Summary
最近的工作揭示了神经元对高级别小儿胶质瘤（pHGG）细胞的影响及其相互相互作用。目前的工作显示了一种 体外 模型的发展，该模型共培养pHGG细胞和谷氨酸能神经元，并记录了它们的电生理相互作用以模仿这些相互作用。
Abstract
儿科高级别胶质瘤（pHGG）代表儿童和青少年脑癌，预后迅速恶化。由于需要克服对当前治疗的耐药性并找到一种新的治疗方法，因此 在体外 环境中尽可能接近地对疾病进行建模以测试新药物和治疗程序要求很高。研究它们的基本病理生物学过程，包括谷氨酸能神经元的过度兴奋性，将是理解环境大脑和pHGG细胞之间相互作用的真正进步。因此，为了重建神经元/pHGG细胞相互作用，这项工作展示了一种功能 性体外 模型的发展，该模型将人类诱导的多能干（hiPS）衍生的皮质谷氨酸能神经元pHGG细胞转化为区室化的微流体装置以及记录其电生理修饰的过程。第一步是区分和表征人类谷氨酸能神经元。其次，将细胞培养在具有pHGG衍生细胞系的微流体装置中。然后将大脑微环境和神经元活动纳入该模型，以分析pHGG细胞对这些微环境神经元的电影响。电生理记录使用多电极阵列（MEA）耦合到这些微流体装置，以模拟生理条件并记录整个神经网络的电活动。在肿瘤细胞存在的情况下，神经元兴奋性的显着增加被强调。
Introduction
小儿高级别胶质瘤 （pHGG） 表现出扩展的基因型和表型多样性，具体取决于患者年龄、肿瘤解剖学位置和扩展以及分子驱动因素1。它们是侵袭性脑肿瘤，目前可用的治疗方案控制不佳，是儿童和青少年脑癌相关死亡的主要原因2。因此，超过80%的患者在诊断后2年内复发，他们的中位生存期为9-15个月，这取决于大脑位置和驱动突变。缺乏治愈性治疗是实验室研究的主要动力，并突出了对新的创新治疗方法的迫切需要。为此，开发了患者来源的细胞系（PDCL），希望在二维（2D）系和/或三维（3D）神经球中提供pHGG多样性3 。然而，这些患者来源 的体外 细胞培养物并不能模拟所有脑变量情况。这些模型不考虑pHGG中通常描述的宏观和微观神经解剖环境。
通常，年幼儿童的pHGG主要发生在脑桥和丘脑区域，而青少年和年轻人的HGG集中在皮质区域，特别是在额颞叶1。这些跨儿科年龄的位置特异性似乎涉及导致胶质瘤发生的不同环境以及肿瘤细胞和特定神经元活动之间错综复杂的网络4，5，6。虽然机制尚未确定，但pHGG主要从神经前体细胞沿着星形胶质细胞和少突胶质细胞谱系的分化轨迹发展而来。虽然这些神经胶质谱系的作用长期以来一直局限于对神经元的简单结构支持，但现在已经明确确定，它们完全整合到神经回路中，并表现出复杂的双向神经胶质 - 神经元相互作用，能够重组大脑的结构区域并重塑神经元回路4，7，8.此外，越来越多的证据表明，中枢神经系统（CNS）在脑癌的发生和进展中起着至关重要的作用。最近的工作集中在神经元活动上，这似乎通过分泌的生长因子和直接的电化学突触通讯来驱动神经胶质恶性肿瘤的生长和有丝分裂6，9。反过来，高级别胶质瘤细胞似乎随着谷氨酸能神经元活动的增加而影响神经元功能，并调节它们在结构和电上集成的电路的运行9。因此，使用患者衍生的模型和控制神经元作用的新型神经科学工具的研究表明，神经元活动对胶质瘤的位置，生长和进展具有电路特异性影响。参与神经胶质瘤的这些神经元投射中的大多数是谷氨酸能的，并通过谷氨酸分泌物进行交流。通常描述特定的谷氨酸能生物标志物，如 mGluR2 或 vGlut1/26。
有趣的是，尽管其分子异质性，但儿童和成人高级别胶质瘤对谷氨酸能神经元活动和其他分泌因子（如神经木质素-3或BDNF（脑源性神经营养因子））表现出典型的增殖反应4，6，10，11，12，13.在皮质区域，儿童和成人HGGs可以通过增加谷氨酸分泌诱导神经元过度兴奋，并抑制GABA中间神经元，导致与癫痫网络活动相关的胶质瘤14，15。最重要的是，神经回路可以通过神经胶质瘤来重塑，这些神经胶质瘤推动特定的神经任务，例如语言，并且可以征用额外的有组织的神经元活动9。
基于这一原理，必须充分阐明对胶质瘤细胞和神经元之间双向通信的理解，并将其与 体外 pHGG方法的早期阶段相结合。这种创新的建模对于理解和测量药物测试期间神经元电活动的影响以及预测pHGG对大脑回路的反应至关重要。神经科学工具的最新发展，如微流体装置和pHGG研究工作，是开发新建模方法的床，现在能够将大脑微环境整合到体外 pHGG模型中3，16，17，18，19。结合使用多电极阵列（MEA）的电生理记录，微流体器件20，21，22 提供了模拟生理条件的可能性，同时记录整个神经网络的电活动并在多种条件下提取网络连接参数。该器件23，24 首先允许将细胞精确地沉积在直接在MEA上的腔室中。该技术能够控制MEA上的细胞接种密度和均匀性，并精细控制培养基交换，这是人类神经祖细胞直接分化成设备的关键步骤。此外，本沉积室可以在不同的时间点接种多个细胞。
因此，本研究旨在开发一种功能 性体外 模型，将人类多能干（hiPS）衍生的皮质谷氨酸能神经元和pHGG衍生的细胞共培养成微流体装置，并记录它们的电活动以评估两个细胞群之间的电相互作用。首先，在培养的不同阶段[第4天（D4）作为hiPS细胞，第21天（D21）和第23天（D23），作为谷氨酸能成熟神经元]的微流体装置中获得hiPS衍生的皮质谷氨酸能神经元并表征。对于共培养的第二步，使用了两种pHGG模型：商业化的儿科UW479系和从患者肿瘤（BT35）3引发的pHGG细胞，带有H3.3 K27M驱动突变。最后，我们在pHGG细胞接种前在D21和共培养48小时后在D23处对谷氨酸能细胞进行了电生理学记录。并在同一微流体装置中。谷氨酸能神经元与pHGG细胞之间的相互作用的特征在于记录的电生理活性显着增加。
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Protocol
对于该协议，与使用人类材料相关的认证编号为DC-2020-4203。
1. 微流控装置的制造、制备和处理
- 使用传统的光刻技术制造SU-8模具18。
注：为此目的，设计了两个光刻掩模，以在硅晶圆衬底上构建两层光刻胶结构和一层薄的SU-8 2005光刻胶层（3.2μm高，6±1μm宽），该层在SU-8 2100（200μm高，1 mm宽， 和13毫米长）（见 补充图S1）。 - 通过使用等离子体清洁剂（5.00e-1 torr，高射频（RF）水平）激活晶圆1分钟，并使用1 mL（三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷在铝夹中将其硅烷化30分钟。
- 准备10：1比例的聚二甲基硅氧烷（PDMS），将预聚物与催化剂混合，将其置于真空干燥器中以除去捕获的气泡，然后将其缓慢浇注到模具上，然后在80°C的烘箱中固化40分钟。
- 之后使用剃须刀将其切成所需尺寸，然后剥离模具。冲出入口和出口区域以获得3毫米宽的孔，清洁PDMS，并使用胶带保护它。
注：最终PDMS器件的厚度约为5 mm。 - 使用等离子清洗剂（5.00e-1 torr，1分钟内的高射频水平）处理设备，用聚苯乙烯培养皿组装，并将真空暴露在紫外线下30分钟。
- 在使用前用70%乙醇移液器填充微流体装置的入口，并通过移液抽吸将其清空。
- 通过添加入口储液器Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（D-PBS）来洗涤微流体装置，并通过连续三次移液抽吸将其清空。
- 使用0.05mg / mL聚-D-赖氨酸涂覆设备，并将其放入培养箱（37°C，5%CO 2）中。24小时后，通过向入口储液器中加入神经基础培养基来冲洗装置，并通过连续三次移液抽吸将其清空。
- 用细胞培养基填充微流控芯片，使其保持在室温下，直到最多使用2小时。
2. 微流体装置中的细胞制备和接种
- 人hiPS衍生的皮质谷氨酸能神经元的培养、播种和免疫荧光表征
注：使用商业化的hiPS衍生皮质谷氨酸能神经元（图1A).保存人为材料，并在批准和立法准则下处理它们。- 在接种前通过移液抽吸器清空微流体装置的入口和出口储液器，仅让装置的通道充满培养基。
- 在第0天（D0）接种hiPS细胞，方法是将10μL6.5×106 hiPS细胞/ mL悬浮液（例如，900 cell / mm2 浓度）与培养基（其组成见 表1）一起接种，并让设备在引擎盖下（室温下）15分钟以允许细胞附着。
- 15分钟后，用50μLD4培养基填充入口和出口储液槽，其整个组成在 表1中给出，并将设备转移到培养箱（37°C，5%CO 2）中。
- 在受控环境（37°C，5%CO 2）和特定的细胞培养基下维持谷氨酸能神经元分化23天（图1A（1），显微镜），其组成如表1所示。定期更换介质，如下一步 5 中所述。就在下面，然后按照图 1B 中的步骤操作。
- 每3~4天更换一次 表1 组合物后的培养基。使用接种培养基至D4，D4培养基至D7，D7培养基至D11，D11培养基剩余时间。
- 使用标准相差显微镜在D4，D21和D23处拍摄显微镜照片，以评估细胞活力并允许细胞计数。
- 为了表征，在培养基抽吸后，在室温下将分化的谷氨酸能神经元在4%多聚甲醛（PFA）中固定30分钟，并遵循免疫荧光染色方案。
- 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞三次，并用0.1%Triton-X将其透化10分钟，然后用3%牛血清白蛋白（BSA）30分钟。加入一抗并将设备在4°C下孵育过夜。
- 用PBS冲洗细胞三次，并在室温下用相应的二抗进一步孵育2小时。
注：本研究中使用的免疫荧光抗体列于 表2。 - 用PBS冲洗细胞三次，并在室温下用DAPI（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚）复染10分钟。
- 使用装有CMOS（互补金属氧化物半导体）相机的倒置落射荧光显微镜采集图像，并使用适当的图像分析软件进行分析。
- 打开DAPI染色的图像，并使用软件中的阈值例程进行二值化。为此，请单击" 图像>调整>阈值"，然后设置适当的参数以将原子核与背景区分开来。然后，单击" >过程>流域" 以拆分聚集体核。
- 之后，使用 分析粒子 先天软件的功能来解释二进制图像。为此，请单击" 分析 "，然后单击" 分析粒子" ，并在此之后设置适当的参数： 尺寸 和 圆度过滤器 （从小于 7 μm、大于 20 μm 或圆度小于 0.1 μm 的分析对象中排除）。
- 将从DAPI分析获得的轮廓图像合并到相应的免疫荧光图像中，以验证正确的染色。
- 最后，保存不同生物标志物的相关数据（对象数，平均面积，覆盖率百分比等），并使用适当的定量软件定量D4和/或D21处的表达。
- 商业化pHGG系UW479和患者来源细胞系的细胞培养，BT353
- 在细胞培养瓶中补充10%胎牛血清（FBS）的DMEM / F-12 GlutaMAX中培养两种细胞系。等待每个细胞系的80%汇合，如图 1C所示。
- 在整个实验过程中，将这些pHGG细胞在37°C的受控环境中保持在正常氧化条件下。
3. 共培养方案
- 当应开始共培养时，调整UW479和BT35细胞系的接种日和浓度，以达到汇合细胞的80%，相当于谷氨酸能神经元培养21天。
- 胰蛋白酶消化UW479和BT35细胞，并将它们接种在每个专用微流体装置（每种细胞类型的靶密度为900个细胞/ mm2 ）的谷氨酸能神经元的顶部，然后将pHGG细胞接种到含有成熟谷氨酸能神经元的微流体装置中。
- 在受控环境（37°C，5%CO 2）下保持共培养物2天，谷氨酸能神经元D11和 表1中详述的更高培养基。
- 使用用图像分析软件分析的显微图像计数pHGG细胞，以评估其活力。计算单元格的百分比。
注意：使用以下公式：100 - （（D23 处的单元格数/D21 处的单元格数）x 100）。
4. 电生理记录
- 使用商业系统和商用软件执行电生理记录。
注：实验是使用MEA进行的，MEA由直径为30μm的电极组成，间隔为100μm。 - 在接种pHGG细胞之前，在D21处对谷氨酸能神经元进行首次电生理记录。使用分化的谷氨酸能神经元作为对照，并与共培养平行单独培养它们。对这两个条件执行第二次记录，如编号为 3 的下一步中所述。
- 在D23处进行第二次电生理记录（共培养2天后）。
5. 电生理数据处理
- 使用二 阶带通巴特沃斯滤波器（通带频率为 100 Hz 和 2500 Hz）过滤原始数据。
- 对于尖峰检测，计算每个电极在10分钟记录期间信号的均方根，并设置对应于该均方根值八倍的幅度阈值。
- 应用 PTSD（精确定时尖峰检测25）算法，考虑一个动作电位的最大持续时间为 2 毫秒。
- 考虑作为有源电极，每个电极检测至少5个尖峰/分钟。如果至少10%的记录电极处于活性，请继续测定。
- 将检测到的尖峰数除以记录的时间段，以计算每个有源电极的平均发射速率。计算每个独立实验的平均平均发射速率。最终，按条件（±SEM）计算平均值，并将其表示为记录当天的函数。
- 计算每个实验的栅格图，表示每个活动电极检测到的事件作为时间的函数。然后，计算所有有源电极的时域阵列范围的发射速率（或瞬时发射速率），从而可以监控神经网络活动的同步性。
- 最后，使用量化软件生成条形图，并使用Kruskal Wallis测试进行比较。
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Representative Results
在研究谷氨酸能神经元和胶质瘤细胞之间的电相互作用之前，对hiPS衍生的皮质谷氨酸能神经元进行了表征，以验证在微流体装置中培养它们的可行性（图1A）。使用Nestin，Sox2，mGlurR2（代谢性谷氨酸受体2）和vGLUT1免疫染色（ 如图1A（2-7）所示）评估其表征。由于巢蛋白是神经祖细胞存活、更新和丝裂原刺激增殖所需的中间丝状蛋白，因此在发育过程中在未分化的CNS细胞中表达。Sox2是参与调节胚胎发育的SRY样HMG盒基因（SOX）转录因子家族的成员，它主要在CNS中神经上皮的未成熟和未分化细胞中表达。mGluR2广泛分布在整个大脑中，在皮层和海马体中具有高表达。通常，它通过其神经元兴奋性和突触传递（例如，谷氨酸能神经元）来定义突触前细胞。vGLUT1也被用作谷氨酸能生物标志物。因此， 图1 侧重于在D4和D21处具有Nestin和Sox2表达的谷氨酰胺能神经元，以验证它们在培养条件下的渐进分化（图1A（2-4））。巢素阳性细胞的百分比从D4时的5.4±0.4%下降到D21时的0.69±0.3%（p<0.01， 图1A5）。同样，确认谷氨酸能神经元的分化状态，Sox2阳性细胞的百分比从D4时的12.2±2.1%下降到D21时的5.5±1.7%（p<0.05，见 图1A6）。在D21处的45.4±4.7%的谷氨酸能细胞中检测到mGluR2的表达（数据未显示），并且在D21的谷氨酸能分化过程中观察到更大的vGLUT1免疫染色。这些结果表明，神经祖细胞的比例仍然很低，并且在微流体装置中培养21天后，大多数细胞分化良好。在 图1B中，多步共培养和电生理记录的一般方案描述了UW479或BT35细胞在D21处的微流体装置中的接种。这些细胞系（图1C）已经描述过，并且与我们之前的观察结果相当3，19。最后，获得两种电生理记录：一种在共培养前的D21，另一种在pHGG细胞系接种48小时后在D23处。
为了理解和跟踪共培养过程中BT35，UW479和谷氨酸能神经元的迁移率和活力，在D21至D23的电生理记录期间定期进行显微镜评估，如图 2所示。微观图像揭示了谷氨酸能神经元在微流体装置上的渐进扩展和特殊分布（图2A）。谷氨酸能细胞在共培养中以类似的方式逐渐形成一些聚集体，并且当单独培养直至D23（对照实验）时。在 图2B，C中，当加入BT35和UW479时，观察到胶质瘤细胞在D21接种后立即存在的漂浮细胞逐渐消失，直到D23并成为贴壁pHGG细胞进入设备。这在UW479系列中尤其值得注意。
此外，在D23的所有电生理记录之后，漂浮细胞没有增加（数据未显示）。尽管如此， 图2D 中活细胞的百分比估计分别为BT35和UW479的83.02%和85.16%。两种细胞系的通量相当，并强调了患者来源的细胞系可以适当使用的事实。与MEA和细胞操作耦合的微流体装置的技术制备不会改变其粘附能力。它似乎不会诱导细胞死亡或改变其微观方面。BT35和UW479细胞似乎绘制了设备中谷氨酸能神经元的确切位置，与兴奋性神经元紧密迁移。
图3描述了UW479 /谷氨酸能神经元共培养物的示例，其尖峰检测沿 图3A 中的记录时间以及 图3B中D23处的光栅图，显示添加pHGG细胞时电活性增加。 图3C 显示了BT35/谷氨酸能神经元共培养物中时间阵列范围的放电速率。在记录D23电活动时，对照实验（谷氨酸能神经元的培养）与谷氨酸能神经元与pHGG细胞的共培养之间的差异显着，如图 3D所示，这表明pHGG对神经元兴奋性的影响。
| 组件 | 播种培养基 | D4 介质 | D7 中型 | D11 及以后的介质 |
| DMEM/F-12 中型 | 0.5 倍 | 0.25 倍 | 0.125倍 | Ø |
| 神经基质培养基 | 0.5 倍 | 0.25 倍 | 0.125倍 | Ø |
| 脑物理介质 | Ø | 0.5 倍 | 0.75 倍 | 1 倍 |
| SM1 补充剂 | 1 倍 | 1 倍 | 1 倍 | 1 倍 |
| N2 补充剂-A | 1 倍 | 1 倍 | 1 倍 | 1 倍 |
| Ala-Gln （GlutaMax） | 0.5 毫米 | 0.5 毫米 | 0.5 毫米 | 0.5 毫米 |
| 断续器 | 10 纳克/毫升 | 10 纳克/毫升 | 10 纳克/毫升 | 10 纳克/毫升 |
| 断续器 | 10 纳克/毫升 | 10 纳克/毫升 | 10 纳克/毫升 | 10 纳克/毫升 |
| TGF-β1 | 1 纳克/毫升 | 1 纳克/毫升 | 1 纳克/毫升 | 1 纳克/毫升 |
| 盖尔特雷克斯 | 30微克/毫升 | Ø | Ø | Ø |
| 播种补充剂 | 1 倍 | Ø | Ø | Ø |
| 第4天补充 | Ø | 1 倍 | Ø | Ø |
表1：hiPS衍生谷氨酸能神经元的培养基组成。
| 抗体 | 库存浓度 | 工作稀释 |
| 雀巢 | 0.5毫克/毫升 | 1:500 |
| （1微克/毫升） | ||
| 袜子2 | 1毫克/毫升 | 1:500 |
| （2微克/毫升） | ||
| mGluR2 | 0.2毫克/毫升 | 1:50 |
| （4微克/毫升） | ||
| vGlut1 | 0.25毫克/毫升 | 1:50 |
| （5微克/毫升） | ||
| 驴子反兔 IgG H&L （AF 647） | 2毫克/毫升 | 1：1000 到 1：2000 |
| （1 至 2 微克/毫升） | ||
| 驴子抗鼠标IgG H&L （AF 555） | 2毫克/毫升 | 1:1000 |
| （2微克/毫升） |
表2：免疫荧光抗体列表。
图1：谷氨酸能神经元和高级别小儿胶质瘤（pHGG）系的细胞表征和共培养方案。（1）谷氨酸能神经元第21天（D21）和第23天（D23）的微观图像。（2） 在 D4（上排）和 D21（底排）处用绿色和 DAPI 在绿色和 DAPI 上标记。（3） D4（上行）和 D21（底排）的绿色 Sox2 标签和蓝色的 DAPI 标记。（4） MGluR2 标签为绿色，DAPI 为蓝色，位于 D21。（5 和 6）在培养物的D4和D21处的Nestin和Sox2标记之间的统计比较，证明了细胞分化。（7） vGlut1 染色为绿色，DAPI 为橙色，为 D21。（B）电生理记录的一般方案，用于研究在设备上共培养谷氨酸能神经元和胶质瘤细胞时的相互作用。（C）BT35和UW479细胞系的先决条件微观方面。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：在多电极阵列（MEA）的微流体装置中培养的谷氨酸能细胞和胶质瘤细胞的微观图像。 谷氨酸能神经元在微流体装置中单独分化和培养，直到第21天（D21）。（A）对于该实验对照，仅将培养基添加到D21处的谷氨酸能细胞中，而在各自的条件下添加BT35（B）或UW479（C）细胞系。在D22和D23的图像在每种情况的电生理记录之前进行。所有图像均使用经典相差显微镜获得。（D）使用图像分析软件的自动计数估计BT35和UW479在D23处的肿瘤细胞活力。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：电生理记录。 （A）在UW479/谷氨酸能神经元共培养物中的记录时间内进行尖峰检测。（B）在D23处计算的光栅图的示例表示在UW479 /谷氨酸能神经元共培养物中检测到的每个活性电极的事件作为时间的函数。（C）记录BT35/谷氨酰胺能神经元共培养物中电活动的所有有源电极的时间阵列范围的放电速率（或瞬时放电速率），允许监测神经网络活动的同步性。（D）控制条件下（例如，谷氨酸能神经元的培养）和添加肿瘤UW479细胞系（绿色）和BT35细胞系（红色）时的平均放电率的条形图。数据显示为SEM±平均值（* p < 0.05）。 请点击此处查看此图的放大版本。
补充图S1：SU-8模具的3D（3维）表示。 （A） 使用AutoCAD软件创建和绘制SU-8模具。（B）具有两层光刻胶结构和四个3毫米宽孔的SU模具的图片。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
这项工作描述了一种准确的功能 体外 模型，以评估微流体装置中人hiPS衍生的皮质谷氨酸能神经元与脑肿瘤细胞之间的相互作用。本方案的关键步骤之一是谷氨酸能神经元中的hiPS分化，这通过Nestin和Sox2免疫荧光染色的减少以及mGluR2和vGLUT1染色的同时出现得到了证实。然而，很少有神经祖细胞留下来，因为只有一半的谷氨酸能细胞表达mGluR2，这意味着异质性神经元细胞群。总而言之，这些结果强调必须特别注意这些装置中的谷氨酸能细胞生长。此外，研究神经元在pHGG细胞存在下的电行为的下一步是相对劳动密集型的，以建立数据处理以优化尖峰检测和解释。然而，正如最近发表的其他著作4，5，6，9，10中预期和描述的那样，pHGGs和谷氨酸能神经元的存在增强了电活动，证实了这些神经元的兴奋性特征。
这种建模的主要局限性可能是神经元在MEA本身上的异质分布，这可能会影响电生理记录。这将需要在微流体装置中维持高密度培养物。对于将次级细胞类型接种到设备上，至关重要的是保持快速增殖和迁移，最初持续48小时，并在48小时记录技术中获得神经元的均匀分布。另一个限制是视觉上区分这些设备中不同类型的细胞群，但使用荧光纳米颗粒的新方法可能有助于跟踪这两种细胞类型26。最后，这种微流体方法的性能仅在两种类型的phGG系中完成，并且应该扩展到具有不同分子驱动因素的更多患者来源的细胞系。可以进行补充评估，以了解共培养这些细胞时的这种兴奋作用。然而，对于携带H3.3 K27M驱动突变的pHGG细胞是可行的，例如在BT35系3中。
这项工作中开发的整体方法是探索电气影响的新方法之一。它已经显示出神经网络分析在微流体培养条件下转导hiPS衍生的谷氨酸能神经元与pHGG肿瘤细胞系之间相互作用的能力。该方法对许多应用都有帮助，特别是对于功能和机制研究以及分析可以阻断pHGG细胞迁移和与神经元相互作用的药理剂的作用。它强调微流体装置的使用，但特别是当实验可能记录电生理活性并且可以添加到MEA中时。
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Disclosures
AB，MG，JR，LM，ML，JV，DD受雇于NETRI，FL是NETRI的首席技术官，TH是NETRI的首席科学官。其他作者没有什么可披露的。
Acknowledgments
这项工作得到了Satt Conectus计划，斯特拉斯堡大学基金会，«J'ai demandé la lune»，«Une roulade pour Charline»，«LifePink»，«Franck，Rayon de Soleil»和«Semeurs d'Etoile»协会的资助。我们感谢受HGGs影响的儿童和家庭对这项研究的贡献和支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
| Cortical Glutamatergic Neurons | BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | - | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
References
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