Summary
Tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopisi, yüksek verimli otomatik veri toplama için uygun bir yazılım paketi ve kullanıcı dostu bir işlem hattı gerektirir. Burada, düşük doz koşullarında vitrifiye biyomoleküllerin veri toplanması için tam otomatik görüntü alma yazılım paketi, Latitude-S ve pratik bir boru hattı uygulamasını sunuyoruz.
Abstract
Son birkaç yılda, tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopislerindeki (kriyo-EM) teknolojik ve metodolojik gelişmeler, biyolojik makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapı tespiti için yeni bir yol açmıştır. Cryo-EM'deki dikkat çekici gelişmelere rağmen, tek parçacık analizi iş akışının çeşitli yönlerinde iyileştirme için hala bir kapsam vardır. Tek parçacıklı analiz, yüksek verimli otomatik veri toplama için uygun bir yazılım paketi gerektirir. Son sekiz yılda tek parçacıklı kriyo-EM için otomatik görüntüleme için çeşitli otomatik veri toplama yazılım paketleri geliştirilmiştir. Bu makale, düşük doz koşullarında vitrifiye biyomoleküller için tam otomatik bir görüntü alma boru hattının bir uygulamasını sunun.
Cryo-EM verilerini tam, otomatik ve tam olarak toplayabilen bir yazılım paketi gösterir. Ek olarak, çeşitli mikroskobik parametreler bu yazılım paketi tarafından kolayca kontrol edilir. Bu protokol, bu yazılım paketinin doğrudan elektron dedektörü (DED) ile donatılmış 200 keV kriyo-elektron mikroskobu ile şiddetli akut solunum sendromu-koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) spike proteininin otomatik görüntülenmeslerindeki potansiyelini göstermektedir. Sars-CoV-2'nin spike proteininin atomik çözünürlüklü bir yapısını sağlayan tek bir oturumda (48 saat) yaklaşık 3.000 kriyo-EM film görüntüsü elde edildi. Ayrıca, bu yapısal çalışma, spike proteininin iki ana uygunluk benimsediğini göstermektedir, 1-RBD (reseptör bağlayıcı alan adı) açık ve tüm RBD kapalı konformasyonları.
Introduction
Tek parçacıklı kriyo-EM, biyolojik makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapı tespiti için ana akım bir yapısal biyoloji tekniği haline gelmiştir1. Tek parçacıklı rekonstrüksiyon, daha sonra biyolojik bir makromolekülün üç boyutlu (3D) yapısını yeniden oluşturmak için kullanılan iki boyutlu (2B) parçacık görüntülerini çıkarmak için çok sayıda vitrifiye örnek mikrobu elde edilmesine bağlıdır2,3. DED'lerin geliştirilmesinden önce, tek parçacıklı rekonstrüksiyondan elde edilen çözünürlük 4 ila 30 Å4,5 arasında değişmektedir. Son zamanlarda, tek parçacıklı cryo-EM'den elde edilebilir çözünürlük 1.8 Å6'nın ötesine ulaştı. DED ve otomatik veri toplama yazılımı, veri toplama için insan müdahalesinin en az olduğu bu çözüm devrimine büyük katkıda bulundu7. Genellikle kriyo-EM görüntüleme, biyolojik örneklerin elektron ışın kaynaklı radyasyon hasarını en aza indirmek için düşük elektron doz oranlarında (20-100 e/Å2) gerçekleştirilir ve bu da görüntüdeki düşük sinyal-gürültü oranına (SNR) katkıda bulunur. Bu düşük SNR, tek parçacık analizi kullanılarak biyolojik makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapılarının karakterizasyonuna engeldir.
Yeni nesil elektron dedektörleri, SNR ile ilgili bu düşük engelleri aşabilen CMOS (tamamlayıcı metal-oksit-yarı iletken) tabanlı dedektörlerdir. Bu doğrudan algılama CMOS kameralar, kameranın daha iyi nokta yayma işlevi, uygun SNR ve biyolojik makromoleküller için mükemmel dedektif kuantum verimliliği (DQE) katkıda bulunduğu için sinyalin hızlı okunmasına izin verir. Doğrudan algılama kameraları, kaydedilen görüntülerde yüksek SNR8 ve düşük gürültü sunar ve bu da dedektif kuantum verimliliğinde (DQE) nicel bir artışa neden olur ve bir dedektörün görüntüye ne kadar gürültü kattığının bir ölçüsü olur. Bu kameralar ayrıca saniyede yüzlerce kare hızında film kaydeder ve bu da hızlı veri alımını sağlar9,10. Tüm bu özellikler, hızlı doğrudan algılama kameralarını düşük doz uygulamaları için uygun hale getirir.
Hareket düzeltilmiş yığın görüntüleri, RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 ve EMAN215 gibi çeşitli yazılım paketlerini kullanarak makromoleküllerin 2B sınıflandırmasını hesaplamak ve 3B yoğunluk haritasını yeniden oluşturmak için veri işleme için kullanılır. Ancak, tek parçacık analizi için, yüksek çözünürlüklü bir yapı elde etmek için muazzam bir veri kümesi gereklidir. Bu nedenle, otomatik veri toplama geçiş ücretleri veri toplama için son derece önemlidir. Büyük kriyo-EM veri kümelerini kaydetmek için son on yılda birkaç yazılım paketi kullanılmıştır. Otomatik Veri Toplama için AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS ve EPU gibi özel yazılım paketleri geliştirilmiştir.
Bu yazılım paketleri, düşük büyütme görüntülerini yüksek büyütme görüntüleriyle ilişkilendirerek delik konumlarını otomatik olarak bulmak için rutin görevleri kullanır, bu da düşük doz koşullarında görüntü alımı için uygun buz kalınlığının vitreus buz ile deliklerin tanımlanmasına yardımcı olan. Bu yazılım paketleri, tekrarlayan görevlerin sayısını azalttı ve herhangi bir kesintiye uğramadan ve operatörün fiziksel varlığı olmadan birkaç gün boyunca sürekli olarak çok miktarda kaliteli veri elde ederek kriyo-EM veri toplamanın verimini artırdı. Latitude-S, tek parçacık analizi için otomatik veri toplama için kullanılan benzer bir yazılım paketidir. Ancak, bu yazılım paketi yalnızca K2/K3 DED'ler için uygundur ve bu dedektörlerle sağlanır.
Bu protokol, SARS-CoV-2 spike proteininin 200 keV kriyo-EM ile donatılmış doğrudan elektron dedektörü ile otomatik görüntü alımında Latitude-S'in potansiyelini göstermektedir ( bkz. Malzeme Tablosu). Bu veri toplama aracı kullanılarak, SARS-CoV-2 spike proteininin 3.000 film dosyası otomatik olarak elde edilir ve 3.9-4.4 şçözünürlüklü başak protein yapısı elde etmek için daha fazla veri işleme gerçekleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Kriyo-EM veri toplama için üç önemli adım gereklidir: 1. kriyo-EM ızgara hazırlama, 2. mikroskobun kalibrasyonu ve hizalanması, 3. otomatik veri toplama (Şekil 1). Ayrıca, otomatik veri toplama a. uygun alan seçimi, b. Latitude-S optimizasyonu, c. otomatik delik seçimine başla ve d. otomatik veri toplamayı başlat (Şekil 1) olarak ikiye ayrılır.
1. Otomatik veri toplama için Cryo-EM ızgara hazırlama ve örnek yükleme
- Izgara deşarjı kullanarak ızgaraları temizleyin ve deneysel gereksinimlere göre kızdırma deşarj parametrelerini değiştirin (burada, 20 mA'da 60 s).
- Işıma deşarjı yapılan ızgaraya yeni hazırlanmış bir protein örneği (3 μL) ekleyin ve 10 sn kuluçkaya yatırın.
- Izgaraları% 100 nemde 3-5 sn lekele ve bir kriyo piston kullanarak sıvı etan içine hızla daldırma.
- Kartuşu esnek bir C klipsi halkası kullanarak oluşturmak için ızgaraları manuel olarak bir klips halkasına sıkıştırın.
- Donmuş kartuşa monte ızgaraları otomatik doldurucu kasetine yükleyin ve kaseti nano kapakla veri toplama için mikroskobun önceden soğmuş otomatik yükleyicisine aktarın.
2. Otomatik veri toplamadan önce mikroskop ayarı ve temel hizalama
- Işın kayması
- Doğrudan Hizalama sekmesinden Işın kaydırma'ya tıklayın.
- Büyütmeyi azaltın ve Çok İşlevli X ve Y düğmesini kullanarak kirişi optik eksene ortala.
- Özet nokta hizalaması
- Doğrudan Hizalama sekmesinden Doğrudan Hizalama pp X'teki Işın eğme seçeneğine tıklayın.
- Çok Fonksiyonlu X ve Y düğmesini kullanarak kirişi bir noktaya yoğunlaştırın ve hareketi en aza indirin.
- C2 diyafram ortalama
- Hizalama sekmesinden kondenser diyaframını seçin.
- Işını bir noktaya yoğunlaştır, ışını optik eksene ortala ve ardından daireyi eşit şekilde kaplayacak şekilde kirişi genişletin.
- Kondenser 2 diyaframı ayarlanana kadar bu adımları yineleyin.
- Koma içermeyen hizalama
- Işını optik eksene hizalamak için Doğrudan Hizalama sekmesinden Coma içermeyen Hizalama X'e tıklayın.
- FFT'nin şeklini ve hareketini en aza indirmek için Çok fonksiyonlu düğmeyi kullanın (kararlı olduğundan emin olun).
- Koma için aynı prosedürü tekrarlayın - serbest hizalama Y.
- C ikiz lens nedeniyle cryo-EM'de veri toplamadan önce paralel aydınlatma ayarlayın.
- Objektif diyaframı (70 μm) kırınım modunda takın.
- Odaklama yoğunluğu düğmesini (objektif lens ve C2 lens akımı) kontrol ederek objektif diyaframı kırınım merceği ön odak düzlemine odakla.
- Objektif diyaframın net kenarının uygun odaklamadan sonra görüldüğünden emin olun.
- Kiriş durdurucuyu yerleştirin ve altın toz kırınım halkaları simge durumuna küçültene kadar yoğunluğu yayın.
NOT: Kiriş düzgün yayılırsa, ekranda altın tozunun net bir kırınım halkası görünür, bu da kirişin paralel olduğunu gösterir. - Paralel aydınlatmayı ayarladıktan sonra ışın durdurucuyu geri çek ve mikroskop modunu Nano prob olarak değiştirin.
NOT: Mikroskobun optimum performansını sağlamak için veri toplamaya başlamadan önce mikroskop ayarlamasını kontrol edin. Tüm bu ayarlar mikroskop Doğrudan Hizalama GUI Sekmesinde gerçekleştirilir. Tüm mikroskop ayarlamaları, veri toplamadan önce bir test kılavuzu kullanılarak gerçekleştirilir.
3. Latitude-S ile veri toplama
- Latitude-S otomatik veri toplama yazılımını başlatın.
NOT: Latitude-S kurulumu ayrıca veri toplamadan önce gerçekleştirilecek mikroskop kalibrasyonu gerektirir ve ayarlar kalıcı olarak saklanır. Veri toplama için beş farklı durum dört farklı büyütme ile kalibre edilir (Şekil 1 ve Şekil 2). Atlas durumu ve ızgara durumu LM modunda iki farklı büyütmededir (düşük büyütme aralıkları). Delik durumu SA modundadır (yüksek büyütme aralıkları) ancak orta derecede büyütmeye sahiptir. Odak ve veri durumu yüksek büyütme SA modunu kullanır.- Başlat menüsünden DigitalMicrograph'a tıklayın veya masaüstündeki DigitalMicrograph simgesine çift tıklayın.
- DigitalMicrograph'tan Teknik yöneticisi simgesini seçin.
NOT: Bu sistem TEM ve Latitude-S simgelerini gösterecektir (Şekil 2 ve Ek Şekil S1). - Tek parçacıklı otomatik veri toplama için Latitude-S simgesini seçin.
NOT: K2 kamera doğrusal/entegre, sayılmış ve süper çözünürlük olmak üzere üç modda çalışır. Kullanıcı DigitalMicrograph arabiriminde herhangi bir modu seçebilir. Veri görüntüleri, doz kesirli görüntü yığınları olarak veya farklı bit derinliklerine sahip MRC, TIF veya .dm4 dosyalarında özetlenmiş görüntüler olarak kaydedilebilir. Ayrıca, veriler K3 kamera için hareketle düzeltilmiş görüntüler olarak kaydedilebilir. K2 kamerada, işlenmemiş bir görüntü yığını 4 bit MRC, 8 bit TIF veya 8 bit .dm4 dosyaları olarak kaydedilebilir.
- Önceki oturumun ayarlarına göre yeni bir oturum oluşturun.
- Paletteki Önceki oturumu temel alan onay kutusunu işaretleyin.
- Yeni düğmesini seçin.
- Yeni oturumun ayarlarının temel aldığı oturumu içeren klasörü seçin. Yeni oturumu oluşturmak için önceki oturum dizinine gidin. Yeni oturumu ve ilişkili verileri kaydetmek için klasörü seçin.
- Yeni oturumun ve ilişkili verilerin kaydedileceği klasörü seçin ve seçin.
NOT: Her durum ve temel ayarları (büyütme, aydınlatma koşulları, görüntü veya projektör) ve ışın kayması ve kamera parametreleri (toplam pozlama, tek kare pozlama ve binning) mevcut oturumdan yeni oturuma dışa aktarılacaktır. Klasörün yolu paletin altında bir metin dizesi olarak gösterilir. Durumların ve yapılandırma paletlerinin her birinin, önceden ayarlandığını ve kullanıma hazır olduğunu göstermek için başlığa eklenen bir yıldız işareti (*) vardır.
- Varolan bir oturuma devam edin.
- Varolan bir oturuma devam etmek için paletteki Devam düğmesine basın.
NOT: Atlas montajı değiştirilemez. - Devam etmesi gereken oturumu içeren klasörü seçin ve bu klasöre gidin.
- Varolan bir oturuma devam etmek için paletteki Devam düğmesine basın.
- Tamamen yeni bir oturum başlatın.
- Paletteki Yeni sekmesine tıklayın. Devam edilecek oturumu içeren klasörü seçin. Verileri kaydetmek için bir klasör seçin.
NOT: Varsayılan klasör adı tarih ve saat kullanılarak oluşturulmuş. - Ayar simgesine tıklayın. Görüntülenen durumu yönet araştırma kutusunda, durum ekleyin, TEM koşulu, kamera koşulu ve görüntü/yığın ayarlayın ve sonra durumu adlandırın.
NOT: Otomatik veri toplama iş akışı, otomatik veri toplama için 5 farklı durum kullanır. Bu durumlar yapılandırılır ve ilgili durum paletlerinde depolanır. Durum özeti Tablo 1'de verilmiştir.
- Paletteki Yeni sekmesine tıklayın. Devam edilecek oturumu içeren klasörü seçin. Verileri kaydetmek için bir klasör seçin.
- Atlas durumunu yapılandırın.
- Atlas durum paleti üzerine tıklayın.
- Atlas durumunu aşağıdaki parametrelerle yapılandırın: nano probda büyütme 115x LM modu, aydınlatma koşulları nokta boyutu 8 ve parlaklık 934400, binning: 1 ve kameraya maruz kalma süresi: Düşük büyütmede görüntüleme için 1,0 s. Tablo 1'de verilen durum özetine bakın.
- Sonraki duruma geçmek için İleri'yi tıklatın.
NOT: Atlas durumu, tüm ızgaranın incelenmesini sağlayan en düşük büyütme durumudur (Ek Şekil S2). Genel olarak, bu durum tüm ızgaraları düşük büyütmede görselleştirmemize ve ızgaraların buz kalınlığını, düzlüğünü ve kırık karesini değerlendirmemize yardımcı olur. Izgaraların optimum buz kalınlığını ve yetersiz buz kalınlığını gözlemlemek için atlasın ızgaranın farklı bölgelerinde oluşturulması önerilir (Ek Şekil S3). Bahsedilen parametreler kullanıcının ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir.
- Kılavuz durumunu yapılandırın.
- Izgara durum paletini tıklatın.
- Izgara durumunu aşağıdaki mikroskop görüntüleme optikleri (Nano probda büyütme 380x LM modu), aydınlatma koşulları (spot boyutu: 8 ve parlaklık 626.200), binning: 1 ve kamera pozlama süresi: 1.0 s ile yapılandırın.
- Tablo 1'de sağlanan Enlem-S durum özetine bakın.
- Sonraki duruma geçmek için İleri'yi tıklatın.
NOT: Kılavuz durumu, görünüm alanı bir ızgara karesi olacak şekilde atlas durumundan daha yüksek bir büyütmeye ayarlanır (Şekil 2). Bu özel büyütmede, bir ızgara karesi gözlenir. Bu nedenle, deliklerin buz kalınlığını kontrol etmek yardımcı olan bu büyütmede delikler doğru bir şekilde gözlenir (Ek Şekil S4). Patent ızgarasındaki delikleri bulmak için ızgara durumunda basit bir bandpass filtresi kullanılır. Bahsedilen parametreler kullanıcının ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir.
- Delik durumunu yapılandırın.
- Delik paletini tıklayın.
- Delik durumunu aşağıdaki mikroskop ayarlarıyla yapılandırın: görüntüleme optikleri (Nano probda büyütme 4500x SM modu), aydınlatma koşulları (spot boyutu: 7 ve Işın çapı 8,81 μm), binning: 1 ve kameraya maruz kalma süresi: 1,0 s.
- Izgara türüne göre gerekirse parametreleri değiştirin. Tablo 1'de sağlanan durum özetine bakın.
- Sonraki duruma geçmek için İleri'yi tıklatın.
NOT: SA modu, elektron mikroskopunda yüksek büyütme aralığını gösterir. Delik durumu, birkaç mikrometrenin (10-20 μm) görüş alanına sahip SA büyütme aralığındadır (Şekil 2 ve Ek Şekil S4). Bu büyütme aralığı Atlas veya Grid durumundan daha yüksektir, ancak Odak/Veri durumundan çok daha küçüktür. Bu büyütmede, bireysel delikler görünecektir. Delik boyutu, yüksek derecede kirlenmeyi, boş delikleri ve deliklerin uygun buz kalınlığını gözlemlemek için uygundur. Görüntüleme delikleri bu varsayımlara göre seçilir. Delik durumunda iki filtre kullanılır: biri delik referans görüntüsünü yeni bir delik görüntüsüyle çapraz ilişkilendirmek ve diğeri sahne yüksekliğini ösantrik yüksekliğe ayarlamak için.
- Odak durumunu yapılandırın.
- Odak paleti'ne tıklayın.
- Odak durumunu aşağıdaki mikroskop ayarlarıyla yapılandırın: görüntüleme optikleri (nano probda büyütme 45.000x SA modu), aydınlatma koşulları (spot boyutu: 8 ve parlaklık 934400), binning: 1 ve kameraya maruz kalma süresi: 1.0 s.
- Deliğin yakınındaki amorf karbon alanına odaklanın. Tablo 1'de sağlanan Enlem-S durum özetine bakın.
- Sonraki duruma geçmek için İleri'yi tıklatın.
NOT: SA modu, elektron mikroskopunda yüksek büyütme aralığını gösterir. Odak durumu daha yüksek SA aralığı büyütmedir. Odak modunda, ışın hedef deliğin yakındaki bir karbon alanına kaydırılır ve verileri veri durumunda toplamak için odağı otomatik olarak gerçekleştirir. Aynı alanın iki odak durumu görüntüsü arasındaki uzaklığı ölçmek için odak durumunda hanning veya yumuşak dikdörtgen filtre ile birlikte bir bandpass filtresi kullanılır (Şekil 2). Bahsedilen parametreler kullanıcının ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir.
- Veri durumunu yapılandırın.
- Veri paleti'ne tıklayın.
- Veri durumunu aşağıdaki mikroskop ayarlarıyla yapılandırın: görüntüleme optikleri (örneğin, nano probda SA modunda büyütme 28.000x, 45.000x, 54.000x), aydınlatma koşulları (spot boyutu: 8 ve parlaklık 934400), binning: 1 ve kameraya maruz kalma süresi: 1.0 s.
- Tablo 1'de verilen Enlem-S durum özetine bakın.
- Sonraki duruma geçmek için İleri'yi tıklatın.
NOT: Veri durumu, piksel boyutu gereksinimlerine ve hedef çözünürlüğe göre seçilen en yüksek büyütmedir (Şekil 2). Genellikle, odaklamadan sonra, ışın verileri toplamak için otomatik olarak hedef alana kaydırılır. Yukarıda belirtilen parametreler kullanıcının gereksinimlerine göre değiştirilebilir.
4. Odak yapılandırması
- Odak yapılandırma paleti'ne tıklayın. Verilen sekmede netleme değerleri aralığını ve adım boyutunu belirtin.
- Sonraki adıma geçmek için İleri düğmesine basın.
NOT: Düşük defokus değerleri yüksek çözünürlüklü veri toplama için kullanılabilir. Genellikle, görüntü alımı için 0,25 veya 0,5 defocus adım boyutlarına sahip -0,5 ila -3,0 μm defocus değerleri kullanılır. Kullanıcılar yalnızca örneği taramak istiyorlarsa odak kurulum adımını atlayabilirler. Odak yapılandırma adımını atlamak için paletteki İleri düğmesine basmanız yeterlidir.
5. İnce hizalama
- Şebekedeki bazı özelliklere odaklanın (örneğin, buz kirlenmesi altıgen buz); bkz. Şekil 3.
NOT: Özellikler çok büyük veya çok küçük olmamalıdır. Bunlar hem Atlas durum büyütme 115x (LA modu) hem de veri büyütmede görünür olmalıdır. - Yakala düğmesine tıklayın. Kırmızı çapraz işareti farklı durumların her görüntüsünde aynı unsura yerleştirin.
- Odak, veri ve delik durumları ile başlayın, çünkü görüş alanlarına atlas ve ızgara durumlarından çok daha büyüktür. Atlas ve ızgara durumlarında kırmızı çapraz işareti aynı özelliğe konumlandırmak için atlas ve ızgara durumlarını yakınlaştırın.
- Durumların her biri arasındaki uzaklıkları hesaplayacak ve bunları çıktı penceresine yansıtacak beş farklı eyaletin konumlarını hesaplamak için Hesapla düğmesini tıklatın.
NOT: Uzaklık değerleri daha fazla kullanım için durumlara entegre edilmiştir (Şekil 3). İnce hizalama, her eyaletin konumunun yüksek doğruluğunu sağlamak için gerçekleştirilir (Şekil 3). Bu ince hizalama, beş eyaletin tamamında tam konumun tam olarak tespit edilmesine yardımcı olur. İnce Hizalama , tek parçacıklı veri toplama için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, görüntülemeden önce İnce Hizalama yapılması şiddetle tavsiye edilir.
6. Latitude-S kullanarak veri toplama prosedürü
- Yakalama paletini tıklatın.
NOT: Genellikle, atlas verileri ızgara karelerinin çoğunu görselleştirmek için düşük büyütmede (115x) toplanır. - Gerekliliğe (örneğin, 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8 veya 8 x 12) bağlı olarak ızgaranın tamamını veya bir kısmını kapsayacak şekilde atlasın boyutunu seçin.
NOT: 16'ya 16 atlas boyutu tüm ızgarayı kapsar. - Atlası yakalamak için Yakala düğmesine tıklayın.
NOT: Ana Latitude-S gezinti penceresi DigitalMicrograph'taki kullanılabilir alanı açar ve doldurur (Ek Şekil S5). Ana gezinti penceresindeki üç resim bölmesi, sistem durumlarının görüntülerini üç farklı büyütmede gösterir. Genel atlas şu anda en soldaki bölmede geçerli alım durumunda görüntülenir. Atlastaki kutucuklar, her yakalama gerçekleştiğinde dolacak. - Atlasta gezinerek buz kalınlığına göre ızgara karesini seçin (Ek Şekil S5). İstediğiniz ızgara kareleri seçildikten sonra , Çiz düğmesine tıklayın ve her ızgara karesi yakalanırken ızgara karesindeki döşemelerin dolduğunu gözlemleyin.
- Kılavuz kareleri seçildikten sonra Zamanla düğmesine tıklayın.
- Konumunu ekleyerek ızgara karesinde temsili bir delik seçin. Bir delik görüntüsü alındıktan sonra, verileri ve odak konumlarını tanımlayın ve düzeni şablon olarak kaydedin (Ek Şekil S6).
- Otomatik bul'a tıklayın, delik boyutunu verin (örneğin, R1.2/1.3) ve programdaki Bul düğmesine tıklayın, bu da Bul programının delik çapına göre delikleri otomatik olarak bulmasına neden olur. Ardından, şablonu eklemek için İşaretle düğmesine tıklayın (Şekil 4) ve bir ızgara veya kısmi ızgara karesindeki tüm deliklere kırmızı daire işaretleri ekleyin.
- Delikleri ızgara karesinden ve buz kirlenmesinden arındırmak için yoğunluğu ayarlayın (Şekil 4).
NOT: Son olarak, seçilen delikler veri toplamayı planlamak için sarı ile işaretlenir. - Otomatik bul aracılığıyla delikleri ekledikten sonra Latitude görevlerinde Zamanla düğmesine tıklayın.
NOT: Otomatik veri toplamayı planlamadan önce, sıvı azot tankı seviyesinin yeterli olduğundan, otomatik doldurucu turbo pompanın kapalı olduğundan ve RAID sürücü alanının boş olduğundan emin olun. Latitude-S görev yöneticisi, veri toplama için zamanlanmış atlas, ızgara karesi, delik ve veri durumlarının sayısını gösterir (Şekil 5). Latitude-S GUI'de çeşitli renk şemaları görünür olacak ve farklı renk düzenlerinin anlamı görüntülenecektir: 1. Sarı planlanmamış gösterir; 2. Yeşil zamanlanmış gösterir; 3. Mavi, Edinilmiş'i gösterir; 4. Kırmızı başarısız olduğunu gösterir.
7. Cryo-EM veri işleme
NOT: Spike proteininin kriyo-EM görüntü işlemesi son literatürde ayrıntılı olarak açıklanmıştır25.
- RELION 3.011 kullanarak SARS-CoV2'nin spike proteininin görüntü işlemesini gerçekleştirin.
- Latitude-S kullanılarak toplanan film görüntülerini manuel olarak tarayın ve MotionCor2 yazılımını kullanarak tek tek filmlerin ışın kaynaklı hareket düzeltmesini gerçekleştirin9. CisTEM yazılım paketi14 yardımıyla hareket düzeltilmiş mikrografların ilk taramasını manuel olarak gerçekleştirin.
NOT: Otomatik olarak elde edilen mikrografların neredeyse% 85'i kaliteliydi ve veriler cisTEM yazılımı14 (Ek Şekil S7A, B) kullanılarak hesaplanan 3.7-5.2 şiçinde sinyale sahipti. - RELION 3.0 yazılım paketini kullanarak verileri işleyin11.
- Başak parçacıklarını manuel olarak seçin ve 2B sınıf sınıflandırmasına tabi dirilayın (Ek Şekil S7C). RELION otomatik seçim aracını kullanarak mikrografilerden 3.99.842 tek başak parçacığını otomatik seçime referans olarak en iyi 2B sınıfı kullanın11.
NOT: Parçacıkları 3D sınıflandırmaya tabi etmeden önce üç tur 2D sınıflandırması gerçekleştirildi (Ek Şekil S8). 3D sınıflandırma için yaklaşık 2.55.982 tek parçacık seçildi ve veri kümesi altı sınıfa sınıflandırıldı. Son 3D otomatik iyileştirme en iyi sınıfla gerçekleştirildi; 3D sınıflandırmasından 85.227 başak parçacığı elde edildi. - Otomatik iyileştirmeden sonra, çözünürlük iyileştirmesi için uygun ışın eğim parametreleriyle parçacık defokus iyileştirmesi başına gerçekleştirin. Ardından, RELION 3.0 yazılım paketini kullanarak parçacıkları Bayes parlatmaya tabi edin11. Son olarak, RELION 3.011 kullanarak başka bir 3D otomatik iyileştirme turu için cilalı parçacık kümesini kullanın.
- Başak parçacıklarını manuel olarak seçin ve 2B sınıf sınıflandırmasına tabi dirilayın (Ek Şekil S7C). RELION otomatik seçim aracını kullanarak mikrografilerden 3.99.842 tek başak parçacığını otomatik seçime referans olarak en iyi 2B sınıfı kullanın11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mevcut pandemi durumunda, cryo-EM, sars-CoV-226,27,28,29'dan çeşitli proteinlerin yapılarının karakterizesinde önemli bir rol oynar ve bu da virüse karşı aşı ve ilaç geliştirilmesine yardımcı olabilir. 2019'un koronavirüs hastalığıyla mücadele için sınırlı insan kaynağına sahip hızlı araştırma çalışmalarına acil ihtiyaç var. Tek parçacıklı kriyo-EM'de veri toplama, makromoleküllerin yapı belirlemesinde zaman alıcı ancak çok önemli bir adımdır. Cryo-EM otomatik veri toplamadaki son gelişmeler, insan müdahalesinin veri toplamada sınırlı olduğunu sağladı. Latitude-S yazılımı, saflaştırılmış SARS-CoV2 spike proteininin otomatik veri toplaması için burada kullanılan önemli bir otomatik veri toplama yazılım paketidir.
SARS-CoV-2 spike proteininin kriyo-EM veri toplama işlemi, K2 Summit DED ile donatılmış 200 keV cryo-EM ile gerçekleştirildi. Islenilen buz kalınlığı ve partikül dağılımı ile ızgarada veri toplama yerleri manuel olarak işaretlendi. Pozisyonlar, arka planda gerçekleşen veri toplama sırasında paralel olarak işaretlendi. İşaretli konumlarda Latitude-S yazılımı, numune seviyesinde 1,17 şpiksel boyutunda 42.200x nominal büyütmede otomatik veri toplama gerçekleştirdi. 42.200x büyütmede veri toplama yapılandırması önceden ayarlanmış ve zaten test edilmiş. Kare başına 2 e−/Å2 elektron dozu ile 8 s için toplam 40 kare kaydedildi; böylece veri toplamada toplam 80 e−/Å2 doz kullanılmıştır (Ek Şekil S9). Veriler −0,75 μm ve −2,25 μm defocus aralığında elde edildi ve iki günde 3.000 film dosyası toplandı. Her 4 saat, periyodik kontroller ve ayarlamalar, 48 saat boyunca toplanan tüm film dosyalarının kaliteli olduğundan ve ışın kayması veya hizalama kayması olmadığından emin olmak için yazılım tarafından gerçekleştirildi. Veriler herhangi bir insan müdahalesi olmadan bağımsız olarak toplandı. Ek olarak, Latitude-S sıvı azot dolumu zamanında görüntülemeyi otomatik olarak durdurur ve bu da görüntülerdeki gereksiz titreşimi veya mekanik sürüklenmeyi azaltır.
Protokol bölümünde de belirtildiği gibi hareket düzeltilmiş mikrografların ilk taraması CISTEM yazılımı kullanılarak manuel olarak gerçek yapılmıştır14. Taramaya dayanarak, verilerin çoğunun 3.7-5.2 ş(Ek Şekil S7A) sinyal aralığında olduğu bulunmuştur. Bu, Latitude-S kullanarak otomatik veri toplamanın iyi olduğunu ve verilerin çoğunun yüksek çözünürlüklü 3D yeniden yapılandırma için uygun olduğunu göstermektedir. Ayrıca, görüntüler defokus aralığında (-0,75 ila -2,25 μm) toplanmış ve çeşitli defokus aralıkları cisTEM14 tarafından manuel olarak kontrol edilmiştir. Elde edilen veriler Latitude-S'deki kurulum defokus aralığına çok yakındı (Ek Şekil S7A,B).
Veri işleme RELION 3.0 yazılım paketi11 kullanılarak gerçekleştirildi. Başak parçacıkları, 2D sınıf ortalamalarını hesaplamak için manuel olarak seçildi. Çeşitli yapısal ayrıntılar (sarmal ve β sayfa) 2D sınıf ortalamalarında görülebilir (Ek Şekil S7C), bu veri kümesi kullanılarak yüksek çözünürlüklü yapısal karakterizasyonun mümkün olduğunu güçlü bir şekilde göstermektedir. Bununla birlikte, 3D sınıflandırması ayrıca spike proteinin 1 reseptör bağlayıcı etki alanına (RBD) açık olduğunu ve tüm RBD aşağı yakın konformasyonuna (Ek Şekil S8) sahip olduğunu gösterir. 3D sınıflandırması, sınıf-1'in 1-RBD yukarı açık uygunluk olarak görünen maksimum parçacık sayısına sahip olduğunu gösterir. Ayrıca, sınıf-3 ve sınıf-4 benzer sayıda parçacıklara sahiptir ve her iki model de tüm RBD'ye yakın uyum sağlamış gibi görünmektedir. Ancak, sınıf-5, 1-RBD'nin ara konumda olduğu bir ara uygunluk gösterir. Bununla birlikte, spike proteininin 1-RBD yukarı açık konformasyonları C1 simetrisi kullanılarak yeniden inşa edilmiştir ve genel çözünürlük 4.4 Å'dır (Şekil 6 ve Ek Şekil S10). Benzer şekilde, tüm RBD aşağı yakın konformasyon (sınıf-3 ve sınıf-4) C3 simetrisi ile birlikte rafine edilmiştir ve 0.143 FSC'deki genel çözünürlük ~3.9 Å'dır (Şekil 7).
Genel görüntü işleme, spike proteininin tüm RBD'leri yakın ve 1-RBD yukarı açık uygunluğu benimsediğini gösterir. Ek olarak, spike proteininin bir ara uygunluğunu tanımlamak tespit edildi. Spike proteininin S2 alt dizisinin yüksek çözünürlüklü kriyo-EM yapısı, bireysel amino asit kalıntılarının yan zincirlerini gösterir (Şekil 6B ve Şekil 7C). Tüm 3D rekonstrüksiyonlar ve kriyo-EM sonuçları, yakın zamanda yayınlanan literatürdeki bulgulara oldukça benzer25. Bununla birlikte, spike proteininin yüksek çözünürlüklü kriyo-EM yapısı 15 gün içinde karakterize edildi, bu da yalnızca otomatik kriyo-EM veri toplama protokolleri ve otomatik parçacık toplama yazılımı nedeniyle mümkün olabilir. Bu nedenle, Latitude-S de dahil olmak üzere otomatik veri toplama yazılım paketleri, biyolojik makromoleküllerin birkaç yüksek çözünürlüklü kriyo-EM yapılarının karakterizasyonuna önemli ölçüde katkıda bulunabilir.
Şekil 1: Latitude-S kullanarak otomatik veri toplama iş akışı: Veri toplamadan önce izlenecek genel adımlar (ızgara hazırlama, örnek yükleme ve mikroskop ayarlama). Veri toplama bu makalenin ana parçasıdır ve veri toplama sırasında izlenecek işlem hattı vurgulanır. Kısaltmalar: kriyo-EM = kriyo-elektron mikroskopisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Latitude-S GUI kullanılarak tek parçacıklı veri toplama için farklı durumların kurulumu. (A) DM3 yazılım kıyafetinde veri toplama için Latitude-S yazılım paketi. (B) Veri toplama prosedürünün iş akışı. (C) Her panelin genişletilmesi. Kısaltma: GUI = grafik kullanıcı arayüzü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Odaklama ve görüntü alma için yüksek doğruluk ayarlamak için ince hizalama. İnce hizalama beş durumda gerçekleştirilir a. Atlas, b. Hole, c. Data, d. Grid, e. Focus. Kırmızı işareti aynı konuma yerleştirerek her durumu odakla. Herhangi bir yeni oturuma başlamadan önce, belirli bir konumda görüntüleme gerçekleştirmeye yardımcı olacak İnce Hizalama yapılması şiddetle tavsiye edilir. Belirli bir konumda (herhangi bir büyük kayma olmadan) görüntü alımı tamamen ince hizalamanın doğruluğuna bağlıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Latitude-S kullanarak otomatik delik seçimi. Veri toplama için deliklerin otomatik olarak bulunması, delik boyutuna göre otomatik olarak gerçekleştirilir. (A) Delikleri otomatik bulmak için delik bulma vektörün konumunu gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B) Delik bulma vektörü kullanılarak deliklerin işaretlenmesi ve işaretleyicinin sınır bölgesinden çıkarılması ve buz kirlenmesinin yoğunluğunun ayarlanmasını gösterir. Ölçek çubukları = 20 μm (sol) ve 10 μm (orta). (C) Görüntüleme için deliklerin otomatik olarak eklenmesini gösterir (sarı). Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Veri toplamanın canlı görünümü. (A) Pozisyonlar, her konumdaki veri toplama durumuna göre sarı, yeşil, mavi ve kırmızı olarak işaretlenir. (B) Veri toplama durumunu izlemek için renk kodu. Yeşil: Zamanlanmış, Sarı: Planlanmamış, Mavi: Edin, Kırmızı: Başarısız. Sol panelde yeşil renkli (zamanlanmış) birkaç delik ve mavi işaretli birkaç delik (edinilmiş) gösterilir; ölçek çubuğu = 10 μm. Orta panel, tek bir deliğin 4.300x büyütmesini gösterir. Bir deliğin (orta panel) bu görüntüsünde, mavi kare kutu odak alanını ve yeşil kare kutusu görüntüleme bölgesini gösterir; ölçek çubuğu = 1000 nm. Sağ panel elde edilen görüntüyü gösterir. Aşırı sağ panelde zamanlanmış görüntü numaraları, görüntüleme için gereken toplam süre ve görüntüleme için kaç görüntünün zamanlandığını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: 1RBD açıkken spike 3D modu. (A) 1-RBD yukarı açık otomatik rafine ve keskinleştirilmiş spike protein haritası yan, üst ve alt görünümlerde temsil edilir. (B) EM haritası, yan zincirlerin daha iyi görselleştirilmesi için kristal yapı ile donatılmıştır. Haritada vurgulanan bölgeler yan zincirler için yoğunluklara sahiptir. Kısaltmalar: 3D = üç boyutlu; RBD = reseptör bağlama etki alanı; EM = elektron mikroskopisi; NTD = N- terminal etki alanı; S1 = alt birlik 1; S2 = alt birlik 2. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Tüm RBD aşağı spike protein yakın uyum. (A) Yan ve üst görünümlerde temsil edilen tüm RBD aşağı yakın konformasyonun otomatik rafine ve keskinleştirilmiş spike protein haritası. (B) EM haritası, yan zincirlerin daha iyi görselleştirilmesi için kristal yapı ile donatılmıştır. Oklar, haritadaki bölgelerin yan zincirler (C) yoğunluklarına sahip olduğunu gösterir. Kısaltmalar: RBD = reseptör bağlama etki alanı; EM = elektron mikroskopisi; NTD = N- terminal etki alanı; S1 = alt birlik 1; S2 = alt birlik 2. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: Latitude-S görüntü alma GUI'liği: Çeşitli mikroskop denetleyicileri (örn. sütun vanası açık/kapalı, ekran ekleme/geri çekme Latitude-S GUI tarafından kontrol edilir. Sütun vanası, kamera, ekran durumu ve sıvı azot dolumu sol panelde kontrol edilebilir. Bu panelin altında, çeşitli kalibrasyon parametreleri yeşil görünür (örneğin, Büyütme, ışın eğimi, nesnel odak). Herhangi bir parametre siyah görünürse, parametrenin doğru şekilde en iyi duruma getirilmiş olmadığını gösterir. Bu nedenle, yeni bir oturuma başlamadan önce tüm parametreler en iyi duruma getirilmelidir. Kısaltma: GUI = grafik kullanıcı arayüzü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S2: Atlas durumunun gösterimi. Izgara karelerini ve oluşan buz türünü gösteren farklı Atlas durumları. (A-F) Çeşitli Atlas boyutları da vurgulanmıştır. (A, B, D, F) Kalın bir buz deseni vurgulanır. (C, D) Kırık kareler vurgulanır. Kalın buz ve kırık bölgeler (şekilde işaretlenmiştir) görüntüleme için uygun değildir. (E, F) Görüntüleme için iyi ızgara kareleri; A, B, C, D ve F, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için uygun ızgara karelerini gösterir. Ancak kalın buz ızgarası kareleri ve kırık ızgara kareleri hariç tutulmalıdır. Ölçek çubukları = 100 μm (A-C), 50 μm (D, E) ve 25 μm (F). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S3: Izgara durumunun ve Delik durumunun gösterimi. Görüntüde ızgara durumu ve karşılık gelen Delik durumu gösterilir. (A, E) Görüntüde boş delik, (F, G) kalın buz, (E) buz kirlenmesi ve (A, B, C, D, E ve G) uygun buz kalınlığı işaretlenmiştir. Görüntü alımı için uygun buz kalınlığı delikleri seçilir (A, B, C, D, E ve G). Ölçek çubukları = 10 μm (A, E, F, G), 2 μm (B), 50 μm (C), 5 μm (D). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S4: Otomatik görüntüleme için delik referansı. Delik görüntüsü (QUANTIFOIL-Holey Carbon grid QUANTIFOIL R 1.2/1.3) yakalanır ve ileride başvurmak üzere kaydedilir. Delik referansının boyutu, farklı ızgara türlerine göre değiştirilebilir. Yeni bir oturuma başlamadan önce her zaman delik başvurusunu yakalamanız önerilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S5: Çeşitli büyütmelerde ve delik seçiminde görüntü yakalama paneli. (A) Yakalama paneli veri toplama ayarlarını gösterir. (B) Latitude-S ana gezinti penceresi art arda üç büyütme gösterir. Atlas durumunda (150x), veri toplama için ızgara kareleri seçilir (sol panel, ölçek çubuğu = 50 μm). Daha yüksek büyütmede (380x), tek bir kareye odaklanıldı (orta panel, ölçek çubuğu = 20 μm). Daha yüksek büyütme (4.300x), her karenin içindeki delikler odaklanmıştır (sağ panel, ölçek çubuğu = 5 μm). Ancak, bu büyütmeler ızgaraların boyutuna ve şekline göre değişecektir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S6: Delik seçimi ve görüntüleme için bir şablon oluşturma. Şablon oluşturma, veriler için deliğe bir konum eklenerek gerçekleştirilir ve odak karbon yüzeyindeki deliğe bitişik olarak konumlanır. Odak karbon alanına yer vermelidir, böylece kiriş çapı bitişik herhangi bir deliğe dokunmamalıdır. Ölçek çubukları = 20 μm (sol panel), 10 μm (orta panel), 1000 nm (sağ panel). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S7: Latitude-S ve görüntü taraması kullanılarak SARS-CoV2'nin kriyo-EM görüntülemesi. (A) Edinilen mikrografların taranır: 1D CTF uyumu, 2D CTF uyumu ve CTF parametreleri; cisTEM kullanılarak SARS-CoV2 spike protein verilerinin tahmini. 1D CTF uyumu ve Thon halkası, genel sinyalin 4,8 şolduğunu gösterir. Ölçek çubukları = 50 nm. (C) Son 2D sınıf ortalaması. 2B sınıf ortalaması spike proteininin üst, alt ve yan görünümlerini gösterir. Tüm yüksek çözünürlüklü ayrıntılar 2D sınıf ortalamalarında görülebilir. Kısaltmalar: kriyo-EM = kriyo-elektron mikroskopisi; 1D = tek boyutlu; 2D = iki boyutlu; CTF = karşıtlık aktarım işlevi; SARS-CoV2 = şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S8: Latitude-S yazılımı kullanılarak elde edilen SARS-CoV2 spike protein verilerinin veri işlemesi. Görüntü, spike proteininin kriyo-EM verilerini işlemek için izlenen iş akışını gösterir. Spike proteininin 3D sınıflandırılması Relion 3.0 kullanılarak gerçekleştirilir. Sınıf-1, 1-RBD yukarı açık uygunluğunu gösterir. Sınıf-3 ve Sınıf-4 tüm RBD'yi spike-proteinin yakın uyumunu gösterir. Sınıf-5, spike proteininin ara uyumunu gösterir. Kısaltmalar: kriyo-EM = kriyo-elektron mikroskopisi; 3D = üç boyutlu; RBD = reseptör bağlama etki alanı; SARS-CoV2 = şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S9: Son görüntü alımı için referans olarak yakalanan doz kesirli görüntü. Doz fraksiyonasyon görüntüleri 8.0 s pozlama ve 0.2 s / çerçeve pozlama ile yakalanır. Film dosyalarını otomatik olarak kaydetmek için kameranın yanındaki Otomatik kaydet düğmesine tıklayın. Görüntü alımından sonra, görüntüyü tıklayın ve veri toplama durumundaki görüntü güncellenmiş düğmesini kullanarak doz kesirli görüntü parametrelerini kaydedin. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S10: Oluşturulan SARS-CoV-2 1 RBD'nin açısal dağılımı ve Fourier kabuk korelasyonu açık uygunluk başak proteini haritası. (A) 1-RBD'nin son 3D modelinin açısal dağılımı, spike proteininin açık uygunluğu. Mavi daha düşük değerleri, kırmızı ise normalleştirilmiş parçacık dağılımının daha yüksek değerlerini temsil eder. (B) 1-RBD yukarı açık spike proteini uyumunun 4.4 şçözünürlüğünü gösteren fourier kabuk korelasyon eğrisi, kesmede tahmin edilmektedir. Kısaltmalar: 3D = üç boyutlu; RBD = reseptör bağlama etki alanı; SARS-CoV2 = şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2; FSC = Fourier kabuk korelasyonu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
| Atlas Görüntü Durumu | Atlas 115 |
| Büyütme | 115, Piksel boyutu 34.7 nm |
| Belirtilen Defocus | 4,38 mm |
| Spot Boyutu | 8 |
| Parlaklık | 934400 |
| Mod | GÖRÜNTÜLEME |
| Binn | 1 |
| Pozlama Süresi | 1.0 sn |
| Kılavuz Anket Durumu | Izgara 380 |
| Büyütme | 380, Piksel boyutu 11,2 nm |
| Belirtilen Defocus | 2,37 mm |
| Spot Boyutu | 8 |
| Parlaklık | 626200 |
| Mod | GÖRÜNTÜLEME |
| Binn | 1 |
| Pozlama Süresi | 1.0 sn |
| Delik Anket Durumu | Delik 3400 |
| Büyütme | 3.400, Piksel boyutu 1.20 nm |
| Belirtilen Defocus | -0,75 μm |
| Spot Boyutu | 7 |
| Kiriş Çapı | 8,81 μm |
| Mod | IMAGINGILM, SA, Mh |
| Binn | 1 |
| Pozlama Süresi | 1.0 sn |
| Odak Durumu | Odak 45k |
| Büyütme | 45.000, Piksel boyutu 0.0924 nm |
| Belirtilen Defocus | 4,51 μm |
| Spot Boyutu | 6 |
| Kiriş Çapı | 0.716 μm |
| Mod | IMAGINGILM, SA, Mh |
| Binn | 1 |
| Pozlama Süresi | 1.0 sn |
| Acqisition Durumu | Veri 45k |
| Büyütme | 45.000, Piksel boyutu 0.0924 nm |
| Odaklama Yapısı | Min: -4.500 nm, Maks: -1.500 nm, Adımlar: 250 nm |
| Spot Boyutu | 6 |
| Kiriş Çapı | 0,752 μm |
| Mod | IMAGINGILM,SA,Mh |
| Binn | 1 |
| Pozlama Süresi | 20 kare için toplam 8 s pozlama |
| Kamera kurulumu | Sayıldı, Kazanç Normalleştirildi, Kusur Düzeltildi |
| Veri kaydetme kurulumu | MRC |
Tablo 1: Enlem-S durum kurulum özeti.
| Şartname | K2 Tabanı | K2 Zirvesi |
| TEM çalışma voltajı | 200-400 kV | |
| Sensör etkin alanı | 19,2 mm × 18,6 mm | |
| Piksel cinsinden sensör boyutu | 3838 × 3710 | 7676 × 7420 Süper- Çözünürlük |
| Fiziksel al piksel boyutu | 5 μm | |
| Binn | 1–8x | |
| Sensör okuma | Herhangi bir keyfi alan | |
| Filme göre büyütme | 1,3–1,5x | |
| Sensör okuma hızı | 50 tam fps | 400 tam fps |
| Hızı bilgisayara aktarma | 8 tam fps | 40 tam fps |
| Görüntü görüntüsü | 8 tam fps | 10 tam fps |
| DQE performansı (300 kV) | >0.30 (zirve) >0.25 fiziksel Nyquist 0.5 | >0.7 (zirve) >0.50 fiziksel Nyquist 0.5 > 1.25 fiziksel Nyquist 1.25 |
| Yazılım | DigitalMicrograph dahil Gatan Mikroskopi Paketi |
Tablo 2: Kamera özellikleri.
| Yapılandırma Seçeneği | Değer |
| Mikroskop Türü | Talos Arctica G2 |
| Yüksek Gerilim | 200 kV |
| Kaynak | XFEG |
| Mercek | Cryo İkiz |
| Vakum Sistemi | Talos TMP IGP |
| Örnek Yükleyici | Otomatik Yükleyici |
Tablo 3: Mikroskop yapılandırması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Latitude-S, iki gün içinde binlerce yüksek çözünürlüklü mikrografiyi veya film dosyasını otomatik olarak kurmak ve toplamak için bir ortam sağlayan sezgisel bir kullanıcı arayüzüdür. Izgaralarda kolay gezinme sağlar ve düşük büyütmeden yüksek büyütmeye geçerken mikroskop aşamasının konumunu korur. Latitude-S ile veri toplamanın her adımı, basit bir kullanıcı arayüzü, 4,5 GB/s hıza kadar hızlı veri akışı ve edinme sırasında verilerin aynı anda görüntülenmesi gibi özelliklerle zaman açısından verimlidir. Ek olarak, önceden kalibre edilmiş doz fraksiyonasyonu, doz oranı, odaklama ve büyütme parametreleri, otomatik veri toplamanın yeni bir oturumuna başlamak ve zamandan tasarruf etmek için kolayca yeniden yüklendi.
Sürekli izlemenin yokluğunda ve veri kümesinin kalitesinden ödün vermeden otomatik olarak veri almak zor ve zaman alıcı bir iştir. Latitude-S yazılımını kullanarak otomatik veri toplama, özellikle bu salgın sırasında zaman ve kaynaklar önemli kısıtlamalar olduğunda uygundur. Bununla birlikte, son birkaç ay içinde, ilaç şirketlerinin aşı geliştirmesine yardımcı olacak çeşitli SARS-CoV-2 proteinlerinin birkaç kriyo-EM yapısı çözüldü. Farklı laboratuvarlar, veri toplamak için farklı türde otomatik veri toplama yazılım paketleri kullanır. Delikli karbon ızgaralarında veya ev yapımı GO kaplamalı ızgaralarda kriyo-EM otomatik veri toplama için K2 Summit DED'li Latitude-S kullandık30.
Bu çalışma, Latitude-S'in tek parçacıklı kriyo-EM için otomatik veri toplama için uygun ve ideal bir yazılım paketi olduğuna dair güçlü kanıtlar sağlayan protokol bölümünde yukarıda belirtilen parametreler kullanılarak gerçekleştirildi. Ancak, bir K2 kamera kullanarak görüntülemeye başlamadan önce belirli protokollere uyulması şiddetle tavsiye edilir. K2 doğrudan algılama kamerası, en yüksek performansı elde etmek için temel bakım rutinleri gerektirir. Kameranın 24 saat boyunca 50° 'ye düzenli tavlama, arka plan gürültüsünü ve yüzey seviyesindeki kirlenmeyi azaltarak sensörün en iyi performansı göstermesine yardımcı olur. Ancak, kamera tavlamadan sonra, kameranın kazancını ve karanlık referanslarını güncellemek, herhangi bir görüntü alımını gerçekleştirmeden önce zorunlu bir adımdır (~45 dakika sürer).
Latitude-S, cryo-EM otomatik veri toplama için kararlı ve kullanıcı dostu bir yazılım paketi olmasına rağmen, başlangıçta Latitude-S'in 5 farklı eyaletinde çeşitli parametreleri (büyütmeler, spot boyutu, parlaklık ve doz oranı) optimize etmek önemlidir. Deliklerin veya ızgara durumlarının büyüttilmesi, delikli ızgaraların veya delikli ızgara türlerinin (örneğin, R2/2 veya R1.2/1.3 veya R 0.6/1) delik boyutlarına bağlıdır. Örneğin, R0.6/1 tipi ızgara deliği boyutu 0.6 μm ve R2/2 ızgarasının delik boyutu 2 μm'dir. Bu nedenle, Latitude-S'deki ızgara ve delik durumlarında R0.6/1 ve R2/2 ızgara tipleri için delikleri düzgün bir şekilde görselleştirmek için iki farklı büyütme türü gerekir.
Bu nedenle, 5 farklı durumda çeşitli ızgara türleri için büyütme ayarları değişken olacaktır. Spot boyutu ve parlaklığı büyük ölçüde büyütmeye bağlıdır. Bu nedenle, bu değerler farklı büyütme değerlerinde değişebilir. Bu nedenle, otomatik veri alımına başlamadan önce farklı cryo-EM ızgaraları kullanarak Latitude-S'in 5 farklı eyaletinin çeşitli parametrelerini optimize etmeniz önerilir. Ancak, tüm parametreler optimize edildikten ve kaydedildikten sonra, kullanıcının gereksinimine göre tüm parametreleri yeniden yüklemek ve farklı büyütmelerde veya ızgara türlerinde Latitude-S kullanmak kolaydır.
K2'yi Latitude-S ile kullanmanın önemli bir yararı, kullanıcıların ışın vanasını kolayca açıp kapatabilmesi, kamerayı yerleştirebilmesi/geri çekebilmesi, mikroskobun fosfor ekranını takabilmesi/geri çekebilmesi ve Latitude-S GUI'sini kullanarak sıvı azot dolumunun düzenlenebilmesidir. Bununla birlikte, diğer seçeneklere (top eğme, top kaydırma, ışın kaydırma, pivot noktaları, C2 diyafram merkezleme, dönme merkezi, koma içermeyen hizalama gibi) K2 Latitude-S GUI Sekmesinden (Ek Şekil S1 ve Şekil 2) erişilemez. Uzun veri toplama saatlerinde kirişin konumu değişebilir.
Latitude-S, veri toplama dönemi boyunca sistemin kararlılığını izlemek için otomatik periyodik kontroller ve düzeltmeler gerçekleştirebilir. Işın ortalanarak ve karanlık referanslar güncellenerek sistemin stabilitesi korunur. Sürekli kontrol, elde edilen verilerin yüksek kalitesini sağlar. Latitude-S'de, ösantrik yükseklik (Z yüksekliği) veri toplamadan önce yalnızca bir kez düzeltilir ve ötemerkez yüksekliği kılavuz karesini değiştirdiğinde Latitude-S tarafından otomatik olarak hesaplanır. Odak, kullanıcı tanımlı odak aralığına göre otomatik olarak ölçülür ve ayarlanır. Program, verilen eşik değerini aşarsa aşama Z konumunu sıfırlar. Bu kararlılık, Sistem Kararlılığı paleti aracılığıyla denetlenr. Bununla birlikte, diğer otomatik veri toplama paketleri gibi Latitude-S'in de bazı sınırlamaları vardır.
Enlem-S, ızgara düzensizse ösantrik yüksekliği (Z yüksekliği) hesaplayamaz. Bu senaryoda, herhangi bir veri toplayamaz veya defocus değerleri tamamen aralık dışında olacaktır. Bu nedenle, kullanıcılar enlem-S kullanarak herhangi bir bükülme ve görüntü olmadan ızgaralarını hazırlamak için son derece dikkatli olmalıdır. Ayrıca, Leginon, SerialEM ve UCSF-Image'ın aksine, Latitude-S serbestçe kullanılabilen bir yazılım paketi değildir. Latitude-S, filtrelenmiş veya bağımsız K2, K3 ve K3 temel doğrudan algılama kameralarının yanı sıra Rio ve OneView kameraları da dahil olmak üzere Gatan kameralarla uyumludur. Kullanıcılar için bir diğer önemli dezavantaj, Falcon DED gibi diğer popüler DED'lerle uyumlu olmamasıdır. Bununla birlikte, bu, kriyo mikroskoplarla kullanılabilen ve yalnızca Falcon kamera ile uyumlu olan başka bir otomatik veri toplama yazılım paketi olan EPU için de geçerlidir. Bununla birlikte, EPU ayrıca bir enerji filtresine (BioQuantum K3 Görüntüleme Filtresi) sahip K2 / K3 ile işlevseldir, ancak bağımsız bir K2 / K3 kamera ile değildir.
Latitude-S, tek parçacıklı cryo-EM için otomatik veri toplama için kullanılan yazılım paketleri olan EPU, SerialEM, AutoEM, AutoEMation ve Leginon'a oldukça benzer. Ancak Latitude-S yalnızca K2 DED, K3 DED veya BioQuantum K3 Görüntüleme Filtresi ile uyumludur. Ayrıca, Şirket tarafından Latitude-S kullanıcıları için sürekli teknik destek sağlanmaktadır. Bu teknik destek, veri toplama için K2 DED, K3 DED veya BioQuantum K3 Görüntüleme Filtresi cihazlarını kullanması gereken ve SerialEM ve Leginon gibi özgür yazılım paketlerinin nasıl kurulacağı veya kullanılacağı hakkında önceden bilgisi olmayan küçük kullanıcı grupları için yararlıdır.
Latitude'un diğer çeşitli sürümlerinde bulunan mikrokristal elektron kırınımı (mikroED), tomografi ve enerji dağıtıcı X-ışını spektrometresi (EDS) gibi birçok özellik vardır. Bu nedenle, kullanıcılar diğer modlarda veri toplama için aynı yazılım paketini kullanabilir. Bilgimize göre, microED, tomografi ve EDS için veri toplama EPU'da veya diğer yazılım paketlerinde mevcut değildir. Bu nedenle, bu Latitude yazılım paketi, tek parçacıklı cryoEM'de otomatik veri alımına ek olarak farklı amaçlar için yararlı olabilir. Bununla birlikte, her ikisi de ücretsiz yazılım paketi olan SerialEM ve Leginon, Falcon veya K2 /K3 kameralar için uygundur ve yeni kullanıcılar için son derece yararlıdır. Ancak, Latitude-S serbestçe kullanılamaz, bu da bu yazılım paketinin bir dezavantajı olabilir.
Özetle, Latitude-S otomatik veri toplama aracı diğer otomatik veri toplama yazılım paketleri (örneğin, EPU, Leginon, SerialEM, UCSF-Image) kadar iyidir. Latitude-S, filtrelenmiş veya bağımsız K2, K3 ve K3 temel doğrudan algılama kameralarının yanı sıra Rio ve OneView kameralarla kullanılabilen son derece kararlı ve kullanıcı dostu bir veri toplama yazılım paketidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri rakip veya finansal çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Biyoteknoloji, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (DST) ve Bilim Bakanlığı ile İnsan Kaynakları Geliştirme Bakanlığı (MHRD), Hindistan'ı, IISc-Bangalore'daki kriyo-EM tesisini finanse etmek için kabul ediyoruz. IISc, Bangalore'daki National Cryo-EM tesisi için DBT-BUILDER Programı (BT/INF/22/SP22844/2017) ve DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) onaylıyoruz. Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 ve SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Kriyo-EM ızgaraları, kriyo-EM veri toplama ve Malzeme Masası'nı hazırladığı için Bayan Ishika Pramanick'e teşekkür ederiz. Ayrıca Bay Suman Mishra'ya kriyo-EM görüntü işleme ve rakamları hazırlamamıza yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Bu çalışma için saflaştırılmış spike protein örneğini elde etmemize yardımcı olduğu için Prof. Raghavan Varadarajan'a teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
References
- Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
- Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
- Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
- Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
- Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Kühlbrandt, W.
- McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
- Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
- Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
- Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
- Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
- Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
- Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, Pt 3 384-389 (2007).
- Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
- Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
- Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
- Hillen, H. S., et al.
- Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
- Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
- Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).
