Summary
Недавние работы раскрывают нейронное воздействие на клетки высокодипломной детской глиомы (pHGG) и их взаимные взаимодействия. Настоящая работа показывает разработку модели in vitro совместного культивирования pHGG-клеток и глутаматергических нейронов и записывающей их электрофизиологические взаимодействия для имитации этих взаимодействий.
Abstract
Детские высокодифференцированные глиомы (pHGG) представляют собой рак мозга у детей и подростков, которые имеют быстрый мрачный прогноз. Поскольку существует необходимость преодолеть устойчивость к текущим методам лечения и найти новый способ лечения, моделирование заболевания как можно ближе в условиях in vitro для тестирования новых лекарств и терапевтических процедур является очень требовательным. Изучение их фундаментальных патобиологических процессов, включая гипервозбудимость глутаматергических нейронов, станет реальным шагом вперед в понимании взаимодействий между мозгом окружающей среды и клетками pHGG. Таким образом, чтобы воссоздать взаимодействия нейронов / клеток pHGG, эта работа показывает разработку функциональной модели in vitro , кокультурирующей индуцированные человеком плюрипотентные стволовые (hiPS) корковые глутаматергические нейроны pHGG в разделенные микрофлюидные устройства и процесс регистрации их электрофизиологических модификаций. Первым шагом была дифференциация и характеристика глутаматергических нейронов человека. Во-вторых, клетки культивировали в микрофлюидных устройствах с клеточными линиями, полученными из pHGG. Микроокружение мозга и активность нейронов были затем включены в эту модель для анализа электрического воздействия клеток pHGG на эти нейроны микросреды. Электрофизиологические записи соединяются с использованием многоэлектродных массивов (MEA) с этими микрофлюидными устройствами для имитации физиологических условий и записи электрической активности всей нейронной сети. Значительное увеличение возбудимости нейронов было подчеркнуто в присутствии опухолевых клеток.
Introduction
Педиатрические высокодифференцированные глиомы (pHGG) демонстрируют расширенное генотипическое и фенотипическое разнообразие в зависимости от возраста пациента, анатомического расположения и расширения опухоли, а также молекулярных драйверов1. Это агрессивные опухоли головного мозга, которые плохо контролируются с помощью доступных в настоящее время вариантов лечения и являются основной причиной смерти, связанной с раком мозга у детей и подростков2. Так, более 80% пациентов рецидивируют в течение 2 лет после постановки диагноза, а их медиана выживаемости составляет 9-15 месяцев, в зависимости от расположения мозга и мутаций водителя. Отсутствие лечебного лечения является основным стимулом для лабораторных исследований и подчеркивает непосредственную потребность в новых инновационных терапевтических подходах. С этой целью были разработаны клеточные линии, полученные от пациента (PDCL) с надеждой обеспечить разнообразие pHGG3 в двумерных (2D) линиях и / или трехмерных (3D) невросферах. Тем не менее, эти клеточные культуры in vitro, полученные от пациента, не имитируют все переменные ситуации мозга. Эти модели не учитывают макроскопические и микроскопические нейроанатомические среды, обычно описываемые в pHGG.
Обычно pHGG у детей младшего возраста в основном развивается в понтиновой и таламической областях, тогда как HGG подростков и молодых людей концентрируются в кортикальных областях, особенно в лобно-височных долях1. Эти особенности местоположения в педиатрическом возрасте, по-видимому, связаны с различными средами, приводящими к глиомагенезу и заглубляющей сети между опухолевыми клетками и специфической нейронной активностью4,5,6. Хотя механизмы до сих пор не идентифицированы, pHGG в основном развивается из нейронных клеток-предшественников по траектории дифференцировки астроглиальных и олигодендроглиальных линий. Хотя роль этих глиальных линий долгое время ограничивалась простой структурной поддержкой нейронов, в настоящее время четко установлено, что они полностью интегрируются в нейронные цепи и демонстрируют сложные двунаправленные глиально-нейрональные взаимодействия, способные реорганизовывать структурные области мозга и реконструировать нейронные схемы4,7,8 . Более того, увеличение количества доказательств указывает на то, что центральная нервная система (ЦНС) играет решающую роль в инициации и прогрессировании рака мозга. Последние работы были сосредоточены на активности нейронов, которая, по-видимому, стимулирует рост и митоз глиальных злокачественных новообразований через секретируемые факторы роста и прямые электрохимические синаптические коммуникации6,9. Взаимно, полноценные клетки глиомы, по-видимому, влияют на функцию нейронов с увеличением глутаматергической нейронной активности и модулируют работу цепей, в которые они структурно и электрически интегрированы9. Таким образом, исследования с использованием моделей, полученных от пациента, и новых инструментов нейробиологии, контролирующих действие нейронов, продемонстрировали специфическое для схемы влияние нейронной активности на расположение, рост и прогрессирование глиомы. Большинство из этих нейронных проекций, участвующих в глиомах, являются глутаматергическими и сообщаются через секрецию глутамата. Обычно описываются специфические глутаматергические биомаркеры, такие как mGluR2 или vGlut1/26.
Интересно, что, несмотря на свою молекулярную гетерогенность, детские и взрослые полноценные глиомы демонстрируют типичный пролиферативный ответ на глутаматергическую активность нейронов и другие секретируемые факторы, такие как нейролигин-3 или BDNF (нейротрофический фактор мозга)4,6,10,11,12,13 . В корковых областях детские и взрослые HGG могут индуцировать гипервозбудимость нейронов через повышенную секрецию глутамата и ингибировать интернейроны ГАМК, что приводит к глиомам, связанным с эпилептической сетевой активностью14,15. Кроме того, нейронные цепи могут быть реконструированы глиомами, подталкивающими конкретные неврологические задачи, например, язык, и могут реквизировать дополнительную организованную нейронную активность9.
Основываясь на этом обосновании, продвижение понимания двунаправленных связей между клетками глиомы и нейронами должно быть полностью выяснено и интегрировано с ранними стадиями подходов pHGG in vitro. Такое инновационное моделирование имеет решающее значение для понимания и измерения влияния электрической активности нейронов во время тестирования на наркотики и прогнозирования реакции pHGG в схему мозга. Последние разработки в области инструментов нейробиологии, такие как микрофлюидные устройства и исследовательские работы pHGG, являются основой для разработки новых подходов к моделированию и теперь могут интегрировать микросреду мозга в модели pHGG in vitro3,16,17,18,19. В сочетании с электрофизиологическими записями с использованием многоэлектродных массивов (MEA) микрофлюидные устройства20,21,22 предлагают возможность имитировать физиологические условия при записи электрической активности всей нейронной сети и извлекать параметры сетевой связности при нескольких условиях. Это устройство23,24 позволяет сначала точно наносить ячейки в камеру непосредственно на MEA. Эта технология позволяет контролировать плотность и однородность посева клеток на MEA и точно контролировать обмен средами, что является критическим шагом для дифференциации нейронных предшественников человека непосредственно в устройствах. Кроме того, настоящая камера осаждения может быть засеяна несколькими клетками в разные моменты времени.
Таким образом, это исследование было направлено на разработку функциональной модели in vitro , совместно культивирующей человеческие плюрипотентные стволовые (hiPS) корковые глутаматергические нейроны и клетки, полученные из pHGG, в микрофлюидные устройства и записывающую их электрическую активность для оценки электрических взаимодействий между обеими клеточными популяциями. Во-первых, кортикальные глутаматергические нейроны, полученные из hiPS, были получены и охарактеризованы в микрофлюидных устройствах на разных стадиях культивирования [день 4 (D4), как клетки hiPS, и день 21 (D21) и день 23 (D23), как глутаматергические зрелые нейроны]. Для второго этапа совместной культивирования использовались две модели pHGG: коммерциализированная педиатрическая линия UW479 и клетки pHGG, инициированные из опухоли пациента (BT35)3, несущие мутацию драйвера H3.3 K27M. Наконец, мы выполнили электрофизиологические записи глутаматергических клеток на D21 перед посевом pHGG-клеток и D23 после 48 ч совместной культуры в одно и то же микрофлюидное устройство. Взаимодействия между глутаматергическими нейронами и pHGG-клетками характеризовались значительным увеличением регистрируемой электрофизиологической активности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Для этого протокола номер аккредитации, связанный с использованием материалов человека, - DC-2020-4203.
1. Изготовление, подготовка и обработка микрофлюидных устройств
- Изготовление пресс-форм СУ-8 с использованием обычных методов фотолитографии18.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этой целью были разработаны две фотолитографические маски для построения двух слоев структур фоторезиста на подложке кремниевой пластины и тонкого слоя фоторезиста SU-8 2005 (высота 3,2 мкм и ширина 6 ± 1 мкм), который определяет асимметричные микроплоты под рисунок основных каналов, выполненных в SU-8 2100 (высота 200 мкм, ширина 1 мм, и 13 мм в длину) (см. дополнительный рисунок S1). - Активируйте пластину с помощью плазменного очистителя (5.00e-1 torr, высокий радиочастотный (RF) уровень) в течение 1 мин и силанизируйте ее с помощью 1 мл (трихлор(1H,1H,2H,2H-перфтороктил)силана в алюминиевой папке в осушитель в течение 30 мин.
- Приготовьте полидиметилсилоксан (PDMS) в соотношении 10:1, смешайте преполимер с катализатором, пропустите его в вакуумный осушитель для удаления захваченных пузырьков и медленно бросьте на форму перед отверждением в духовке при 80 °C в течение 40 минут.
- Вырежьте его после этого с помощью бритвы нужного размера перед отслаиванием формы. Выбивайте входную и выходную зоны, чтобы получить отверстия шириной 3 мм, очистите PDMS и защитите его с помощью клейкой ленты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина конечного устройства PDMS составляет приблизительно 5 мм. - Обработайте устройство с помощью плазменного очистителя (5.00e-1 torr, высокий уровень ВЧ в течение 1 мин), соберите его с полистирольной чашкой Петри и подвергайте вакуум воздействию ультрафиолетового излучения в течение 30 мин.
- Заполните пипеткой входное отверстие микрофлюидного устройства перед использованием 70% этанолом и опорожните его путем аспирации пипетирования.
- Промыть микрофлюидное устройство, добавив впускные резервуары Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) и опорожнить его, пипетируя аспирацию три раза подряд.
- Нанесите на устройство покрытие с использованием 0,05 мг/мл поли-D-лизина и поместите его в инкубатор (37 °C, 5% CO2). Через 24 ч промыть устройство, добавив во входной резервуар нейробазальную среду и опорожнить его путем пипетирования аспирации три раза подряд.
- Наполните микрофлюидный чип средой для культивирования клеток и оставьте его при комнатной температуре до использования в течение максимум 2 ч.
2. Подготовка и посев клеток в микрофлюидном устройстве
- Культивирование, посев и иммунофлуоресцентная характеристика корковых глутаматергических нейронов человека, полученных из hiPS
ПРИМЕЧАНИЕ: Проведение экспериментов с коммерциализированными кортикальными глутаматергическими нейронами, полученными из hiPS (Рисунок 1А). Сохранять материалы, полученные от человека, и обращаться с ними с одобрения и в соответствии с руководящими принципами законодательства.- Опорожняйте входной и выходной резервуары микрофлюидного устройства аспирацией пипетки перед посевом, позволяя заполнять средой только каналы устройства.
- Засейте hiPS-клетки на 0-й день (D0), положив 10 мкл 6,5 x 106 суспензии hiPS/мл (например, концентрация 900 клеток/мм2 ) на среду, состав которой приведен в таблице 1, и оставьте устройство под капотом (при комнатной температуре) в течение 15 мин, чтобы клетки могли прикрепиться.
- Через 15 мин заполняют как впускные, так и выходные резервуары 50 мкл питательной среды D4, весь состав которой приведен в таблице 1, и перекладывают устройство в инкубатор (37 °C, 5% CO2).
- Поддерживать дифференцировку глутаматергических нейронов в течение 23 дней (фиг.1А(1), микроскопия) в контролируемой среде (37 °C, 5% CO2) и с помощью специфической клеточной культуральной среды, состав которой описан в таблице 1. Регулярно заменяйте носитель, как описано в следующем шаге 5. чуть ниже и следуйте инструкциям, как показано на рисунке 1B.
- Заменяйте среду каждые 3 - 4 дня после таблицы 1 состава. Используйте посевную среду до D4, среду D4 до D7, среду D7 до D11 и среду D11 в течение оставшегося времени культуры.
- Делайте микроскопические снимки на D4, D21 и D23 с помощью стандартного фазово-контрастного микроскопа для оценки жизнеспособности клеток и подсчета клеток.
- Для характеристики зафиксируйте дифференцированные глутаматергические нейроны в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 30 мин при комнатной температуре после аспирации среды и следуйте протоколу иммунофлуоресцентного окрашивания.
- Промыть клетки три раза фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и пропитать их в течение 10 мин с 0,1% Triton-X, а затем 30 мин с 3% бычьим сывороточным альбумином (BSA). Добавьте первичные антитела и инкубируйте устройство в течение ночи при 4 °C.
- Промыть клетки три раза PBS и инкубировать далее с соответствующими вторичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунофлуоресцентные антитела, используемые в исследовании, перечислены в таблице 2. - Промыть клетки три раза PBS и противопачкать DAPI (4',6-диамино-2-фенилиндол) в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Получайте изображения с помощью инвертированного эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного CMOS-камерой (Complementary metal-oxide-semiconductor), и анализируйте с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа изображений.
- Откройте окрашенные изображения DAPI и выполните бинаризацию с помощью процедуры пороговых значений в программном обеспечении. Для этого нажмите на Image > Adjust > Threshold, и задайте соответствующие параметры, чтобы отличить ядро от фона. Затем нажмите «Применить > процесс > водоразделе, чтобы разделить совокупное ядро.
- После этого используйте функцию врожденного программного обеспечения Analyze Particles для интерпретации двоичных изображений. Для этого нажмите « Анализировать», а затем « Анализировать частицы» и после этого задайте соответствующие параметры: фильтр размера и цикличности (исключить из анализа объекты размером менее 7 мкм, размером более 20 мкм или с окружностью менее 0,1 мкм).
- Объедините контурные изображения, полученные в результате анализа DAPI, с соответствующими иммунофлуоресцентными изображениями для проверки правильности окрашивания.
- Наконец, сохраните связанные данные (количество объектов, средняя площадь, % покрытия и т.д.) для различных биомаркеров и количественно оцените экспрессию на D4 и/или D21 с использованием соответствующего программного обеспечения для количественной оценки.
- Клеточная культура коммерциализированной линии pHGG, UW479, и клеточной линии, полученной от пациента, BT353
- Культивируйте обе клеточные линии в DMEM/F-12 GlutaMAX с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в колбе для клеточной культуры. Дождитесь 80% слияния каждой клеточной линии, как показано на рисунке 1С.
- Поддерживайте эти pHGG-клетки в контролируемой среде при 37 °C в нормоксических условиях на протяжении всех экспериментов.
3. Протокол совместного культивирования
- Скорректируйте день посева и концентрацию для клеточных линий UW479 и BT35, чтобы достичь 80% сливающихся клеток, когда должна начаться кокультура, что соответствует 21 дню культивирования для глутаматергических нейронов.
- Трипсинизируют клетки UW479 и BT35 и засевают их поверх глутаматергических нейронов в каждом выделенном микрофлюидном устройстве (с целевой плотностью 900 клеток / мм2 для каждого типа клеток) перед посевом клеток pHGG в микрофлюидное устройство, содержащее зрелые глутаматергические нейроны.
- Поддерживать кокультуры в течение 2 дней в контролируемой среде (37 °C, 5% CO2) с глутаматергическим нейроном D11 и последующей средой, подробно описанной в таблице 1.
- Подсчитайте клетки pHGG с помощью микроскопических изображений, проанализированных с помощью программного обеспечения для анализа изображений, чтобы оценить их жизнеспособность. Рассчитайте процент ячеек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующую формулу: 100 - ((количество ячеек при D23 / количество ячеек при D21) x 100).
4. Электрофизиологический учет
- Выполните электрофизиологическую запись с помощью коммерческой системы и коммерчески доступного программного обеспечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты проводились с МЭА, который состоял из электродов диаметром 30 мкм, расположенных на 100 мкм. - Выполните первую электрофизиологическую запись на глутаматергических нейронах в D21 перед посевом клеток pHGG. Используйте дифференцированные глутаматергические нейроны в качестве контроля и культивируйте их отдельно параллельно с кокультурой. Выполните вторую запись для обоих условий, как описано в следующем шаге под номером 3.
- Выполните вторую электрофизиологическую запись на D23 (после 2 дней совместной культивации).
5. Электрофизиологическая обработка данных
- Фильтруйте необработанные данные с помощью полосового фильтра Баттерворта 2-го порядка (с частотами полосы пропускания 100 Гц и 2500 Гц).
- Для обнаружения шипов вычислите средний квадрат корня сигнала за 10 минут записи для каждого электрода и установите порог амплитуды, соответствующий восьмикратному квадратному значению этого среднего корня.
- Примените алгоритм PTSD (Precision Timing Spike Detection25), учитывая максимальную продолжительность 2 мс для одного потенциала действия.
- Рассмотрим как активный электрод, каждый электрод обнаруживает не менее 5 шипов/мин. Продолжайте анализ, если активны не менее 10% регистрирующих электродов.
- Разделите количество обнаруженных всплесков на период регистрации, чтобы рассчитать среднюю скорость срабатывания каждого активного электрода. Рассчитайте среднюю скорость стрельбы для каждого независимого эксперимента. В конечном счете, вычислите среднее значение по условию (±SEM) и выразите его как функцию в день записи.
- Вычислите растровую диаграмму для каждого эксперимента, представляющую события, обнаруженные для каждого активного электрода в зависимости от времени. Затем рассчитайте временные скорости срабатывания (или мгновенные скорости срабатывания) всех активных электродов, что позволит контролировать синхронность активности нейронной сети.
- Наконец, генерируйте гистограммы с помощью программного обеспечения для количественной оценки и выполняйте сравнения с помощью тестов Kruskal Wallis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
До изучения электрических взаимодействий между глутаматергическими нейронами и клетками глиомы были охарактеризованы корковые глутаматергические нейроны, полученные из hiPS, для проверки возможности их культивирования в микрофлюидных устройствах (рисунок 1A). Их характеристику оценивали с использованием иммуноокрашивания Nestin, Sox2, mGlurR2 (метаботропные глутаматные рецепторы 2) и vGLUT1, представленные на рисунке 1A(2-7). Поскольку Нестин является промежуточным нитчатым белком, необходимым для выживания, обновления и стимуляции митогеном пролиферации нейронных клеток-предшественников, он, таким образом, экспрессируется в недифференцированных клетках ЦНС во время развития. Sox2 является членом семейства транскрипционных факторов SRY-подобного гена HMG-box (SOX), участвующего в регуляции эмбрионального развития, и он преимущественно экспрессируется в незрелых и недифференцированных клетках нервного эпителия в ЦНС. mGluR2 широко распространен по всему мозгу, с высокой экспрессией в коре и гиппокампе. Обычно он определяет пресинаптические клетки с их возбудимостью нейронов и синаптической передачей (например, глутаматергические нейроны). vGLUT1 также используется в качестве глутаматергического биомаркера. Поэтому на рисунке 1 основное внимание уделяется глутаматергическим нейронам с экспрессиями Nestin и Sox2 в D4 и D21 для подтверждения их прогрессивной дифференциации в условиях культуры (рисунок 1A(2-4). Процент нестин-положительных клеток снизился с 5,4 ± 0,4% при D4 до 0,69 ± 0,3% при D21 (p < 0,01, рисунок 1A5). Аналогичным образом, подтверждая дифференцированное состояние глутаматергических нейронов, процент положительных клеток Sox2 снизился с 12,2 ± 2,1% при D4 до 5,5 ± 1,7% при D21 (p < 0,05, см. Рисунок 1A6). Экспрессия mGluR2 была обнаружена у 45,4 ± 4,7% глутаматергических клеток в D21 (данные не показаны), а более крупное иммуноокрашивание vGLUT1 наблюдалось при глутаматергической дифференцировке при D21. Эти результаты показали, что доля нейронных предшественников оставалась низкой и что большинство клеток были хорошо дифференцированы после 21-дневной культуры в микрофлюидных устройствах. На рисунке 1B общий протокол многоступенчатых кокультур и электрофизиологической регистрации описывает посев клеток UW479 или BT35 в микрофлюидных устройствах на D21. Эти клеточные линии (рисунок 1С) уже были описаны и сопоставимы с предыдущими наблюдениями, сделанными нами3,19. В итоге были получены две электрофизиологические записи: одна на D21 перед совместным культивированием, а другая на D23 после 48 ч посева клеточной линии pHGG.
Для понимания и отслеживания подвижности и жизнеспособности нейронов BT35, UW479 и глутаматергических нейронов во время кокультур микроскопические оценки регулярно проводились в период электрофизиологической регистрации от D21 до D23 и представлены на рисунке 2. Микроскопические изображения показали прогрессивное расширение и особое распределение глутаматергических нейронов по микрофлюидным устройствам (рисунок 2А). Глутаматергические клетки образуют некоторые агрегаты постепенно аналогичным образом в кокультуре и при культивировании в одиночку до D23 (контрольный эксперимент). На рисунке 2B,C при добавлении BT35 и UW479 было замечено, что плавающие клетки, присутствующие сразу после посева клеток глиомы в D21, постепенно исчезали до D23 и становились адгезивными pHGG-клетками в устройстве. Это было особенно примечательно для линейки UW479.
Более того, не было увеличения плавающих клеток после всех электрофизиологических записей на D23 (данные не показаны). Тем не менее, процентное содержание жизнеспособных клеток на рисунке 2D оценивалось в 83,02% и 85,16% для BT35 и UW479 соответственно. Жизнеспособность обеих линий была сопоставима и подчеркивала тот факт, что клеточные линии, полученные от пациента, могут быть использованы надлежащим образом. Техническая подготовка микрофлюидных устройств, соединенных с МЭА и клеточными манипуляциями, не изменяет их адгезионную способность. По-видимому, он не вызывает гибель клеток или не изменяет их микроскопические аспекты. Клетки BT35 и UW479, по-видимому, отображают точное местоположение глутаматергических нейронов в устройстве, мигрируя близко к возбуждающим нейронам.
На фиг.3 в качестве примера описаны кокультуры нейронов UW479/glutamatergic с их обнаружением всплесков вдоль времени записи на фиг.3A и его растрового графика на D23 на рисунке 3B, демонстрирующего повышенную электрическую активность при добавлении pHGG-клеток. На рисунке 3C показана временная скорость срабатывания по всему массиву в кокультурах BT35/глутаматергических нейронов. Различия между контрольным экспериментом (культурой глутаматергических нейронов) и кокультурами глутаматергических нейронов с pHGG-клетками значительны при регистрации электрической активности D23, как показано на рисунке 3D, что указывает на влияние рНГГ на возбудимость нейронов.
| Компоненты | Посадочная среда | D4 средний | D7 средний | D11 и дальнейшая среда |
| DMEM/F-12 Средний | в 0,5 раза | в 0,25х | в 0,125х | Ø |
| Нейробазальная среда | в 0,5 раза | в 0,25х | в 0,125х | Ø |
| Мозговая физ-среда | Ø | в 0,5 раза | в 0,75х | в 1 раз |
| Дополнение SM1 | в 1 раз | в 1 раз | в 1 раз | в 1 раз |
| N2 Дополнение-А | в 1 раз | в 1 раз | в 1 раз | в 1 раз |
| Ала-Гльн (ГлутаМакс) | 0,5 мМ | 0,5 мМ | 0,5 мМ | 0,5 мМ |
| БДНФ | 10 нг/мл | 10 нг/мл | 10 нг/мл | 10 нг/мл |
| ГДНФ | 10 нг/мл | 10 нг/мл | 10 нг/мл | 10 нг/мл |
| ТГФ-β1 | 1 нг/мл | 1 нг/мл | 1 нг/мл | 1 нг/мл |
| Гельтрекс | 30 мкг/мл | Ø | Ø | Ø |
| Добавка для посева | в 1 раз | Ø | Ø | Ø |
| День 4 Доплата | Ø | в 1 раз | Ø | Ø |
Таблица 1: Композиция питательных сред для глутаматергических нейронов, полученных из hiPS.
| Антитела | Концентрации запасов | Рабочие разбавления |
| Нестин | 0,5 мг/мл | 1:500 |
| (1 мкг/мл) | ||
| Сокс2 | 1 мг/мл | 1:500 |
| (2 мкг/мл) | ||
| мГлюР2 | 0,2 мг/мл | 1:50 |
| (4 мкг/мл) | ||
| vGlut1 | 0,25 мг/мл | 1:50 |
| (5 мкг/мл) | ||
| Ослик анти-кролик IgG H&L (AF 647) | 2 мг/мл | 1:1000 до 1:2000 |
| (от 1 до 2 мкг/мл) | ||
| Ослик против мыши IgG H&L (AF 555) | 2 мг/мл | 1:1000 |
| (2 мкг/мл) |
Таблица 2: Перечень иммунофлуоресцентных антител.
Рисунок 1: Клеточная характеристика и протокол кокультуры глутаматергических нейронов и высокодифференцированных линий детской глиомы (рНГГ). (А) Предпосылка микроскопической и иммунофлуоресцентной характеристики глутаматергических нейронов. (1) Микроскопические снимки на 21 день (D21) и 23 день (D23) глутаматергических нейронов. (2) Маркировка Nestin зеленым цветом и DAPI синим цветом в D4 (верхний ряд) и D21 (нижний ряд). (3) Маркировка Sox2 зеленым цветом и DAPI синего цвета в D4 (верхний ряд) и D21 (нижний ряд). (4) маркировка mGluR2 зеленым цветом и DAPI синего цвета при D21. (5 и 6) Статистические сравнения между маркировкой Nestin и Sox2 в D4 и D21 культуры, демонстрирующие дифференцировку клеток. (7) окрашивание vGlut1 в зеленый цвет и DAPI в оранжевый цвет при D21. (B) Общий протокол электрофизиологической регистрации для изучения взаимодействий при совместном культивировании глутаматергических нейронов и клеток глиомы на устройствах. (C) Предпосылки микроскопических аспектов клеточных линий BT35 и UW479. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Микроскопические изображения глутаматергических и глиомных клеток, культивируемых в микрофлюидных устройствах, соединенных с многоэлектродными массивами (MEA). Глутаматергические нейроны дифференцируются и культивируются отдельно в микрофлюидном устройстве до 21-го дня (D21). (A) Для этого экспериментального контроля к глутаматергическим ячейкам добавляли только среду при D21, в то время как клеточные линии BT35 (B) или UW479 (C) добавляли в их соответствующих условиях. Изображения на D22 и D23 были выполнены перед электрофизиологическими записями для каждого состояния. Все снимки были получены с помощью классического фазоконтрастного микроскопа. (D) Жизнеспособность опухолевых клеток для BT35 и UW479 при D23 оценивалась с использованием автоматизированного подсчета с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Электрофизиологическая запись. (A) Обнаружение всплесков во время записи в кокультурах UW479/глутаматергических нейронов. (B) Пример вычисляемого растрового графика на D23 представляет события, обнаруженные для каждого активного электрода в зависимости от времени в кокультурах нейронов UW479/глутаматергических нейронов. (C) Временная скорость срабатывания (или мгновенная скорость срабатывания) всех активных электродов, регистрирующих электрическую активность в кокультурах нейронов BT35/glutamatergic, что позволяет контролировать синхронность активности нейронной сети. (D) Гистограммы средней скорости срабатывания в контрольном состоянии (например, культура глутаматергических нейронов) и при добавлении опухолевой клеточной линии UW479 (зеленым цветом) и клеточной линии BT35 (красным цветом). Данные показаны как среднее ± SEM. (* p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: 3D (3-мерное) представление пресс-форм СУ-8. (A) Создание и нанесение на карту пресс-форм СУ-8 с помощью программного обеспечения AutoCAD. (B) Изображение SU-форм с двумя слоями фоторезистических структур и четырьмя отверстиями шириной 3 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой работе описывается точная функциональная модель in vitro для оценки взаимодействия между кортикальными глутаматергическими нейронами человека, полученными из hiPS, и опухолевыми клетками головного мозга в микрофлюидных устройствах. Одним из важнейших шагов в настоящем протоколе была дифференцировка hiPS в глутаматергических нейронах, что было подтверждено уменьшением иммунофлуоресцентного окрашивания Nestin и Sox2 и одновременным появлением окрашивания mGluR2 и vGLUT1. Тем не менее, немногие нейронные предшественники остались, так как только половина глутаматергических клеток экспрессировала mGluR2, что означает гетерогенную популяцию нейронных клеток. В целом, эти результаты подчеркивают, что особое внимание должно быть уделено росту глутаматергических клеток в таких устройствах. Кроме того, следующий шаг изучения электрического поведения нейронов в присутствии pHGG-клеток был относительно трудоемким для настройки обработки данных для оптимизации обнаружения и интерпретации всплесков. Тем не менее, как и ожидалось и описано в других недавно опубликованных работах4,5,6,9,10, наличие pHGG и глутаматергических нейронов усиливает электрическую активность, подтверждая возбуждающую особенность этих нейронов.
Основным ограничением этого моделирования может быть гетерогенное распределение нейронов на самом MEA, которое может влиять на электрофизиологические записи. Это потребует поддержания культуры высокой плотности в микрофлюидном устройстве. Для посева вторичного типа клеток на устройство крайне важно поддерживать быструю пролиферацию и миграцию первоначально в течение 48 ч и получать как для нейронов однородное распределение в 48-часовой технике регистрации. Другим ограничением является визуальная дифференциация различных типов клеточных популяций в таких устройствах, но новые подходы с использованием флуоресцентных наночастиц могут помочь следовать обоим типам клеток26. Наконец, производительность этого микрофлюидного подхода была выполнена только в двух типах линий phGG и должна быть распространена на более полученные от пациента клеточные линии, несущие различные молекулярные драйверы. Дополнительные оценки могут быть сделаны, чтобы понять этот возбуждающий эффект при совместном культивировании этих клеток. Тем не менее, это возможно с pHGG-клетками, несущими мутацию драйвера H3.3 K27M, например, в линии BT353.
Общий метод, разработанный в этой работе, является одним из новых подходов к исследованию электрического воздействия. Он показал способность анализа нейронных сетей трансдуцировать взаимодействие между глутаматергическими нейронами, полученными из hiPS, и опухолевыми клеточными линиями pHGG в условиях микрофлюидной культуры. Этот метод полезен для многих применений, особенно для функциональных и механистических исследований и для анализа эффектов фармакологических агентов, которые могут блокировать миграцию клеток pHGG и взаимодействие с нейронами. Он подчеркивает использование микрофлюидных устройств, но особенно когда эксперименты могут регистрировать электрофизиологическую активность и могут быть добавлены к MEA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AB, MG, JR, LM, ML, JV, DD работают в NETRI, FL является главным техническим директором NETRI, а TH является главным научным сотрудником NETRI. Другим авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами программы Satt Conectus, Фонда Страсбургского университета, ассоциаций «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Franck, Rayon de Soleil» и «Semeurs d'Etoile». Мы благодарим детей и семьи, пострадавшие от HGG, за их вклад в это исследование и их поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
| Cortical Glutamatergic Neurons | BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | - | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
References
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Ostrom, Q. T., et al. Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro-Oncology. 16, Suppl 10 1-36 (2015).
- Blandin, A. F., et al. Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity. Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).
- Monje, M.
- Mount, C. W., Yalçın, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity. eLife. 18 (8), 49291 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders. Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Neftel, C., et al. An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Krishna, S., et al. Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival. BioRxiv. , (2021).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).
- Wang, X., et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression. Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).
- Venkatesh, H. S., et al. Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma. Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).
- Venkatesh, H. S., et al. Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion. Cell. 161 (4), 803-816 (2015).
- Buckingham, S. C., et al. Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity. Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).
- Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks. Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).
- Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks. BioRxiv. , (2021).
- Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings. Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).
- Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks. Scientific Reports. 6, 28384 (2016).
- Nguyen, A., et al. Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1α axis inhibition. Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Cerea, A., et al. Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors. Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).
- Bruno, G., et al. Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Maisonneuve, B. G. C., et al. Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework. BioRxiv. , (2021).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Andreiuk, B., et al. Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo. Small. 13 (38), (2017).
