Summary
최근 작품은 고급 소아 신경 교종에 신경 영향을 발견 (pHGG) 세포와 그들의 상호 작용. 본 작품은 생체 외 모델의 발달을 pHGG 세포와 글루타미터기뉴런과 기록하여 그 간 작용을 모방하였다.
Abstract
소아 고급 진모 (pHGG)는 급속한 음이없는 예후를 운반하는 유년기 및 사춘기 뇌암을 나타냅니다. 현재 치료에 대한 저항을 극복하고 새로운 치료법을 찾을 필요가 있기 때문에, 새로운 약물과 치료 절차를 테스트하기 위해 체외 설정에서 가능한 한 가까운 질병을 모델링하는 것은 매우 까다롭습니다. 글루타마테어기신경 과민성 을 포함한 그들의 근본적인 병리학 적 과정을 공부하는 것은 환경 두뇌와 pHGG 세포 사이 상호 작용을 이해하는 실제적인 진보가 될 것입니다. 따라서, 뉴런/pHGG 세포 상호 작용을 재현하기 위하여, 이 작품은 인간 유도한 다능성 줄기(hiPS)-유래 된 피질 글루타마테릭 뉴런 pHGG 세포를 구획화된 미세 유체 장치로 pHGG 세포와 그들의 전기생리학적 수정을 기록하는 프로세스를 공동 배양하는 시험관 내 모델의 발달을 보여줍니다. 첫 번째 단계는 인간의 글루타미터기 뉴런을 분화하고 특성화하는 것이었습니다. 둘째, 세포는 pHGG 유래 세포주를 가진 미세유체 장치에서 배양되었다. 뇌 미세 환경과 뉴런 활동은 이러한 마이크로 환경 뉴런에 pHGG 세포의 전기적 영향을 분석하기 위해 이 모델에 포함되었다. 전기 생리학적 기록은 이러한 미세 유체 장치에 다중 전기 분해 어레이(MEA)를 사용하여 생리적 조건을 모방하고 전체 신경망의 전기 활성을 기록합니다. 뉴런 흥분성에 있는 중요한 증가는 종양 세포의 존재에서 밑줄이 있었습니다.
Introduction
소아 고급 진모(pHGG)는 환자 연령, 종양 해부학적 위치 및 확장 및 분자 동인1에 따라 확장된 지노티픽 및 페노티픽 다이버시티를 나타낸다. 그(것)들은 현재 유효한 처리 선택권으로 제대로 통제되고 아이들과 청소년에 있는 두뇌 암과 관련되되되는 죽음의 주요한 원인인 공격적인 두뇌 종양입니다2. 따라서 환자의 80 % 이상이 진단 후 2 년 이내에 재발하고 있으며, 뇌 위치와 운전자 돌연변이에 따라 평균 생존율은 9-15 개월입니다. 치료 치료의 부재는 실험실 연구를위한 주요 충동이며 새로운 혁신적인 치료 접근 에 대한 즉각적인 필요성을 강조합니다. 이를 위해, 환자 유래 세포주(PDCL)는 2차원(2D) 라인 및/또는 3차원(3D) 신경구에서 pHGG 다이버시티3 를 제공한다는 희망으로 개발되었다. 그럼에도 불구 하 고, 그 환자 파생 된 체 외 세포 배양 모든 뇌 변수 상황을 모방 하지 않습니다. 이러한 모델은 일반적으로 pHGG에 기술된 거시적 및 현미경 신경 해부학 환경을 고려하지 않습니다.
일반적으로, 어린 아이들의 pHGG는 주로 pontine 및 thalamic 지역에서 발전하고 있는 반면, 사춘기와 젊은 성인의 HGG는 피질 지역에 집중하는 반면, 특히 정면 엽1에서. 소아 시대에 걸친 이러한 위치 특이성은 신경종과 종양 세포 와 특정 신경 활동 사이의 복잡한 네트워크로 이어지는 다른 환경을 수반하는 것으로 보입니다4,5,6. 메커니즘은 아직 확인되지 않지만, pHGG는 주로 천체 글리 올과 올리고 의 분화 궤적을 따라 신경 전구체 세포에서 개발. 이러한 신경교 혈통의 역할은 뉴런에 대한 간단한 구조적 지원에 오랫동안 제한되어 왔지만, 이제 는 신경 회로에 완전히 통합하고 뇌의 구조 영역을 재구성하고 뉴런 회로를 리모델링 할 수있는 복잡한 양방향 신경교신경 상호 작용을 나타낸다는 것이 명확합니다4,7,8 . 더욱이, 증거의 파쇄를 증가하는 것은 중추 신경계 (CNS)가 뇌암 개시 및 진행에 중요한 역할을한다는 것을 나타냅니다. 최근 의외의 성장 인자와 직접 전기화학적 시냅스 통신6,9을 통해 글리아 악성종양의 성장과 미토시스를 유도하는 것으로 보이는 신경 활동에 초점을 맞춘 최근 작품. 회귀적으로, 고급 신경교종 세포는 증가하는 글루타머지 뉴런 활동으로 신경 기능에 영향을 미치고 구조적으로 그리고 전기적으로 통합되는 회로의 작동을 조절하는 것처럼 보입니다9. 따라서, 환자 유래 모델과 뉴런 작용을 제어하는 새로운 신경 과학 도구를 사용하여 연구는 신경교종 위치, 성장 및 진행에 신경 활동의 회로 특정 효과를 입증했다. 교종에 관련 된 이러한 신경 투영의 대부분은 글루타머게틱 과 조미료 분비를 통해 의사 소통. mGluR2 또는 vGlut1/2와 같은 특정 글루타마테르기브 바이오마커는 일반적으로 설명되어 있습니다6.
흥미롭게도, 그들의 분자 이질성에도 불구하고, 소아및 성인 고학년 진모는 글루타민간 신경 활동 및 neuroligin-3 또는 BDNF (두뇌 유래 신경 영양인자)와 같은 그밖 분비한 요인에 전형적인 증식 반응을 보여줍니다 (두뇌 유래 신경 영양 인자)4,6,10,11,12,13 . 피질 영역에서, 소아 및 성인 HGGs 증가 된 조미료 분 비를 통해 신경 과민성을 유도 하 고 간 질 네트워크 활동과 관련 된 교감으로 이어지는 GABA 인터뉴런을 억제 할 수 있습니다14,15. 그 위에, 신경 회로는 특정 신경 학 작업을 추진 하는 gliomas에 의해 리모델링 될 수 있습니다., 예를 들어, 언어, 그리고 추가 조직 된 신경 활동을 요구할 수 있습니다9.
이 근거에 근거하여, 신경교종 세포와 신경 사이 양방향 커뮤니케이션의 이해를 전진하는 것은 완전히 해명되고 체외 pHGG 접근의 초기 단계와 통합되어야 합니다. 이러한 혁신적인 모델링은 약물 테스트 중 뉴런 전기 활동 영향을 이해하고 측정하고 뇌 회로에 pHGG 반응을 예측하는 데 매우 중요합니다. 미세 유체 장치 및 pHGG 연구 작품과 같은 신경 과학 도구의 최근 개발은 새로운 모델링 접근 법을 개발하고 이제 체외 pHGG 모델3,16,17,18,19에 뇌 미세 환경을 통합 할 수 있습니다. 다중 전기 극어(MEA)를 이용한 전기생리학적 기록과 결합된 미세유체 장치20,21,22는 전체 신경망의 전기 적 활성을 기록하고 여러 조건하에서 네트워크 연결 파라미터를 추출하면서 생리학적 조건을 모방할 수 있는 가능성을 제공한다. 이 장치23,24는 먼저 MEA에 직접 챔버에서 세포의 정확한 증착을 허용한다. 이 기술은 MEA에 세포 파종 밀도 및 균질성을 제어하고 인간 신경 전조자가 장치로 직접 분화하는 중요한 단계인 미디어 교환의 미세 한 제어를 가능하게합니다. 더욱이, 본 증착 챔버는 상이한 시점에서 다중 세포로 시드될 수 있다.
그래서, 이 연구는 인간 다능성 줄기 (hiPS)유래 된 피질 글루타마테기신경 및 pHGG 유래 세포를 미세 유체 장치로 공동 배양하고 두 세포 집단 사이의 전기 적 상호 작용을 평가하기 위해 전기 활동을 기록하는 기능적 인 시험관 내 모델을 개발하는 것을 목표로했습니다. 첫째, hiPS 유래 피질 글루타마테기닉 뉴런은 다양한 배양 단계[일 4일(D4), hiPS 세포로서, 21일(D21) 및 23일(D23) 및 23일(D23)에서 글루타머기틱 성숙뉴런으로 마이크로유체 장치에서 수득및 특징지어졌다. 공동 배양의 두 번째 단계를 위해, 두 개의 pHGG 모델이 사용되었다: 상용화 된 소아 UW479 라인과 pHGG 세포는 환자 종양에서 시작 (BT35)3, H3.3 K27M 드라이버 돌연변이를 베어링. 마지막으로, 동일한 미세 유체 장치에 공동 배양의 48 h 후 pHGG 세포 파종 및 D23 전에 D21에서 글루타미테르기 세포의 전기 생리학적 기록을 수행했습니다. 글루타미터기뉴런과 pHGG 세포 간의 상호작용은 기록된 전기생리활성의 현저한 증가를 특징으로 하였다.
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Protocol
이 프로토콜의 경우, 인간 물질의 사용과 관련된 인증 번호는 DC-2020-4203입니다.
1. 미세 유체 장치 제조, 준비 및 치료
- 기존의 포토리소그래피 기법을 사용하여 SU-8 금형을 제작합니다18.
참고: 이를 위해 2개의 포토리소그래피 마스크는 실리콘 웨이퍼 기판에 포토레지스트 구조의 두 층과 얇은 SU-8 2005 포토레지스트 층(3.2 μm 높이 및 6 ± 1 μm 폭)을 구성하도록 설계되었으며, SU-8 2100(20μm, 1mm) 에서 만든 주요 채널의 패턴으로 비대칭 마이크로그루브를 정의합니다. 길이 13mm)( 보충 도면 S1 참조). - 1분 동안 플라즈마 클리너(5.00e-1 토르, 고무선 주파수(RF) 레벨을 사용하여 웨이퍼를 활성화하고 알루미늄 폴더에 1mL(트리클로로,1H,2H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)를 사용하여 30분 동안 데시카이터로 탈옥을 한다.
- 폴리디메틸실록산(PDMS)의 10:1 비율을 준비하고, 프리폴리머를 촉매와 혼합하고, 진공 건조기에서 전달하여 갇힌 기포를 제거하고, 80°C에서 오븐에서 40분 동안 경화되기 전에 금형에 천천히 캐스팅한다.
- 금형을 벗겨내기 전에 원하는 크기로 면도기를 사용하여 그 후에 잘라냅니다. 입구와 콘센트 영역을 펀치하여 3mm 너비의 구멍을 확보하고 PDMS를 청소하고 접착제 테이프를 사용하여 보호하십시오.
참고: 최종 PDMS 장치의 두께는 약 5mm입니다. - 플라즈마 클리너(5.00e-1 토르, 1분 동안 높은 RF 레벨)를 사용하여 장치를 처리하고 폴리스티렌 페트리 접시로 조립하고 30분 동안 UV 광 아래에서 진공을 노출시다.
- 70% 에탄올로 사용하기 전에 미세 유체 장치의 입구인 파이펫을 채우고 포부를 피펫팅하여 비웁니다.
- 입구 저수지 를 추가하여 미세 유체 장치를 세척 덜벡코의 인산염 버퍼 살린 (D-PBS) 세 번 연속 포부를 피펫하여 비우십시오.
- 0.05 mg/mL 폴리-D-리신을 사용하여 장치를 코팅하고 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에 넣습니다. 24시간 후, 유입구에 신경물질 배지를 추가하여 장치를 헹구고 포부를 3회 연속으로 피펫팅하여 비우게 한다.
- 세포 배양 배지로 미세 유체 칩을 채우고 최대 2 시간 동안 사용할 때까지 실온에 남아 있게하십시오.
2. 미세 유체 장치에서 세포 준비 및 파종
- 인간 hiPS 유래 피질 글루타머기뉴런의 배양, 파종 및 면역형 특성화
참고: 상용화된 hiPS 유래 피질 글루타마테기뉴런으로 실험을 수행합니다(그림 1A). 인간이 파생한 자료를 보존하고 승인 및 입법 지침에 따라 처리하십시오.- 파종 하기 전에 파이펫 포부로 미세 유체 장치의 입구 및 콘센트 저장소를 비우고 장치의 채널만 매체로 채워집니다.
- 0일(D0)에서 hiPS 세포를 종자(D0)는 6.5 x 106 hiPS 세포/mL 현탁액(예를 들어, 900 셀/mm2 농도)의 10μL을 매체와 함께 넣고, 그 조성물은 표 1에 주어지며, 세포가 15분 동안 후드(실온에서) 아래에 있게 한다.
- 15분 후, 입구와 콘센트 저장소를 모두 50 μL의 D4 배양 배지로 채우고, 전체 조성물은 표 1에 주어지며, 장치를 인큐베이터(37°C, 5% CO2)로 이송한다.
- 대조되는 환경(37°C, 5% CO2) 및 특정 세포 배양 배지하에서 23일 동안 글루타미터기뉴런 분화를 유지하며, 그의 조성물은 표 1에 기재되어 있다. 다음 단계 5에서 자세히 설명된 대로 미디어를 정기적으로 교체합니다. 바로 아래 그림 1B에서와 같이 단계를 따르십시오.
- 표 1 컴포지션 다음 3~4일마다 배지를 교체합니다. D4까지 시드 배지를 사용, D4 배지까지 D7, D7 배지까지 D11, 및 D11 배지는 문화의 나머지 시간 동안.
- 표준 위상 대비 현미경을 사용하여 D4, D21 및 D23에서 현미경 사진을 찍어 세포 생존 가능성을 평가하고 세포 계산을 허용하십시오.
- 특성화의 경우, 분화 된 글루타미터제닉 뉴런을 4% 파라포름데히드(PFA)에서 중간 포부 후 실온에서 30분 동안 수정하고 면역 불피성 염색 프로토콜을 따릅니다.
- 포스페이트 버퍼살린 살린(PBS)으로 3회 세척하고, 트리톤-X0.1%로 10분 동안 30분, 30분 동안 30분동안 소세럼 알부민(BSA)을 세척한다. 1 차적인 항체를 추가하고 4 °C에서 하룻밤 동안 장치를 배양하십시오.
- PBS로 세포를 세 번 헹구고 실온에서 2h에 해당하는 이차 항체와 함께 더 배양한다.
참고: 연구에서 사용되는 면역 형광 항체는 표 2에 나열됩니다. - 실온에서 10분 동안 PBS와 카운터스테인(4',6-디아미노-2-페닐린돌)으로 세포를 세 번 헹구는다.
- CMOS(보완 금속-산화물-반도체) 카메라가 장착된 반전 된 상피 불피 현미경으로 이미지를 획득하고 적절한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하십시오.
- DAPI 염색 된 이미지를 열고 소프트웨어의 임계값 루틴으로 비나이즈합니다. 이렇게 하려면 이미지 > > 임계값 조정을 클릭하고 적절한 매개 변수를 설정하여 핵을 배경과 구별합니다. 그런 다음 유 역 > > 프로세스 적용 을 클릭하여 집계 핵을 분할합니다.
- 그 후, 이진 이미지를 해석하는 입자 분석 소프트웨어의 기능을 사용합니다. 이렇게 하려면 입자 분석 분석을 클릭한 다음 크기 및 순환 필터(7 μm보다 작은 분석 개체, 20 μm 보다 크거나 0.1 μm 보다 작은 원형)와 같은 적절한 매개 변수를 설정합니다.
- DAPI 분석에서 얻은 윤곽 이미지를 면역 형광 사진으로 병합하여 올바른 염색을 검증합니다.
- 마지막으로, 상이한 바이오마커에 대해 관련 데이터(개체 수, 평균 면적, 커버리지%등)를 저장하고 적절한 정량화 소프트웨어를 사용하여 D4 및/또는 D21에서 발현을 정량화한다.
- 상용화된 pHGG 라인, UW479 및 환자 유래 세포주, BT353의 세포 배양
- DMEM/F-12 글루타맥스의 두 세포주를 세포 배양물에서 10% 태아 소 혈청(FBS)으로 보충하였다. 도 1C에 제시된 바와 같이 각 세포주 80% 합류를 기다립니다.
- 실험 전반에 걸쳐 노목조건에서 37°C의 제어된 환경에서 이러한 pHGG 세포를 유지한다.
3. 공동 배양 프로토콜
- UW479 및 BT35 세포주에 대한 파종일과 농도를 조정하여 공동 배양이 시작될 때 컨쿼티 세포의 80%에 도달하도록 조정하며, 이는 글루타머기뉴런을 위한 21일간의 배양에 해당한다.
- 트립시네화 UW479 및 BT35 세포를 시도하고 성숙한 글루타미터지닉 뉴런을 포함하는 미세 유체 장치에 pHGG 세포를 시드하기 전에 각 전용 미세 유체 장치 (각 세포 유형에 대한 900 세포 / mm2 의 목표 밀도)에서 글루타마테어릭 뉴런의 상단에 시드.
- 대조환경(37°C, 5% CO2)에서 2일 동안 공동배양을 유지하며, 표 1에 상세되는 글루타미터기닉 뉴런 D11을 갖는다.
- 이미지 분석 소프트웨어로 분석된 현미경 사진을 사용하여 pHGG 셀을 계산하여 생존 가능성을 평가합니다. 셀 백분율을 계산합니다.
참고: 다음 수식을 사용하십시오: 100 - (D23의 세포 수 / D21의 세포 수) x 100).
4. 전기 생리학 기록
- 상용 시스템과 시판 가능한 소프트웨어로 전기 생리학적 기록을 수행합니다.
참고: 실험은 100 μm에 의해 간격이 30 μm 직경 전극으로 구성된 MEA로 수행되었다. - pHGG 세포의 파종 하기 전에 D21에서 글루타마테르기신경에 첫 번째 전기 생리학적 기록을 수행. 대조군으로 차별화 된 글루타머지 뉴런을 사용 하 여 공동 배양에 동호배와 병행하여 단독으로 배양. 다음 단계 번호 3에 설명된 대로 두 조건에 대해 두 번째 레코딩을 수행합니다.
- D23(2일 후)에서 두 번째 전기생리학적 레코딩을 수행한다.
5. 전기 생리학적 데이터 처리
- 2차 대역 패스 버터워스 필터(100Hz 및 2500Hz의 패스밴드 주파수)로 원시 데이터를 필터링합니다.
- 스파이크 검출의 경우 각 전극에 대해 10분 동안 신호의 루트 평균 사각형을 계산하고 이 루트 평균의 제곱값의 8배에 해당하는 진폭 임계값을 설정합니다.
- 하나의 작업 잠재력에 대해 최대 2ms의 지속 시간을 고려하여 PTSD(정밀 타이밍 스파이크 감지25) 알고리즘을 적용합니다.
- 활성 전극으로 간주, 각 전극은 적어도 5 스파이크 / 분 감지. 기록 전극의 10% 이상이 활성 상태인 경우 분석서를 계속합니다.
- 각 활성 전극의 평균 발사 속도를 계산하기 위해 검출된 스파이크 수를 기록 기간별로 나눕니다. 각 독립 실험에 대한 평균 평균 평균 발사 속도를 계산합니다. 궁극적으로 조건(±SEM)별로 평균을 계산하고 기록 당일 함수로 표현합니다.
- 각 활성 전극에 대해 감지된 이벤트를 나타내는 각 실험에 대해 래스터 플롯을 시간 함수로 계산합니다. 그런 다음 모든 활성 전극의 시간적 배열 전체 발사 속도(또는 즉각적인 발사 속도)를 계산하여 신경망 활동의 동시성을 모니터링할 수 있습니다.
- 마지막으로 정량화 소프트웨어를 사용하여 막대 그래프를 생성하고 Kruskal Wallis 테스트를 사용하여 비교를 수행합니다.
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Representative Results
글루타미터기뉴런과 신경교종 세포 간의 전기적 상호작용을 연구하기 전에 hiPS 유래 피질 글루타머기뉴런은 미세유체 장치에서 배양할 수 있는 타당성을 검증하는 것이 특징이었습니다(그림 1A). 이들의 특성화는 네스티닌, 삭스2, mGlurR2(대사위픽 글루타민체 수용체 2) 및 vGLUT1 면역스테인링을 사용하여 평가되었으며, 도 1A(2-7)로 나타났다. 네신틴은 신경 전구 세포의 생존, 재생 및 미토겐 자극 증식에 필요한 중간 필라멘트 단백질이므로, 따라서 개발 중에 미분화 된 CNS 세포에서 발현된다. Sox2는 배아 발달 조절에 관여하는 SRY 형 HMG 박스 유전자(SOX) 전사 인자 가족의 일원이며, 주로 CNS의 신경 상피의 미성숙하고 미분화되지 않은 세포에서 발현된다. mGluR2널리 피질과 해마에서 높은 발현과 뇌 전체에 분포. 일반적으로, 그것은 그들의 신경 흥분성 및 시 냅 스 전송(예를 들어, 글루타마테릭 뉴런)으로 전시 냅 션 세포를 정의 합니다. vGLUT1은 글루타마테르기식 바이오마커로도 사용된다. 따라서 도 1은 D4 및 D21에서 네스테인 및 Sox2 발현을 가진 글루타머딕 뉴런에 초점을 맞추고 배양 조건으로의 점진적 분화를 검증합니다(그림 1A(도 1A(2-4). 네스티닌 양성세포의 비율은 D21에서 5.4± 0.4%에서 0.69%로 0.69%± 0.3% 감소했습니다(p < 0.01, 그림 1A5). 유사하게, 글루타미터기뉴런의 분화상태를 확인하면, Sox2 양성세포의 비율은 D21에서 D4에서 2.1%± 로 2.1%에서 5.5%± 로 감소하였다(p< 0.05, 그림 1A6 참조). mGluR2의 발현은 D21에서 글루타마테르기세포의 45.4 ± 4.7%에서 검출되었고(데이터는 도시되지 않음), D21에서 글루타미터기분분화 시 더 큰 vGLUT1 면역스테인링이 관찰되었다. 이러한 결과는 신경 전조자의 비율이 낮게 유지되었고 대부분의 세포가 미세 유체 장치에서 21 일 배양 후에 잘 분화되었다는 것을 보여주었습니다. 도 1B에서, 다단계 공동 배양 및 전기 생리학적 기록의 일반적인 프로토콜은 D21에서 미세유체 장치에서 UW479 또는 BT35 세포 파종을 설명합니다. 그 세포주 (그림 1C)는 이미 기술되고 us3,19에 의해 만들어진 이전 관측에 필적합니다. 결국, 2개의 전기생리학적 기록이 얻어졌다: D21에서 하나, pHGG 세포주 파종의 48h 후 D23에서 D23에서 하나.
공동 배양 중 BT35, UW479 및 글루타마테어기뉴닉뉴런의 이동성 및 생존가능성을 이해하고 따르기 위해, D21에서 D23까지의 전기생리학적 기록 기간 동안 현미경 평가가 정기적으로 수행되었으며 도 2에 제시된다. 현미경 이미지는 미세 유체 장치에 걸쳐 글루타머기 뉴런의 점진적 확장 및 특정 분포를 밝혔다 (그림 2A). 글루타미터기세포는 공동 배양과 D23(대조군 실험)까지 단독으로 배양될 때 와 유사한 방식으로 점진적으로 일부 응집체를 형성한다. 도 2B,C에서, BT35 및 UW479를 첨가할 때, D21에서 신경교종 세포의 파종 직후에 존재하는 부동 세포가 D23까지 점진적으로 사라지고 부착된 pHGG 세포가 장치로 유입되는 것을 관찰하였다. 이것은 특히 UW479 라인에 대 한 주목할 만한.
더욱이, D23에서 모든 전기 생리학적 기록 후 부동 세포의 증가가 없었다 (데이터는 표시되지 않음). 그럼에도 불구하고 , 도 2D 에서 실행 가능한 세포의 백분율은 BT35및 UW479에 대해 각각 83.02 %와 85.16 %로 추정되었다. 두 라인 비부채는 비교하고 환자 유래 세포주를 적절하게 사용할 수 있다는 사실을 밑줄이 그렸다. MEA 및 세포 조작과 결합된 미세 유체 장치의 기술적 준비는 접착 능력을 변경하지 않습니다. 그것은 세포 죽음을 유도 하거나 그들의 현미경 측면을 수정 하지 않는 것 같다. BT35 및 UW479 세포는 절세 신경에 밀접하게 마이그레이션, 장치에 글루타머기 뉴런의 정확한 위치를 매핑하는 것 같다.
도 3는 도 3B에서 기록 시간 및 D23에서의 래스터 플롯을 따라 스파이크 검출을 가진 UW479/글루타마테르기크 뉴런 공동 배양을 예로 설명하며, pHGG 세포를 추가할 때 증가된 전기 활성을 보여준다. 도 3C는 BT35/글루타마테르기크 뉴런 공동 배양에서 측두열 전체 발사 속도를 제시한다. 대조군 실험(글루타미터기뉴런의 배양)과 pHGG 세포를 가진 글루타마게틱 뉴런의 공동 배양 사이의 차이는 PHGG가 뉴런 흥분성에 미치는 영향을 나타내는 도 3D에 도시된 바와 같이 D23 전기 활동을 기록할 때 유의하다.
| 구성 요소 | 시드 매체 | D4 매디엄 | D7 배지 | D11 및 이후 중간 |
| DMEM/F-12 미디엄 | 0.5배 | 0.25x | 0.125x | Ø (Ø) |
| 신경 유저 중형 | 0.5배 | 0.25x | 0.125x | Ø (Ø) |
| 브레인피 매체 | Ø (Ø) | 0.5배 | 0.75x | 1x |
| SM1 보충제 | 1x | 1x | 1x | 1x |
| N2 보충 A | 1x | 1x | 1x | 1x |
| 알라글른 (글루타맥스) | 0.5 mM | 0.5 mM | 0.5 mM | 0.5 mM |
| BDNF | 10 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| GDNF | 10 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| TGF-β1 | 1 ng/mL | 1 ng/mL | 1 ng/mL | 1 ng/mL |
| 겔트렉스 | 30 μg/mL | Ø (Ø) | Ø (Ø) | Ø (Ø) |
| 시드 보충 | 1x | Ø (Ø) | Ø (Ø) | Ø (Ø) |
| 일 4 보충 | Ø (Ø) | 1x | Ø (Ø) | Ø (Ø) |
표 1: hiPS 유래 글루타미터기뉴런을 위한 배양 미디어 조성.
| 항 체 | 재고 농도 | 작업 희석제 |
| 네스티인 | 0.5 mg/mL | 1:500 |
| (1 μg/mL) | ||
| 삭스2 | 1 mg/mL | 1:500 |
| (2 μg/mL) | ||
| mGluR2 | 0.2 mg/mL | 1:50 |
| (4 μg/mL) | ||
| v글루티1 | 0.25 mg/mL | 1:50 |
| (5 μg/mL) | ||
| 당나귀 안티 래빗 IgG H&L (AF 647) | 2 mg/mL | 1:1000 ~ 1:2000 |
| (1~2μg/mL) | ||
| 당나귀 안티 마우스 IgG H&L (AF 555) | 2 mg/mL | 1:1000 |
| (2 μg/mL) |
표 2: 면역형광 항체 목록.
도 1: 글루타머기 뉴런과 고급 소아 신경교종(pHGG) 라인의 세포 특성화 및 공동 배양 프로토콜. (A) 글루타미터기뉴런의 전제 조건 현미경 및 면역형 특성화. (1) 글루타미터기뉴런의 21일(D21) 및 23일(D23)의 현미경 사진. (2) 네신은 D4(상층) 및 D21(아래줄)에서 파란색으로 녹색 및 DAPI 라벨을 붙입니다. (3) Sox2 는 D4(상층) 및 D21(아래 줄)에서 파란색으로 녹색 및 DAPI 라벨을 붙입니다. (4) mGluR2 는 D21에서 파란색으로 녹색 및 DAPI 라벨. (5, 6) 네스테인과 Sox2 사이의 통계적 비교는 배양의 D4와 D21에서 라벨링하여 세포 분화를 입증합니다. (7) vGlut1 은 D21에서 오렌지색으로 녹색및 DAPI염색. (B) 전자 생리학적 기록을 위한 일반적인 프로토콜은 장치에서 글루타머기 뉴런 과 신경교 세포를 공동 배양할 때 상호 작용을 연구한다. (C) BT35 및 UW479 세포주의 전제 조건 현미경 측면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 다중 전기열 배열(MEA)에 결합된 미세유체 장치에서 배양된 글루타머기 및 신경교종 세포의 현미경 이미지. 글루타미테르기크 뉴런은 21일째(D21)까지 미세유체 장치에서 단독으로 분화되고 배양된다. (A) 이러한 실험 적 대조군의 경우, 단지 배지가 D21에서 글루타머틱 세포에 첨가되었고, BT35(B) 또는 UW479(C) 세포주중 하나가 각각의 조건에서 첨가되었다. D22 및 D23의 이미지는 각 조건에 대한 전기 생리학적 기록 전에 수행되었다. 모든 이미지는 고전적인 위상 대비 현미경을 사용하여 수득하였다. (D) D23에서 BT35 및 UW479에 대한 종양 세포 생존가능성은 이미지 분석 소프트웨어와 함께 자동화된 수를 사용하여 추정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 전기생리학 기록. (A) UW479/글루타마테르기크 뉴런 공동 배양에서 기록 시간을 따라 스파이크 검출. (b) D23에서 계산된 래스터 플롯의 예는 UW479/글루타미터기크 뉴런 공동 배양에서 시간의 함수로서 각 활성 전극에 대해 검출된 이벤트를 나타낸다. (C) BT35/글루타마테르기크 뉴런 공동 배양에서 전기 활성을 기록하는 모든 활성 전극의 시간적 배열 차원 발사 속도(또는 즉각적인 발사 속도)를 통해 신경망 활동의 동시성을 모니터링할 수 있다. (D) 대조군 조건(예를 들어, 글루타머기뉴런의 배양)과 종양 UW479 세포주(녹색) 및 BT35 세포주(빨간색)를 첨가할 때 평균 발사 속도의 막대 차트. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다(* p < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도S1: SU-8 금형의 3D(3차원) 표현. (A) AutoCAD 소프트웨어로 SU-8 금형의 생성 및 그림. (B) 포토레지스트 구조의 두 층과 3mm 폭의 4개의 구멍이 있는 SU 몰드의 그림. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 작품은 미세 유체 장치에서 인간 hiPS 파생 된 피질 글루타머기신경과 뇌 종양 세포 사이의 상호 작용을 평가하기 위해 정확한 기능적 인 체외 모델을 설명합니다. 본 프로토콜에서 중요한 단계 중 하나는 글루타머기 뉴런의 hiPS 분화였으며, 네스티닌과 Sox2 면역 형광염색 의 감소및 mGluR2 및 vGLUT1 염색의 동시 출현에 의해 확인되었다. 그럼에도 불구 하 고, 몇 가지 신경 선조 는 글루타머기 세포의 절반으로 남아 mGluR2 표현, 이질적인 뉴런 세포 인구를 의미. 전부, 이 결과는 특정 배려가 그 같은 장치에 있는 글루타머지 세포 성장에 투입되어야 한다는 것을 강조합니다. 더욱이, pHGG 세포가 있는 동안 뉴런의 전기적 거동을 연구하는 다음 단계는 스파이크 검출 및 해석을 최적화하기 위해 데이터 처리를 설정하는 비교적 노동 집약적이었다. 그럼에도 불구 하 고, 예상 하 고 다른 최근 출판 된 작품4,5,6,9,10, pHGG와 글루타미터기뉴런의 존재는 그 뉴런의 흥분 기능을 확인 하는 전기 활동을 향상.
이 모델링의 주요 제한은 전기 생리적 기록에 영향을 미칠 수있는 MEA 자체에 뉴런의 이기종 분포 일 수 있습니다. 그것은 미세 유체 장치에서 고밀도 배양의 유지 보수가 필요합니다. 장치에 이차 세포 유형을 파종하는 경우, 48h에 대한 급속증 및 마이그레이션을 초기에 유지하고 기록을 위한 48h 기법에서 뉴런에 대해 균질분포를 얻는 것이 중요하다. 또 다른 제한은 이러한 장치에서 세포 집단의 다른 유형을 시각적으로 분화하는 것이지만 형광 나노 입자를 사용하는 새로운 접근 법은 두 세포 type26을 따르는 데 도움이 될 수 있습니다. 마지막으로, 이 미세유체 접근법의 성능은 두 가지 유형의 phGG 줄에서만 수행되었으며 다른 분자 드라이버를 베어링하는 환자 유래 세포주로 확장되어야 합니다. 보완 평가는 그 세포를 공동 배양할 때 이 흥분 효과를 이해하기 위하여 행해질 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, BT35 라인3와 같은 H3.3 K27M 드라이버 돌연변이를 베어링pHGG 세포로 가능하다.
이 작업에서 개발 된 전반적인 방법은 전기 적 영향을 탐구하는 새로운 방법 중 하나입니다. 그것은 미세 유체 배양 조건에서 hiPS 유래 글루타머기신경과 pHGG 종양 세포 주 사이의 상호 작용을 변환하는 신경망 분석의 용량을 보여 주었다. 이 방법은 많은 응용 프로그램에 대 한 도움이, 특히 기능 및 기계 연구 및 pHGG 세포 마이그레이션 및 뉴런과의 상호 작용을 차단할 수 있는 약리학 에이전트의 효과 분석에 대 한. 그것은 미세 유체 장치의 사용을 강조하지만, 실험이 전기 생리 활성을 기록 할 수 있으며 MEA에 추가 될 수있는 경우에 특히.
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Disclosures
AB, MG, JR, LM, ML, JV, DD는 NETRI에 의해 고용되고, FL은 NETRI의 최고 기술 책임자이며, TH는 NETRI의 최고 과학 책임자입니다. 다른 저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 Satt Conectus 프로그램, 퐁디 드 l'Université 드 스트라스부르, «J'ai 요구 라 루네», «Une 룰라드 부어 샬린», «LifePink», «프랭크, 레이온 드 솔레일»과 «셈퍼스 데토일»의 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 이 연구와 지원에 기여한 HG의 영향을 받는 어린이와 가족들에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
| Cortical Glutamatergic Neurons | BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | - | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
References
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