Summary
Recente werken onthullen de neuronale impact op hoogwaardige pediatrische glioomcellen (pHGG) en hun wederzijdse interacties. Het huidige werk toont de ontwikkeling van een in vitro model dat pHGG-cellen en glutamaterge neuronen co-cultiveert en hun elektrofysiologische interacties registreerde om die interactiviteiten na te bootsen.
Abstract
Pediatrische hooggradige gliomen (pHGG) vertegenwoordigen hersenkanker bij kinderen en adolescenten die een snelle sombere prognose hebben. Omdat het nodig is om de weerstand tegen de huidige behandelingen te overwinnen en een nieuwe manier van genezen te vinden, is het zeer veeleisend om de ziekte zo dicht mogelijk in een in vitro setting te modelleren om nieuwe geneesmiddelen en therapeutische procedures te testen. Het bestuderen van hun fundamentele pathobiologische processen, waaronder glutamaterge neuron hyperexcitabiliteit, zal een echte vooruitgang zijn in het begrijpen van interacties tussen de omgevingshersenen en pHGG-cellen. Daarom, om neuronen / pHGG-celinteracties te recreëren, toont dit werk de ontwikkeling van een functioneel in vitro model dat door de mens geïnduceerde Pluripotente Stem (hiPS) -afgeleide corticale glutamaterge neuronen pHGG-cellen co-cultiveert in gecompartimenteerde microfluïdische apparaten en een proces om hun elektrofysiologische modificaties vast te leggen. De eerste stap was het differentiëren en karakteriseren van menselijke glutamaterge neuronen. Ten tweede werden de cellen gekweekt in microfluïdische apparaten met pHGG-afgeleide cellijnen. Micro-omgeving van de hersenen en neuronale activiteit werden vervolgens in dit model opgenomen om de elektrische impact van pHGG-cellen op deze micro-omgevingsneuronen te analyseren. Elektrofysiologische opnames worden met behulp van multi-elektrode arrays (MEA) gekoppeld aan deze microfluïdische apparaten om fysiologische omstandigheden na te bootsen en de elektrische activiteit van het gehele neurale netwerk vast te leggen. Een significante toename van de prikkelbaarheid van neuronen werd onderstreept in de aanwezigheid van tumorcellen.
Introduction
Pediatrische hooggradige gliomen (pHGG) vertonen een uitgebreide genotypische en fenotypische diversiteit, afhankelijk van de leeftijd van de patiënt, tumoranatomische locatie en extensie en moleculaire drivers1. Het zijn agressieve hersentumoren die slecht onder controle zijn met de momenteel beschikbare behandelingsopties en de belangrijkste doodsoorzaak zijn in verband met hersenkanker bij kinderen en adolescenten2. Dus, meer dan 80% van de patiënten recidiveert binnen 2 jaar na hun diagnose, en hun mediane overleving is 9-15 maanden, afhankelijk van hersenlocaties en drivermutaties. De afwezigheid van curatieve behandeling is de primaire drang naar laboratoriumonderzoek en benadrukt de onmiddellijke behoefte aan nieuwe innovatieve therapeutische benaderingen. Voor dit doel werden patiënt-afgeleide cellijnen (PDCL) ontwikkeld in de hoop de pHGG-diversiteit3 te leveren in tweedimensionale (2D) lijnen en / of driedimensionale (3D) neurosferen. Toch bootsen die patiënt-afgeleide in vitro celculturen niet alle hersenvariabele situaties na. Deze modellen houden geen rekening met de macroscopische en microscopische neuro-anatomische omgevingen die doorgaans worden beschreven in pHGG.
Gewoonlijk ontwikkelt pHGG bij jongere kinderen zich voornamelijk in pontine- en thalamische regio's, terwijl HGG van adolescenten en jongvolwassenen zich concentreren in de corticale gebieden, vooral in frontotemporale kwabben1. Deze locatiespecifieke kenmerken in pediatrische leeftijden lijken verschillende omgevingen te omvatten die leiden tot gliomagenese en een ingewikkeld netwerk tussen tumorcellen en specifieke neuronale activiteit4,5,6. Hoewel mechanismen nog steeds niet zijn geïdentificeerd, ontwikkelt pHGG zich voornamelijk uit neurale voorlopercellen langs het differentiatietraject van astrogliale en oligodendrogliale afstammingslijnen. Hoewel de rol van deze gliale afstammingslijnen lange tijd beperkt is gebleven tot eenvoudige structurele ondersteuning voor neuronen, is nu duidelijk vastgesteld dat ze volledig integreren in neurale circuits en complexe bidirectionele gliale-neuronale interacties vertonen die in staat zijn om structurele gebieden van de hersenen te reorganiseren en neuronale circuits te hermodelleren4,7,8 . Bovendien wijzen toenemende flarden bewijs erop dat het centrale zenuwstelsel (CZS) een cruciale rol speelt bij het initiëren en progressie van hersenkanker. Recente werken richtten zich op neuronale activiteit, die de groei en mitose van gliale maligniteiten lijkt te stimuleren door uitgescheiden groeifactoren en directe elektrochemische synaptische communicatie6,9. Omgekeerd lijken hoogwaardige glioomcellen de neuronale functie te beïnvloeden met een toenemende glutamaterge neuronale activiteit en moduleren ze de werking van de circuits waarin ze structureel en elektrisch zijn geïntegreerd9. Dus studies met behulp van patiënt-afgeleide modellen en nieuwe neurowetenschappelijke hulpmiddelen die de werking van neuronen regelen, toonden een circuitspecifiek effect van neuronale activiteit op glioomlocatie, groei en progressie. De meeste van deze neuronale projecties die betrokken zijn bij gliomen zijn glutamaterge en communiceren via glutamaatafscheidingen. Specifieke glutamaterge biomarkers zoals mGluR2 of vGlut1/2 worden vaak beschreven6.
Interessant is dat pediatrische en volwassen hooggradige gliomen, ondanks hun moleculaire heterogeniteit, een typische proliferatieve respons vertonen op glutamaterge neuronale activiteit en andere uitgescheiden factoren zoals neuroligine-3 of BDNF (van de hersenen afgeleide neurotrofe factor)4,6,10,11,12,13 . In corticale regio's kunnen pediatrische en volwassen HGG's neuronale hyperexcitabiliteit induceren door een verhoogde glutamaatsecretie en GABA-interneuronen remmen, wat leidt tot gliomen geassocieerd met epileptische netwerkactiviteit14,15. Bovendien kunnen neurale circuits worden geremodelleerd door gliomen die specifieke neurologische taken pushen, bijvoorbeeld taal, en kunnen ze extra georganiseerde neuronale activiteit eisen9.
Op basis van deze redenering moet het bevorderen van het begrip van bidirectionele communicatie tussen glioomcellen en neuronen volledig worden opgehelderd en geïntegreerd met de vroege stadia van in vitro pHGG-benaderingen. Dergelijke innovatieve modellering is cruciaal bij het begrijpen en meten van de neuronale elektrische activiteitsimpact tijdens het testen van geneesmiddelen en het anticiperen op pHGG-respons in hersencircuits. Recente ontwikkelingen in neurowetenschappelijke hulpmiddelen, zoals microfluïdische apparaten en pHGG-onderzoekswerken, vormen het bed om nieuwe modelleringsbenaderingen te ontwikkelen en nu in staat te zijn om hersenmicro-omgeving te integreren in in vitro pHGG-modellen3,16,17,18,19. In combinatie met elektrofysiologische opnames met behulp van multi-elektrode arrays (MEA), bieden microfluïdische apparaten20,21,22 de mogelijkheid om fysiologische omstandigheden na te bootsen terwijl de elektrische activiteit van het gehele neurale netwerk wordt vastgelegd en netwerkconnectiviteitsparameters onder verschillende omstandigheden worden geëxtraheerd. Dit apparaat23,24 maakt het eerst mogelijk om cellen in een kamer direct op MEA nauwkeurig af te zetten. Deze technologie maakt de controle van celzaaidichtheid en homogeniteit op MEA en de fijne controle van media-uitwisseling mogelijk, wat een cruciale stap is voor menselijke neurale voorloperdifferentiatie rechtstreeks in apparaten. Bovendien kan de huidige depositiekamer worden bezaaid met meerdere cellen op verschillende tijdstippen.
Deze studie was dus gericht op het ontwikkelen van een functioneel in vitro model dat menselijke Pluripotente Stem (hiPS) -afgeleide corticale glutamaterge neuronen en pHGG-afgeleide cellen co-cultiveert in microfluïdische apparaten en hun elektrische activiteit registreert om elektrische interacties tussen beide celpopulaties te evalueren. Ten eerste werden hiPS-afgeleide corticale glutamaterge neuronen verkregen en gekarakteriseerd in microfluïdische apparaten in verschillende stadia van cultuur [dag 4 (D4), als hiPS-cellen, en dag 21 (D21) en dag 23 (D23), als glutamaterge gerijpte neuronen]. Voor de tweede stap van co-cultuur werden twee pHGG-modellen gebruikt: gecommercialiseerde pediatrische UW479-lijn en pHGG-cellen geïnitieerd uit een patiënttumor (BT35)3, met een H3.3 K27M-drivermutatie. Ten slotte voerden we elektrofysiologische opnames uit van glutamaterge cellen op D21 vóór pHGG-celzaaien en D23 na 48 uur co-kweek in hetzelfde microfluïdische apparaat. De interacties tussen glutamaterge neuronen en pHGG-cellen werden gekenmerkt door een significante toename van de geregistreerde elektrofysiologische activiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voor dit protocol is het accreditatienummer met betrekking tot het gebruik van menselijke materialen DC-2020-4203.
1. Fabricage, bereiding en behandeling van microfluïdische apparaten
- Fabriceer SU-8 mallen met behulp van conventionele fotolithografietechnieken18.
OPMERKING: Voor dit doel zijn twee fotolithografiemaskers ontworpen om twee lagen fotoresistente structuren op silicium wafersubstraat en een dunne SU-8 2005 fotoresistente laag (3,2 μm hoog en 6 ± 1 μm breed) te construeren die asymmetrische microgrooves definieert onder de patroonvorming van hoofdkanalen gemaakt in SU-8 2100 (200 μm hoog, 1 mm breed, en 13 mm lang) (zie aanvullende figuur S1). - Activeer de wafer met behulp van een plasmareiniger (5.00e-1 torr, hoog radiofrequentie (RF) niveau) gedurende 1 minuut en silaniseer het met behulp van 1 ml (trichloor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silaan in een aluminium map in een exsiccator gedurende 30 minuten.
- Bereid een 10:1 verhouding van Polydimethylsiloxaan (PDMS), meng het prepolymeer met katalysator, breng het in een vacuüm exsiccator om opgesloten bubbels te verwijderen en giet het langzaam op de vorm voordat het wordt uitgehard in een oven bij 80 °C gedurende 40 minuten.
- Snijd het daarna met een scheermes op de gewenste grootte voordat je de vorm afpelt. Pons de inlaat en de uitlaatzones uit om gaten van 3 mm breed te verkrijgen, reinig het PDMS en bescherm het met plakband.
OPMERKING: De dikte van het uiteindelijke PDMS-apparaat is ongeveer 5 mm. - Behandel het apparaat met een plasmareiniger (5.00e-1 torr, hoog RF-niveau gedurende 1 minuut), monteer het met een polystyreen petrischaaltje en stel het vacuüm gedurende 30 minuten bloot aan UV-licht.
- Vul met een pipet de inlaat van het microfluïdische apparaat voor gebruik met 70% ethanol en leeg deze door pipetteeraspiratie.
- Was het microfluïdische apparaat door inlaatreservoirs Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) toe te voegen en leeg het door drie opeenvolgende keren aspiratie te pipetteren.
- Coat het apparaat met 0,05 mg/ml Poly-D-Lysine en plaats het in een incubator (37 °C, 5% CO2). Spoel het apparaat na 24 uur door het neurobasismedium aan het inlaatreservoir toe te voegen en leeg het door drie opeenvolgende keren aspiratie te pipetteren.
- Vul de microfluïdische chip met het celkweekmedium en laat deze maximaal 2 uur op kamertemperatuur blijven tot gebruik.
2. Celvoorbereiding en zaaien in het microfluïdische apparaat
- Kweek, zaaiing en immunofluorescentie karakterisering van menselijke hiPS-afgeleide corticale glutamaterge neuronen
OPMERKING: Voer experimenten uit met gecommercialiseerde hiPS-afgeleide corticale glutamaterge neuronen (Figuur 1A). Behoud van van mensen afgeleide materialen en behandel ze met de goedkeuring en volgens de richtlijnen van de wetgeving.- Leeg de inlaat- en uitlaatreservoirs van het microfluïdische apparaat door pipetpantatie vóór het zaaien, zodat alleen de kanalen van het apparaat met medium kunnen worden gevuld.
- Zaai de hiPS-cellen op dag 0 (D0) door 10 μL van een 6,5 x 106 hiPS-cellen / ml suspensie (bijv. 900 cel / mm2-concentratie ) bij het medium te plaatsen, waarvan de samenstelling is aangegeven in tabel 1, en laat het apparaat gedurende 15 minuten onder de motorkap (bij kamertemperatuur) zitten om cellen in staat te stellen zich te hechten.
- Vul na 15 minuten zowel inlaat- als uitlaatreservoirs met 50 μL D4-kweekmedium, waarvan de volledige samenstelling is weergegeven in tabel 1, en breng het apparaat over in de incubator (37 °C, 5% CO2).
- Behoud glutamaterge neurondifferentiatie gedurende 23 dagen (figuur 1A(1), microscopie) onder een gecontroleerde omgeving (37 °C, 5% CO2) en met een specifiek celkweekmedium, waarvan de samenstelling is beschreven in tabel 1. Vervang het medium regelmatig zoals beschreven in de volgende stap 5. net hieronder en volg de stappen zoals in figuur 1B.
- Vervang het medium elke 3 tot 4 dagen na tabel 1 samenstelling. Gebruik zaaimedium tot D4, D4 medium tot D7, D7 medium tot D11 en D11 medium voor de resterende tijd van de kweek.
- Maak microscopische foto's op D4, D21 en D23 met behulp van een standaard fasecontrastmicroscoop om de levensvatbaarheid van cellen te beoordelen en celtelling mogelijk te maken.
- Fixeer voor karakterisering de gedifferentieerde glutamaterge neuronen in 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur na medium aspiratie en volg het protocol voor immunofluorescentiekleuring.
- Was cellen driemaal met Fosfaat-Gebufferde Zoutoplossing (PBS) en permeabiliseer ze gedurende 10 minuten met 0,1% Triton-X gevolgd door 30 min met 3% Bovine Serum Albumine (BSA). Voeg primaire antilichamen toe en incubeer het apparaat een nacht bij 4 °C.
- Spoel de cellen driemaal met PBS en incubeer verder met de overeenkomstige secundaire antilichamen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Immunofluorescente antilichamen die in het onderzoek zijn gebruikt, zijn vermeld in tabel 2. - Spoel de cellen driemaal met PBS en counterstain met DAPI (4',6-diamino-2-fenylindool) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Verkrijg beelden met een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een CMOS-camera (Complementary metal-oxide-semiconductor) en analyseer met behulp van geschikte beeldanalysesoftware.
- Open de DAPI-gekleurde afbeeldingen en binarize met de drempelroutine in de software. Klik hiervoor op Afbeelding > Pas > drempel aan en stel de juiste parameters in om de kern van de achtergrond te onderscheiden. Klik vervolgens op Apply > Process > Watershed om de geaggregeerde kern te splitsen.
- Gebruik daarna de functie van de functie van de aangeboren software Analyseren deeltjes om de binaire afbeeldingen te interpreteren. Om dit te doen, klikt u op Analyseren en vervolgens op Deeltjes analyseren en stelt u hierna de juiste parameters in: grootte en circulariteitsfilter (uitsluiten van analyseobjecten kleiner dan 7 μm, groter dan 20 μm of met een circulariteit kleiner dan 0,1 μm).
- Voeg de contourbeelden verkregen uit DAPI-analyse samen met corresponderende immunofluorescentiefoto's om de juiste kleuring te valideren.
- Sla ten slotte de bijbehorende gegevens (aantal objecten, gemiddelde oppervlakte, % van de dekking, enz.) op voor de verschillende biomarkers en kwantificeer de expressie op D4 en/of D21 met behulp van geschikte kwantificeringssoftware.
- Celcultuur van gecommercialiseerde pHGG-lijn, UW479, en patiënt-afgeleide cellijn, BT353
- Kweek beide cellijnen in DMEM/F-12 GlutaMAX aangevuld met 10% Foetaal Runderserum (FBS) in een celkweekkolf. Wacht op 80% samenvloeiing van elke cellijn zoals weergegeven in figuur 1C.
- Houd deze pHGG-cellen onder een gecontroleerde omgeving bij 37 °C in normoxische omstandigheden gedurende de experimenten.
3. Co-cultuur protocol
- Pas de zaaidag en concentratie voor UW479- en BT35-cellijnen aan om 80% van de confluentcellen te bereiken wanneer de co-kweek zou moeten beginnen, wat overeenkomt met 21 dagen cultuur voor glutamaterge neuronen.
- Trypsiniseer UW479- en BT35-cellen en zaai ze op de top van glutamaterge neuronen in elk speciaal microfluïdisch apparaat (met een doeldichtheid van 900 cel / mm2 voor elk celtype) voordat de pHGG-cellen in het microfluïdische apparaat met volwassen glutamaterge neuronen worden gezaaid.
- Bewaar de coculturen gedurende 2 dagen onder een gecontroleerde omgeving (37 °C, 5% CO2) met glutamaterge neuron D11 en hoger medium zoals beschreven in tabel 1.
- Tel pHGG-cellen met behulp van de microscopische foto's geanalyseerd met een beeldanalysesoftware om hun levensvatbaarheid te beoordelen. Bereken het percentage cellen.
OPMERKING: Gebruik de volgende formule: 100 - ((aantal cellen bij D23 / aantal cellen bij D21) x 100).
4. Elektrofysiologische opname
- Voer de elektrofysiologische opname uit met een commercieel systeem en in de handel verkrijgbare software.
OPMERKING: De experimenten werden uitgevoerd met een MEA die bestond uit elektroden met een diameter van 30 μm met een afstand van 100 μm. - Voer een eerste elektrofysiologische registratie uit op glutamaterge neuronen op D21 voordat pHGG-cellen worden gezaaid. Gebruik de gedifferentieerde glutamaterge neuronen als controle en kweek ze alleen parallel aan de co-cultuur. Voer een tweede opname uit voor beide aandoeningen zoals beschreven in de volgende stap genummerd 3.
- Voer een tweede elektrofysiologische opname uit op D23 (na 2 dagen co-cultuur).
5. Elektrofysiologische gegevensverwerking
- Filter de ruwe data met een 2e orde Band-pass Butterworth filter (met passband frequenties van 100 Hz en 2500 Hz).
- Voor spikedetectie berekent u het wortelgemiddelde kwadraat van het signaal over de opname van 10 minuten voor elke elektrode en stelt u een amplitudedrempel in die overeenkomt met acht keer de kwadratische waarde van dit wortelgemiddelde.
- Pas een PTSS-algoritme (Precision Timing Spike Detection25) toe, rekening houdend met een maximale duur van 2 ms voor één actiepotentiaal.
- Beschouw als een actieve elektrode, elke elektrode detecteert ten minste 5 spikes / min. Ga door met de test als ten minste 10% van de opname-elektroden actief is.
- Deel het aantal gedetecteerde pieken door de opnametijd om de gemiddelde vuursnelheid van elke actieve elektrode te berekenen. Bereken een gemiddelde gemiddelde vuursnelheid voor elk onafhankelijk experiment. Bereken uiteindelijk een gemiddelde op voorwaarde (±SEM) en druk het uit als een functie op de dag van opname.
- Bereken een rasterplot voor elk experiment dat de gebeurtenissen weergeeft die zijn gedetecteerd voor elke actieve elektrode als functie van de tijd. Bereken vervolgens de temporele array-brede vuursnelheden (of momentane vuursnelheden) van alle actieve elektroden, waardoor de synchroniciteit van de neurale netwerkactiviteit kan worden bewaakt.
- Genereer ten slotte staafdiagrammen met behulp van de kwantificeringssoftware en voer vergelijkingen uit met behulp van Kruskal Wallis-tests.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voordat elektrische interacties tussen glutamaterge neuronen en glioomcellen werden bestudeerd, werden hiPS-afgeleide corticale glutamaterge neuronen gekarakteriseerd om de haalbaarheid van het kweken ervan in microfluïdische apparaten te valideren (figuur 1A). Hun karakterisering werd beoordeeld met behulp van Nestin, Sox2, mGlurR2 (metabotrope glutamaatreceptoren 2) en vGLUT1 immunostaining, weergegeven in figuur 1A (2-7). Omdat Nestine een intermediair filamenteiwit is dat nodig is voor overleving, vernieuwing en mitogeen-gestimuleerde proliferatie van neurale voorlopercellen, wordt het dus tot expressie gebracht in ongedifferentieerde CZS-cellen tijdens de ontwikkeling. Sox2 is een lid van de SRY-achtige HMG-box gen (SOX) transcriptiefactor familie die betrokken is bij de regulatie van de embryonale ontwikkeling, en het wordt voornamelijk uitgedrukt in onrijpe en ongedifferentieerde cellen van het neurale epitheel in het CZS. mGluR2 is wijd verspreid over de hersenen, met een hoge expressie in de cortex en hippocampus. Meestal definieert het de presynaptische cellen met hun neuronale prikkelbaarheid en synaptische transmissie (bijvoorbeeld de glutamaterge neuronen). vGLUT1 wordt ook gebruikt als glutamaterge biomarker. Daarom richt figuur 1 zich op glutamaterge neuronen met Nestine- en Sox2-expressies op D4 en D21 om hun progressieve differentiatie in de kweekomstandigheden te valideren (figuur 1A (2-4). Het percentage nestinepositieve cellen daalde van 5,4 ± 0,4% bij D4 tot 0,69 ± 0,3% bij D21 (p < 0,01, figuur 1A5). Evenzo, ter bevestiging van de gedifferentieerde toestand van glutamaterge neuronen, daalde het percentage Sox2-positieve cellen van 12,2 ± 2,1% bij D4 tot 5,5 ± 1,7% bij D21 (p < 0,05, zie figuur 1A6). De expressie van mGluR2 werd gedetecteerd in 45,4 ± 4,7% van de glutamaterge cellen bij D21 (gegevens niet getoond), en een grotere vGLUT1-immunostaining werd waargenomen tijdens glutamaterge differentiatie bij D21. Deze resultaten toonden aan dat het aandeel neurale voorlopercellen laag bleef en dat de meeste cellen goed gedifferentieerd waren na een 21-daagse cultuur in de microfluïdische apparaten. In figuur 1B beschrijft een algemeen protocol van de meerstaps coculturen en elektrofysiologische registratie de UW479- of BT35-celzaaiing in de microfluïdische apparaten op D21. Die cellijnen (figuur 1C) zijn al beschreven en zijn vergelijkbaar met de eerdere waarnemingen van us3,19. Uiteindelijk werden twee elektrofysiologische opnames verkregen: één op D21 voor co-culturing en de andere op D23 na 48 h pHGG cellijn zaaien.
Voor het begrijpen en volgen van de mobiliteit en levensvatbaarheid van BT35, UW479 en glutamaterge neuronen tijdens co-culturen, werden microscopische beoordelingen regelmatig uitgevoerd tijdens de elektrofysiologische registratieperiode van D21 tot D23 en worden weergegeven in figuur 2. De microscopische beelden toonden een progressieve uitbreiding en bijzondere verdeling van glutamaterge neuronen over microfluïdische apparaten (figuur 2A). De glutamaterge cellen vormen sommige aggregaten progressief op een vergelijkbare manier in co-cultuur en wanneer ze alleen worden gekweekt tot D23 (controle-experiment). In figuur 2B,C werd bij het toevoegen van BT35 en UW479 waargenomen dat de zwevende cellen die onmiddellijk na het zaaien van glioomcellen bij D21 aanwezig waren, geleidelijk verdwenen tot D23 en aanhangende pHGG-cellen in het apparaat werden. Dit was met name opmerkelijk voor de UW479-lijn.
Bovendien was er geen toename van zwevende cellen na alle elektrofysiologische opnames bij D23 (gegevens niet getoond). Niettemin werden de percentages levensvatbare cellen in figuur 2D geschat op respectievelijk 83,02% en 85,16% voor BT35 en UW479. Beide lijnflabiliteiten waren vergelijkbaar en onderstreepten het feit dat patiënt-afgeleide cellijnen op de juiste manier kunnen worden gebruikt. De technische voorbereiding van microfluïdische apparaten gekoppeld aan MEA en celmanipulaties verandert hun adhesiecapaciteiten niet. Het lijkt geen celdood te induceren of hun microscopische aspecten te wijzigen. BT35- en UW479-cellen lijken de exacte locaties van glutamaterge neuronen in het apparaat in kaart te brengen en migreren dicht bij de exciterende neuronen.
Figuur 3 beschrijft als voorbeeld UW479/glutamaterge neuron co-culturen met hun spike detectie langs de opnametijd in Figuur 3A en de rasterplot op D23 in Figuur 3B, met verhoogde elektrische activiteit bij het toevoegen van pHGG-cellen. Figuur 3C toont de temporele array-brede vuursnelheid in BT35/glutamaterge neuron co-culturen. De verschillen tussen het controle-experiment (cultuur van glutamaterge neuronen) en coculturen van glutamaterge neuronen met pHGG-cellen zijn significant bij het registreren van D23 elektrische activiteit, zoals weergegeven in figuur 3D, wat wijst op een impact van pHGG op de prikkelbaarheid van neuronen.
| Onderdelen | Zaaimedium | D4 middelgroot | D7 middelgroot | D11 en hoger medium |
| DMEM/F-12 Middelgroot | 0,5x | 0,25x | 0,125x | Ø |
| Neurobasaal Medium | 0,5x | 0,25x | 0,125x | Ø |
| BrainPhys Medium | Ø | 0,5x | 0,75x | 1x |
| SM1 Supplement | 1x | 1x | 1x | 1x |
| N2 Supplement-A | 1x | 1x | 1x | 1x |
| Ala-Gln (GlutaMax) | 0,5 mM | 0,5 mM | 0,5 mM | 0,5 mM |
| BDNF | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml |
| GDNF | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml |
| TGF-β1 | 1 ng/ml | 1 ng/ml | 1 ng/ml | 1 ng/ml |
| Geltrex | 30 μg/ml | Ø | Ø | Ø |
| Zaaisupplement | 1x | Ø | Ø | Ø |
| Dag 4 Supplement | Ø | 1x | Ø | Ø |
Tabel 1: Samenstelling van kweekmedia voor hiPS-afgeleide glutamaterge neuronen.
| Antilichamen | Voorraadconcentraties | Werkverdunningen |
| Nestin | 0,5 mg/ml | 1:500 |
| (1 μg/ml) | ||
| Sox2 | 1mg/ml | 1:500 |
| (2 μg/ml) | ||
| mGluR2 | 0,2 mg/ml | 1:50 |
| (4 μg/ml) | ||
| vGlut1 | 0,25 mg/ml | 1:50 |
| (5 μg/ml) | ||
| Ezel anti-konijn IgG H&L (AF 647) | 2mg/ml | 1:1000 tot 1:2000 |
| (1 tot 2 μg/ml) | ||
| Ezel anti-muis IgG H&L (AF 555) | 2mg/ml | 1:1000 |
| (2 μg/ml) |
Tabel 2: Lijst van immunofluorescente antilichamen.
Figuur 1: Celkarakterisering en co-kweekprotocol van glutamaterge neuronen en hoogwaardige pediatrische glioom (pHGG) lijnen. (A) Vereiste microscopische en immunofluorescente karakterisering van glutamaterge neuronen. (1) Microscopische foto's op dag 21 (D21) en dag 23 (D23) van glutamaterge neuronen. (2) Nestin-etikettering in groen en DAPI in blauw op D4 (bovenste rij) en D21 (onderste rij). (3) Sox2-etikettering in groen en DAPI in blauw op D4 (bovenste rij) en D21 (onderste rij). (4) mGluR2-etikettering in groen en DAPI in blauw bij D21. (5 en 6) Statistische vergelijkingen tussen Nestin en Sox2 labeling op D4 en D21 van cultuur, die celdifferentiatie aantonen. (7) vGlut1-kleuring in groen en DAPI in oranje bij D21. (B) Algemeen protocol voor elektrofysiologische registratie om interacties te bestuderen bij het co-kweken van glutamaterge neuronen en glioomcellen op apparaten. (C) Vereiste microscopische aspecten van BT35- en UW479-cellijnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Microscopische beelden van glutamaterge en glioomcellen gekweekt in microfluïdische apparaten gekoppeld aan multi-elektrode arrays (MEA). Glutamaterge neuronen worden gedifferentieerd en alleen gekweekt in het microfluïdische apparaat tot dag 21 (D21). (A) Voor deze experimentele controle werd alleen het medium toegevoegd aan glutamaterge cellen bij D21, terwijl BT35 (B) of UW479 (C) cellijnen werden toegevoegd in hun respectieve omstandigheden. Beelden bij D22 en D23 werden uitgevoerd voordat de elektrofysiologische records voor elke aandoening werden geregistreerd. Alle beelden werden verkregen met behulp van een klassieke fasecontrastmicroscoop. (D) De levensvatbaarheid van tumorcellen voor BT35 en UW479 bij D23 werd geschat met behulp van een geautomatiseerde telling met beeldanalysesoftware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Elektrofysiologische registratie. (A) Piekdetectie langs de opnametijd in UW479/glutamaterge neuron-coculturen. (B) Een voorbeeld van de berekende rasterplot op D23 vertegenwoordigt de gebeurtenissen die voor elke actieve elektrode zijn gedetecteerd als functie van de tijd in UW479/glutamaterge neuroncoculturen. (C) Temporele array-brede vuursnelheid (of momentane vuursnelheid) van alle actieve elektroden die elektrische activiteit registreren in BT35 / glutamaterge neuron-coculturen, waardoor de synchroniciteit van de neurale netwerkactiviteit kan worden bewaakt. (D) Staafdiagrammen van de gemiddelde vuursnelheid in de controleconditie (bijv. De cultuur van glutamaterge neuronen) en bij het toevoegen van tumorale UW479-cellijn (in groen) en BT35-cellijn (in rood). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. (* p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: 3D (3-dimensionale) weergave van SU-8 mallen. (A) Creatie en afbeelding van SU-8 mallen met AutoCAD-software. (B) Afbeelding van de SU-mallen met de twee lagen fotoresist structuren en vier gaten van 3 mm breedte. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit werk beschrijft een nauwkeurig functioneel in vitro model om de interactie tussen menselijke hiPS-afgeleide corticale glutamaterge neuronen en hersentumorcellen in microfluïdische apparaten te evalueren. Een van de cruciale stappen in het huidige protocol was de hiPS-differentiatie in glutamaterge neuronen, die werd bevestigd door de afname van Nestin en Sox2 immunofluorescente kleuring en gelijktijdig verschijnen van mGluR2 en vGLUT1 kleuring. Niettemin bleven er weinig neurale voorlopers over omdat slechts de helft van de glutamaterge cellen mGluR2 tot expressie bracht, wat een heterogene neuroncelpopulatie betekent. Al met al benadrukken deze resultaten dat bijzondere zorg moet worden besteed aan glutamaterge celgroei in dergelijke apparaten. Bovendien was de volgende stap die het elektrische gedrag van neuronen in de aanwezigheid van pHGG-cellen bestudeerde relatief arbeidsintensief om de gegevensverwerking op te zetten om de piekdetectie en -interpretatie te optimaliseren. Niettemin, zoals verwacht en beschreven in andere recent gepubliceerde werken4,5,6,9,10, verbetert de aanwezigheid van pHGGs en glutamaterge neuronen de elektrische activiteit die de prikkelende eigenschap van die neuronen bevestigt.
De belangrijkste beperking van deze modellering zou de heterogene verdeling van neuronen op de MEA zelf kunnen zijn die elektrofysiologische opnames kan beïnvloeden. Het zou het onderhoud van cultuur met hoge dichtheid in het microfluïdische apparaat vereisen. Voor het zaaien van een secundair celtype op het apparaat is het van cruciaal belang om een snelle proliferatie en migratie in eerste instantie gedurende 48 uur te handhaven en zoals voor neuronen een homogene verdeling te verkrijgen in de 48 uur-techniek voor registratie. Een andere beperking is het visueel onderscheiden van de verschillende soorten celpopulaties in dergelijke apparaten, maar nieuwe benaderingen met behulp van fluorescerende nanodeeltjes kunnen helpen bij het volgen van beide celtypen26. Ten slotte werd de uitvoering van deze microfluïdische benadering slechts in twee soorten phGG-lijnen uitgevoerd en moet deze worden uitgebreid naar meer patiënt-afgeleide cellijnen met verschillende moleculaire drivers. Aanvullende beoordelingen kunnen worden gedaan om dit prikkelende effect te begrijpen bij het co-kweken van die cellen. Niettemin is het haalbaar met pHGG-cellen met een H3.3 K27M-drivermutatie, zoals in de BT35-lijn3.
De algemene methode die in dit werk is ontwikkeld, is een van de nieuwe benaderingen om de elektrische impact te onderzoeken. Het heeft het vermogen van neurale netwerkanalyse aangetoond om de interactie tussen hiPS-afgeleide glutamaterge neuronen en pHGG tumorale cellijnen in microfluïdische kweekomstandigheden te transduceren. Deze methode is nuttig voor vele toepassingen, met name voor functionele en mechanistische studies en voor het analyseren van de effecten van farmacologische middelen die pHGG-celmigratie en interactie met neuronen kunnen blokkeren. Het benadrukt het gebruik van microfluïdische apparaten, maar specifiek wanneer experimenten de elektrofysiologische activiteit kunnen registreren en kunnen worden toegevoegd aan een MEA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AB, MG, JR, LM, ML, JV, DD zijn in dienst van NETRI, FL is Chief Technology Officer bij NETRI en TH is Chief Scientific Officer bij NETRI. De andere auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Satt Conectus-programma, Fondation de l'Université de Strasbourg, «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Franck, Rayon de Soleil» en «Semeurs d'Etoile» verenigingen. We bedanken de kinderen en gezinnen die getroffen zijn door HGG's voor hun bijdragen aan dit onderzoek en hun steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
| Cortical Glutamatergic Neurons | BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | - | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
References
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Ostrom, Q. T., et al. Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro-Oncology. 16, Suppl 10 1-36 (2015).
- Blandin, A. F., et al. Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity. Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).
- Monje, M.
- Mount, C. W., Yalçın, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity. eLife. 18 (8), 49291 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders. Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Neftel, C., et al. An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Krishna, S., et al. Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival. BioRxiv. , (2021).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).
- Wang, X., et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression. Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).
- Venkatesh, H. S., et al. Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma. Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).
- Venkatesh, H. S., et al. Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion. Cell. 161 (4), 803-816 (2015).
- Buckingham, S. C., et al. Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity. Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).
- Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks. Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).
- Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks. BioRxiv. , (2021).
- Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings. Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).
- Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks. Scientific Reports. 6, 28384 (2016).
- Nguyen, A., et al. Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1α axis inhibition. Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Cerea, A., et al. Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors. Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).
- Bruno, G., et al. Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Maisonneuve, B. G. C., et al. Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework. BioRxiv. , (2021).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Andreiuk, B., et al. Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo. Small. 13 (38), (2017).
