Summary
Son çalışmalar, yüksek dereceli pediatrik glioma (pHGG) hücreleri üzerindeki nöronal etkiyi ve bunların karşılıklı etkileşimlerini ortaya çıkarmaktadır. Bu çalışma, pHGG hücrelerini ve glutamaterjik nöronları birlikte kültleyen bir in vitro modelin gelişimini göstermektedir ve bu etkileşimleri taklit etmek için elektrofizyolojik etkileşimlerini kaydetmektedir.
Abstract
Pediatrik yüksek dereceli gliomalar (pHGG), hızlı bir dismal prognoz taşıyan çocukluk ve ergen beyin kanserlerini temsil eder. Mevcut tedavilere karşı direncin üstesinden gelmeye ve yeni bir tedavi yöntemi bulmaya ihtiyaç olduğundan, yeni ilaçları ve terapötik prosedürleri test etmek için in vitro bir ortamda hastalığı mümkün olduğunca yakın modellemek oldukça zorludur. Glutamaterjik nöron hiperexcitability de dahil olmak üzere temel patobiyolojik süreçlerini incelemek, çevresel beyin ve pHGG hücreleri arasındaki etkileşimleri anlamada gerçek bir ilerleme olacaktır. Bu nedenle, nöronları / pHGG hücre etkileşimlerini yeniden oluşturmak için, bu çalışma, insan kaynaklı Pluripotent Stem (hiPS) türevi kortikal glutamaterjik nöronlar pHGG hücrelerini bölümlere ayrılmış mikroakışkan cihazlara ve elektrofizyolojik modifikasyonlarını kaydetmek için bir süreç haline getirerek fonksiyonel bir in vitro modelin gelişimini göstermektedir. İlk adım, insan glutamaterjik nöronlarını ayırt etmek ve karakterize etmekti. İkinci olarak, hücreler pHGG türevi hücre hatlarına sahip mikroakışkan cihazlarda kültürlendi. Daha sonra pHGG hücrelerinin bu mikro çevresel nöronlar üzerindeki elektriksel etkisini analiz etmek için beyin mikroçevriciliği ve nöronal aktivitesi bu modele dahil edildi. Elektrofizyolojik kayıtlar, fizyolojik koşulları taklit etmek ve tüm sinir ağının elektriksel aktivitesini kaydetmek için bu mikroakışkan cihazlara multielektrod dizileri (MEA) kullanılarak birleştirilmiştir. Tümör hücrelerinin varlığında nöron ekssitability'de önemli bir artış olduğunun altı çizildi.
Introduction
Pediatrik yüksek dereceli gliomalar (pHGG), hasta yaşına, tümör anatomik konumuna ve uzantısına ve moleküler sürücülere bağlı olarak genişletilmiş genotipik ve fenotipik çeşitlilik sergiler1. Şu anda mevcut tedavi seçenekleri ile kötü kontrol edilen agresif beyin tümörleridir ve çocuk ve ergenlerde beyin kanserleri ile ilgili önde gelen ölüm nedenidir2. Yani, hastaların% 80'inden fazlası teşhislerinden sonraki 2 yıl içinde nüks ediyor ve beyin konumlarına ve sürücü mutasyonlarına bağlı olarak ortanca sağkalımları 9-15 aydır. İyileştirici tedavinin olmaması laboratuvar araştırmaları için birincil dürtüdür ve yeni yenilikçi terapötik yaklaşımlara olan acil ihtiyacı vurgulamaktadır. Bu amaçla, hasta kaynaklı hücre hatları (PDCL), pHGG çeşitliliğinin üç boyutlu (2D) çizgilerde ve/veya üç boyutlu (3D) nörosferlerde sağlanması umuduyla geliştirilmiştir. Bununla birlikte, hasta kaynaklı in vitro hücre kültürleri tüm beyin değişken durumlarını taklit etmez. Bu modeller tipik olarak pHGG'de tanımlanan makroskopik ve mikroskobik nöro-anatomik ortamları dikkate almaz.
Genellikle, küçük çocuklarda pHGG esas olarak pontin ve talamik bölgelerde gelişirken, ergen ve genç yetişkinin HGG'si kortikal alanlarda, özellikle frontotemporal loblarda yoğunlaşmak1. Pediatrik yaşlardaki bu konum özellikleri gliomageneze yol açan farklı ortamları ve tümör hücreleri ile spesifik nöronal aktivite arasında karmaşık bir ağı içeriyor gibi görünmektedir4,5,6. Mekanizmalar hala tanımlanmasa da, pHGG esas olarak astroglial ve oligodendroglial soyların farklılaşma yörüngesi boyunca sinirsel öncül hücrelerden gelişir. Bu glial soyların rolü uzun zamandır nöronlar için basit yapısal destekle sınırlı olsa da, artık tamamen sinir devrelerine entegre oldukları ve beynin yapısal bölgelerini yeniden düzenleyebilen ve nöronal devreleri yeniden şekillendirebilen karmaşık çift yönlü glial-nöronal etkileşimler sergiledikleri açıkça belirlenmiştir4,7,8 . Ayrıca, artan kanıt kırıntıları, merkezi sinir sisteminin (CNS) beyin kanserinin başlatılmasında ve ilerlemesinde kritik bir rol oynadığını göstermektedir. Son çalışmalar, salgılanan büyüme faktörleri ve doğrudan elektrokimyasal sinaptik iletişim yoluyla glial malignitelerin büyümesini ve mitozini yönlendiren nöronal aktiviteye odaklanmıştır6,9. Karşılıklı olarak, yüksek dereceli glioma hücreleri artan glutamaterjik nöronal aktivite ile nöronal fonksiyonu etkiliyor ve yapısal ve elektriksel olarak entegre oldukları devrelerin çalışmasını modüle ediyor gibi görünmektedir9. Bu nedenle, nöron eylemini kontrol eden hasta kaynaklı modeller ve yeni sinirbilim araçları kullanılarak yapılan çalışmalar, nöronal aktivitenin glioma konumu, büyümesi ve ilerlemesi üzerinde devreye özgü bir etkisini göstermiştir. Gliomalarda yer alan bu nöronal projeksiyonların çoğu glutamaterjiktir ve glutamat salgıları yoluyla iletişim kurar. mGluR2 veya vGlut1/2 gibi spesifik glutamaterjik biyobelirteçler yaygın olarak tanımlanır6.
İlginçtir ki, moleküler heterojenliklerine rağmen, pediatrik ve erişkin yüksek dereceli gliomalar glutamaterjik nöronal aktiviteye ve nöroligin-3 veya BDNF (beyin kaynaklı nörotrofik faktör) gibi diğer salgılanan faktörlere tipik bir proliferatif yanıt göstermektedir 4,6,10,11,12,13 . Kortikal bölgelerde pediatrik ve erişkin HGG'ler artan glutamat salgılanması yoluyla nöronal hiperexcitability'e neden olabilir ve epileptik ağ aktivitesi ile ilişkili gliomalara yol açan GABA internöronlarını inhibe edebilir14,15. Bunun da ayrıca, nöral devreler gliomalar tarafından belirli nörolojik görevleri, örneğin dili iterek yeniden şekillendirilebilir ve ek organize nöronal aktivite talep edebilir9.
Bu gerekçeye dayanarak, glioma hücreleri ve nöronlar arasındaki çift yönlü iletişimin anlaşılmasının ilerletilmesi, in vitro pHGG yaklaşımlarının erken aşamaları ile tam olarak aydınlatılmalı ve entegre edilmelidir. Bu tür yenilikçi modelleme, ilaç testi sırasında nöronal elektriksel aktivite etkisini anlama ve ölçmede ve beyin devrelerine pHGG yanıtını tahmin etmede çok önemlidir. Mikroakışkan cihazlar ve pHGG araştırma çalışmaları gibi nörobilim araçlarındaki son gelişmeler, yeni modelleme yaklaşımları geliştirmek ve artık beyin mikroçevrimini in vitro pHGG modellerine entegre edebilmek için yataktır3,16,17,18,19. Multielektrod dizileri (MEA) kullanan elektrofizyolojik kayıtlarla birleştiğinde, mikroakışkan cihazlar20,21,22, tüm sinir ağının elektriksel aktivitesini kaydederken fizyolojik koşulları taklit etme ve çeşitli koşullar altında ağ bağlantı parametrelerini çıkarma imkanı sunar. Bu cihaz23,24, önce hücrelerin doğrudan MEA'da bir odada hassas bir şekilde birikmesini sağlar. Bu teknoloji, MEA'daki hücre tohumlama yoğunluğunun ve homojenliğinin kontrolünü ve insan sinir progenitörlerinin doğrudan cihazlara farklılaşması için kritik bir adım olan medya değişiminin ince kontrolünü sağlar. Ayrıca, mevcut biriktirme odası farklı zaman noktalarında birden fazla hücre ile tohumlanabilir.
Bu nedenle, bu çalışma, insan Pluripotent Stem (hiPS) türevi kortikal glutamaterjik nöronları ve pHGG türevi hücreleri mikroakışkan cihazlara eş-kültleyen ve her iki hücre popülasyonu arasındaki elektriksel etkileşimleri değerlendirmek için elektriksel aktivitelerini kaydeden fonksiyonel bir in vitro model geliştirmeyi amaçlamıştır. İlk olarak, hiPS türevi kortikal glutamaterjik nöronlar, kültürün farklı aşamalarında mikroakışkan cihazlarda [gün 4 (D4), hiPS hücreleri olarak ve 21. Ortak kültürün ikinci adımı için iki pHGG modeli kullanıldı: H3.3 K27M sürücü mutasyonu taşıyan bir hasta tümöründen (BT35)3 başlatılan ticarileştirilmiş pediatrik UW479 hattı ve pHGG hücreleri. Son olarak, pHGG hücre tohumlamadan önce D21'de glutamaterjik hücrelerin elektrofizyolojik kayıtlarını ve aynı mikroakışkan cihaza 48 saat birlikte kültürden sonra D23'ü gerçekleştirdik. Glutamaterjik nöronlar ve pHGG hücreleri arasındaki etkileşimler, kaydedilen elektrofizyolojik aktivitede önemli bir artış ile karakterize edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol için insan malzemelerinin kullanımı ile ilgili akreditasyon numarası DC-2020-4203'tür.
1. Mikroakışkan cihaz imalatı, hazırlanması ve tedavisi
- Geleneksel fotolithografi tekniklerini kullanarak SU-8 kalıpları üretin18.
NOT: Bu amaçla, iki fotolithografi maskesi, silikon gofret substratı üzerinde iki fotoresist yapı katmanı ve SU-8 2100'de (200 μm yüksekliğinde) yapılan ana kanalların deseni altında asimetrik mikrogroovları tanımlayan ince bir SU-8 2005 fotoresist katmanı (3,2 μm yüksekliğinde ve 6 ± 1 μm genişliğinde) oluşturmak için tasarlanmıştır. 1 mm genişliğinde, ve 13 mm uzunluğunda) (bkz. Ek Şekil S1). - 1 dakika boyunca bir plazma temizleyici (5.00e-1 torr, yüksek radyo frekansı (RF) seviyesi) kullanarak gofreti etkinleştirin ve alüminyum bir klasörde 30 dakika boyunca bir desiccator içine 1 mL (trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silane kullanarak silenize edin.
- 10:1 polidimetilsiloksisan (PDMS) oranı hazırlayın, prepolimeri katalizörle karıştırın, sıkışmış kabarcıkları çıkarmak için vakumlu bir kurutucuya geçirin ve 40 dakika boyunca 80 ° C'de bir fırında kürlenmeden önce yavaşça kalıba atın.
- Bundan sonra kalıbı soymadan önce istenen boyutta bir jilet kullanarak kesin. 3 mm genişliğinde delikler elde etmek için girişi ve çıkış bölgelerini delin, PDMS'yi temizleyin ve yapışkan bant kullanarak koruyun.
NOT: Son PDMS cihazının kalınlığı yaklaşık 5 mm'dir. - Cihazı bir plazma temizleyici (5.00e-1 torr, 1 dakika boyunca Yüksek RF seviyesi) kullanarak tedavi edin, bir polistiren Petri kabı ile monte edin ve vakumun UV ışığı altında 30 dakika boyunca maruz bırakılın.
- %70 etanol kullanmadan önce mikroakışkan cihazın giriş kısmını pipetle doldurun ve pipet aspirasyonu ile boşaltın.
- Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS) giriş rezervuarlarını ekleyerek mikroakışkan cihazı yıkayın ve aspirasyonu art arda üç kez pipetleyarak boşaltın.
- Cihazı 0,05 mg/mL Poli-D-Lizin kullanarak kaplayıp bir inkübatöre (%37 °C, %5 CO2) yerleştirin. 24 saat sonra, cihazı giriş haznesine nörobakal ortamı ekleyerek durulayın ve aspirasyonu art arda üç kez pipetleyarak boşaltın.
- Mikroakışkan çipi hücre kültürü ortamıyla doldurun ve maksimum 2 saat kullanıma kadar oda sıcaklığında kalmasını kesin.
2. Mikroakışkan cihazda hücre hazırlama ve tohumlama
- İnsan hiPS türevi kortikal glutamaterjik nöronların kültürü, tohumlanması ve immünofluoresan karakterizasyonu
NOT: Ticarileştirilmiş hiPS türevi kortikal glutamaterjik nöronlar (Şekil 1A). İnsan kaynaklı malzemeleri koruyun ve bunları onay ile ve mevzuat kuralları çerçevesinde ele alın.- Mikroakışkan cihazın giriş ve çıkış rezervuarlarını tohumlamadan önce pipet aspirasyonu ile boşaltın, böylece sadece cihazın kanalları orta ile doldurulur.
- HiPS hücrelerini, kompozisyonu Tablo 1'de verilen ortamla birlikte 6,5 x 106 hiPS hücre/mL süspansiyonun 10 μL'si (örneğin, 900 hücre/mm2 konsantrasyonu) koyarak 0.Gün'de (D0) tohumlayın ve hücrelerin takılmasını sağlamak için cihazın 15 dakika boyunca kaputun altında (oda sıcaklığında) olmasını kesin.
- 15 dakika sonra, hem giriş hem de çıkış rezervuarlarını, tüm bileşimi Tablo 1'de verilen 50 μL D4 kültür ortamı ile doldurun ve cihazı inkübatöre aktarın (%37 °C, %5 CO2).
- Glutamaterjik nöron farklılığını kontrollü bir ortamda (%37 °C, %5 CO2) ve bileşimi Tablo 1'de açıklanan belirli bir hücre kültürü ortamı ile 23 gün boyunca koruyun (Şekil 1A(1), mikroskopi). Ortamı bir sonraki adım 5'te ayrıntılı olarak belirtildiği gibi düzenli olarak değiştirin. hemen aşağıda ve Şekil 1B'deki gibi adımları izleyin.
- Tablo 1 kompozisyonunu izleyen her 3 ila 4 günde bir ortamı değiştirin. D4'e kadar tohumlama ortamı, D7'ye kadar D4 ortamı, D11'e kadar D7 ortamı ve kültürün kalan süresi için D11 ortamını kullanın.
- Hücre canlılığını değerlendirmek ve hücre sayımına izin vermek için standart faz kontrastlı mikroskop kullanarak D4, D21 ve D23'te mikroskobik fotoğraflar çekin.
- Karakterizasyon için, farklılaştırılmış glutamaterjik nöronları orta aspirasyondan sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehitte (PFA) sabitlayın ve immünoresans boyama protokolünü izleyin.
- Hücreleri Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile üç kez yıkayın ve %0,1 Triton-X ile 10 dakika, ardından %3 Sığır Serum Albümin (BSA) ile 30 dakika permeabilize edin. Birincil antikorları ekleyin ve cihazı 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
- Hücreleri PBS ile üç kez durulayın ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca karşılık gelen ikincil antikorlarla daha fazla kuluçkaya yatırın.
NOT: Çalışmada kullanılan immünofluoresan antikorlar Tablo 2'de listelenmiştir. - Hücreleri PBS ile üç kez durulayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca DAPI (4',6-diamino-2-fenylindole) ile karşıt çizgi.
- CMOS (Tamamlayıcı metal-oksit-yarı iletken) kamera ile donatılmış ters epifluoresans mikroskobu ile görüntüler elde edin ve uygun görüntü analiz yazılımını kullanarak analiz edin.
- DAPI lekeli görüntüleri açın ve yazılımdaki eşik yordamıyla binarize edin. Bunu yapmak için , Görüntü > > Eşiğini Ayarla'yı tıklatın ve çekirdeği arka plandan ayırmak için uygun parametreleri ayarlayın. Ardından, toplam çekirdeği bölmek için > İşlem uygula > Su Havzası'na tıklayın.
- Bundan sonra, ikili görüntüleri yorumlamak için Parçacıkları Analiz Et yazılımının işlevini kullanın. Bunu yapmak için, Analiz et'e ve ardından Parçacıkları Analiz Et'e tıklayın ve bundan sonra uygun parametreleri ayarlayın: boyut ve döngüsellik filtresi (7 μm'den küçük, 20 μm'den büyük veya 0,1 μm'den küçük bir döngüselliğe sahip analiz nesnelerinden hariç tutun).
- Doğru boyamayı doğrulamak için DAPI analizinden elde edilen kontur görüntülerini muhabir immünofluoresan resimlerle birleştirin.
- Son olarak, farklı biyobelirteçler için ilişkili verileri (nesne sayısı, ortalama alan, kapsama alanı yüzdesi vb.) kaydedin ve uygun niceleme yazılımını kullanarak D4 ve/veya D21'deki ifadeyi ölçün.
- Ticarileştirilmiş pHGG hattı, UW479 ve hasta türevi hücre hattının hücre kültürü, BT353
- DMEM/F-12 GlutaMAX'teki her iki hücre hattını da bir hücre kültürü şişesinde %10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile desteklenerek kültür edin. Şekil 1C'de sunulduğu gibi her hücre hattının %80 birleştiği yer için bekleyin.
- Deneyler boyunca bu pHGG hücrelerini 37 °C'de kontrollü bir ortamda normoksik koşullarda muhafaza edin.
3. Ortak kültür protokolü
- UW479 ve BT35 hücre hatları için tohumlama gününü ve konsantrasyonu, birlikte kültürün başlaması gerektiğinde, glutamaterjik nöronlar için 21 günlük kültüre karşılık gelen konfüçyüs hücrelerinin% 80'ine ulaşacak şekilde ayarlayın.
- Trypsinize UW479 ve BT35 hücrelerini deneyin ve pHGG hücrelerini olgun glutamaterjik nöronlar içeren mikroakışkan cihaza tohumlamadan önce her özel mikroakışkan cihazda (her hücre tipi için 900 hücre / mm2 hedef yoğunluğu ile) glutamaterjik nöronların üstüne tohumlayın.
- Tablo 1'de ayrıntılı olarak açıklanan glutamaterjik nöron D11 ve ileriye dönük ortam ile ortak kültürleri kontrollü bir ortamda (%37 °C, %5 CO2) 2 gün boyunca koruyun.
- Canlılıklarını değerlendirmek için bir görüntü analiz yazılımı ile analiz edilen mikroskobik resimleri kullanarak pHGG hücrelerini sayın. Hücrelerin yüzdesini hesaplayın.
NOT: Aşağıdaki formülü kullanın: 100 - ((D23'teki hücre sayısı / D21'deki hücre sayısı) x 100).
4. Elektrofizyolojik kayıt
- Elektrofizyolojik kaydı ticari bir sistem ve piyasada bulunan bir yazılımla gerçekleştirin.
NOT: Deneyler, 100 μm aralıklı 30 μm çapında elektrotlardan oluşan bir MEA ile gerçekleştirildi. - PHGG hücrelerinin tohumlanmadan önce D21'de glutamaterjik nöronlar üzerinde ilk elektrofizyolojik kaydı gerçekleştirin. Farklılaştırılmış glutamaterjik nöronları kontrol olarak kullanın ve ortak kültüre paralel olarak tek başına kültür edin. 3 numaralı sonraki adımda açıklandığı gibi her iki koşul için de ikinci bir kayıt yapın.
- D23'te ikinci bir elektrofizyolojik kayıt gerçekleştirin (2 günlük ortak kültürden sonra).
5. Elektrofizyolojik veri işleme
- Ham verileri 2. sıra Band-pass Butterworth filtresiyle filtreleyin (100 Hz ve 2500 Hz passband frekanslarıyla).
- Ani algılama için, sinyalin kök ortalama karesini her elektrot için 10 dakikalık kayıt üzerinden hesaplayın ve bu kök ortalamanın kare değerinin sekiz katına karşılık gelen bir genlik eşiği ayarlayın.
- Bir eylem potansiyeli için en fazla 2 ms süre göz önünde bulundurarak bir TSSB (Precision Timing Spike Detection25) algoritması uygulayın.
- Aktif bir elektrot olarak düşünün, her elektrot en az 5 çivi / dk algılar. Kayıt elektrotlarının en az %10'u aktifse teste devam edin.
- Her aktif elektrodun ortalama atış hızını hesaplamak için algılanan ani artışların sayısını kayıt süresine bölün. Her bağımsız deney için ortalama atış hızını hesaplayın. Sonuçta, bir ortalamayı koşula göre hesaplayın (±SEM) ve kayıt gününde bir işlev olarak ifade edin.
- Zamanın bir işlevi olarak her etkin elektrot için algılanan olayları temsil eden her deneme için bir raster çizimi hesaplayın. Ardından, tüm aktif elektrotların zamansal dizi çapındaki ateşleme hızlarını (veya anlık ateşleme hızlarını) hesaplayarak sinir ağı aktivitesinin eşzamanlılığını izlemeyi sağlar.
- Son olarak, nicelik yazılımını kullanarak çubuk grafikler oluşturun ve Kruskal Wallis testlerini kullanarak karşılaştırmalar yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Glutamaterjik nöronlar ve glioma hücreleri arasındaki elektriksel etkileşimleri incelemeden önce, hiPS türevi kortikal glutamaterjik nöronlar mikroakışkan cihazlarda kültlemenin fizibilitesini doğrulamak için karakterize edildi (Şekil 1A). Karakterizasyonları Nestin, Sox2, mGlurR2 (metabotropik Glutamat Reseptörleri 2) ve Şekil 1A(2-7)'de temsil edilen vGLUT1 immünostaining kullanılarak değerlendirildi. Nestin, nöral progenitör hücrelerin hayatta kalması, yenilenmesi ve mitojen uyarılmış çoğalması için gerekli bir ara filament proteini olduğundan, gelişim sırasında farklılaşmamış CNS hücrelerinde ifade edilir. Sox2, embriyonik gelişimin düzenlenmesinde rol oynayan SRY benzeri HMG-box gen (SOX) transkripsiyon faktörü ailesinin bir üyesidir ve ağırlıklı olarak CNS'deki nöral epitelin olgunlaşmamış ve farklılaşmamış hücrelerinde ifade edilir. mGluR2, korteks ve hipokampusta yüksek ekspresyon ile beyin boyunca yaygın olarak dağıtılır. Genellikle, presinaptik hücreleri nöronal eksistik ve sinaptik iletimleri (örneğin, glutamaterjik nöronlar) ile tanımlar. vGLUT1 glutamaterjik biyobelirteç olarak da kullanılır. Bu nedenle Şekil 1, D4 ve D21'de Nestin ve Sox2 ekspresyonlarına sahip glutamaterjik nöronlara odaklanarak ilerleyici farklılaşmalarını kültür koşullarına doğrulamaya odaklanmaktadır (Şekil 1A(2-4)). Nestin pozitif hücrelerin yüzdesi D4'te %5,4'ten %0,4'e ± D21'de %0,3'± 0,69'a düştü (p < 0,01, Şekil 1A5). Benzer şekilde, glutamaterjik nöronların farklılaşmış durumunu doğrulayarak, Sox2 pozitif hücrelerinin yüzdesi D4'te% 12.2'den% 2.1'± D21'de% 5.5'e ±% 1.7'ye düştü (p < 0.05, bkz. Şekil 1A6). MGluR2 ekspresyolü D21'de glutamaterjik hücrelerin %4.7'± 45.4'ında saptadı (veriler gösterilmedi) ve D21'de glutamaterjik farklılaşma sırasında daha büyük bir vGLUT1 immünostaining gözlendi. Bu sonuçlar, nöral progenitörlerin oranının düşük kaldığını ve mikroakışkan cihazlarda 21 günlük bir kültürden sonra çoğu hücrenin iyi farklılaştırıldığını göstermiştir. Şekil 1B'de, çok noktalı ortak kültürlerin ve elektrofizyolojik kaydın genel bir protokolü, D21'deki mikroakışkan cihazlarda UW479 veya BT35 hücre tohumlamasını açıklar. Bu hücre hatları (Şekil 1C) zaten tanımlanmıştır ve bizim tarafından yapılan önceki gözlemlerle karşılaştırılabilir 3,19. Sonunda, iki elektrofizyolojik kayıt elde edildi: biri birlikte kültlemeden önce D21'de, diğeri 48 saat pHGG hücre hattı tohumlaması yapıldıktan sonra D23'te.
BT35, UW479 ve glutamaterjik nöronların ortak kültürler sırasında hareketliliğini ve canlılığını anlamak ve takip etmek için, D21'den D23'e elektrofizyolojik kayıt döneminde mikroskobik değerlendirmeler düzenli olarak yapıldı ve Şekil 2'de sunuldu. Mikroskobik görüntüler, glutamaterjik nöronların mikroakışkan cihazlar arasında ilerleyici bir uzantısını ve özel dağılımını ortaya koydu (Şekil 2A). Glutamaterjik hücreler, bazı agregaları, ortak kültürde ve D23'e (kontrol deneyi) kadar tek başına kültürlendiğinde benzer şekilde aşamalı olarak oluşturur. Şekil 2B,C'de, BT35 ve UW479 eklendiğinde, glioma hücrelerinin D21'deki tohumlamasından hemen sonra ortaya çıkan yüzen hücrelerin D23'e kadar giderek kaybolduğu ve cihaza yapışan pHGG hücreleri haline geldiği gözlenmiştir. Bu özellikle UW479 hattı için dikkat çekiciydi.
Ayrıca, D23'teki tüm elektrofizyolojik kayıtlardan sonra yüzen hücrelerde bir artış olmadı (veriler gösterilmedi). Bununla birlikte, Şekil 2D'deki canlı hücrelerin yüzdeleri BT35 ve UW479 için sırasıyla% 83.02 ve% 85.16 olarak tahmin edildi. Her iki hat canlılığı da karşılaştırılabilirdi ve hasta kaynaklı hücre hatlarının uygun şekilde kullanılabileceğinin altını çizdi. MEA ve hücre manipülasyonları ile birleştirilen mikroakışkan cihazların teknik olarak hazırlanması yapışma kapasitelerini değiştirmez. Hücre ölümünü teşvik etmiyor veya mikroskobik yönlerini değiştirmiyor gibi görünüyor. BT35 ve UW479 hücreleri, glutamaterjik nöronların cihazdaki tam konumlarını haritalıyor gibi görünüyor ve uyarıcı nöronlara yakından göç ediyor.
Şekil 3, Şekil 3A'daki kayıt süresi boyunca ani algılamaları ve Şekil 3B'deki D23'teki raster grafiği ile UW479/glutamatergic nöron ortak kültürlerine örnek olarak açıklanmaktadır ve pHGG hücreleri eklerken artan elektriksel aktiviteyi gösterir. Şekil 3C, BT35/glutamaterjik nöron ortak kültürlerinde zamansal dizi çapında ateşleme hızını sunar. Kontrol deneyi (glutamaterjik nöron kültürü) ve pHGG hücrelerine sahip glutamaterjik nöronların ortak kültürleri arasındaki farklar, pHGG'nin nöron uyarlanabilirliği üzerindeki etkisini gösteren Şekil 3D'de gösterildiği gibi, D23 elektriksel aktiviteyi kaydederken önemlidir.
| Bileşen | Tohumlama ortamı | D4 ortamı | D7 orta | D11 ve ileri orta |
| DMEM/F-12 Orta | 0,5x | 0,25x | 0,125x | Ø |
| Nörobakal Orta | 0,5x | 0,25x | 0,125x | Ø |
| BrainPhys Orta | Ø | 0,5x | 0,75x | 1x |
| SM1 Eki | 1x | 1x | 1x | 1x |
| N2 Eki-A | 1x | 1x | 1x | 1x |
| Ala-Gln (GlutaMax) | 0,5 mM | 0,5 mM | 0,5 mM | 0,5 mM |
| BDNF | 10 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| GDNF | 10 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| TGF-β1 | 1 ng/mL | 1 ng/mL | 1 ng/mL | 1 ng/mL |
| Geltrex | 30 μg/mL | Ø | Ø | Ø |
| Tohumlama Eki | 1x | Ø | Ø | Ø |
| 4. Gün Eki | Ø | 1x | Ø | Ø |
Tablo 1: HiPS türevi glutamaterjik nöronlar için kültür ortamı bileşimi.
| Antikor | Stok konsantrasyonları | Çalışan seyreltmeler |
| Nestin | 0,5 mg/mL | 1:500 |
| (1 μg/mL) | ||
| Sox2 | 1 mg/mL | 1:500 |
| (2 μg/mL) | ||
| mGluR2 | 0.2 mg/mL | 1:50 |
| (4 μg/mL) | ||
| vGlut1 | 0.25 mg/mL | 1:50 |
| (5 μg/mL) | ||
| Eşek anti-tavşan IgG H&L (AF 647) | 2 mg/mL | 1:1000 - 1:2000 |
| (1 ila 2 μg/mL) | ||
| Eşek anti-fare IgG H&L (AF 555) | 2 mg/mL | 1:1000 |
| (2 μg/mL) |
Tablo 2: İmmünofluoresan antikorların listesi.
Şekil 1: Glutamaterjik nöronların ve yüksek dereceli pediatrik gliom (pHGG) çizgilerinin hücre karakterizasyonu ve ortak kültür protokolü. (A) Glutamaterjik nöronların prekreksit mikroskobik ve immünofluoresan karakterizasyonu. (1) Glutaterjik nöronların 21 (D21) ve 23.gün (D23) mikroskobik resimleri. (2) D4 (üst sıra) ve D21'de (alt satır) yeşil ve DAPI mavi olarak nestin etiketleme. (3) Sox2 etiketleme yeşil ve DAPI mavi D4 (üst satır) ve D21 (alt satır). (4) mGluR2 D21'de yeşil ve DAPI mavi etiketleme. (5 ve 6) Kültürün D4 ve D21'inde Nestin ve Sox2 etiketlemesi arasındaki istatistiksel karşılaştırmalar hücre farklılaşması gösterir. (7) VGlut1 yeşil renkte ve DAPI turuncu renkte D21'de. (B) Cihazlarda glutamaterjik nöronları ve glioma hücrelerini birlikte kültlerken etkileşimleri incelemek için elektrofizyolojik kayıt için genel protokol. (C) BT35 ve UW479 hücre hatlarının önkoşul mikroskobik yönleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mikroakışkan cihazlarda kültürlenmiş glutamaterjik ve glioma hücrelerinin mikroskobik görüntüleri multielektorit dizileri (MEA). Glutamaterjik nöronlar 21.güne (D21) kadar mikroakışkan cihazda tek başına farklılaştırılıyor ve kültürleniyor. (A) Bu deneysel kontrol için, D21'deki glutamaterjik hücrelere sadece ortam eklenirken, bt35 (B) veya UW479 (C) hücre hatları kendi koşullarında eklendi. D22 ve D23'teki görüntüler her durum için elektrofizyolojik kayıtlardan önce gerçekleştirildi. Tüm görüntüler klasik faz kontrastlı mikroskop kullanılarak elde edildi. (D) D23'te BT35 ve UW479 için tümör hücre canlılığı, görüntü analiz yazılımı ile otomatik bir sayı kullanılarak tahmin edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Elektrofizyolojik kayıt. (A) UW479/glutamaterjik nöron ortak kültürlerinde kayıt süresi boyunca spike tespiti. (B) D23'teki hesaplanan raster arsasının bir örneği, UW479/glutamaterjik nöron ortak kültürlerinde zamanın bir fonksiyonu olarak her aktif elektrot için tespit edilen olayları temsil eder. (C) BT35/glutamaterjik nöron ortak kültürlerinde elektriksel aktiviteyi kaydeden tüm aktif elektrotların zamansal dizi çapında ateşleme hızı (veya anlık ateşleme hızı), sinir ağı aktivitesinin eşzamanlılığını izlemeyi sağlar. (D) Kontrol durumunda (örneğin glutamaterjik nöron kültürü) ve tümöral UW479 hücre hattı (yeşil) ve BT35 hücre hattı (kırmızı) eklerken ortalama ateşleme hızının çubuk çizelgeleri. Veriler SEM. (* p < 0.05) ± ortalama olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: SU-8 kalıplarının 3D (3 boyutlu) gösterimi. (A) AutoCAD yazılımı ile SU-8 kalıplarının oluşturulması ve hayal edilebilir. (B) fotoresist yapıların iki katmanı ve 3 mm genişliğinde dört delikli SU kalıplarının resmi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, mikroakışkan cihazlarda insan hiPS türevi kortikal glutamaterjik nöronlar ve beyin tümöral hücreleri arasındaki etkileşimi değerlendirmek için doğru bir fonksiyonel in vitro modeli açıklamaktadır. Mevcut protokoldeki önemli adımlardan biri, Nestin ve Sox2 immünofluoresan lekelenmenin azalması ve mGluR2 ve vGLUT1 lekelemenin eşzamanlı görünümü ile doğrulanan glutamaterjik nöronlardaki hiPS farklılaşmasıydı. Bununla birlikte, glutaterjik hücrelerin sadece yarısı heterojen nöron hücre popülasyonu anlamına gelen mGluR2'yi ifade ettiğinden, az sayıda nöral progenitör kalmıştır. Tamamen, bu sonuçlar, bu tür cihazlarda glutamaterjik hücre büyümesine özel bir bakım yapılması gerektiğini vurgulamaktadır. Ayrıca, nöronların pHGG hücrelerinin varlığındaki elektriksel davranışlarını inceleyen bir sonraki adım, ani tespit ve yorumlamayı optimize etmek için veri işlemeyi ayarlamak için nispeten emek yoğundu. Bununla birlikte, beklendiği gibi ve yakın zamanda yayınlanan diğer çalışmalarda açıklandığı gibi4,5,6,9,10, pHGG'lerin ve glutamaterjik nöronların varlığı, bu nöronların uyarıcı özelliğini doğrulayan elektriksel aktiviteyi arttırır.
Bu modellemenin en büyük sınırlaması, nöronların MEA'nın kendisi üzerinde elektrofizyolojik kayıtları etkileyebilecek heterojen dağılımı olabilir. Mikroakışkan cihazda yüksek yoğunluklu kültürün korunmasını gerektirir. İkincil bir hücre tipini cihaza tohumlamak için, başlangıçta 48 saat boyunca hızlı bir çoğalma ve göçü korumak ve nöronlara kayıt için 48 saat tekniğinde homojen bir dağılım elde etmek önemlidir. Başka bir sınırlama, bu tür cihazlardaki farklı hücre popülasyonlarını görsel olarak ayırt etmektir, ancak floresan nanopartikülleri kullanan yeni yaklaşımlar her iki hücre tipini de takip etmeye yardımcı olabilir26. Son olarak, bu mikroakışkan yaklaşımın performansı sadece iki tip phGG hattında yapılmıştır ve farklı moleküler sürücüler taşıyan daha hasta kaynaklı hücre hatlarına genişletilmelidir. Bu hücreleri birlikte kültlerken bu heyecan verici etkiyi anlamak için tamamlayıcı değerlendirmeler yapılabilir. Bununla birlikte, BT35 line3 gibi H3.3 K27M sürücü mutasyonu taşıyan pHGG hücreleri ile mümkündür.
Bu çalışmada geliştirilen genel yöntem, elektriksel etkiyi araştırmak için yeni yaklaşımlardan biridir. Mikroakışkan kültür koşullarında hiPS türevi glutamaterjik nöronlar ile pHGG tümöral hücre hatları arasındaki etkileşimi dönüştürücü sinir ağı analizinin kapasitesini göstermiştir. Bu yöntem, özellikle fonksiyonel ve mekanistik çalışmalar ve pHGG hücre göçini ve nöronlarla etkileşimi engelleyebilen farmakolojik ajanların etkilerini analiz etmek için birçok uygulama için yararlıdır. Mikroakışkan cihazların kullanımını vurgular, ancak özellikle deneyler elektrofizyolojik aktiviteyi kaydedebileceğinde ve bir MEA'ya eklenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AB, MG, JR, LM, ML, JV, DD NETRI tarafından istihdam edilir, FL NETRI'de Baş Teknoloji Sorumlusudur ve TH NETRI'de Baş Bilimsel Sorumludur. Diğer yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Satt Conectus programı, Fondation de l'Université de Strasbourg, «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Franck, Rayon de Soleil» ve «Semeurs d'Etoile» derneklerinin hibeleriyle desteklendi. HGG'lerden etkilenen çocuklara ve ailelere bu araştırmaya katkıları ve destekleri için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
| Cortical Glutamatergic Neurons | BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | - | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
References
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Ostrom, Q. T., et al. Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro-Oncology. 16, Suppl 10 1-36 (2015).
- Blandin, A. F., et al. Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity. Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).
- Monje, M.
- Mount, C. W., Yalçın, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity. eLife. 18 (8), 49291 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders. Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Neftel, C., et al. An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Krishna, S., et al. Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival. BioRxiv. , (2021).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).
- Wang, X., et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression. Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).
- Venkatesh, H. S., et al. Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma. Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).
- Venkatesh, H. S., et al. Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion. Cell. 161 (4), 803-816 (2015).
- Buckingham, S. C., et al. Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity. Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).
- Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks. Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).
- Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks. BioRxiv. , (2021).
- Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings. Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).
- Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks. Scientific Reports. 6, 28384 (2016).
- Nguyen, A., et al. Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1α axis inhibition. Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Cerea, A., et al. Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors. Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).
- Bruno, G., et al. Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Maisonneuve, B. G. C., et al. Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework. BioRxiv. , (2021).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Andreiuk, B., et al. Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo. Small. 13 (38), (2017).
