Summary
Neuere Arbeiten decken die neuronalen Auswirkungen auf hochgradige pädiatrische Gliomzellen (pHGG) und ihre wechselseitigen Interaktionen auf. Die vorliegende Arbeit zeigt die Entwicklung eines In-vitro-Modells , das pHGG-Zellen und glutamaterge Neuronen kokulturiert und ihre elektrophysiologischen Interaktionen aufzeichnet, um diese Wechselwirkungen nachzuahmen.
Abstract
Pädiatrische hochgradige Gliome (pHGG) repräsentieren Hirntumore im Kindes- und Jugendalter, die eine schnelle düstere Prognose haben. Da es notwendig ist, die Resistenz gegen aktuelle Behandlungen zu überwinden und einen neuen Weg der Heilung zu finden, ist es sehr anspruchsvoll, die Krankheit in einem In-vitro-Setting so nah wie möglich zu modellieren, um neue Medikamente und therapeutische Verfahren zu testen. Die Untersuchung ihrer grundlegenden pathologischen Prozesse, einschließlich der Übererregbarkeit von glutamatergen Neuronen, wird ein echter Fortschritt beim Verständnis der Wechselwirkungen zwischen dem Umweltgehirn und den pHGG-Zellen sein. Um Neuronen/ pHGG-Zellinteraktionen nachzubilden, zeigt diese Arbeit die Entwicklung eines funktionellen In-vitro-Modells , das human-induzierte pluripotente Stamm (hiPS) -abgeleitete kortikale glutamaterge Neuronen pHGG-Zellen in kompartimentierte mikrofluidische Geräte und einen Prozess zur Aufzeichnung ihrer elektrophysiologischen Modifikationen kokulturiert. Der erste Schritt bestand darin, menschliche glutamaterge Neuronen zu differenzieren und zu charakterisieren. Zweitens wurden die Zellen in mikrofluidischen Geräten mit pHGG-abgeleiteten Zelllinien kultiviert. Die Mikroumgebung des Gehirns und die neuronale Aktivität wurden dann in dieses Modell einbezogen, um die elektrischen Auswirkungen von pHGG-Zellen auf diese Mikroumgebungsneuronen zu analysieren. Elektrophysiologische Aufzeichnungen werden unter Verwendung von Multielektrodenarrays (MEA) an diese mikrofluidischen Geräte gekoppelt, um physiologische Bedingungen nachzuahmen und die elektrische Aktivität des gesamten neuronalen Netzwerks aufzuzeichnen. Eine signifikante Erhöhung der Neuronenerregbarkeit wurde in Gegenwart von Tumorzellen unterstrichen.
Introduction
Pädiatrische hochgradige Gliome (pHGG) weisen eine erweiterte genotypische und phänotypische Vielfalt auf, abhängig vom Alter des Patienten, der anatomischen Lage und Erweiterung des Tumors sowie den molekularen Treibern1. Es handelt sich um aggressive Hirntumore, die mit den derzeit verfügbaren Behandlungsmöglichkeiten schlecht kontrolliert werden und die häufigste Todesursache im Zusammenhang mit Hirntumoren bei Kindern und Jugendlichen sind2. So erleiden mehr als 80% der Patienten innerhalb von 2 Jahren nach ihrer Diagnose einen Rückfall, und ihr medianes Überleben beträgt 9-15 Monate, abhängig von Gehirnstandorten und Treibermutationen. Das Fehlen einer kurativen Behandlung ist der primäre Drang zur Laborforschung und unterstreicht den unmittelbaren Bedarf an neuen innovativen Therapieansätzen. Zu diesem Zweck wurden patientenabgeleitete Zelllinien (PDCL) mit der Hoffnung entwickelt, die pHGG-Diversität3 in zweidimensionalen (2D) Linien und/oder dreidimensionalen (3D) Neurosphären bereitzustellen. Dennoch ahmen diese von Patienten abgeleiteten In-vitro-Zellkulturen nicht alle variablen Situationen des Gehirns nach. Diese Modelle berücksichtigen nicht die makroskopischen und mikroskopischen neuroanatomischen Umgebungen, die typischerweise in pHGG beschrieben werden.
Normalerweise entwickelt sich pHGG bei jüngeren Kindern hauptsächlich in pontinen und thalamischen Regionen, während sich das HGG von Jugendlichen und jungen Erwachsenen in den kortikalen Bereichen konzentriert, insbesondere in frontotemporalen Lappen1. Diese Standortspezifitäten im pädiatrischen Alter scheinen verschiedene Umgebungen zu umfassen, die zu Gliomagenese und einem sich verbindenden Netzwerk zwischen Tumorzellen und spezifischer neuronaler Aktivität führen4,5,6. Obwohl Mechanismen noch nicht identifiziert sind, entwickelt sich pHGG hauptsächlich aus neuronalen Vorläuferzellen entlang der Differenzierungsbahn von astroglialen und oligodendroglialen Linien. Während die Rolle dieser Glialinien lange Zeit auf einfache strukturelle Unterstützung für Neuronen beschränkt war, ist es jetzt klar erwiesen, dass sie sich vollständig in neuronale Schaltkreise integrieren und komplexe bidirektionale glia-neuronale Interaktionen aufweisen, die in der Lage sind, strukturelle Regionen des Gehirns zu reorganisieren und neuronale Schaltkreise umzugestalten4,7,8 . Darüber hinaus deuten zunehmende Fetzen von Beweisen darauf hin, dass das zentrale Nervensystem (ZNS) eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und progression von Hirntumoren spielt. Jüngste Arbeiten konzentrierten sich auf neuronale Aktivität, die das Wachstum und die Mitose von glialen Malignomen durch sezernierte Wachstumsfaktoren und direkte elektrochemische synaptische Kommunikation anzutreiben scheint6,9. Reziprok umgekehrt scheinen hochgradige Gliomzellen die neuronale Funktion mit zunehmender glutamaterger neuronaler Aktivität zu beeinflussen und modulieren den Betrieb der Schaltkreise, in die sie strukturell und elektrisch integriert sind9. Studien, die von Patienten abgeleitete Modelle und neuartige neurowissenschaftliche Werkzeuge zur Kontrolle der Neuronenwirkung verwendeten, zeigten eine schaltkreisspezifische Wirkung der neuronalen Aktivität auf die Lage, das Wachstum und die Progression von Gliomen. Die meisten dieser neuronalen Projektionen, die an Gliomen beteiligt sind, sind glutamaterg und kommunizieren über Glutamatsekretionen. Spezifische glutamaterge Biomarker wie mGluR2 oder vGlut1/2 werden häufig beschrieben6.
Interessanterweise zeigen pädiatrische und adulte hochgradige Gliome trotz ihrer molekularen Heterogenität eine typische proliferative Reaktion auf glutamaterge neuronale Aktivität und andere sezernierte Faktoren wie Neuroligin-3 oder BDNF (brain-derived neurotrophic factor)4,6,10,11,12,13 . In kortikalen Regionen können pädiatrische und erwachsene HGGs durch eine erhöhte Glutamatsekretion neuronale Übererregbarkeit induzieren und GABA-Interneuronen hemmen, was zu Gliomen führt, die mit epileptischer Netzwerkaktivität assoziiert sind14,15. Darüber hinaus können neuronale Schaltkreise durch Gliome, die bestimmte neurologische Aufgaben, z. B. Sprache, vorantreiben, umgestaltet werden und zusätzliche organisierte neuronale Aktivitäten erfordern9.
Basierend auf dieser Begründung muss das Verständnis der bidirektionalen Kommunikation zwischen Gliomzellen und Neuronen vollständig aufgeklärt und in die frühen Stadien der In-vitro-pHGG-Ansätze integriert werden. Eine solche innovative Modellierung ist entscheidend für das Verständnis und die Messung der Auswirkungen der neuronalen elektrischen Aktivität während des Drogentests und die Antizipation der pHGG-Reaktion in die Schaltkreise des Gehirns. Jüngste Entwicklungen in neurowissenschaftlichen Werkzeugen, wie mikrofluidische Geräte und pHGG-Forschungsarbeiten, sind das Fundament, um neue Modellierungsansätze zu entwickeln und nun in der Lage zu sein, die Mikroumgebung des Gehirns in In-vitro-pHGG-Modelle zu integrieren3,16,17,18,19. Gekoppelt mit elektrophysiologischen Aufzeichnungen unter Verwendung von Multielektrodenarrays (MEA) bieten mikrofluidische Bauelemente20,21,22 die Möglichkeit, physiologische Bedingungen nachzuahmen, während die elektrische Aktivität des gesamten neuronalen Netzwerks aufgezeichnet und Netzwerkkonnektivitätsparameter unter verschiedenen Bedingungen extrahiert werden. Dieses Gerät23,24 ermöglicht zunächst die präzise Abscheidung von Zellen in einer Kammer direkt auf MEA. Diese Technologie ermöglicht die Kontrolle der Zellsaatdichte und -homogenität auf MEA und die Feinsteuerung des Medienaustauschs, was ein kritischer Schritt für die Differenzierung des menschlichen neuronalen Vorläufers direkt in Geräte ist. Darüber hinaus kann die vorliegende Abscheidungskammer mit mehreren Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten ausgesät werden.
Daher zielte diese Studie darauf ab, ein funktionelles In-vitro-Modell zu entwickeln, das menschliche pluripotente Stamm (hiPS) -abgeleitete kortikale glutamaterge Neuronen und pHGG-abgeleitete Zellen in mikrofluidische Geräte kokulturiert und ihre elektrische Aktivität aufzeichnet, um elektrische Wechselwirkungen zwischen beiden Zellpopulationen zu bewerten. Zuerst wurden hiPS-abgeleitete kortikale glutamaterge Neuronen in mikrofluidischen Geräten in verschiedenen Stadien der Kultur [Tag 4 (D4) als hiPS-Zellen und Tag 21 (D21) und Tag 23 (D23) als glutamaterge gereifte Neuronen] erhalten und charakterisiert. Für den zweiten Schritt der Kokultur wurden zwei pHGG-Modelle verwendet: kommerzialisierte pädiatrische UW479-Linie und pHGG-Zellen, die von einem Patiententumor (BT35)3 initiiert wurden, der eine H3.3 K27M-Treibermutation trug. Schließlich führten wir elektrophysiologische Aufnahmen von glutamatergen Zellen bei D21 vor der pHGG-Zellaussaat und D23 nach 48 h Kokultur in dasselbe mikrofluidische Gerät durch. Die Wechselwirkungen zwischen glutamatergen Neuronen und pHGG-Zellen waren durch einen signifikanten Anstieg der aufgezeichneten elektrophysiologischen Aktivität gekennzeichnet.
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Protocol
Für dieses Protokoll lautet die Akkreditierungsnummer für die Verwendung menschlicher Materialien DC-2020-4203.
1. Herstellung, Herstellung und Behandlung mikrofluidischer Geräte
- Herstellung von SU-8-Formen mit herkömmlichen Photolithographietechniken18.
HINWEIS: Zu diesem Zweck wurden zwei Photolithographiemasken entwickelt, um zwei Schichten von Fotolackstrukturen auf Siliziumwafersubstrat und eine dünne SU-8 2005-Fotolackschicht (3,2 μm hoch und 6 ± 1 μm breit) zu konstruieren, die asymmetrische Mikronebel unter der Strukturierung von Hauptkanälen definiert, die in SU-8 2100 (200 μm hoch, 1 mm breit, und 13 mm lang) (siehe ergänzende Abbildung S1). - Aktivieren Sie den Wafer unter Verwendung eines Plasmareinigers (5,00e-1 torr, Hochradiofrequenz (RF) für 1 min und silanisieren Sie ihn mit 1 ml (Trichlor (1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)silan in einem Aluminiumordner zu einem Exsikkator für 30 min.
- Bereiten Sie ein 10: 1-Verhältnis von Polydimethylsiloxan (PDMS) vor, mischen Sie das Prepolymer mit Katalysator, geben Sie es in einen Vakuum-Exsikkator, um eingeschlossene Blasen zu entfernen, und gießen Sie es langsam auf die Form, bevor es in einem Ofen bei 80 ° C für 40 min ausgehärtet wird.
- Schneiden Sie es danach mit einem Rasiermesser in der gewünschten Größe, bevor Sie die Form abziehen. Stanzen Sie die Einlass- und Auslasszonen aus, um 3 mm breite Löcher zu erhalten, reinigen Sie das PDMS und schützen Sie es mit Klebeband.
HINWEIS: Die Dicke des endgültigen PDMS-Geräts beträgt ca. 5 mm. - Behandeln Sie das Gerät mit einem Plasmareiniger (5.00e-1 torr, hoher HF-Pegel während 1 min), montieren Sie es mit einer Polystyrol-Petrischale und setzen Sie das Vakuum 30 min unter UV-Licht aus.
- Füllen Sie den Einlass des mikrofluidischen Geräts vor Gebrauch mit einer Pipette mit 70% Ethanol und entleeren Sie ihn durch Pipettieren der Aspiration.
- Waschen Sie das mikrofluidische Gerät durch Zugabe von Einlassreservoirs Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS) und entleeren Sie es, indem Sie die Aspiration dreimal hintereinander pipettieren.
- Beschichten Sie das Gerät mit 0,05 mg/ml Poly-D-Lysin und legen Sie es in einen Inkubator (37 °C, 5% CO2). Nach 24 h spülen Sie das Gerät aus, indem Sie das neurobasale Medium in das Einlassreservoir geben und es durch dreimal hintereinander pipettierende Aspiration entleeren.
- Füllen Sie den mikrofluidischen Chip mit dem Zellkulturmedium und lassen Sie es bis zu einem Gebrauch für maximal 2 h bei Raumtemperatur stehen.
2. Zellvorbereitung und Aussaat im mikrofluidischen Gerät
- Kultur, Seeding und immunfluoreszierende Charakterisierung menschlicher hiPS-abgeleiteter kortikaler glutamaterger Neuronen
HINWEIS: Durchführung von Experimenten mit kommerzialisierten hiPS-abgeleiteten kortikalen glutamatergen Neuronen (Abbildung 1A). Bewahren Sie aus dem Menschen gewonnene Materialien und behandeln Sie sie mit der Genehmigung und nach den Richtlinien der Gesetzgebung.- Entleeren Sie die Ein- und Auslassbehälter des mikrofluidischen Geräts vor dem Aussaaten durch Pipettenaspiration und lassen Sie nur die Kanäle des Geräts mit Medium füllen.
- Säen Sie die hiPS-Zellen an Tag 0 (D0) aus, indem Sie 10 μL einer 6,5 x 106 hiPS-Zellen/ml-Suspension (z. B. 900 Zellen/mm2-Konzentration ) mit dem Medium, dessen Zusammensetzung in Tabelle 1 angegeben ist, und lassen Sie das Gerät 15 Minuten lang unter der Haube (bei Raumtemperatur) sein, damit sich die Zellen anheften können.
- Füllen Sie nach 15 min sowohl die Einlass- als auch die Auslassbehälter mit 50 μL D4-Kulturmedium, dessen gesamte Zusammensetzung in Tabelle 1 angegeben ist, und geben Sie das Gerät in den Inkubator (37 °C, 5% CO2).
- Aufrechterhaltung der glutamatergen Neuronendifferenzierung für 23 Tage (Abbildung 1A(1), Mikroskopie) unter kontrollierter Umgebung (37 °C, 5 % CO2) und mit einem spezifischen Zellkulturmedium, dessen Zusammensetzung in Tabelle 1 beschrieben ist. Ersetzen Sie das Medium regelmäßig, wie im nächsten Schritt 5 beschrieben. direkt darunter, und führen Sie die Schritte wie in Abbildung 1B aus.
- Ersetzen Sie das Medium alle 3 bis 4 Tage nach Tabelle 1 Zusammensetzung. Verwenden Sie das Aussaatmedium bis D4, das Medium D4 bis D7, das Medium D7 bis D11 und das Medium D11 für die verbleibende Zeit der Kultur.
- Machen Sie mikroskopische Bilder an D4, D21 und D23 mit einem Standard-Phasenkontrastmikroskop, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu beurteilen und die Zellzählung zu ermöglichen.
- Zur Charakterisierung fixieren Sie die differenzierten glutamatergen Neuronen in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 30 min bei Raumtemperatur nach mittlerer Aspiration und befolgen Sie das Protokoll für die Immunfluoreszenzfärbung.
- Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen und 10 min mit 0,1% Triton-X permeabilisieren, gefolgt von 30 min mit 3% Rinderserumalbumin (BSA). Fügen Sie primäre Antikörper hinzu und inkubieren Sie das Gerät über Nacht bei 4 °C.
- Spülen Sie die Zellen dreimal mit PBS und inkubieren Sie weiter mit den entsprechenden sekundären Antikörpern für 2 h bei Raumtemperatur.
ANMERKUNG: Die in der Studie verwendeten immunfluoreszierenden Antikörper sind in Tabelle 2 aufgeführt. - Spülen Sie die Zellen dreimal mit PBS ab und enthalten Sie sie mit DAPI (4',6-Diamino-2-phenylindol) für 10 min bei Raumtemperatur.
- Erfassen Sie Bilder mit einem inversen Epifluoreszenzmikroskop, das mit einer CMOS-Kamera (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor) ausgestattet ist, und analysieren Sie sie mit einer geeigneten Bildanalysesoftware.
- Öffnen Sie die DAPI-gefärbten Bilder und binarisieren Sie mit der Thresholding-Routine in der Software. Klicken Sie dazu auf Bild > > Schwellenwert anpassen und stellen Sie die entsprechenden Parameter ein, um den Kern vom Hintergrund zu unterscheiden. Klicken Sie dann auf Apply > Process > Watershed , um den aggregierten Kern zu teilen.
- Verwenden Sie anschließend die Funktion der angeborenen Software Analyze Particles , um die Binärbilder zu interpretieren. Klicken Sie dazu auf Analysieren und dann auf Partikel analysieren und legen Sie danach die entsprechenden Parameter fest: Größen - und Zirkularitätsfilter (Objekte kleiner als 7 μm, größer als 20 μm oder mit einer Zirkularität kleiner als 0,1 μm von der Analyse ausschließen).
- Führen Sie die aus der DAPI-Analyse erhaltenen Konturbilder mit entsprechenden Immunfluoreszenzbildern zusammen, um die korrekte Färbung zu validieren.
- Speichern Sie abschließend die zugehörigen Daten (Anzahl der Objekte, mittlere Fläche, % der Abdeckung usw.) für die verschiedenen Biomarker und quantifizieren Sie die Expression bei D4 und/oder D21 mit geeigneter Quantifizierungssoftware.
- Zellkultur der kommerzialisierten pHGG-Linie, UW479, und der vom Patienten abgeleiteten Zelllinie BT353
- Kultur beider Zelllinien in DMEM/F-12 GlutaMAX ergänzt mit 10% Fetal Bovine Serum (FBS) in einem Zellkulturkolben. Warten Sie auf 80% Konfluenz jeder Zelllinie, wie in Abbildung 1C dargestellt.
- Halten Sie diese pHGG-Zellen während der gesamten Experimente unter einer kontrollierten Umgebung bei 37 °C unter normoxischen Bedingungen aufrecht.
3. Co-Culture-Protokoll
- Passen Sie den Seeding-Tag und die Konzentration für UW479- und BT35-Zelllinien an, um 80% der konfluenten Zellen zu erreichen, wenn die Kokultur beginnen sollte, was 21 Tagen Kultur für glutamaterge Neuronen entspricht.
- Trypsinisieren Sie UW479- und BT35-Zellen und säen Sie sie auf die Oberseite der glutamatergen Neuronen in jedem dedizierten mikrofluidischen Gerät (mit einer Zieldichte von 900 Zellen / mm2 für jeden Zelltyp), bevor Sie die pHGG-Zellen in das mikrofluidische Gerät säen, das gereifte glutamaterge Neuronen enthält.
- Halten Sie die Co-Kulturen 2 Tage lang unter einer kontrollierten Umgebung (37 °C, 5% CO2) mit dem glutamatergen Neuron D11 und dem in Tabelle 1 beschriebenen Medium weiter.
- Zählen Sie pHGG-Zellen anhand der mikroskopischen Bilder, die mit einer Bildanalysesoftware analysiert wurden, um ihre Lebensfähigkeit zu beurteilen. Berechnen Sie den Prozentsatz der Zellen.
HINWEIS: Verwenden Sie die folgende Formel: 100 - ((Anzahl der Zellen bei D23 / Anzahl der Zellen bei D21) x 100).
4. Elektrophysiologische Aufzeichnung
- Führen Sie die elektrophysiologische Aufzeichnung mit einem kommerziellen System und handelsüblicher Software durch.
HINWEIS: Die Experimente wurden mit einem MEA durchgeführt, das aus Elektroden mit einem Durchmesser von 30 μm im Abstand von 100 μm bestand. - Führen Sie eine erste elektrophysiologische Aufzeichnung an glutamatergen Neuronen bei D21 durch, bevor Sie pHGG-Zellen aussäen. Nutzen Sie die differenzierten glutamatergen Neuronen als Kontrolle und kultivieren Sie sie allein parallel zur Kokultur. Führen Sie eine zweite Aufzeichnung für beide Bedingungen durch, wie im nächsten Schritt mit der Nummer 3 beschrieben.
- Führen Sie eine zweite elektrophysiologische Aufnahme bei D23 durch (nach 2 Tagen Kokultur).
5. Elektrophysiologische Datenverarbeitung
- Filtern Sie die Rohdaten mit einem Bandpass-Butterworth-Filter 2. Ordnung (mit Passbandfrequenzen von 100 Hz und 2500 Hz).
- Berechnen Sie für die Spike-Erkennung das mittlere Quadrat des Signals über die 10-minütige Aufzeichnung für jede Elektrode und legen Sie einen Amplitudenschwellenwert fest, der dem Achtfachen des quadratischen Wertes dieses Mittelwerts entspricht.
- Wenden Sie einen PTBS-Algorithmus (Precision Timing Spike Detection25) an und berücksichtigen Sie eine maximale Dauer von 2 ms für ein Aktionspotential.
- Betrachten Sie als aktive Elektrode jede Elektrode, die mindestens 5 Spikes / min erkennt. Setzen Sie den Test fort, wenn mindestens 10% der Aufzeichnungselektroden aktiv sind.
- Teilen Sie die Anzahl der erkannten Spitzen durch den Zeitraum der Aufzeichnung, um die mittlere Zündrate jeder aktiven Elektrode zu berechnen. Berechnen Sie eine durchschnittliche mittlere Feuerrate für jedes unabhängige Experiment. Berechnen Sie letztendlich einen Durchschnitt nach Bedingung (±SEM) und drücken Sie ihn als Funktion am Tag der Aufzeichnung aus.
- Berechnen Sie ein Rasterdiagramm für jedes Experiment, das die für jede aktive Elektrode detektierten Ereignisse als Funktion der Zeit darstellt. Berechnen Sie dann die zeitlichen Array-weiten Feuerungsraten (oder momentanen Feuerraten) aller aktiven Elektroden, um die Synchronizität der neuronalen Netzwerkaktivität zu überwachen.
- Generieren Sie schließlich Balkendiagramme mit der Quantifizierungssoftware und führen Sie Vergleiche mit Kruskal Wallis-Tests durch.
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Representative Results
Vor der Untersuchung elektrischer Wechselwirkungen zwischen glutamatergen Neuronen und Gliomzellen wurden hiPS-abgeleitete kortikale glutamaterge Neuronen charakterisiert, um die Machbarkeit ihrer Kultivierung in mikrofluidischen Geräten zu validieren (Abbildung 1A). Ihre Charakterisierung wurde unter Verwendung von Nestin, Sox2, mGlurR2 (metabotrope Glutamatrezeptoren 2) und vGLUT1-Immunostaining, dargestellt in Abbildung 1A(2-7), bewertet. Da Nestin ein intermediäres Filamentprotein ist, das für das Überleben, die Erneuerung und die mitogenstimulierte Proliferation neuronaler Vorläuferzellen benötigt wird, wird es daher während der Entwicklung in undifferenzierten ZNS-Zellen exprimiert. Sox2 ist ein Mitglied der SRY-ähnlichen HMG-Box-Gen (SOX) Transkriptionsfaktorfamilie, die an der Regulation der Embryonalentwicklung beteiligt ist, und es wird überwiegend in unreifen und undifferenzierten Zellen des neuronalen Epithels im ZNS exprimiert. mGluR2 ist im gesamten Gehirn weit verbreitet, mit hoher Expression im Kortex und Hippocampus. Normalerweise definiert es die präsynaptischen Zellen mit ihrer neuronalen Erregbarkeit und synaptischen Übertragung (z. B. die glutamatergen Neuronen). vGLUT1 wird auch als glutamatoger Biomarker verwendet. Daher konzentriert sich Abbildung 1 auf glutamaterge Neuronen mit Nestin- und Sox2-Expressionen bei D4 und D21, um ihre progressive Differenzierung in die Kulturbedingungen zu validieren (Abbildung 1A(2-4). Der Prozentsatz der Nestin-positiven Zellen sank von 5,4 ± 0,4% bei D4 auf 0,69 ± 0,3% bei D21 (p < 0,01, Abbildung 1A5). Um den differenzierten Zustand glutamaterger Neuronen zu bestätigen, sank der Prozentsatz der Sox2-positiven Zellen von 12,2 ± 2,1% bei D4 auf 5,5 ± 1,7% bei D21 (p < 0,05, siehe Abbildung 1A6). Die Expression von mGluR2 wurde in 45,4 ± 4,7% der glutamatergen Zellen bei D21 nachgewiesen (Daten nicht gezeigt), und eine größere vGLUT1-Immunfärbung wurde während der glutamatergen Differenzierung bei D21 beobachtet. Diese Ergebnisse zeigten, dass der Anteil der neuralen Vorläufer gering blieb und dass die meisten Zellen nach einer 21-tägigen Kultur in den mikrofluidischen Geräten gut differenziert waren. In Abbildung 1B beschreibt ein allgemeines Protokoll der mehrstufigen Cokulturen und der elektrophysiologischen Aufzeichnung das UW479- oder BT35-Zell-Seeding in den mikrofluidischen Bauelementen bei D21. Diese Zelllinien (Abbildung 1C) wurden bereits beschrieben und sind vergleichbar mit den bisherigen Beobachtungen von uns3,19. Am Ende wurden zwei elektrophysiologische Aufnahmen gemacht: eine bei D21 vor der Kokulturierung und die andere bei D23 nach 48 h pHGG-Zellliniensaat.
Um die Mobilität und Lebensfähigkeit von BT35-, UW479- und glutamatergen Neuronen während der Co-Kulturen zu verstehen und zu verfolgen, wurden während des elektrophysiologischen Aufzeichnungszeitraums von D21 bis D23 regelmäßig mikroskopische Untersuchungen durchgeführt, die in Abbildung 2 dargestellt sind. Die mikroskopischen Bilder zeigten eine fortschreitende Erweiterung und besondere Verteilung von glutamatergen Neuronen über mikrofluidische Geräte (Abbildung 2A). Die glutamatergen Zellen bilden einige Aggregate progressiv in ähnlicher Weise in Co-Kultur und bei alleiniger Kultivierung bis D23 (Kontrollexperiment). In Abbildung 2B,C wurde bei Zugabe von BT35 und UW479 beobachtet, dass die schwimmenden Zellen, die unmittelbar nach der Aussaat der Gliomzellen bei D21 vorhanden waren, bis D23 progressiv verschwanden und zu adhärenten pHGG-Zellen in das Gerät wurden. Dies war besonders bemerkenswert für die UW479-Linie.
Darüber hinaus gab es nach allen elektrophysiologischen Aufnahmen an D23 keinen Anstieg der schwimmenden Zellen (Daten nicht gezeigt). Dennoch wurde der Prozentsatz der lebensfähigen Zellen in Abbildung 2D auf 83,02% bzw. 85,16% für BT35 bzw. UW479 geschätzt. Beide Liniendurchführungen waren vergleichbar und unterstrichen die Tatsache, dass patientenabstammende Zelllinien angemessen eingesetzt werden können. Die technische Herstellung von mikrofluidischen Bauelementen, die an MEA und Zellmanipulationen gekoppelt sind, ändert nichts an deren Adhäsionsvermögen. Es scheint keinen Zelltod zu induzieren oder ihre mikroskopischen Aspekte zu verändern. BT35- und UW479-Zellen scheinen die genauen Positionen von glutamatergen Neuronen im Gerät abzubilden und wandern eng zu den exzitatorischen Neuronen.
Abbildung 3 beschreibt als Beispiel UW479/glutamaterge Neuronen-Co-Kulturen mit ihrer Spike-Erkennung entlang der Aufzeichnungszeit in Abbildung 3A und ihrem Raster-Plot bei D23 in Abbildung 3B, was eine erhöhte elektrische Aktivität beim Hinzufügen von pHGG-Zellen zeigt. Abbildung 3C zeigt die temporale Array-weite Feuerungsrate in BT35/glutamatergen Neuronen-Co-Kulturen. Die Unterschiede zwischen dem Kontrollexperiment (Kultur von glutamatergen Neuronen) und Co-Kulturen von glutamatergen Neuronen mit pHGG-Zellen sind signifikant bei der Aufzeichnung der elektrischen D23-Aktivität, wie in Abbildung 3D gezeigt, was auf einen Einfluss von pHGG auf die Erregbarkeit von Neuronen hinweist.
| Komponenten | Aussaatmedium | D4 mittel | D7 mittel | D11 und höher Medium |
| DMEM/F-12 Mittel | 0,5-fach | 0,25-fach | 0,125-fach | Ø |
| Neurobasales Medium | 0,5-fach | 0,25-fach | 0,125-fach | Ø |
| BrainPhys Mittel | Ø | 0,5-fach | 0,75-fach | 1x |
| SM1 Ergänzung | 1x | 1x | 1x | 1x |
| N2 Ergänzung-A | 1x | 1x | 1x | 1x |
| Ala-Gln (GlutaMax) | 0,5 mM | 0,5 mM | 0,5 mM | 0,5 mM |
| BDNF | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml |
| GDNF | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml |
| TGF-β1 | 1 ng/ml | 1 ng/ml | 1 ng/ml | 1 ng/ml |
| Geltrex | 30 μg/ml | Ø | Ø | Ø |
| Seeding Ergänzung | 1x | Ø | Ø | Ø |
| Tag 4 Zuschlag | Ø | 1x | Ø | Ø |
Tabelle 1: Zusammensetzung der Kulturmedien für hiPS-abgeleitete glutamaterge Neuronen.
| Antikörper | Bestandskonzentrationen | Arbeitsverdünnungen |
| Nestin | | 0,5 mg/ml | 1:500 |
| (1 μg/ml) | ||
| Sox2 | 1 mg/ml | 1:500 |
| (2 μg/ml) | ||
| mGluR2 | 0,2 mg/ml | 1:50 |
| (4 μg/ml) | ||
| vGlut1 | 0,25 mg/ml | 1:50 |
| (5 μg/ml) | ||
| Esel Anti-Kaninchen IgG H& L (AF 647) | 2 mg/ml | 1:1000 bis 1:2000 |
| (1 bis 2 μg/ml) | ||
| Esel Anti-Maus IgG H& L (AF 555) | 2 mg/ml | 1:1000 |
| (2 μg/ml) |
Tabelle 2: Liste der immunfluoreszierenden Antikörper.
Abbildung 1: Zellcharakterisierung und Kokulturprotokoll von glutamatergen Neuronen und hochgradigen pädiatrischen Gliomlinien (pHGG). (A) Voraussetzung für eine mikroskopische und immunfluoreszierende Charakterisierung glutamaterger Neuronen. (1) Mikroskopische Bilder an Tag 21 (D21) und Tag 23 (D23) von glutamatergen Neuronen. (2) Nestin-Beschriftung in Grün und DAPI in Blau bei D4 (obere Reihe) und D21 (untere Reihe). (3) Sox2-Beschriftung in Grün und DAPI in Blau bei D4 (obere Reihe) und D21 (untere Reihe). (4) mGluR2-Kennzeichnung in Grün und DAPI in Blau bei D21. (5 und 6) Statistische Vergleiche zwischen Nestin- und Sox2-Markierung bei D4 und D21 der Kultur, die die Zelldifferenzierung zeigen. (7) vGlut1-Färbung in Grün und DAPI in Orange bei D21. (B) Allgemeines Protokoll für die elektrophysiologische Aufzeichnung zur Untersuchung von Wechselwirkungen bei der Co-Kultivierung glutamaterger Neuronen und Gliomzellen auf Produkten. (C) Voraussetzung für mikroskopische Aspekte von BT35- und UW479-Zelllinien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Mikroskopische Aufnahmen von glutamatergen und Gliomzellen, die in mikrofluidischen Geräten kultiviert wurden, die an Multielektroden-Arrays (MEA) gekoppelt sind. Glutamerge Neuronen werden bis Zum 21. Tag (D21) allein im mikrofluidischen Gerät differenziert und kultiviert. (A) Für diese experimentelle Kontrolle wurde nur das Medium zu glutamatergen Zellen an D21 gegeben, während entweder BT35 (B) oder UW479 (C) Zelllinien unter ihren jeweiligen Bedingungen hinzugefügt wurden. Bilder in D22 und D23 wurden vor den elektrophysiologischen Aufzeichnungen für jede Bedingung durchgeführt. Alle Bilder wurden mit einem klassischen Phasenkontrastmikroskop aufgenommen. (D) Die Lebensfähigkeit von Tumorzellen für BT35 und UW479 bei D23 wurde mithilfe einer automatisierten Zählung mit Bildanalysesoftware geschätzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Elektrophysiologische Aufzeichnung. (A) Spike-Detektion entlang der Aufzeichnungszeit in UW479/glutamatergen Neuronen-Co-Kulturen. (B) Ein Beispiel für das berechnete Rasterdiagramm bei D23 stellt die Ereignisse dar, die für jede aktive Elektrode als Funktion der Zeit in UW479/glutamatergen Neuronen-Co-Kulturen detektiert wurden. (C) Zeitliche Array-weite Feuerungsrate (oder momentane Feuerrate) aller aktiven Elektroden, die elektrische Aktivität in BT35/glutamatergen Neuronen-Co-Kulturen aufzeichnen, was die Überwachung der Synchronizität der neuronalen Netzwerkaktivität ermöglicht. (D) Balkendiagramme der mittleren Feuerrate unter der Kontrollbedingung (z. B. die Kultur glutamaterger Neuronen) und bei Zugabe der tumoralen UW479-Zelllinie (in grün) und bt35-Zelllinie (in rot). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. (* S. < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung S1: 3D-Darstellung (3-dimensional) von SU-8-Formen. (A) Erstellung und Abbildung von SU-8-Formen mit AutoCAD-Software. (B) Bild der SU-Formen mit den zwei Schichten von Fotolackstrukturen und vier Löchern von 3 mm Breite. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Diese Arbeit beschreibt ein genaues funktionelles In-vitro-Modell zur Bewertung der Interaktion zwischen humanen hiPS-abgeleiteten kortikalen glutamatergen Neuronen und Hirntumorzellen in mikrofluidischen Geräten. Einer der entscheidenden Schritte im vorliegenden Protokoll war die hiPS-Differenzierung in glutamatergen Neuronen, die durch die Abnahme der Nestin- und Sox2-Immunfluoreszenzfärbung und das gleichzeitige Auftreten von mGluR2- und vGLUT1-Färbung bestätigt wurde. Dennoch blieben nur wenige neuronale Vorläufer übrig, da nur die Hälfte der glutamatergen Zellen mGluR2 exprimierte, was eine heterogene Neuronenzellpopulation bedeutet. Insgesamt unterstreichen diese Ergebnisse, dass dem glutamatergen Zellwachstum in solchen Geräten besondere Aufmerksamkeit gewidmet werden muss. Darüber hinaus war der nächste Schritt, der das elektrische Verhalten von Neuronen in Gegenwart von pHGG-Zellen untersuchte, relativ arbeitsintensiv, um die Datenverarbeitung zur Optimierung der Spike-Erkennung und -Interpretation einzurichten. Dennoch, wie erwartet und in anderen kürzlich veröffentlichten Arbeiten beschrieben4,5,6,9,10, verstärkt das Vorhandensein von pHGGs und glutamatergen Neuronen die elektrische Aktivität, was das erregende Merkmal dieser Neuronen bestätigt.
Die Haupteinschränkung dieser Modellierung könnte die heterogene Verteilung von Neuronen auf der MEA selbst sein, die elektrophysiologische Aufzeichnungen beeinflussen kann. Es würde die Aufrechterhaltung einer Kultur mit hoher Dichte im mikrofluidischen Gerät erfordern. Für die Aussaat eines sekundären Zelltyps auf das Gerät ist es entscheidend, eine schnelle Proliferation und Migration zunächst für 48 h aufrechtzuerhalten und wie bei Neuronen eine homogene Verteilung in der 48-h-Technik für die Aufzeichnung zu erhalten. Eine weitere Einschränkung besteht darin, die verschiedenen Arten von Zellpopulationen in solchen Geräten visuell zu unterscheiden, aber neue Ansätze mit fluoreszierenden Nanopartikeln könnten helfen, beiden Zelltypen zu folgen26. Schließlich wurde die Leistung dieses mikrofluidischen Ansatzes nur in zwei Arten von phGG-Linien durchgeführt und sollte auf mehr von Patienten abgeleitete Zelllinien mit unterschiedlichen molekularen Treibern ausgeweitet werden. Ergänzende Bewertungen könnten durchgeführt werden, um diesen erregenden Effekt bei der Kokulturierung dieser Zellen zu verstehen. Dennoch ist es mit pHGG-Zellen mit einer H3.3 K27M-Treibermutation möglich, wie in der BT35-Linie3.
Die in dieser Arbeit entwickelte Gesamtmethode ist einer der neuen Ansätze zur Erforschung der elektrischen Auswirkungen. Es hat die Fähigkeit der neuronalen Netzwerkanalyse gezeigt, die Interaktion zwischen hiPS-abgeleiteten glutamatergen Neuronen und pHGG-Tumorzelllinien unter mikrofluidischen Kulturbedingungen zu übertragen. Diese Methode ist für viele Anwendungen hilfreich, insbesondere für funktionelle und mechanistische Studien und für die Analyse der Wirkungen pharmakologischer Wirkstoffe, die die Migration von pHGG-Zellen und die Interaktion mit Neuronen blockieren können. Es betont die Verwendung von mikrofluidischen Geräten, aber speziell, wenn Experimente die elektrophysiologische Aktivität aufzeichnen und zu einer MEA hinzugefügt werden können.
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Disclosures
AB, MG, JR, LM, ML, JV, DD sind bei NETRI beschäftigt, FL ist Chief Technology Officer bei NETRI und TH ist Chief Scientific Officer bei NETRI. Die anderen Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Satt Conectus-Programms, der Fondation de l'Université de Strasbourg, «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Franck, Rayon de Soleil» und «Semeurs d'Etoile» unterstützt. Wir danken den von HGGs betroffenen Kindern und Familien für ihre Beiträge zu dieser Forschung und ihre Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
| Cortical Glutamatergic Neurons | BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | - | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
References
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