Summary
単粒子のクライオ電子顕微鏡では、高スループットの自動データ取得に適したソフトウェアパッケージとユーザーフレンドリーなパイプラインが必要です。ここでは、完全に自動化された画像取得ソフトウェアパッケージLatitude-Sの応用と、低線量条件下でのガラス化生体分子のデータ収集のための実用的なパイプラインを紹介する。
Abstract
過去数年間、単粒子クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)の技術と方法論的進歩は、生物学的高分子の高解像度構造決定のための新しい道を開きました。クライオEMの著しい進歩にもかかわらず、単粒子分析ワークフローの様々な側面において改善の余地が依然として存在する。単粒子分析では、高スループットの自動データ取得に適したソフトウェアパッケージが必要です。過去8年間に単粒子クライオEM用の自動イメージング用に、いくつかの自動データ取得ソフトウェアパッケージが開発されました。本論文は、低用量条件下でのガラス化生体分子に対する完全自動画像取得パイプラインの適用を提示する。
これは、cryo-EMデータを完全、自動的、および正確に収集できるソフトウェアパッケージを示しています。さらに、さまざまな顕微鏡パラメータは、このソフトウェアパッケージによって容易に制御されます。このプロトコルは、直接電子検出器(DED)を搭載した200 keVクライオ電子顕微鏡を用いた重症急性呼吸器症候群-コロナウイルス2(SARS-CoV-2)スパイクタンパク質の自動イメージングにおけるこのソフトウェアパッケージの可能性を示しています。1回のセッション(48時間)で約3,000枚のクライオEMムービー画像を取得し、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質の原子分解能構造を生み出しました。さらに、この構造研究は、スパイクタンパク質が開いた1-RBD(受容体結合ドメイン)およびすべてのRBD閉鎖された立体構造の2つの主要な立体構造を採用することを示している。
Introduction
単粒子クライオEMは、生体高分子の高分解能構造決定のための主流の構造生物学技術となっています1。単粒子の再構築は、2次元(2D)粒子画像を抽出するために膨大な数のガラス化サンプルの顕微鏡写真を取得することに依存し、その後、生物学的高分子の3次元(3D)構造を再構築するために使用されます。DEDの開発前に、単粒子の再構成から達成された分解能は4から30Å4,5の範囲に及んだ。最近、単粒子クライオEMからの達成可能な解像度は1.8 Å6を超えています。DEDおよび自動データ収集ソフトウェアは、データ収集のための人間の介入が最小限に抑えられるこの解決革命7の主要な貢献者となっています。一般に、クライオEMイメージングは、低電子線量率(20-100 e/Å2)で行われ、生体試料の電子ビームによる放射線損傷を最小限に抑え、画像内の低信号対雑音比(SNR)に寄与します。この低いSNRは、単粒子分析を用いた生体高分子の高分解能構造の特性解析を妨げる。
新世代の電子検出器は、CMOS(相補的な金属酸化物半導体)ベースの検出器で、これらの低いSNR関連の障害を克服することができます。これらの直接検出CMOSカメラは、カメラが優れた点広がり機能、適切なSNR、および生体高分子のための優れた探偵量子効率(DQE)に寄与するため、信号の高速読み出しを可能にします。直接検出カメラは、記録された画像に高いSNR8と低ノイズを提供し、その結果、検出器が画像にどれだけのノイズを追加するかを測定する探偵量子効率(DQE)の定量的な増加をもたらします。これらのカメラは毎秒数百フレームの速度で映画を録画し、高速データ取得を可能にします 9,10.これらの特性はすべて、低線量のアプリケーションに適した高速直接検出カメラを作ります。
動補正スタック画像は、RELION11、FREALIGN12、cryoSPARC13、cisTEM14、EMAN215などの様々なソフトウェアパッケージを使用して、2D分類を計算し、高分子の3D密度マップを再構築するためにデータ処理に使用されます。ただし、単一粒子解析では、高解像度の構造を実現するためには膨大なデータセットが必要です。したがって、自動データ取得の通行料は、データ収集に非常に重要です。大規模なクライオEMデータセットを記録するために、過去10年間にいくつかのソフトウェアパッケージが使用されてきました。AutoEM16、AutoEMation17、Leginon18、SerialEM19、UCSF-Image420、TOM221、SAM22、JAMES23、JADAS24、EM-TOOLS、EPUなどの専用ソフトウェアパッケージが自動データ取得用に開発されています。
これらのソフトウェアパッケージは、低倍率画像を高倍率画像に相関させることによって、自動的に穴位置を見つけるためにルーチンタスクを使用し、低線量条件下で画像取得のための割り当て氷の硝子体氷で穴を識別するのに役立ちます。これらのソフトウェアパッケージは、繰り返しのタスクの数を減らし、オペレータの物理的な存在を中断することなく、数日間連続して高品質のデータの膨大な量を取得することにより、クライオEMデータ収集のスループットを向上させます。Latitude-S は、単一粒子分析のための自動データ収集に使用される同様のソフトウェア パッケージです。しかし、このソフトウェアパッケージはK2/K3 DEDsにのみ適しており、これらの検出器を備えています。
このプロトコルは、200 keV cryo-EMを搭載した直接電子検出器を備えたSARS-CoV-2スパイクタンパク質の自動画像取得におけるLatitude-Sの可能性を示しています( 材料表を参照)。このデータ収集ツールを使用して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の3,000のムービーファイルが自動的に取得され、さらにデータ処理が行われ、3.9-4.4Å分解能スパイクタンパク質構造を得ます。
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Protocol
注:クライオEMデータ収集には、1.cryo-EMグリッドの準備、2.顕微鏡のキャリブレーションとアライメント、3.自動データ収集の3つの重要なステップが必要です(図1)。さらに、自動データ収集は、適切な領域選択、b.の最適化、緯度-S、c.開始自動穴選択、およびd.開始自動データ収集に細分化されます(図1)。
1. 自動データ取得のためのCryo-EMグリッドの準備とサンプルローディング
- グロー放電器を使用してグリッドを清掃し、実験要件に基づいてグロー放電パラメータを変更します(ここでは、20 mAで60 s)。
- 作りたてのタンパク質サンプル(3 μL)をグロー放電グリッドに加え、10秒インキュベートします。
- 湿度100%で3-5sのグリッドをブロットし、すぐにクライオプランジャーを使用して液体エタンに突っ込みます。
- グリッドをクリップリングに手動でクランプし、フレキシブルなCクリップリングを使用してカートリッジを形成します。
- 冷凍カートリッジ取り付けされたグリッドをオートローダーカセットにロードし、ナノキャップでカセットを顕微鏡のプリクールオートローダーに転送してデータ収集します。
2. 自動データ取得前の顕微鏡のチューニングと基本的なアライメント
- ビームシフト
- [直接配置]タブから[梁シフト]をクリックします。
- 倍率を下げ、 多機能 X および Y ノブを使用して光軸にビームを中央に配置します。
- ピボット ポイントの配置
- [直接配置]タブの[位置合わせ]の[X]で、[ビームチルト]オプションをクリックします。
- ビームをスポットに凝縮し、 多機能 X および Y ノブを使用して動きを最小限に抑えます。
- C2絞りセンタリング
- [配置]タブからコンデンサ絞りを選択します。
- ビームをスポットに凝縮し、ビームを光軸に中央に配置し、ビームを拡大して円を均等に覆います。
- コンデンサ2絞りが調整されるまで、これらの手順を繰り返します。
- コマフリーアライメント
- [直接配置]タブから[コマなしの位置合わせ X]をクリックして、ビームを光軸に位置合わせします。
- 多機能ノブを使用して、FFTの形状と動きを最小限に抑えます(安定していることを確認してください)。
- コマ - フリーアライメント Y についても同じ手順を繰り返します。
- Cツインレンズのため、クライオEMでデータ収集の前に平行光を設定します。
- 目的開口(70 μm)を回折モードで挿入します。
- 焦点が強いノブ(対物レンズとC2レンズ電流)を制御して、回折レンズの前面焦点面に目的開口を焦点を合わせます。
- 適切な焦点を下した後、客観的な絞りの鮮明なエッジが見えるようにしてください。
- ビームストッパーを挿入し、金粉回折リングが最小化されるまで強度を広げます。
注:ビームが適切に広がっていれば、金色の粉末の透明な回折リングが画面に表示され、ビームが平行であることを示します。 - 平行照明を設定した後、ビームストッパーを引き込み、顕微鏡モードを ナノプローブに変更します。
メモ:データ収集を開始する前に、顕微鏡のチューニングを確認して、顕微鏡の最適な性能を確認してください。これらの設定はすべて、顕微鏡の ダイレクトアライメントGUI タブで行われます。すべての顕微鏡のチューニングは、データ収集の前にテストグリッドを使用して行われます。
3. 緯度Sによるデータ取得
- Latitude-S 自動データ取得ソフトウェアを起動します。
注:Latitude-Sのインストールには、データ収集前に実行される顕微鏡キャリブレーションも必要であり、設定は永久に保存されます。データ収集の 5 つの異なる状態は、4 つの異なる倍率で調整されます (図 1 および 図 2)。アトラス状態とグリッド状態は、LMモード(低倍率範囲)で2つの異なる倍率にあります。穴の状態は SA モード (高倍率の範囲) ですが、適度な拡大率で表示されます。フォーカスとデータの状態は、高倍率 SA モードを使用します。- [スタート]メニューから[デジタルマイクログラフ]をクリックするか、デスクトップのDigitalMicrographアイコンをダブルクリックします。
- デジタルマイクログラフからテクニックマネージャアイコンを選択します。
注: このシステムには 、TEM と 緯度 S の アイコンが表示されます (図 2 および 図 S1 の補足図)。 - 単一粒子自動データ収集の [緯度-S ]アイコンを選択します。
メモ:K2カメラは、リニア/統合、カウント、超解像度の3つのモードで動作します。ユーザーは 、DigitalMicrographのインターフェースで任意のモードを選択できます。データ イメージは、線量分数画画像スタックとして保存することも、異なるビット深度の MRC、TIF、.dm4 ファイルの合計画像として保存することもできます。さらに、データはK3カメラの動き補正画像として保存することができます。K2 カメラでは、未処理のイメージ スタックを 4 ビット MRC、8 ビット TIF、または 8 ビットの .dm4 ファイルとして保存できます。
- 前のセッションの設定に基づいて新しいセッションを作成します。
- パレットの「 前のセッションに基づく 」チェックボックスをオンにします。
- [ 新規作成 ] ボタンを選択します。
- 新しいセッションの設定の基になるセッションを含むフォルダを選択します。前のセッションディレクトリに移動して、新しいセッションを作成します。新しいセッションと関連データを保存するフォルダを選択します。
- 新しいセッションと関連データを保存するフォルダを選択して選択します。
注: 各状態とその下にある設定(拡大、照明条件、イメージ、またはプロジェクター)とビームシフトとカメラパラメータ(総露出、単一フレーム露出、およびビニング)は、既存のセッションから新しいセッションにエクスポートされます。フォルダのパスは、パレットの下部にテキスト文字列として表示されます。各状態パレットと構成パレットには、タイトルにアスタリスク (*) が付加され、既に設定されており、使用できる状態であることを示します。
- 既存のセッションを続行します。
- パレットの 「続行 」ボタンを押して、既存のセッションを続行します。
注: アトラスモンタージュは変更できません。 - 続行する必要があるセッションを含むフォルダーを選択して、ナビゲートします。
- パレットの 「続行 」ボタンを押して、既存のセッションを続行します。
- まったく新しいセッションを開始します。
- パレットの [新規]タブ をクリックします。継続するセッションが含まれているフォルダーを選択します。データを保存するフォルダを選択します。
注: 既定のフォルダー名は、日付と時刻を使用して作成されます。 - [設定]アイコンをクリックします。表示される [状態の管理] 探索ボックスで、状態を追加し、TEM 条件、カメラの状態、およびイメージ/スタックを設定し、状態に名前を付けます。
注: 自動データ取得ワークフローでは、自動データ収集に 5 つの異なる状態が使用されます。これらの状態は、それぞれの状態パレットで構成および保存されます。状態の概要は 表 1 に示されています。
- パレットの [新規]タブ をクリックします。継続するセッションが含まれているフォルダーを選択します。データを保存するフォルダを選択します。
- アトラス状態を設定します。
- アトラス状態パレットをクリックします。
- ナノプローブの拡大115x LMモード、照明条件スポットサイズ8、明るさ934400、ビニング:1とカメラ露出時間:低倍率での撮像時間:1.0 sのパラメータでアトラス状態を設定します。 表 1 に示す状態の概要を参照してください。
- 次の状態に移動するには、[ 次へ ]をクリックします。
注: アトラス状態は最も低い倍率状態で、グリッド全体の調査を提供します(補足図 S2)。一般的に、この状態は、低倍率でグリッド全体を視覚化し、氷の厚さ、平坦度、およびグリッドの壊れた正方形を判断するのに役立ちます。グリッドの異なる領域にアトラスを生成して、最適な氷の厚さとグリッドの最適でない氷の厚さを観察することをお勧めします(補足図S3)。上記のパラメータは、ユーザーのニーズに応じて変更できます。
- グリッド状態を構成します。
- グリッド状態パレットをクリックします。
- 次の顕微鏡イメージング光学(ナノプローブの拡大380x LMモード)、照明条件(スポットサイズ:8と明るさ626,200)、ビニング:1とカメラ露出時間:1.0 sでグリッド状態を設定します。
- 表 1 に示す緯度-S の状態の概要を参照してください。
- 次の状態に移動するには、[ 次へ ]をクリックします。
注: グリッドの状態は、視野が 1 つのグリッド四角形になるように、アトラス状態よりも高い倍率で設定されます(図 2)。この特定の倍率では、1つのグリッド四角形が観察される。したがって、穴は、穴の氷の厚さを確認するのに役立つこの倍率で正しく観察されます(補足図S4)。シンプルなバンドパスフィルタは、パテントグリッドの穴を見つけるためにグリッド状態で使用されます。上記のパラメータは、ユーザーのニーズに応じて変更できます。
- 穴の状態を設定します。
- 穴パレットをクリックします。
- 穴の状態を次の顕微鏡設定で設定します:イメージング光学(ナノプローブの拡大4500x SMモード)、照明条件(スポットサイズ:7とビーム直径8.81μm)、ビニング:1とカメラ露出時間:1.0 s。
- 必要に応じて、グリッドの種類に基づいてパラメータを変更します。 表 1 に示されている状態の概要を参照してください。
- 次の状態に移動するには、[ 次へ ]をクリックします。
注: SA モードは、電子顕微鏡の高倍率範囲を示します。穴の状態は、数マイクロメートル(10〜20 μm)の視野を持つSA倍率範囲内にあります(図2 および 補足図S4)。この倍率の範囲は、アトラスまたはグリッドの状態よりも高いが、フォーカス/データ状態よりもはるかに小さいです。この倍率では、個々の穴が表示されます。穴のサイズは、汚染の高い度、空の穴、および穴の適切な氷の厚さを観察するのに適しています。イメージング用の穴は、これらの仮定に基づいて選択されます。穴の状態では、1 つは新しい穴イメージと穴参照イメージを相互に関連付け、もう 1 つはステージの高さをユーセントリック高に調整するフィルタです。
- フォーカス状態を構成します。
- フォーカスパレットをクリックします。
- 焦点状態を次の顕微鏡設定で設定します:イメージング光学(ナノプローブの拡大45,000x SAモード)、照明条件(スポットサイズ:8と明るさ934400)、ビニング:1とカメラ露出時間:1.0 s。
- 穴の近くのアモルファスカーボン領域に焦点を当てます。 表 1 に示す緯度 S の状態の概要を参照してください。
- 次の状態に移動するには、[ 次へ ]をクリックします。
注: SA モードは、電子顕微鏡の高倍率範囲を示します。フォーカス状態は、SA 範囲の倍率が高くなります。フォーカスモードでは、ビームはターゲットホールの近くのカーボン領域にシフトされ、自動的にフォーカスを実行してデータ状態のデータを収集します。焦点状態では、ハンニングまたはソフト長方形のフィルタと組み合わせたバンドパスフィルタを使用して、同じ領域の2つのフォーカス状態画像間のオフセットを測定します(図2)。上記のパラメータは、ユーザーのニーズに応じて変更できます。
- データ状態を構成します。
- データ パレットをクリックします。
- 画像化光学(例えば、ナノプローブのSAモードで倍率28,000x、45,000x、54,000倍)、照明条件(スポットサイズ:8と明るさ934400)、ビニング:1とカメラ露出時間:1.0 sのイメージング光学を使用してデータ状態を構成します。
- 表 1 に示す緯度-S の状態の概要を参照してください。
- 次の状態に移動するには、[ 次へ ]をクリックします。
注: データ状態は、ピクセル サイズの要件とターゲット解像度に基づいて選択される最大の倍率です(図 2)。一般に、焦点を合わせた後、ビームは自動的にターゲット領域に移動してデータを収集します。上記のパラメータは、ユーザーの要件に基づいて変更できます。
4. フォーカス構成
- [フォーカス]設定パレットをクリックします。指定したタブで、フォーカス解除の値の範囲とステップサイズを指定します。
- [次へ] ボタンを押して、次のステップに進みます。
注: 低いデフォーカス値は、高解像度のデータ取得に使用できます。一般に、0.25または0.5デフォーカスステップサイズの-0.5~-3.0 μmのデフォーカス値は、画像取得に使用されます。サンプルをスクリーニングするだけの場合は、フォーカス設定の手順を省略できます。パレットの Next ボタンを押すだけで、フォーカス設定のステップをスキップします。
5. 細かいアライメント
- グリッド上のいくつかの機能(例えば、氷の汚染六角形の氷)に焦点を当てます。 図3を参照してください。
注: 機能は大きすぎたり小さすぎたりしないでください。これらは、アトラス状態拡大115x(LAモード)とデータ倍率の両方で表示される必要があります。 - [ キャプチャ ]ボタンをクリックします。異なる状態の各イメージ上の同じフィーチャに赤い十字マークを配置します。
- 視野がアトラスとグリッドの状態よりもはるかに大きいため、フォーカス、データ、穴の状態から始めます。アトラスとグリッドの状態を拡大して、アトラスとグリッドの状態の同じフィーチャに赤い十字マークを配置します。
- [計算]ボタンをクリックして、5つの異なる状態の位置を計算し、各状態間のオフセットを計算し、出力ウィンドウに反映します。
注: オフセット値は、さらに使用するためにステートに統合されます(図 3)。細かなアライメントが各状態の位置の精度を高くするために行われる(図3)。この細かい配置は、5 つの状態すべてで正確な位置を特定するのに役立ちます。 細かい位置合わせは 、単一粒子データ集録に不可欠です。そのため、イメージングの前にファインアライメントを実行することを強くお勧めします。
6. 緯度Sを用いたデータ取得手順
- キャプチャ パレットをクリックします。
注: 一般的に、アトラスデータは低倍率(115x)で収集され、グリッドの大部分を視覚化します。 - 要件に基づいてグリッド全体またはグリッドの一部をカバーするアトラスのサイズを選択します(例えば、6 x 6、8 x 8、12 x 12、6 x 8、8 x 6、12 x 8、または8 x 12)。
注: 16 から 16 アトラスサイズはグリッド全体をカバーします。 - [キャプチャ]ボタンをクリックして、アトラスをキャプチャします。
注: メインの Latitude-S ナビゲーション ウィンドウが開き、DigitalMicrograph の使用可能なスペースがいっぱい表示されます (補足図 S5)。メイン ナビゲーション ウィンドウの 3 つのピクチャ ウィンドウには、3 つの異なる倍率でシステム状態のイメージが表示されます。現在、全体のアトラスは、現在の取得状態で一番左側のペインに表示されます。各キャプチャが発生すると、アトラス内のタイルがいっぱいになります。 - アトラス上を移動して氷の厚さに基づいてグリッドの正方形を選択します(補足図S5)。目的のグリッドの正方形を選択したら、[ スケジュール ]ボタンをクリックし、グリッドの正方形がキャプチャされるごとに、グリッドの正方形のタイルがいっぱいに表示されます。
- グリッドの正方形を選択したら、[ スケジュール ] ボタンをクリックします。
- グリッドの位置を追加して、グリッドの正方形の代表穴を選択します。穴の画像を取得したら、データとフォーカス位置を定義し、レイアウトをテンプレートとして保存します(補足図S6)。
- [自動検索]をクリックし、穴のサイズ(R1.2/1.3など)を指定し、プログラムの[検索]ボタンをクリックすると、自動的に穴の直径に基づいて穴が見つかります。次に、[マーク] ボタンをクリックしてテンプレートを追加し (図 4)、1 つのグリッドまたは部分的なグリッドの四角形のすべての穴に赤い円マークを追加します。
- グリッドの正方形と氷の汚染から穴を取り除く強度を設定します(図4)。
注: 最後に、選択した穴はデータ収集のスケジュールに黄色でマークされます。 - [自動検索]を通じて穴を追加した後、Latitude タスクの[スケジュール]ボタンをクリックします。
注: 自動データ収集をスケジュールする前に、液体窒素タンクのレベルが十分で、オートローダー ターボポンプがオフで、RAID ドライブの空き容量があることを確認してください。Latitude-S タスク マネージャーは、データ収集にスケジュールされたアトラス、グリッドの正方形、穴、およびデータの状態の数を示します (図 5)。Latitude-S GUI では、さまざまな配色が表示され、異なる配色の意味が表示されます。2. 緑はスケジュールを示します。3. 青は取得済みであることを示します。4. 赤は失敗したことを示します。
7. クライオEMデータ処理
注:スパイクタンパク質のCryo-EM画像処理は、最近の文献25に詳述されている。
- RELION 3.011を用いてSARS-CoV2のスパイクタンパク質の画像処理を行う。
- Latitude-Sを使用して収集したムービー画像を手動でスクリーニングし、MotionCor2ソフトウェア9を使用して個々の映画のビーム誘発モーション補正を行います。cisTEMソフトウェアパッケージ14の助けを借りて、モーション補正された顕微鏡写真の初期スクリーニングを手動で行います。
注:自動取得された顕微鏡写真のほぼ85%は良好な品質であり、データはcisTEMソフトウェア14 (補足図S7A、B)を使用して計算される3.7-5.2 Å内の信号を持っていました。 - RELION 3.0 ソフトウェア パッケージ11を使用してデータを処理します。
- スパイクパーティクルを手動で選択し、2D クラス分類(補足図 S7C)に適用します。RELION 自動ピック ツール 11 を使用して、マイクログラフから 3,99,842 個のシングルスパイク パーティクルを自動ピックするためのリファレンスとして、最適な 2D クラスを使用します。
注:3D分類の3ラウンドは、粒子を3D分類にする前に行いました(補足図S8)。3D分類のために約2,55,982個の単一粒子が選択され、データセットは6つのクラスに分類されました。最終的な3D自動改良は、最高のクラスで行われました。85,227のスパイク粒子が3D分類から得られた。 - 自動改良後、解像度を向上させる適切なビームチルトパラメータを使用して、パーティクルごとに焦点を合わせ解除するリファインを実行します。次に、RELION 3.0ソフトウェアパッケージ11を用いて、ベイジアン研磨に粒子を供する。最後に、RELION 3.011 を使用して、別の 3D 自動細分化のラウンドに対して、ポリッシュパーティクル セットを使用します。
- スパイクパーティクルを手動で選択し、2D クラス分類(補足図 S7C)に適用します。RELION 自動ピック ツール 11 を使用して、マイクログラフから 3,99,842 個のシングルスパイク パーティクルを自動ピックするためのリファレンスとして、最適な 2D クラスを使用します。
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Representative Results
現在のパンデミック状況では、CRYO-EMはSARS-CoV-226-226,27,28,29の様々なタンパク質の構造を特徴づける上で重要な役割を果たしており、ウイルスに対するワクチンや薬剤の開発に役立つ可能性があります。2019年のコロナウイルス病に対抗するために、限られた人材を持つ迅速な研究努力が急務です。単粒子クライオEMでのデータ取得は、高分子の構造決定において時間がかかりますが、重要なステップです。クライオEM自動データ取得の最近の発展は、データ収集における限られた人間の干渉を可能にしました。Latitude-S ソフトウェアは、精製された SARS-CoV2 スパイクタンパク質の自動データ収集にここで使用される重要な自動データ取得ソフトウェア パッケージです。
SARS-CoV-2スパイクタンパク質のクライオEMデータ取得は、K2サミットDEDを搭載した200keVクライオEMで行った。望ましい氷の厚さと粒子分布を持つグリッド上のデータ取得の位置は手動でマークされました。バックグラウンドで発生するデータ取得中に、ポジションは並行してマークされました。マークされた位置で、Latitude-Sソフトウェアは、検体レベルで1.17 Åのピクセルサイズで42,200倍の公称倍率で自動データ取得を行いました。42,200 倍倍のデータ収集の構成は事前に設定されており、既にテスト済みでした。8 sの合計40フレームが記録され、1フレームあたり2 e/Å2の電子線量が記録されました。したがって、データ収集には合計80 e-/Å2が使用されました(補足図S9)。データは-0.75 μmおよび−2.25 μmの焦点脱焦点範囲で取得され、2日間で3,000個のムービーファイルが収集されました。4時間ごとに、定期的なチェックと調整が行われ、48時間にわたって収集されたすべてのムービーファイルが良好な品質であり、ビームシフトやアライメントシフトがないことを確認しました。データは、人間の介入なしに独立して収集されました。さらに、Latitude-Sは液体窒素充填時に自動的にイメージングを停止し、画像の不必要な振動や機械的なドリフトを低減します。
プロトコルセクションで述べたように、動き補正された顕微鏡写真の初期スクリーニングは、cisTEMソフトウェア14を用いて手動で行った。スクリーニングに基づいて、データの大部分は3.7-5.2 Å(補足図S7A)の信号範囲内にあることが判明した。これは、Latitude-S を使用した自動データ収集が良好であり、データのほとんどが高解像度の 3D 再構築に適していることを示唆しています。さらに、画像を焦点外範囲(-0.75~-2.25μm)で収集し、cisTEM14によって様々な焦点外の範囲を手動で確認した。取得したデータは、Latitude-S のセットアップの焦点解除範囲に非常に近かった (補足図 S7A,B)。
データ処理はRELION 3.0ソフトウェアパッケージ11を用いて行った。スパイク粒子は手動で選択され、2D クラスの平均を計算しました。2Dクラス平均(補足図S7C)には様々な構造詳細(らせんおよびβシート)が表示され、このデータセットを使用して高解像度の構造特性を可能とすることを強く示唆しています。しかし、3D分類は、スパイクタンパク質が1受容体結合ドメイン(RBD)を開き、すべてのRBDが閉じた立体構造を閉じていることを示している(補足図S8)。3D 分類は、クラス 1 に最大数のパーティクルが含まれており、1-RBD アップ オープンコンフォメーションとして表示されることを示します。さらに、クラス3とクラス4は、粒子の数が似ており、両方のモデルは、すべてのRBDが密接な立体構造を持っているように見えました。しかし、クラス5は、1-RBDが中間位置にある中間的な立体構造を示す。しかし、スパイクタンパク質の1-RBDアップ開いた立体構造をC1対称性を用いて再構築し、全体的な分解能は4.4Å(図6 および 補足図S10)である。同様に、すべてのRBDダウン近接立体構造(クラス3およびクラス4)をC3対称性とともに改良し、0.143 FSCの総合分解能は〜3.9Å(図7)であった。
全体的な画像処理は、スパイクタンパク質がすべてのRBDを近接し、1-RBDを採用していることを示しています。さらに、スパイクタンパク質の中間立体構造を同定し同定した。スパイクタンパク質のS2サブドメインの高解像度のクライオEM構造は、個々のアミノ酸残基の側鎖を示す(図6B および 図7C)。すべての3D再構成とクライオEMの結果は、最近発表された文献25の所見と非常によく似ています。しかし、スパイクタンパク質の高解像度のクライオEM構造は、自動クライオEMデータ取得プロトコルと自動粒子ピッキングソフトウェアのためにのみ可能である15日以内に特徴付けられました。したがって、緯度Sを含む自動データ取得ソフトウェアパッケージは、生物学的高分子のいくつかの高解像度クライオEM構造の特性評価に大きく寄与する可能性があります。
図1:Latitude-Sを使用した自動データ取得のワークフロー: データ収集の前に実行する一般的な手順 (グリッドの準備、サンプルの読み込み、および顕微鏡の調整)。データ取得はこの原稿の主要部分であり、データ取得中に続くパイプラインが強調表示されます。略語: クライオEM = クライオ電子顕微鏡. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: DM3 ソフトウェア スーツでデータを取得するための Latitude-S GUI(A) Latitude-S ソフトウェア パッケージを使用した単一粒子データ収集の異なる状態の設定(B) データ取得手順のワークフロー。(C) 各パネルの拡張。略語: GUI = グラフィカル ユーザー インターフェイス。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:焦点を合わせ、画像取得のために高精度を設定するための微調整配置。 微調整は、A. アトラス、b. ホール、c. データ、d. グリッド、e. フォーカスの 5 つの状態に対して実行されます。赤いマークを同じ位置に配置して、各状態に焦点を合わせます。新しいセッションを開始する前に 微調整アライメント を実行することを強くお勧めします。特定の位置での画像取得(大きなシフトなし)は、細かな位置合わせの精度に完全に依存します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:緯度-Sを使用した穴の自動選択 データ取得のための穴の自動検索は、穴のサイズに基づいて自動的に行われます。(A) 穴を自動検索するための穴検出ベクトルの位置を示します。スケールバー= 20 μm(B)穴検出ベクトルを使用し、強度を調整して境界領域と氷の汚染からマーカーを除去する穴のマーキングを示します。スケールバー= 20 μm(左)と10 μm(中央)(C)は、撮像用穴の自動追加(黄色)を示す。スケールバー= 20 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:データ取得のライブビュー(A)各ポジションのデータ取得状況に基づいて、黄色、緑、青、赤でマークされています。(B) データ取得の状態を監視するためのカラーコード。緑: スケジュール済み, 黄色: 予定外, 青: 取得, 赤: 失敗しました.左側のパネルには、緑色の穴(予定)と青(取得)を示すいくつかの穴が表示されます。スケールバー= 10 μm中央のパネルには、個々の穴の 4,300 倍の倍率が表示されます。この穴の図(中央パネル)では、青い四角形のボックスがフォーカス領域を示し、緑色の四角形のボックスはイメージング領域を示しています。スケール バー = 1000 nm。右のパネルには、取得した画像が表示されます。右端のパネルには、スケジュールされた画像番号、イメージングに必要な合計時間、イメージングの予定値が表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:1RBDを開いたスパイク3Dモード。 (A) 1-RBDアップオープンの自動精製およびシャープスパイクタンパク質マップは、側面、上、および底面図で表されます。(B)EMマップは、サイドチェーンのより良い視覚化のための結晶構造を取り付けています。マップ内でハイライト表示された領域には、サイド チェーンの密度があります。略語: 3D = 3 次元;RBD = 受容体結合ドメイン;EM = 電子顕微鏡;NTD = N- ターミナル ドメイン;S1 = サブユニット 1;S2 = サブユニット 2. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:すべてのRBDは、スパイクタンパク質の近い立体構造を閉じる。 (A)側面および上部図に示される全RBDダウン近接立体構造の自動精製およびシャープスパイクタンパク質マップ。(B)EMマップは、サイドチェーンのより良い視覚化のための結晶構造を取り付けています。矢印は、マップ内の領域にサイド チェーン(C)の密度があることを示しています。略語: RBD = 受容体結合ドメイン;EM = 電子顕微鏡;NTD = N- ターミナル ドメイン;S1 = サブユニット 1;S2 = サブユニット 2. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 S1: 緯度-S 画像取得 GUI: 様々な顕微鏡コントローラ(例えば、カラムバルブオープン/クローズ、スクリーンインサート/リトラクトは、Latitude-S GUIによって制御されます。左パネルでカラムバルブ、カメラ、スクリーンステータス、液体窒素充填を制御できます。このパネルの下部には、さまざまなキャリブレーションパラメータが緑色に表示されます(例えば、倍率、ビームチルト、客観的な焦点)。いずれかのパラメーターが黒で表示されている場合は、パラメーターが正しく最適化されないことを示します。したがって、新しいセッションを開始する前に、すべてのパラメーターを最適化する必要があります。略語: GUI = グラフィカル ユーザー インターフェイス。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:アトラス状態の表現 グリッドの正方形と形成された氷の種類を示す異なるアトラス状態。(A-F)アトラスの様々なサイズもハイライトされています。(A、B、D、F)厚い氷のパターンが強調表示されます。(C、D)壊れた四角形が強調表示されます。厚い氷と壊れた領域(図で示されている)は、イメージングには適していません。(E、F)イメージングに適したグリッド正方形。A、B、C、D、およびFは、高解像度イメージングに適したグリッド四角形を示す。ただし、厚い氷グリッドの正方形と壊れたグリッドの正方形は除外する必要があります。スケールバー=100 μm(A-C)、50 μm(D、E)、25 μm(F)このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 S3: グリッド状態とホール状態の表現。 グリッド状態と対応する穴の状態がイメージに表示されます。(A、E)空孔は、(F、G)厚い氷、(E)氷の汚染、および(A、B、C、D、E、およびG)に適した氷の厚さが画像に示される。適切な氷の厚さの穴は、画像取得(A、B、C、D、E、およびG)に選択されます。スケールバー=10μm(A、E、F、G)、2μm(B)、50μm(C)、5μm(D)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S4:自動イメージング用穴参照。 穴のイメージ(QUANTIFOIL-穴あきカーボングリッドQUANTIFOIL R 1.2/1.3)は、キャプチャされ、将来の参照のために保存されます。穴参照のサイズは、グリッドの種類によって変わります。新しいセッションを開始する前に、穴の参照を常にキャプチャすることをお勧めします。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S5:様々な倍率および穴選択での画像キャプチャパネル。 (A) キャプチャパネルにデータ取得の設定が表示されます。(B) Latitude-S のメイン ナビゲーション ウィンドウには、3 つの連続した拡大率が表示されます。アトラス状態(150x)では、グリッドの正方形がデータ取得用に選択されます(左側のパネル、スケールバー= 50μm)。高倍率(380x)では、1つの正方形が焦点を合わせます(中央パネル、スケールバー= 20 μm)。さらに高い倍率(4,300x)、各正方形の内側の穴が焦点を合わせられます(右側のパネル、スケールバー= 5 μm)。ただし、これらの倍率はグリッドのサイズと形状に応じて変化します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 S6: 穴の選択とイメージングのためのテンプレートの作成 テンプレート生成は、データ用の穴に位置を追加することによって行われ、焦点はカーボン表面の穴に隣接して配置されます。ビーム直径が隣接する穴に触れないように、焦点はカーボン領域に位置する必要があります。スケールバー=20 μm(左パネル)、10 μm(中央パネル)、1000 nm(右パネル)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S7:緯度Sと画像スクリーニングを用いたSARS-CoV2のクライオEMイメージング (A) 取得した顕微鏡写真のスクリーニング:1D CTF適合、2D CTF適合、およびCTFパラメータcisTEMを用いたSARS-CoV2スパイクタンパク質データの推定1D CTFフィットおよびトンリングは、全体の信号が4.8Åであることを示しています。スケール バー = 50 nm。(C) 最終2Dクラス平均。2Dクラス平均は、スパイクタンパク質の上、下、および側面のビューを示しています。高解像度の詳細はすべて、2D クラス平均で表示されます。略語: クライオEM = クライオ電子顕微鏡;1D = 1 次元;2D = 2 次元;CTF = コントラスト伝達関数;SARS-CoV2=重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S8:Latitude-Sソフトウェアを用いて取得したSARS-CoV2スパイクタンパク質データのデータ処理画像は、スパイクタンパク質のクライオEMデータを処理するためのワークフローを示しています。スパイクタンパク質の3D分類は、Relion 3.0を用いて行われる。クラス1は、1-RBDアップオープン立体構造を示しています。クラス3およびクラス4は、スパイクタンパク質の全てのRBDが閉じた立体構造を示す。クラス5は、スパイクタンパク質の中間立体構造を示す。略語: クライオEM = クライオ電子顕微鏡;3D = 3 次元;RBD = 受容体結合ドメイン;SARS-CoV2=重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S9:最終画像取得の基準として撮影した線量分画画像。線量分画画像は、8.0 s露光と0.2秒/フレーム露光で撮影されます。カメラの近くにある 自動保存 ボタンをクリックすると、ムービーファイルが自動的に保存されます。画像取得後、画像をクリックし、データ収集状態の 画像更新 ボタンを使用して線量分画画像パラメータを保存します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S10:生成されたSARS-CoV-2 1 RBDの角分布とフーリエシェル相関は、開いた立体構造スパイクタンパク質マップ。 (A)スパイクタンパク質の開いた立体構造を1-RBDアップの最終3Dモデルの角分布。青は低い値を表し、赤は正規化されたパーティクル分布の高い値を表します。(B)フーリエシェル相関曲線は、スパイクタンパク質の1-RBDアップ開いた立体構造の4.4Å分解能を示し、カットオフで推定した。略語: 3D = 3 次元;RBD = 受容体結合ドメイン;SARS-CoV2=重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2;FSC = フーリエシェル相関。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
| アトラスイメージの状態 | アトラス 115 |
| 拡大 | 115,ピクセルサイズ 34.7 nm |
| 示されたデフォーカス | 4.38 mm |
| スポットサイズ | 8 |
| 明るさ | 934400 |
| モード | イメージングイルム |
| ビニング | 1 |
| 露光時間 | 1.0 s |
| グリッド調査の状態 | グリッド 380 |
| 拡大 | 380,ピクセルサイズ 11.2 nm |
| 示されたデフォーカス | 2.37 mm |
| スポットサイズ | 8 |
| 明るさ | 626200 |
| モード | イメージングイルム |
| ビニング | 1 |
| 露光時間 | 1.0 s |
| 穴調査の状態 | 穴3400 |
| 拡大 | 3,400,ピクセルサイズ1.20 nm |
| 示されたデフォーカス | -0.75 μm |
| スポットサイズ | 7 |
| ビーム直径 | 8.81 μm |
| モード | イメージングイルム、SA、Mh |
| ビニング | 1 |
| 露光時間 | 1.0 s |
| フォーカス状態 | フォーカス45k |
| 拡大 | 45,000, ピクセルサイズ 0.0924 nm |
| 示されたデフォーカス | 4.51 μm |
| スポットサイズ | 6 |
| ビーム直径 | 0.716 μm |
| モード | イメージングイルム、SA、Mh |
| ビニング | 1 |
| 露光時間 | 1.0 s |
| アキシション状態 | データ 45k |
| 拡大 | 45,000, ピクセルサイズ 0.0924 nm |
| デフォーカス設定 | 最小:-4,500 nm、最大:-1,500 nm、ステップ:250 nm |
| スポットサイズ | 6 |
| ビーム直径 | 0.752 μm |
| モード | イメージングイルム,SA,Mh |
| ビニング | 1 |
| 露光時間 | 20 フレームの合計 8 s エクスポージャー |
| カメラのセットアップ | カウント、ゲイン正規化、欠陥修正 |
| データ保存の設定 | MRC |
表 1: 緯度-S 状態の設定の概要
| 仕様 | K2ベース | K2サミット |
| TEM動作電圧 | 200-400 kV | |
| センサーのアクティブ領域 | 19.2 mm × 18.6 mm | |
| センサーサイズ (ピクセル単位) | 3838 × 3710 | 7676 × 7420 スーパー- 解決 |
| 物理アルピクセルサイズ | 5 μm | |
| ビニング | 1~8倍 | |
| センサーの読み出し | 任意の領域 | |
| フィルムに対する倍率 | 1.3-1.5x | |
| センサーの読み出し速度 | 50フルfps | 400フルfps |
| コンピュータへの転送速度 | 8 フル fps | 40 フル fps |
| 画像表示 | 8 フル fps | 10 フル fps |
| DQE 性能(300 kV) | >0.30(ピーク)>0.25、物理的なナイキストの0.5で | >0.7(ピーク)>0.50で物理的なナイキストの0.50で>0.06で物理的なナイキストの1.25で |
| ソフトウェア | デジタル顕微鏡を含むガタン顕微鏡スイート |
表2:カメラ仕様
| 構成オプション | 価値 |
| 顕微鏡タイプ | タロス・ロクシアカ G2 |
| 高圧 | 200 kV |
| 源 | XFEG |
| レンズ | クライオツイン |
| 真空システム | タロス TMP IGP |
| サンプルローダー | オートローダ |
表3:顕微鏡構成。
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Discussion
Latitude-S は直感的なユーザー インターフェイスで、2 日間で何千もの高解像度の顕微鏡写真やムービー ファイルを自動的にセットアップして収集する環境を提供します。それは格子を渡る容易な運行を提供し、顕微鏡段階の位置を維持し、低倍率から高倍率に移動する。Latitude-S によるデータ取得の各ステップは、シンプルなユーザー インターフェイス、最大 4.5 GB/秒の速度での高速データストリーミング、取得時のデータの同時表示などの機能を備えた時間効率が高くなります。さらに、事前調整された線量分画、線量率、焦点、倍率のパラメータを簡単に再ロードして、データ自動取得の新しいセッションを開始し、時間を節約しました。
常時監視が行われず、データ セットの品質を損なうことなく、データを自動的に取得することは、困難で時間のかかる作業です。緯度Sソフトウェアを使用した自動データ収集は、時間とリソースが大きな制約である場合、特にこのパンデミックの間に便利です。しかし、SARS-CoV-2の様々なタンパク質のいくつかのクライオEM構造は、製薬会社がワクチンを開発するのに役立つ、過去数ヶ月で解決されています。異なる研究所では、データを収集するために、さまざまなタイプの自動データ収集ソフトウェアパッケージを使用します。ラッシーカーボングリッドまたは自家製GOコーティンググリッド30上のクライオEM自動データ収集のためにK2サミットDEDとLatitude-Sを使用しました。
この研究は、Latitude-Sが単粒子クライオEMの自動データ収集に適した理想的なソフトウェアパッケージであるという強力な証拠を提供するプロトコルセクションの上記のパラメータを使用して行われました。ただし、K2 カメラを使用してイメージングを開始する前に、特定のプロトコルに従うことを強くお勧めします。K2直接検出カメラは最高の性能を達成するために基本的な維持ルーチンを必要とする。カメラを24時間50°に定期的にアニーリングすると、表面レベルでのバックグラウンドノイズと汚染を低減することで、センサーの性能を最適に向上できます。しかし、カメラのアニーリング後、カメラのゲインと暗い参照を更新することは、任意の画像取得を実行する前に必須のステップ(〜約45分)です。
Latitude-S は、クライオ EM 自動データ収集用の安定したユーザーフレンドリーなソフトウェア パッケージですが、最初に Latitude-S の 5 つの異なる状態でさまざまなパラメータ (拡大、スポット サイズ、明るさ、および線量率) を最適化することが不可欠です。穴またはグリッド状態の拡大は、穴あきグリッドまたは穴あきグリッドタイプの穴サイズ(R2/2、R1.2/1.3、R 0.6/1など)によって異なります。例えば、R0.6/1タイプのグリッドホールサイズは0.6μm、R2/2グリッドの穴サイズは2μmです。したがって、緯度-Sのグリッドと穴の状態でグリッドタイプR0.6/1とR2/2の穴を適切に視覚化するには、2つの異なるタイプの倍率が必要です。
したがって、5つの異なる状態のグリッドの様々なタイプの拡大設定は可変になります。スポットサイズと明るさは、倍率に大きく依存します。したがって、これらの値は、異なる倍率値で変化する可能性があります。したがって、自動データ取得を開始する前に、異なるタイプのcryo-EMグリッドを使用してLatitude-Sの5つの異なる状態の様々なパラメータを最適化することをお勧めします。ただし、すべてのパラメータが最適化され保存されると、ユーザーの要件に基づいてすべてのパラメータを再読み込みし、異なる倍率またはグリッドタイプで Latitude-S を使用することは簡単です。
K2をLatitude-Sで使用する重要な利点は、ユーザーが簡単にビームバルブを開く/閉じる、カメラを挿入/後退、顕微鏡の蛍光体スクリーンを挿入/後退させ、およびLatitude-SのGUIを使用して液体窒素充填を調節できることです。ただし、他のオプション(銃の傾き、銃のシフト、ビームシフト、ピボットポイント、C2開口中心、回転中心、昏睡のない位置合わせ)は、K2 Latitude-S GUIタブ(補足図S1および図2)からはアクセスできません。データ収集の長い時間の間に、ビームの位置がシフトすることがあります。
Latitude-S は、データ取得期間を通じてシステムの安定性を追跡するために、自動定期チェックと修正を実行できます。ビームを中心にして暗い参照を更新することで、システムの安定性が維持されます。定常チェックにより、取得したデータの高品質を保証します。緯度-Sでは、ユーセント高(Z-height)はデータ収集前に一度だけ修正され、ユーセントリック高さは、グリッドの正方形を変更するときに緯度-Sによって自動的に計算されます。フォーカスは、ユーザー定義のフォーカス範囲に基づいて自動的に測定および調整されます。プログラムは、指定されたしきい値を超えるとステージ Z 位置をリセットします。この安定性は、システムの安定性パレットを通じて制御されます。ただし、他の自動データ取得パッケージと同様に、Latitude-S にもいくつかの制限があります。
緯度Sは、グリッドが不均一な場合、ユーセント高(Z-height)を計算できません。このシナリオでは、データを収集できないか、フォーカス解除値が完全に範囲外になります。したがって、ユーザーは、緯度-Sを使用して、曲げや画像のみのフラットサーフェスグリッドなしでグリッドを準備するために非常に慎重にする必要があります。さらに、レギノン、シリアルEM、UCSF イメージとは異なり、Latitude-S は自由に利用できるソフトウェア パッケージではありません。Latitude-Sは、フィルタまたはスタンドアロンのK2、K3、K3ベースの直接検出カメラ、リオカメラ、OneViewカメラなど、ガタンカメラと互換性があります。ユーザーにとってもう一つの重要な欠点は、Falcon DED などの他の一般的な DE と互換性がないことです。しかし、これはEPU、クライオ顕微鏡で利用可能で、ファルコンカメラとのみ互換性がある別の自動データ取得ソフトウェアパッケージにも当てはまります。しかし、EPUはエネルギーフィルタ(バイオクタムK3イメージングフィルタ)を搭載したK2/K3でも機能しますが、スタンドアロンのK2/K3カメラでは機能しません。
緯度-SはEPU、シリアルEM、オートエム、オートエム、レギノンと非常によく似ており、単粒子クライオEMの自動データ取得に使用されるソフトウェアパッケージです。ただし、緯度SはK2 DED、K3 DED、またはバイオクォンタムK3イメージングフィルタとのみ互換性があります。また、同社は Latitude-S ユーザー向けに継続的なテクニカル サポートを提供しています。このテクニカルサポートは、データ取得にK2 DED、K3 DED、またはBioQuantum K3イメージングフィルタデバイスを使用する必要があり、SerialEMやLeginonなどのフリーソフトウェアパッケージのセットアップ方法や使用方法に関する事前知識がない小規模なユーザーグループにとって有益です。
マイクロクリスタル電子回折(マイクロED)、断層撮影、エネルギー分散X線分光(EDS)など、他にも多くの特徴があり、他の様々なバージョンのLatitudeで利用可能です。したがって、ユーザーは、他のモードでのデータ収集に同じソフトウェア パッケージを使用できます。私たちの知る限りでは、マイクロED、トモグラフィー、EDSのデータ収集は、EPUまたはその他のソフトウェアパッケージでは利用できません。したがって、この Latitude ソフトウェア パッケージは、単一粒子 cryoEM での自動データ取得に加えて、さまざまな目的に役立つ可能性があります。しかし、 SerialEM と Leginon, 両方のフリー ソフトウェア パッケージ, ファルコンや K2/K3 カメラに適しており、新しいユーザーのために非常に便利です..ただし、Latitude-S は自由に利用できず、このソフトウェア パッケージの欠点となる可能性があります。
要約すると、Latitude-S 自動データ取得ツールは、他の自動データ収集ソフトウェア パッケージ(EPU、レギノン、シリアルEM、UCSF-Image など)と同じくらい優れたものです。Latitude-S は非常に安定したユーザーフレンドリーなデータ取得ソフトウェア パッケージで、フィルター処理されたまたはスタンドアロンの K2、K3、および K3 ベースの直接検出カメラ、リオおよび OneView カメラを使用できます。
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Disclosures
著者は、宣言する競合や財政的な利益相反はありません。
Acknowledgments
我々は、バイオテクノロジー省、科学技術省(DST)、インドの人事開発省(MHRD)に対し、IISc-バンガロールの資金調達とクライオEM施設について認める。我々は、バンガロール州IIScのナショナルクライオEM施設に対するDBT-BUILDERプログラム(BT/INF/22/SP22844/2017)とDST-FIST(SR/FST/LSII-039/2015)を認めます。我々は、理工学研究委員会(SERB)(グラントNo.SB/S2/RJN-145/2015、SERB-EMR/2016/000608およびSERB-IPA/2020/000094)、DBT(グラントNo.1)からの財政支援を認める。BT/PR25580/BRB/10/1619/2017)。クライオEMグリッド、クライオEMデータ収集、 材料表の準備をしてくれたイシカ・プラマニックさんに感謝します。また、スマン・ミシュラ氏のクライオEM画像処理と、フィギュアの準備を手伝ってくれたことに感謝します。ラガヴァン・バラダラジャン教授は、この研究のために精製スパイクタンパク質サンプルを入手するのを助けてくれたことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
References
- Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
- Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
- Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
- Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
- Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Kühlbrandt, W.
- McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
- Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
- Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
- Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
- Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
- Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
- Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, Pt 3 384-389 (2007).
- Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
- Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
- Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
- Hillen, H. S., et al.
- Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
- Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
- Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).
