최근 작품은 고급 소아 신경 교종에 신경 영향을 발견 (pHGG) 세포와 그들의 상호 작용. 본 작품은 생체 외 모델의 발달을 pHGG 세포와 글루타미터기뉴런과 기록하여 그 간 작용을 모방하였다.
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방법 논문
글루타미터기뉴런과 소아 고학년 신경교세포의 공동 배양을 미세유체 장치로 결합하여 전기 적 상호 작용을 평가합니다.
이 논문에서
요약
초록
소아 고급 진모 (pHGG)는 급속한 음이없는 예후를 운반하는 유년기 및 사춘기 뇌암을 나타냅니다. 현재 치료에 대한 저항을 극복하고 새로운 치료법을 찾을 필요가 있기 때문에, 새로운 약물과 치료 절차를 테스트하기 위해 체외 설정에서 가능한 한 가까운 질병을 모델링하는 것은 매우 까다롭습니다. 글루타마테어기신경 과민성 을 포함한 그들의 근본적인 병리학 적 과정을 공부하는 것은 환경 두뇌와 pHGG 세포 사이 상호 작용을 이해하는 실제적인 진보가 될 것입니다. 따라서, 뉴런/pHGG 세포 상호 작용을 재현하기 위하여, 이 작품은 인간 유도한 다능성 줄기(hiPS)-유래 된 피질 글루타마테릭 뉴런 pHGG 세포를 구획화된 미세 유체 장치로 pHGG 세포와 그들의 전기생리학적 수정을 기록하는 프로세스를 공동 배양하는 시험관 내 모델의 발달을 보여줍니다. 첫 번째 단계는 인간의 글루타미터기 뉴런을 분화하고 특성화하는 것이었습니다. 둘째, 세포는 pHGG 유래 세포주를 가진 미세유체 장치에서 배양되었다. 뇌 미세 환경과 뉴런 활동은 이러한 마이크로 환경 뉴런에 pHGG 세포의 전기적 영향을 분석하기 위해 이 모델에 포함되었다. 전기 생리학적 기록은 이러한 미세 유체 장치에 다중 전기 분해 어레이(MEA)를 사용하여 생리적 조건을 모방하고 전체 신경망의 전기 활성을 기록합니다. 뉴런 흥분성에 있는 중요한 증가는 종양 세포의 존재에서 밑줄이 있었습니다.
서론
소아 고급 진모(pHGG)는 환자 연령, 종양 해부학적 위치 및 확장 및 분자 동인1에 따라 확장된 지노티픽 및 페노티픽 다이버시티를 나타낸다. 그(것)들은 현재 유효한 처리 선택권으로 제대로 통제되고 아이들과 청소년에 있는 두뇌 암과 관련되되되는 죽음의 주요한 원인인 공격적인 두뇌 종양입니다2. 따라서 환자의 80 % 이상이 진단 후 2 년 이내에 재발하고 있으며, 뇌 위치와 운전자 돌연변이에 따라 평균 생존율은 9-15 개월입니다. 치료 치료의 부재는 실험실 연구를위한 주요 충동이며 새로운 혁신적인 치료 접근 에 대한 즉각적인 필요성을 강조합니다. 이를 위해, 환자 유래 세포주(PDCL)는 2차원(2D) 라인 및/또는 3차원(3D) 신경구에서 pHGG 다이버시티3 를 제공한다는 희망으로 개발되었다. 그럼에도 불구 하 고, 그 환자 파생 된 체 외 세포 배양 모든 뇌 변수 상황을 모방 하지 않습니다. 이러한 모델은 일반적으로 pHGG에 기술된 거시적 및 현미경 신경 해부학 환경을 고려하지 않습니다.
일반적으로, 어린 아이들의 pHGG는 주로 pontine 및 thalamic 지역에서 발전하고 있는 ....
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프로토콜
이 프로토콜의 경우, 인간 물질의 사용과 관련된 인증 번호는 DC-2020-4203입니다.
1. 미세 유체 장치 제조, 준비 및 치료
- 기존의 포토리소그래피 기법을 사용하여 SU-8 금형을 제작합니다18.
참고: 이를 위해 2개의 포토리소그래피 마스크는 실리콘 웨이퍼 기판에 포토레지스트 구조의 두 층과 얇은 SU-8 2005 포토레지스트 층(3.2 μm 높이 및 6 ± 1 μm 폭)을 구성하도록 설계되었으며, SU-8 2100(20μm, 1mm) 에서 만든 주요 채널의 패턴으로 비대칭 마이크로그루브를 정의합니다. 길이 13mm)( 보충 도면 S1 참조). - 1분 동안 플라즈마 클리너(5.00e-1 토르, 고무선 주파수(RF) 레벨을 사용하여 웨이퍼를 활성화하고 알루미늄 폴더에 1mL(트리클로로,1H,2H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)를 사용하여 30분 동안 데시카이터로 탈옥을 한다.
- 폴리디메틸실록산(PDMS)의 10:1 비율을 준비하고, 프리폴리머를 촉매와 혼합하고, 진공 건조기에서 전달하여 갇힌 기포를 제거하고, 80°C에서 오븐에서 40분 동안 경화되기 전에 금형에 천천히 캐스팅한다. ....
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결과
글루타미터기뉴런과 신경교종 세포 간의 전기적 상호작용을 연구하기 전에 hiPS 유래 피질 글루타머기뉴런은 미세유체 장치에서 배양할 수 있는 타당성을 검증하는 것이 특징이었습니다(그림 1A). 이들의 특성화는 네스티닌, 삭스2, mGlurR2(대사위픽 글루타민체 수용체 2) 및 vGLUT1 면역스테인링을 사용하여 평가되었으며, 도 1A(2-7)로 나타났다. 네신틴은 신경 전구 세포의 생존, 재생 및 미토겐 자극 증식에 필요한 중간 필라멘트 단백질이므로, 따라서 개발 중에 미분화 된 CNS 세포에서 발현된다. Sox2는 배아 발달 조절에 관여하는 SRY 형 HMG 박스 유전자(SOX) 전사 인자 가족의 일원이며, 주로 CNS의 신경 상피의 미성숙하고 미분화되지 않은 세포에서 발현된다. mGluR2널리 피질과 해마에서 높은 발현과 뇌 전체에 분포. 일반적.......
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토론
이 작품은 미세 유체 장치에서 인간 hiPS 파생 된 피질 글루타머기신경과 뇌 종양 세포 사이의 상호 작용을 평가하기 위해 정확한 기능적 인 체외 모델을 설명합니다. 본 프로토콜에서 중요한 단계 중 하나는 글루타머기 뉴런의 hiPS 분화였으며, 네스티닌과 Sox2 면역 형광염색 의 감소및 mGluR2 및 vGLUT1 염색의 동시 출현에 의해 확인되었다. 그럼에도 불구 하 고, 몇 가지 신경 선조 는 글루타머기 세포의 절반으로 남아 mGluR2 표현, 이질적인 뉴런 세포 인구를 의미. 전부, 이 결과는 특정 배려가 그 같은 장치에 있는 글루타머지 세포 성장에 투입되어야 한다는 것을 강조합니다. 더욱이, pHGG 세포가 있는 동안 뉴런의 전기적 거동을 연구하는 다음 단계는 스파이크 검출 및 해석을 최적화하기 위해 데이터 처리를 설정하는 비교적 노동 집약적이었다. 그럼에도 불구 하 고, 예상 하 고 다른 최근 출판 된 작품4,5,6,9,10
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공개 사항
AB, MG, JR, LM, ML, JV, DD는 NETRI에 의해 고용되고, FL은 NETRI의 최고 기술 책임자이며, TH는 NETRI의 최고 과학 책임자입니다. 다른 저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 Satt Conectus 프로그램, 퐁디 드 l'Université 드 스트라스부르, «J'ai 요구 라 루네», «Une 룰라드 부어 샬린», «LifePink», «프랭크, 레이온 드 솔레일»과 «셈퍼스 데토일»의 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 이 연구와 지원에 기여한 HG의 영향을 받는 어린이와 가족들에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 &마이크로; m 프로브 for Scepter 카운터 | Dutscher | 53750 | |
| 60 &마이크로; m 프로브 for Scepter 카운터 | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 현미경 | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| 필터 멤브레인이 있는 캡이 있는 세포 배양 플라스크 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| 클래스 II 생물 안전 캐비닛 | Thermo Scientific | HERASafe 유형 KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
| 피질 글루타메이터 뉴런 | BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 중간 | 시그마 | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM 세포 배양 플라스크 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| 소 태아 혈청 (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| 인큐베이터 | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| 마이크로 피펫 P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| 마이크로 피펫 P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| 마이크로 피펫 P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| 마이크로 피펫 P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS-N2 | ||
| Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 뉴런 보충제 | StemCell | 5711 | |
| 비 필터 팁 0.1 - 10 &마이크로; l ClearLine® 탈착식 뚜껑 랙에 멸균됨 | Dutscher | 030570ACL | |
| 비필터 팁 1 - 200 &마이크로; l ClearLine® 탈착식 뚜껑 랙에 멸균됨 | Dutscher | 032260CL | |
| 비필터 팁 50 - 1250 &마이크로; l ClearLine® 탈착식 뚜껑 랙에서 멸균 | Dutscher | 134760CL | |
| L-글루타민이 없는 비필수 아미노산(NEAA) | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| 세포 배양용 피펫 10mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| 피펫 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β 1 | Peprotech | 100-21C | |
| 튜브, 원뿔형 바닥 15 mL (대량) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| 원뿔형 바닥이 있는 튜브 50mL(벌크) Falcon® | 더처 | 352070 |
참고문헌
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Ostrom, Q. T., et al.
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