה עבור 48 שעות ולקבל כמו נוירונים התפלגות הומוגנית בטכניקת 48 שעות להקלטה. מגבלה נוספת היא הבחנה בין סוגים שונים של אוכלוסיות תאים במכשירים כאלה מבחינה חזותית, אך גישות חדשות באמצעות חלקיקים פלואורסצנטיים עשויות לסייע בעקבות שני סוגי התאים26. לבסוף, הביצועים של גישה מיקרופלואידית זו נעשו רק בשני סוגים של קווי PHGG ויש להרחיבם לקווי תאים נגזרים יותר על ידי המטופל הנושאים נהגים מולקולריים שונים. הערכות משלימות עשויות להיעשות כדי להבין את האפקט המרגש הזה בעת שיתוף פולחן תאים אלה. עם זאת, זה אפשרי עם תאי pHGG הנושאים מוטציה של מנהל התקן H3.3 K27M, כגון בקו BT353.
השיטה הכוללת שפותחה בעבודה זו היא אחת הגישות החדשות לחקור את ההשפעה החשמלית. זה הראה את היכולת של ניתוח רשת עצבית כדי להעביר את האינטראקציה בין נוירונים גלוטמטרגיים שמקורם hiPS וקווי תאים סרטניים pHGG בתנאי תרבית מיקרופלואידית. שיטה זו מועילה עבור יישומים רבים, במיוחד עבור מחקרים פונקציונליים ומכניסטיים לניתוח ההשפעות של סוכנים פרמקולוגיים שיכולים לחסום נדידת תאי pHGG ואינטראקציה עם נוירונים. הוא מדגיש את השימוש במכשירים מיקרופלואידיים, אך במיוחד כאשר ניסויים עשויים לתעד את הפעילות האלקטרופיזיולוגית וניתן להוסיףם ל- MEA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AB, MG, JR, LM, ML, JV, DD מועסקים על ידי NETRI, FL הוא מנהל טכנולוגיה ראשי ב- NETRI, ו- TH הוא מנהל מדעי ראשי ב- NETRI. למחברים האחרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתוכנית Satt Conectus, Fondation de l'Université de Strasbourg, «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «פרנק, רון דה סוליי» ו «Semeurs d'Etoile» עמותות. אנו מודים לילדים ולמשפחות שנפגעו מהפגנים על תרומתם למחקר זה ולתמיכתם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
| Cortical Glutamatergic Neurons | BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | - | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
References
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Ostrom, Q. T., et al. Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro-Oncology. 16, Suppl 10 1-36 (2015).
- Blandin, A. F., et al. Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity. Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).
- Monje, M.
- Mount, C. W., Yalçın, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity. eLife. 18 (8), 49291 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders. Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Neftel, C., et al. An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Krishna, S., et al. Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival. BioRxiv. , (2021).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).
- Wang, X., et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression. Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).
- Venkatesh, H. S., et al. Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma. Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).
- Venkatesh, H. S., et al. Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion. Cell. 161 (4), 803-816 (2015).
- Buckingham, S. C., et al. Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity. Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).
- Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks. Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).
- Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks. BioRxiv. , (2021).
- Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings. Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).
- Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks. Scientific Reports. 6, 28384 (2016).
- Nguyen, A., et al. Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1α axis inhibition. Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Cerea, A., et al. Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors. Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).
- Bruno, G., et al. Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Maisonneuve, B. G. C., et al. Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework. BioRxiv. , (2021).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Andreiuk, B., et al. Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo. Small. 13 (38), (2017).
