Summary
Nylige værker afdække neuronal indvirkning på høj kvalitet pædiatriske gliom (pHGG) celler og deres gensidige interaktioner. Det nuværende arbejde viser udviklingen af en in vitro model co-culturing pHGG celler og glutamatergic neuroner og indspillet deres elektrofysiologiske interaktioner til at efterligne disse interaktiviteter.
Abstract
Pædiatriske høj kvalitet gliomer (pHGG) repræsenterer barndom og unge hjernekræft, der bærer en hurtig dyster prognose. Da der er behov for at overvinde modstanden mod de nuværende behandlinger og finde en ny måde at helbrede på, er det meget krævende at modellere sygdommen så tæt som muligt i en in vitro-indstilling for at teste nye lægemidler og terapeutiske procedurer. At studere deres grundlæggende patobiologiske processer, herunder glutamatergisk neuron hyperexcitability, vil være et reelt fremskridt i forståelsen af interaktioner mellem miljøhjernen og pHGG-cellerne. Derfor, at genskabe neuroner / pHGG celle interaktioner, dette arbejde viser udviklingen af en funktionel in vitro model co-culturing human-induceret Pluripotent Stem (hiPS)-afledt kortikale glutamatergiske neuroner pHGG celler i opdelte mikrofluidiske enheder og en proces til at registrere deres elektrofysiologiske modifikationer. Det første skridt var at differentiere og karakterisere menneskelige glutamatergiske neuroner. For det andet blev cellerne kultiveret i mikrofluidiske enheder med pHGG afledte cellelinjer. Hjernens mikromiljø og neuronal aktivitet blev derefter inkluderet i denne model for at analysere pHGG-cellernes elektriske indvirkning på disse mikromiljøniske neuroner. Elektrofysiologiske optagelser er koblet ved hjælp af multielektrode arrays (MEA) til disse mikrofluidiske enheder til at efterligne fysiologiske forhold og til at registrere den elektriske aktivitet i hele neurale netværk. En betydelig stigning i neuron excitabilitet blev understreget i overværelse af tumorceller.
Introduction
Pædiatriske høj kvalitet gliomer (pHGG) udviser en udvidet genolypic og fænotypisk mangfoldighed afhængigt af patientens alder, tumor anatomiske placering og udvidelse, og molekylære drivere1. De er aggressive hjernetumorer, der er dårligt kontrolleret med de aktuelt tilgængelige behandlingsmuligheder og er den hyppigste dødsårsag relateret til hjernekræft hos børn og unge2. Så mere end 80% af patienterne er tilbagefald inden for 2 år efter deres diagnose, og deres median overlevelse er 9-15 måneder, afhængigt af hjernens placeringer og driver mutationer. Fraværet af helbredende behandling er den primære trang til laboratorieforskning og fremhæver det umiddelbare behov for nye innovative terapeutiske tilgange. Til dette formål blev patientafledte cellelinjer (PDCL) udviklet i håb om at give pHGG-mangfoldigheden3 i todimensionelle (2D) linjer og / eller tredimensionelle (3D) neurosfærer. Ikke desto mindre efterligner de patientafledte in vitro-cellekulturer ikke alle hjernevariable situationer. Disse modeller betragter ikke de makroskopiske og mikroskopiske neuro-anatomiske miljøer, der typisk er beskrevet i pHGG.
Normalt udvikler pHGG hos yngre børn hovedsageligt i pontin- og thalamiske regioner, mens unge og unge voksnes HGG koncentrerer sig i de kortikale områder, især i frontotemporale lobes1. Disse placeringsspecifikiteter på tværs af pædiatriske aldre synes at involvere forskellige miljøer, der fører til gliomagenese og et snørklede netværk mellem tumorceller og specifik neuronal aktivitet4,5,6. Selv om mekanismer stadig ikke er identificeret, pHGG primært udvikler sig fra neurale prækursorer celler langs differentiering bane af astrogliale og oligodendroglial slægter. Mens disse glial afstamninger længe har været begrænset til simpel strukturel støtte til neuroner, er det nu klart fastslået, at de integreres helt i neurale kredsløb og udviser komplekse tovejs glial-neuronale interaktioner i stand til at reorganisere strukturelle regioner i hjernen og ombygge neuronale kredsløb4,7,8 . Desuden, stigende stumper af beviser tyder på, at centralnervesystemet (CNS) spiller en afgørende rolle i hjernen kræft indledning og progression. Nylige værker fokuseret på neuronal aktivitet, som synes at drive vækst og mitose af glial maligniteter gennem udskilles vækstfaktorer og direkte elektrokemiske synaptiske kommunikation6,9. Gensidigt, høj kvalitet gliom celler synes at påvirke neuronal funktion med en stigende glutamatergic neuronal aktivitet og modulere driften af de kredsløb, hvor de er strukturelt og elektrisk integreret9. Så, undersøgelser ved hjælp af patient-afledte modeller og nye neurovidenskab værktøjer kontrollerende neuron handling demonstreret en kredsløbsspecifik effekt af neuronal aktivitet på gliom placering, vækst, og progression. De fleste af disse neuronale fremskrivninger involveret i gliomer er glutamatergic og kommunikere gennem glutamat sekreter. Specifikke glutamatergiske biomarkører såsom mGluR2 eller vGlut1/2 er almindeligt beskrevet6.
Interessant, på trods af deres molekylære heterogenitet, pædiatriske og voksne høj kvalitet gliomer viser en typisk proliferativ reaktion på glutamatergic neuronal aktivitet og andre udskilles faktorer såsom neuroligin-3 eller BDNF (hjerne-afledt neurotrofisk faktor)4,6,10,11,12,13 . I kortikale regioner, pædiatriske og voksne HGG'er kan fremkalde neuronal hyperexcitability gennem en øget glutamat sekretion og hæmme GABA interneurons fører til gliomer forbundet med epileptisk netværk aktivitet14,15. Derudover kan neurale kredsløb ombygges af gliomer, der skubber specifikke neurologiske opgaver, for eksempel sprog, og kan rekvirere yderligere organiseret neuronal aktivitet9.
Baseret på dette rationale skal forståelsen af tovejskommunikation mellem gliomceller og neuroner være fuldt belyst og integreret med de tidlige stadier af in vitro pHGG-tilgange. En sådan innovativ modellering er afgørende for at forstå og måle den neuronale elektriske aktivitetspåvirkning under lægemiddeltest og foregribe pHGG-respons i hjernekredsløb. Den seneste udvikling inden for neurovidenskabsværktøjer, såsom mikrofluidiske enheder og pHGG-forskningsarbejder, er sengen til at udvikle nye modelleringsmetoder og nu være i stand til at integrere hjernens mikromiljø i in vitro pHGG-modeller3,16,17,18,19. Kombineret med elektrofysiologiske optagelser ved hjælp af multielektrode arrays (MEA), mikrofluidiske enheder20,21,22 giver mulighed for at efterligne fysiologiske forhold, mens registrering af den elektriske aktivitet i hele neurale netværk og udtrække netværksforbindelse parametre under flere betingelser. Denne enhed23,24 tillader først den præcise aflejring af celler i et kammer direkte på MEA. Denne teknologi gør det muligt at styre celle såtæthed og homogenitet på MEA og fin kontrol af medieudveksling, hvilket er et kritisk skridt for menneskelig neural stamfaderdifferentiering direkte i enheder. Desuden kan det nuværende depositionskammer sås med flere celler på forskellige tidspunkter.
Så denne undersøgelse havde til formål at udvikle en funktionel in vitro model co-culturing menneskelige Pluripotent Stem (hiPS)-afledte kortikale glutamatergiske neuroner og pHGG-afledte celler i mikrofluidiske enheder og registrere deres elektriske aktivitet til at evaluere elektriske interaktioner mellem begge cellepopulationer. For det første blev hiPS-afledte kortikale glutamatergiske neuroner opnået og karakteriseret i mikrofluidiske enheder på forskellige stadier af kultur [dag 4 (D4), som hiPS-celler og dag 21 (D21) og dag 23 (D23), som glutamatergiske modnede neuroner]. For det andet trin i co-kultur, to pHGG modeller blev brugt: kommercialiseret pædiatrisk UW479 linje og pHGG celler indledt fra en patient tumor (BT35)3, der bærer en H3.3 K27M driver mutation. Endelig udførte vi elektrofysiologiske optagelser af glutamatergiske celler på D21 før pHGG cellesåning og D23 efter 48 timers co-kultur i den samme mikrofluidiske enhed. Samspillet mellem glutamatergiske neuroner og pHGG-celler var karakteriseret ved en betydelig stigning i den registrerede elektrofysiologiske aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For denne protokol er akkrediteringsnummeret relateret til brugen af humant materiale DC-2020-4203.
1. Fremstilling, forberedelse og behandling af mikrofluidiske anordninger
- Fabrikere SU-8 forme ved hjælp af konventionelle fotolitografi teknikker18.
BEMÆRK: Til dette formål er to fotolitografimasker designet til at konstruere to lag fotoresistensstrukturer på silicium wafersubstrat og et tyndt SU-8 2005 fotoresistlag (3,2 μm højt og 6 ± 1 μm bredt), der definerer asymmetriske mikrogroove under mønstre af hovedkanaler fremstillet i SU-8 2100 (200 μm høj, 1 mm bred, og 13 mm lang) (se supplerende figur S1). - Aktiver waferen ved hjælp af en plasmarenser (5.00e-1 torr , højradiofrekvens (RF) i 1 min og silanisere den ved hjælp af 1 mL (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silan i en aluminiumsmappe til en udtørrer i 30 min.
- Forbered et 10:1-forhold mellem Polydimethylsiloxane (PDMS), bland prepolymeren med katalysator, send den i en vakuumafsikkator for at fjerne fanget bobler, og støbt den langsomt på formen, før den hærdes i en ovn ved 80 °C i 40 min.
- Skær det derefter ved hjælp af en barbermaskine i den ønskede størrelse, før du skræller formen af. Udstans indløbet og udløbszonerne for at opnå 3 mm brede huller, rengør PDMS, og beskyt det ved hjælp af tape.
BEMÆRK: Tykkelsen af den endelige PDMS-enhed er ca. 5 mm. - Behandl enheden ved hjælp af en plasmarenser (5.00e-1 torr, Højt RF-niveau i løbet af 1 min), saml den med en polystyren petriskål, og eksponer vakuumet under UV-lys i 30 min.
- Fyld med en pipette indløbet af den mikrofluidiske enhed før brug med 70% ethanol og tøm den ved pipettering aspiration.
- Vask den mikrofluidiske anordning ved at tilføje indløbsreservoirer Dulbeccos Fosfat Buffered Saline (D-PBS) og tøm den ved at pipette aspiration tre på hinanden følgende gange.
- Bekæl enheden ved hjælp af 0,05 mg/mL Poly-D-Lysin, og læg den i en inkubator (37 °C, 5 % CO2). Efter 24 timer skylles enheden ved at tilføje neurobasalmediet neurobasalmediet ind i indløbsbeholderen og tømme det ved at pipette aspiration tre på hinanden følgende gange.
- Fyld den mikrofluidiske chip med cellekulturmediet og lad den forblive ved stuetemperatur indtil brug i højst 2 timer.
2. Celleforberedelse og såning i den mikrofluidiske anordning
- Kultur, såning og immunfluorescent karakterisering af humane hiPS-afledte kortikale glutamatergiske neuroner
BEMÆRK: Udføre eksperimenter med kommercialiserede hiPS-afledte kortikale glutamatergiske neuroner (Figur 1A). Bevar materialer, der er afledt af mennesker, og håndter dem med godkendelsen og i henhold til lovgivningens retningslinjer.- Tøm indløbs- og udløbsbeholderne på den mikrofluidiske anordning med pipette aspiration før såning, så kun enhedens kanaler kan fyldes med medium.
- Frø hiPS-cellerne på dag 0 (D0) ved at sætte 10 μL af en 6,5 x 106 hiPS-celler/mL-affjedring (f.eks. 900 celle/mm2 koncentration) med mediet, hvis sammensætning er angivet i tabel 1, og lad enheden være under kølerhjelmen (ved stuetemperatur) i 15 minutter, så cellerne kan fastgøres.
- Efter 15 min skal både indløbs- og udløbsreservoirer fyldes med 50 μL D4-kulturmedium, hvis hele sammensætning er angivet i tabel 1, og overfør anordningen til inkubatoren (37 °C, 5% CO2).
- Opretholde glutamatrgisk neurondifferentiering i 23 dage (figur 1A( 1), mikroskopi) under et kontrolleret miljø (37 °C, 5% CO2) og med et bestemt cellekulturmedium, hvis sammensætning er beskrevet i tabel 1. Udskift mediet regelmæssigt som beskrevet i næste trin 5. lige nedenfor og følg trinnene som i figur 1B.
- Udskift mediet hver 3.-4. dag efter tabel 1-sammensætning . Brug såning medium indtil D4, D4 medium indtil D7, D7 medium indtil D11, og D11 medium for den resterende tid af kulturen.
- Tag mikroskopiske billeder på D4, D21 og D23 ved hjælp af et standardmikrotossmikroskop med fasekontrast til at vurdere celleens levedygtighed og tillade celletælling.
- Til karakterisering skal du fastgøre de differentierede glutamatergiske neuroner i 4% paraformaldehyd (PFA) i 30 min ved stuetemperatur efter medium aspiration og følge protokollen for immunfluorescence farvning.
- Vask cellerne tre gange med Fosfat-Buffered Saline (PBS) og permeabilize dem i 10 min med 0,1% Triton-X efterfulgt af 30 min med 3% Kvæg Serum Albumin (BSA). Tilsættes primære antistoffer, og ankuber enheden natten over ved 4 °C.
- Skyl cellerne tre gange med PBS, og inkuber yderligere med de tilsvarende sekundære antistoffer i 2 timer ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Immunfluorescent antistoffer, der anvendes i undersøgelsen, er anført i tabel 2. - Skyl cellerne tre gange med PBS og counterstain med DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole) i 10 min ved stuetemperatur.
- Få billeder med et omvendt epifluorescencemikroskop udstyret med et CMOS-kamera (Complementary metal-oxide-semiconductor), og analyser ved hjælp af passende billedanalysesoftware.
- Åbn DAPI-farvede billeder, og binarize med tærskelrutinen i softwaren. Det kan du gøre ved at klikke på Billede > Juster > Threshold og angive de relevante parametre for at skelne kernen fra baggrunden. Klik derefter på Anvend > proces > skelsættende for at opdele den samlede kerne.
- Derefter skal du bruge funktionen Analysér partikler medfødt software til at fortolke de binære billeder. Det gør du ved at klikke på Analyser og derefter på Analyser partikler og indstille de relevante parametre efter dette: størrelses- og cirkularitetsfilter (ekskluder fra analyseobjekter mindre end 7 μm, større end 20 μm eller med en cirkularitet mindre end 0,1 μm).
- Flet konturbillederne fra DAPI-analyse til korrespondentimfluorescent billeder for at validere den korrekte farvning.
- Endelig gemmes de tilknyttede data (antal objekter, middelområde, % af dækningen osv.) for de forskellige biomarkører, og udtrykket kvantificeres ved D4 og/eller D21 ved hjælp af passende kvantificeringssoftware.
- Cellekultur af kommercialiseret pHGG-linje, UW479, og patient-afledt cellelinje, BT353
- Kultur begge cellelinjer i DMEM/F-12 GlutaMAX suppleret med 10% Føtalt kvægserum (FBS) i en cellekulturkolbe. Vent på 80% sammenløb af hver cellelinje som vist i figur 1C.
- Disse pHGG-celler vedligeholdes under et kontrolleret miljø ved 37 °C under normoxiske forhold under hele forsøgene.
3. Co-kultur protokol
- Juster såningsdag og koncentration for UW479- og BT35-cellelinjer for at nå op på 80 % af sammenløbscellerne, når samkulturen skal starte, svarende til 21 dages kultur for glutamatergiske neuroner.
- Trypsinize UW479 og BT35 celler og så dem på toppen af glutamatergiske neuroner i hver dedikeret mikrofluidisk enhed (med et måltæthed på 900 celle / mm2 for hver celletype), før såning pHGG celler i den mikrofluidiske enhed, der indeholder modnet glutamatergic neuroner.
- Opretholde co-kulturer i 2 dage under et kontrolleret miljø (37 °C, 5% CO2) med glutamatergic neuron D11 og videre medium beskrevet i tabel 1.
- Tæl pHGG-celler ved hjælp af de mikroskopiske billeder analyseret med en billedanalysesoftware for at vurdere deres levedygtighed. Beregn procentdelen af celler.
BEMÆRK: Brug følgende formel: 100 - ((antal celler ved D23 / antal celler ved D21) x 100).
4. Elektrofysiologisk optagelse
- Udfør den elektrofysiologiske optagelse med et kommercielt system og kommercielt tilgængelig software.
BEMÆRK: Forsøgene blev udført med en MEA, der bestod af elektroder med en diameter på 30 μm fordelt med 100 μm. - Udfør en første elektrofysiologisk optagelse på glutamatergiske neuroner ved D21 før såning af pHGG-celler. Brug de differentierede glutamatergiske neuroner som kontrol og kultur dem alene parallelt med co-kultur. Gør en anden optagelse for begge betingelser som beskrevet i det næste trin nummereret 3.
- Udfør en anden elektrofysiologisk optagelse på D23 (efter 2 dages co-kultur).
5. Elektrofysiologisk databehandling
- Filtrer de rå data med et 2.
- For spike detektion, beregne roden gennemsnitlige kvadrat af signalet i løbet af 10 min optagelse for hver elektrode og indstille en amplitud tærskel svarende til otte gange denne rod middelværdi kvadratværdi.
- Anvend en PTSD-algoritme (Precision Timing Spike Detection25) under hensyntagen til en maksimal varighed på 2 ms for ét handlingspotentiale.
- Overvej som en aktiv elektrode, hver elektrode detekterer mindst 5 pigge / min. Fortsæt analysen, hvis mindst 10% af optageelektroderne er aktive.
- Dividere antallet af fundne pigge med registreringsperioden for at beregne den gennemsnitlige fyringshastighed for hver aktiv elektrode. Beregn en gennemsnitlig gennemsnitlig affyringshastighed for hvert uafhængigt eksperiment. I sidste ende beregne et gennemsnit efter betingelse (±SEM) og udtrykke det som en funktion på dagen for optagelse.
- Beregne et rasterplot for hvert eksperiment, der repræsenterer de hændelser, der registreres for hver aktiv elektrode, som en funktion af tiden. Derefter beregne den tidsmæssige array-dækkende fyringshastigheder (eller øjeblikkelige fyringshastigheder) af alle de aktive elektroder, hvilket gør det muligt at overvåge synkroniciteten af neural netværksaktiviteten.
- Endelig generere bar grafer ved hjælp af kvantificering software og udføre sammenligninger ved hjælp af Kruskal Wallis tests.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før man studerede elektriske interaktioner mellem glutamatergiske neuroner og gliomceller, blev hiPS-afledte kortikale glutamatergiske neuroner karakteriseret for at validere muligheden for at dyrke dem i mikrofluidiske enheder (Figur 1A). Deres karakterisering blev vurderet ved hjælp af Nestin, Sox2, mGlurR2 (metabotropiske glutamatreceptorer 2) og vGLUT1 immunstaining, repræsenteret i figur 1A(2-7). Da Nestin er et mellemliggende glødetrådsprotein, der kræves for overlevelse, fornyelse og mitogen-stimuleret spredning af neurale stamfaderceller, udtrykkes det således i udifferentierede CNS-celler under udviklingen. Sox2 er medlem af den SRY-lignende HMG-box gen (SOX) transskription faktor familie involveret i reguleringen af embryonale udvikling, og det er overvejende udtrykt i umodne og udifferentierede celler i neurale epitel i CNS. mGluR2 er bredt fordelt over hele hjernen, med højt udtryk i cortex og hippocampus. Normalt definerer den de præsynaptiske celler med deres neuronale excitabilitet og synaptiske transmission (f.eks. glutamatergiske neuroner). vGLUT1 bruges også som glutamatrgisk biomarkør. Figur 1 fokuserer derfor på glutamatergiske neuroner med Nestin- og Sox2-udtryk ved D4 og D21 for at validere deres gradvise differentiering i kulturbetingelserne (figur 1A(2-4). Nestins positive cellers procentdel faldt fra 5,4 ± 0,4% ved D4 til 0,69 ± 0,3% ved D21 (p < 0,01, figur 1A5). Tilsvarende bekræfter den differentierede tilstand af glutamatergic neuroner, procentdelen af Sox2 positive celler faldt fra 12,2 ± 2,1% ved D4 til 5,5 ± 1,7% ved D21 (p < 0,05, se figur 1A6). Udtrykket af mGluR2 blev påvist i 45,4 ± 4,7 % af glutamatergiske celler ved D21 (data, der ikke er vist), og der blev observeret en større vGLUT1-immunstaining under glutamatrgisk differentiering ved D21. Disse resultater viste, at andelen af neurale forfædre forblev lav, og at de fleste celler var godt differentieret efter en 21-dages kultur i de mikrofluidiske enheder. I figur 1B beskriver en generel protokol for multistep-samkulturer og elektrofysiologisk registrering cellesåningen i UW479- eller BT35-cellesåningen i de mikrofluidiske anordninger ved D21. Disse cellelinjer (figur 1C) er allerede beskrevet og kan sammenlignes med de tidligere observationer fra us3,19. I sidste ende blev der opnået to elektrofysiologiske optagelser: en ved D21 før co-culturing og den anden ved D23 efter 48 timers pHGG cellelinje såning.
For at forstå og følge BT35's, UW479' og glutamatergiske neuroners mobilitet og levedygtighed under co-kulturer blev der regelmæssigt udført mikroskopiske vurderinger i den elektrofysiologiske registreringsperiode fra D21 til D23 og præsenteres i figur 2. De mikroskopiske billeder afslørede en progressiv udvidelse og særlig fordeling af glutamatergiske neuroner på tværs af mikrofluidiske enheder (Figur 2A). Glutamatergic celler danner nogle aggregater gradvist på samme måde i co-kultur, og når dyrkes alene indtil D23 (kontrol eksperiment). I figur 2B,C, når der tilsættes BT35 og UW479, blev det bemærket, at de flydende celler, der var til stede umiddelbart efter gliomcellernes såning ved D21, gradvist forsvandt indtil D23 og blev klæbende pHGG-celler i enheden. Dette var især bemærkelsesværdigt for UW479-linjen.
Desuden var der ingen stigning i flydende celler efter alle elektrofysiologiske optagelser på D23 (data ikke vist). Ikke desto mindre blev procentdelen af levedygtige celler i figur 2D anslået til henholdsvis 83,02 % og 85,16 % for BT35 og UW479. Begge linjeviabilities var sammenlignelige og understregede, at patientafledte cellelinjer kan bruges korrekt. Den tekniske forberedelse af mikrofluidiske anordninger kombineret med mea- og cellemanipulationer ændrer ikke deres vedhæftningskapacitet. Det synes ikke at fremkalde celledød eller ændre deres mikroskopiske aspekter. BT35 og UW479 celler synes at kortlægge de nøjagtige placeringer af glutamatergiske neuroner i enheden, migrerer tæt til excitatoriske neuroner.
Figur 3 beskriver som et eksempel UW479/glutamatergic neuron co-kulturer med deres spike detektion langs registreringstiden i figur 3A og dens raster plot på D23 i Figur 3B, der viser øget elektrisk aktivitet, når du tilføjer pHGG celler. Figur 3C præsenterer den tidsmæssige array-dækkende fyring sats i BT35/glutamatergic neuron co-kulturer. Forskellene mellem kontroleksperimentet (kultur af glutamatergiske neuroner) og co-kulturer af glutamatergiske neuroner med pHGG-celler er signifikante ved registrering af D23 elektrisk aktivitet, som vist i figur 3D, hvilket indikerer en indvirkning af pHGG på neuron excitabilitet.
| Komponenter | Såning medium | D4 medium | D7 medium | D11 og videre medium |
| DMEM/F-12 Medium | 0,5x | 0,25x | 0,125x | Ø |
| Neurobasalt medium | 0,5x | 0,25x | 0,125x | Ø |
| BrainPhys Medium | Ø | 0,5x | 0,75x | 1x |
| SM1 Tillæg | 1x | 1x | 1x | 1x |
| N2 Tillæg-A | 1x | 1x | 1x | 1x |
| Ala-Gln (GlutaMax) | 0,5 mM | 0,5 mM | 0,5 mM | 0,5 mM |
| BDNF | 10 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| DDR | 10 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| TGF-β1 | 1 ng/mL | 1 ng/mL | 1 ng/mL | 1 ng/mL |
| Geltrex | 30 μg/mL | Ø | Ø | Ø |
| Såning Supplement | 1x | Ø | Ø | Ø |
| Tillæg på dag 4 | Ø | 1x | Ø | Ø |
Tabel 1: Kulturmediesammensætning for hiPS-afledte glutamatergiske neuroner.
| Antistoffer | Aktiekoncentrationer | Fungerende fortyndinger |
| Nestin | 0,5 mg/mL | 1:500 |
| (1 μg/mL) | ||
| Sox2 | 1 mg/mL | 1:500 |
| (2 μg/mL) | ||
| mGluR2 | 0,2 mg/mL | 1:50 |
| (4 μg/mL) | ||
| vGlut1 | 0,25 mg/mL | 1:50 |
| (5 μg/mL) | ||
| Æsel anti-kanin IgG H &L (AF 647) | 2 mg/mL | 1:1000 til 1:2000 |
| (1 til 2 μg/mL) | ||
| Æsel anti-mus IgG H &L (AF 555) | 2 mg/mL | 1:1000 |
| (2 μg/mL) |
Tabel 2: Liste over immunfluorescent antistoffer.
Figur 1: Cellekarakteriserings- og cokulturprotokol for glutamatergiske neuroner og pædiatriske gliomlinjer (pHGG) af høj kvalitet. (A) Forudsætning mikroskopisk og immunfluorescent karakterisering af glutamatergiske neuroner. (1) Mikroskopiske billeder på dag 21 (D21) og dag 23 (D23) af glutamatergiske neuroner. (2) Nestin mærkning i grøn og DAPI i blåt på D4 (øverste række) og D21 (nederste række). (3) Sox2-mærkning i grøn og DAPI i blåt ved D4 (øverste række) og D21 (nederste række). (4) mGluR2 mærkning i grøn og DAPI i blåt ved D21. (5 og 6) Statistiske sammenligninger mellem Nestin og Sox2 mærkning på D4 og D21 af kultur, der viser celledifferentiering. (7) vGlut1 farvning i grøn og DAPI i orange på D21. (B) Generel protokol for elektrofysiologisk optagelse for at studere interaktioner, når der dyrkes glutamatergiske neuroner og gliomceller på enheder. (C) Forudsætninger mikroskopiske aspekter af BT35 og UW479 cellelinjer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Mikroskopiske billeder af glutamatergiske og ggliomceller, der dyrkes i mikrofluidiske enheder kombineret med multielektrodesystemer (MEA). Glutamatergiske neuroner differentieres og dyrkes alene i den mikrofluidiske enhed indtil dag 21 (D21). (A) Til denne eksperimentelle kontrol blev der kun tilsat mediet til glutamatergiske celler ved D21, mens der blev tilføjet enten BT35 (B) eller UW479 (C) cellelinjer under deres respektive forhold. Billeder på D22 og D23 blev udført før de elektrofysiologiske optegnelser for hver tilstand. Alle billederne blev opnået ved hjælp af et klassisk fasekontrastmikroskop. (D) Tumorcelle levedygtighed for BT35 og UW479 på D23 blev anslået ved hjælp af en automatiseret optælling med billedanalyse software. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Elektrofysiologisk optagelse. (A) Spikedetektering langs registreringstiden i UW479/glutamatergiske neuron co-cultureer. (B) Et eksempel på det beregnede rasterplot ved D23 repræsenterer de hændelser, der registreres for hver aktiv elektrode som funktion af tiden i UW479/glutamatergiske neuron-samkulturer. (C) Tidsmæssig array-dækkende fyringshastighed (eller øjeblikkelig fyringshastighed) af alle de aktive elektroder, der registrerer elektrisk aktivitet i BT35/glutamatergiske neuron-samkulturer, hvilket gør det muligt at overvåge synkroniciteten af neural netværksaktiviteten. (D) Søjlediagrammer over middelfyringshastighed i kontroltilstanden (f.eks. glutamatergiske neuroners kultur) og ved tilsætning af tumoral UW479-cellelinje (i grøn) og BT35-cellelinje (med rødt). Data vises som gennemsnitlige ± SEM. (* p < 0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur S1: 3D (3-dimensionel) repræsentation af SU-8 forme. (A) Oprettelse og billede af SU-8 forme med AutoCAD software. (B) Billede af SU-forme med de to lag af fotoresistens strukturer og fire huller på 3 mm bredde. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbejde beskriver en nøjagtig funktionel in vitro-model til at evaluere samspillet mellem menneskelige hiPS-afledte kortikale glutamatergiske neuroner og hjernetumorceller i mikrofluidiske enheder. Et af de afgørende skridt i denne protokol var hiPS differentiering i glutamatergiske neuroner, som blev bekræftet af faldet i Nestin og Sox2 immunofluorescent farvning og samtidig udseende af mGluR2 og vGLUT1 farvning. Ikke desto mindre forblev kun få neurale forfædre, da kun halvdelen af de glutamatergiske celler udtrykte mGluR2, hvilket betyder en heterogen neuroncellepopulation. Alt i alt understreger disse resultater, at der skal udvises særlig omhu for glutamatrgisk cellevækst i sådanne anordninger. Desuden var det næste skridt, der studerede neuronernes elektriske adfærd i nærværelse af pHGG-celler, relativt arbejdskrævende at konfigurere databehandlingen for at optimere spikedetektering og fortolkning. Ikke desto mindre, som forventet og beskrevet i andre nyligt offentliggjorte værker4,5,6,9,10, tilstedeværelsen af pHGGs og glutamatergic neuroner øger elektrisk aktivitet bekræfter excitatoriske træk ved disse neuroner.
Den største begrænsning af denne modellering kan være den heterogene fordeling af neuroner på MEA selv, der kan påvirke elektrofysiologiske optagelser. Det ville kræve opretholdelse af høj densitetskultur i den mikrofluidiske enhed. For såning af en sekundær celletype på enheden er det afgørende at opretholde en hurtig spredning og migration i første omgang i 48 timer og opnå som for neuroner en homogen fordeling i 48 timers teknikken til optagelse. En anden begrænsning er at differentiere de forskellige typer af cellepopulationer i sådanne enheder visuelt, men nye tilgange ved hjælp af fluorescerende nanopartikler kan hjælpe med at følge begge celletyper26. Endelig blev udførelsen af denne mikrofluidiske tilgang kun udført i to typer phGG-linjer og bør udvides til mere patientafledte cellelinjer, der bærer forskellige molekylære drivere. Supplerende vurderinger kan gøres for at forstå denne excitatoriske virkning, når de samtidig medtrkulerer disse celler. Ikke desto mindre er det muligt med pHGG-celler, der bærer en H3.3 K27M drivermutation, som i BT35-linjen3.
Den overordnede metode, der er udviklet i dette arbejde, er en af de nye metoder til at udforske den elektriske påvirkning. Det har vist kapaciteten af neurale netværk analyse til at transduce samspillet mellem hiPS-afledte glutamatergic neuroner og pHGG tumorale cellelinjer i mikrofluidiske kulturforhold. Denne metode er nyttig til mange applikationer, især til funktionelle og mekanistiske undersøgelser og til analyse af virkningerne af farmakologiske midler, der kan blokere pHGG cellemigrering og interaktion med neuroner. Det understreger brugen af mikrofluidiske enheder, men specifikt når eksperimenter kan registrere den elektrofysiologiske aktivitet og kan føjes til en MEA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AB, MG, JR, LM, ML, JV, DD er ansat af NETRI, FL er Chief Technology Officer hos NETRI, og TH er Chief Scientific Officer hos NETRI. De andre forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Satt Conectus program, Fondation de l'Université de Strasbourg, «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Franck, Rayon de Soleil» og «Semeurs d'Etoile» associations. Vi takker de børn og familier, der er berørt af HGG'erne, for deres bidrag til denne forskning og deres støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
| Cortical Glutamatergic Neurons | BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | - | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
References
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Ostrom, Q. T., et al. Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro-Oncology. 16, Suppl 10 1-36 (2015).
- Blandin, A. F., et al. Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity. Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).
- Monje, M.
- Mount, C. W., Yalçın, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity. eLife. 18 (8), 49291 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders. Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Neftel, C., et al. An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Krishna, S., et al. Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival. BioRxiv. , (2021).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).
- Wang, X., et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression. Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).
- Venkatesh, H. S., et al. Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma. Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).
- Venkatesh, H. S., et al. Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion. Cell. 161 (4), 803-816 (2015).
- Buckingham, S. C., et al. Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity. Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).
- Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks. Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).
- Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks. BioRxiv. , (2021).
- Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings. Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).
- Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks. Scientific Reports. 6, 28384 (2016).
- Nguyen, A., et al. Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1α axis inhibition. Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Cerea, A., et al. Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors. Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).
- Bruno, G., et al. Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Maisonneuve, B. G. C., et al. Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework. BioRxiv. , (2021).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Andreiuk, B., et al. Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo. Small. 13 (38), (2017).
