Summary
الهدف من هذه الطريقة هو فحص ارتفاع الحرارة أو النوبات الناجمة عن الحرارة في نماذج الفئران. يصف البروتوكول استخدام غرفة مبنية خصيصا مع مراقبة مستمرة لدرجة حرارة الجسم لتحديد ما إذا كانت درجة حرارة الجسم المرتفعة تؤدي إلى نوبات.
Abstract
أثبتت نماذج الفئران المعدلة وراثيا أنها أدوات قوية في دراسة الجوانب المختلفة للاضطرابات العصبية البشرية ، بما في ذلك الصرع. يشمل الصرع الوراثي المرتبط ب SCN1A مجموعة واسعة من اضطرابات النوبات مع اختراق غير كامل وتباين سريري. يمكن أن تؤدي طفرات SCN1A إلى مجموعة كبيرة ومتنوعة من النمط الظاهري للنوبات تتراوح بين النوبات الحموية البسيطة والمحدودة ذاتيا المرتبطة بالحمى (FS) والصرع الوراثي المعتدل المستوى مع النوبات الحموية بالإضافة إلى (GEFS+) إلى متلازمة درافيت الأكثر حدة (DS). على الرغم من أن FS ينظر إليه عادة في الأطفال الذين تقل أعمارهم عن 6-7 سنوات والذين ليس لديهم صرع وراثي ، إلا أن FS في مرضى GEFS + لا يزالون يحدثون في مرحلة البلوغ. تقليديا ، تم تحفيز FS التجريبي في الفئران عن طريق تعريض الحيوان لتيار من الهواء الجاف أو مصابيح التدفئة ، وغالبا ما لا يتم التحكم في معدل التغير في درجة حرارة الجسم بشكل جيد. هنا ، نصف غرفة تسخين مصممة خصيصا ، مع واجهة زجاجية شبكية ، مزودة بوحدة تحكم رقمية في درجة الحرارة ومروحة كهربائية مجهزة بسخان ، والتي يمكنها إرسال الهواء القسري الساخن إلى ساحة الاختبار بطريقة يتم التحكم في درجة حرارتها. يمكن زيادة درجة حرارة جسم الفأر الموضوع في الغرفة ، والذي تتم مراقبته من خلال مسبار المستقيم ، إلى 40-42 درجة مئوية بطريقة قابلة للتكرار عن طريق زيادة درجة الحرارة داخل الغرفة. يوضح الرصد البصري المستمر للحيوانات خلال فترة التسخين تحريض النوبات الناجمة عن الحرارة في الفئران التي تحمل طفرة FS في درجة حرارة الجسم التي لا تثير نوبات سلوكية في زملاء القمامة من النوع البري. يمكن إزالة الحيوانات بسهولة من الغرفة ووضعها على وسادة تبريد لإعادة درجة حرارة الجسم بسرعة إلى وضعها الطبيعي. توفر هذه الطريقة بروتوكول فحص بسيط وسريع وقابل للتكرار لحدوث نوبات ناجمة عن الحرارة في نماذج فأر الصرع.
Introduction
يتميز الصرع، وهو رابع أكثر أنواع الاضطرابات العصبية شيوعا في الولايات المتحدة1، باختلال التوازن بين الدافع المثير والمثبط في الجهاز العصبي المركزي الذي يؤدي إلى نوبات متكررة. يمكن أن تحدث النوبات الحموية (FS) أو النوبات المرتبطة بالحمى في عموم السكان ، وغالبا ما تحدث في الأطفال في وقت مبكر من 3 أشهر حتى 6-7 سنوات من العمر. ومع ذلك ، في بعض الأفراد الذين يعانون من طفرات جينية ، في معظم الأحيان في جين قناة الصوديوم ، يمكن أن يستمر FS بعد سن 7 سنوات في مرحلة البلوغ. يشار إلى هذه الحالة باسم النوبات الحموية زائد أو FS +. وقد حدد التقدم السريع في تسلسل الجينوم أكثر من 1300 طفرة في جين قناة أيون الصوديوم البشرية SCN1A، مما يجعلها نقطة ساخنة لطفرات الصرع. تم ربط طفرات SCN1A بمجموعة واسعة من اضطرابات النوبات، بما في ذلك النوبات الحموية (FS)، والصرع الوراثي مع النوبات الحموية زائد (GEFS+)، ومتلازمة درافيت (DS)2،3،4،5،6. حوالي 20٪ من طفرات سوء الفهم SCN1A تؤدي إلى GEFS + 5,7,8. يمكن أن يتطور تاريخ الأطفال من FS المعقد أو المطول في مرحلة الطفولة لاحقا إلى أشكال أكثر إضعافا للصرع مثل صرع الفص الصدغي (TLE) 9،10،11. تنشأ متلازمة درافيت بسبب طفرات الاقتطاع أو فقدان الطفرات الوظيفية في SCN1A وهي شكل حاد من أشكال الصرع المستعصي ، مع بداية الطفولة من النوبات الحموية التي تتطور إلى نوبات حرارية ، وغالبا ما ترتبط بالإعاقات المعرفية والتنموية والحركية2,5,12 . نظرا لأن العديد من الأفراد المصابين ب GEFS + و / أو DS يظهرون نوبات حموية ، يصبح من الضروري تطوير علاجات جديدة لمكافحة اضطرابات النوبات هذه بشكل أفضل.
أثبتت النماذج الحيوانية للصرع المرتبط ب SCN1A أنها لا تقدر بثمن في توصيف أنواع مختلفة من النوبات (الحموية مقابل المعممة) وتشريح الآلية العصبية لتوليد النوبات13،14،15،16،17،18. في حين أن دراسة النوبات التلقائية عبر تسجيلات EEG / EMG في أدمغة القوارض راسخة وهي أداة مفيدة للغاية ، إلا أن عددا قليلا فقط من الدراسات حاولت محاكاة النوبات الحموية في نماذج الفئران14،16،19،20،21،22،23 . استخدمت دراسات سابقة نفاثة من الهواء الجاف الساخن ، أو أسطوانة ميثاكريليت مزودة بنظام حراري ، أو مصابيح حرارية مزودة بوحدة تحكم في درجة الحرارة في ساحات الاختبار المغلقة9،16،21،22،23،24 للحث على النوبات عن طريق ارتفاع الحرارة. من أجل زيادة درجة حرارة الجسم في بيئة أكثر تحكما ، يستخدم البروتوكول الموصوف هنا غرفة مصممة خصيصا مع نظام تسخين يتم التحكم في درجة حرارته يسمح بمعدلات زيادة قابلة للتكرار في درجة حرارة جسم الماوس داخل الغرفة. تم بناء غرفة الحرارة من الخشب (الطول 40 سم × العرض 34 سم × الارتفاع 31 سم) وتم تزويدها بوحدة تحكم رقمية في درجة الحرارة مع ثنائي حراري K. تقوم مروحة محورية صغيرة مجهزة بسخان في اللوحة الخلفية للغرفة بتوجيه الهواء الساخن إلى الغرفة التي تنظمها وحدة تحكم رقمية في درجة الحرارة. يمكن نظام تسخين الهواء القسري هذا المرء من التحكم في المعدل الذي تزداد به درجة حرارة الغرفة. (الشكل 1 ألف، ب). يرسل المزدوجان الحراريان K الموجود داخل غرفة الحرارة الخشبية ملاحظات إلى وحدة التحكم الرقمية في درجة الحرارة ، للحفاظ على درجات حرارة ثابتة داخل الصندوق أثناء الفحص. إن ضبط درجة الحرارة على وحدة التحكم الرقمية في درجة الحرارة ، يمكن المروحة الكهربائية من إرسال هواء قسري ساخن من خلال فتحات لتسخين الغرفة بشكل موحد (الشكل 1A). اللوحة الأمامية للغرفة الحرارية عبارة عن ورقة زجاجية شبكية شفافة لتمكين تسجيل الفيديو السهل للتجارب.
تم اختيار الفئران البالغة (P30-P40) ، غير المتجانسة الزيجوت لطفرة سوء الفهم في SCN1A التي تسبب GEFS + وعدد متساو من زملاء القمامة من النوع البري للعمل كمجموعة تحكم ، لكل تجربة. وبلغ وزن الحيوانات، ذكورا وإناثا، المستخدمة في هذه الدراسات ما لا يقل عن 15 غراما، حيث كانت الفئران البرية التي تزن أقل أكثر حساسية للنوبات الناجمة عن الحرارة من الحيوانات الأثقل وزنا من نفس العمر. في الدراسة التجريبية ، لوحظ أن كل من الفئران المتحولة والبرية تبحث عن الزوايا الأكثر برودة في الغرفة في الخلف وبقيت هناك لفترات طويلة من الزمن. للتحايل على ذلك ، تم تقليل حجم الأرضية الفعال داخل ساحة اختبار غرفة الحرارة إلى طول 16.5 سم × عرض 21.5 سم × ارتفاع 27.5 سم عن طريق وضع كتلة خشبية B (الأبعاد 20 سم × 8 سم × 7.2 سم) في الجانب الأيمن من الغرفة (الشكل 1A). تم بناء غرفة الحرارة من الخشب الرقائقي بسماكة 1.9 سم (الطول 40 سم × العرض 34 سم × الارتفاع 31 سم) مغطاة بصفح أبيض ومزودة بوحدة تحكم رقمية في درجة الحرارة مع مزدوج حراري K. السطح الرقائقي لجدران الغرفة غير منفذ ويمكن تعقيمه بسهولة بين التجارب عن طريق المسح بالإيثانول بنسبة 70٪. تم ضبط درجة حرارة غرفة الحرارة في البداية على 50 درجة مئوية وتم تسخينها مسبقا لمدة 1 ساعة على الأقل قبل بدء التجربة ، لضمان تسخين موحد داخل الغرفة. تم تزويد كل فأر بمقياس حرارة مستقيمي للمراقبة المستمرة لدرجة حرارة الجسم طوال التجربة. تم وضع فأر واحد في الغرفة في كل مرة وتم الحفاظ على درجة الحرارة عند 50 درجة مئوية بين الدقيقة 1 و 10. ثم تم رفع درجة الحرارة إلى 55 درجة مئوية في الدقيقة 11-20 ، وأخيرا رفعت إلى 60 درجة مئوية في الدقيقة 21-30. وأدى ذلك إلى زيادة في معدل الزيادة القابلة للتكرار في درجة حرارة جسم الفأر (الشكل 2 ألف). تم تسجيل كل تجربة بالفيديو وتم إجراء تحليل سلوكي في وضع عدم الاتصال.
يمكن تعديل بروتوكول التسخين بسهولة لتغيير درجة الحرارة الأولية لغرفة الحرارة ومعدل تسخين الغرفة ، مما يؤدي بدوره إلى تغيير مدى سرعة ارتفاع درجة حرارة جسم الماوس أثناء الفحص. وبالتالي ، توفر هذه الطريقة المزيد من المرونة مقارنة بالطرق التقليدية في إعداد الشاشات السلوكية التي تنطوي على نوبات ناجمة عن الحرارة. يمكن أيضا استخدام بروتوكول النوبات المستحثة بالحرارة للكشف عن الأدوية المضادة للصرع التي تجعل الفئران المتحولة أكثر مقاومة للنوبات الناجمة عن الحرارة أو تزيد من درجة حرارة العتبة التي تلاحظ عندها النوبات. وبالمثل ، يمكن فحص الآثار المفيدة لأنظمة النظام الغذائي التقييدي مثل نظام كيتو الغذائي على النوبات الناجمة عن الحرارة في الفئران العادية التي تتغذى على تشاو مقابل الفئران التي تتغذى على الكيتو.
الشكل 1: وصف غرفة حرارة الماوس المصممة خصيصا . (أ) تعرض اللوحة الأمامية لغرفة حرارة الماوس الخشبية لوحة التحكم الجانبية التي تحتوي على مفتاح التشغيل / الإيقاف الذي يقوم بتشغيل وحدة التحكم الرقمية في درجة الحرارة ، والمزدوجات الحرارية K ، ومفتاح التشغيل / الإيقاف في سخان المروحة ومؤشر الحرارة. تظهر الأبعاد الخارجية للصندوق وساحة الاختبار الداخلية بالسنتيمتر. كما تظهر كتلة خشبية B تستخدم لتقليل سطح ساحة الاختبار بشكل فعال. الجزء السفلي من ساحة الاختبار مغطى بفراش قطعة خبز لمنع الفئران من ملامسة الأسطح الخشبية الساخنة مباشرة. (ب) تظهر اللوحة الخلفية لغرفة الحرارة المروحة المثبتة على فتحة التهوية العلوية وسلك الطاقة لتزويد الغرفة بالكهرباء. تم تعديل هذا الرقم من الشكل 3 في Das et al.، 2021، eNeuro14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في جامعة كاليفورنيا ، إيرفين.
1. التحضير لفحص النوبات الناجمة عن الحرارة
- قم بتشغيل زر التشغيل في غرفة الحرارة ، متبوعا بزر التشغيل الحراري.
- اضبط درجة حرارة غرفة الحرارة على 50 درجة مئوية باستخدام لوحة المفاتيح الموجودة على وحدة التحكم الرقمية في درجة الحرارة.
- انتظر لمدة لا تقل عن 1 ساعة لتسخين الغرفة عند 50 درجة مئوية قبل إدخال الماوس الأول إلى الغرفة. يضمن التسخين المسبق تدفئة موحدة داخل الغرفة.
- خط أرضية غرفة حرارة الماوس مع فراش قطعة خبز.
- قم بتركيب كاميرا تسجيل فيديو أمام غرفة الحرارة لتسجيل كل تجربة فحص للنوبات الناجمة عن الحرارة.
- قم بتبطين طبق بتري قطره 140 مم بطبقات سميكة من المناديل الورقية وضعه على الجليد ليكون بمثابة وسادة تبريد.
ملاحظة: في نهاية الفحص ، سيتم نقل الماوس الفردي على وسادة التبريد المبردة مسبقا للمساعدة في خفض درجة حرارة الجسم المرتفعة.
2. إعداد الماوس لفحص النوبات الناجمة عن الحرارة
- اختر 10 فئران بالغة (P30-P40) ، و 5 تحمل الصرع المسبب للطفرة و 5 من زملاء القمامة من النوع البري لفحص النوبات الناجم عن الحرارة.
ملاحظة: الفئران من النوع البري ، التي لا تؤوي أي صرع يسبب طفرة ، لا تظهر نوبات ناجمة عن الحرارة عند درجات حرارة أقل من 44 درجة مئوية وتعمل كمجموعة التحكم. - وزن كل ماوس لاستخدامه في فحص الفحص وتسجيل وزن جسمه. يجب استخدام الفئران التي تزن 15 جم أو أكثر فقط للفحص.
- قم بفحص ماوس واحد في كل مرة في غرفة حرارة الماوس.
- تخدير الماوس لفترة وجيزة لمدة 10-15 ثانية باستخدام بضع قطرات من الأيزوفلوران في الجزء السفلي من جرة الجرس.
- أخرج الحيوان من جرة الجرس وضعه على منشفة ورقية.
- تأكد من تخدير الماوس بالكامل عن طريق التحقق من أن الماوس لا يستجيب لقرصة إصبع القدم الضارة.
- قم بتغطية الطرف المعدني لمسبار درجة حرارة المستقيم بمادة تشحيم (مثل الفازلين) وأدخله برفق في الماوس على عمق أقل من أو يساوي 2 سم.
- قم بتأمين مسبار المستقيم على ذيل الماوس بشريط لاصق ، بحيث لا يخرج المسبار أثناء الفحص.
ملاحظة: بدلا من ذلك ، ضع الحيوان في مخروط مانع الماوس وأدخل مسبار درجة حرارة المستقيم. قم بتأمينه عن طريق النقر على الذيل. - تأكد من توصيل مسبار المستقيم بمقياس متعدد يعرض درجة حرارة الجسم الداخلية للماوس.
- ضع الحيوان في قفص جديد مبطن بفراش قطعة خبز ، أي قفص الاسترداد.
- ابدأ تشغيل مؤقت وانتظر لمدة 5 دقائق. راقب الفأر حتى يتعافى تماما من التخدير ويكون الماوس نشطا ومهذبا.
- في الوقت نفسه ، راقب درجة حرارة الجسم الأساسية للماوس حتى يستقر عند 35-36 درجة مئوية.
- في نهاية 5 دقائق ، لاحظ درجة حرارة جسم الماوس. هذه هي درجة حرارة الجسم الأولية في الوقت "0" دقيقة.
ملاحظة: إذا كانت درجة حرارة الجسم الأساسية للفأر أقل من 35 درجة مئوية ، فانتظر وقتا إضافيا حتى يتعافى الحيوان من انخفاض حرارة الجسم الناجم عن التخدير. - بسرعة ، انقل الماوس الفردي إلى غرفة الماوس المسخنة مسبقا. يمثل هذا بداية تجربة التجربة. يتم فحص ماوس واحد فقط في وقت معين.
3. فحص النوبات الناجمة عن الحرارة
- بعد وضع الماوس برفق على أرضية غرفة حرارة الماوس المسخنة مسبقا ، أغلق باب زجاج شبكي وابدأ تشغيل الكاميرا لتسجيل التجربة بالفيديو.
- ابدأ تشغيل ساعة التوقيت. سجل درجة حرارة جسم الماوس من ميزان الحرارة المستقيمي على فترات 1 دقيقة طوال مدة التجربة.
- على فترات منتظمة ، قم بزيادة درجة حرارة غرفة حرارة الماوس بحيث تزداد درجة حرارة جسم الماوس بمعدل 0.25-0.5 درجة مئوية / دقيقة.
ملاحظة: يمكن أن تؤدي الزيادات السريعة في درجة حرارة الجسم إلى ضربة شمس أو وفاة ويجب تجنبها. - باتباع هذا البروتوكول ، قم بزيادة درجة حرارة غرفة حرارة الماوس بمقدار 5 درجات مئوية كل 10 دقائق كما هو موضح في الشكل 2A.
- في 9.5 دقيقة ، اضبط درجة حرارة غرفة الحرارة على 55 درجة مئوية ، لتحقيق الاستقرار في درجة حرارة غرفة الحرارة إلى 55 درجة مئوية بحلول الدقيقة 10 كما هو موضح في شاشة درجة الحرارة الرقمية.
- وبالمثل ، قم بزيادة درجة الحرارة إلى 60 درجة مئوية في 19.5 دقيقة لتحقيق الاستقرار في درجة حرارة غرفة الحرارة إلى 60 درجة مئوية بحلول الدقيقة 20. تستمر كل تجربة فحص النوبات لمدة 30 دقيقة.
- إذا كان الفأر يعاني من نوبة (ينطق ، أو يظهر إيماءة الرأس ، أو كلونس الطرف الأمامي ، أو تمديد الطرف الخلفي ، أو يسقط على جانبه ، أو يعاني من تشنجات منشطة / منشطة معممة) ، فقم بتسجيل المعلومات التالية.
- سجل درجة حرارة جسم الفأر أثناء النوبة (درجة حرارة عتبة النوبة) من ميزان حرارة درجة حرارة المستقيم.
- سجل خصائص سلوك النوبة مثل الإيماء بالرأس ، و clonus الطرف الأمامي ، وتمديد الطرف الخلفي ، والسقوط على الجانب ، و / أو النوبات المنشطة / الكلونية المعممة (GTCS) التي يعرضها الماوس.
- التقط الماوس بسرعة ولكن بلطف من الغرفة وضعه على وسادة التبريد المعدة في الخطوة 1.6.
ملاحظة: إذا كان الفأر يعاني من نوبات مقياس راسين 5 ويظهر قفزا غير منضبط ، فقد يكون من الصعب التقاط الحيوان من غرفة الحرارة ونقله إلى وسادة التبريد في الخارج. ومع ذلك ، تستمر النوبة النموذجية الناجمة عن الحرارة بين 30 ثانية إلى 60 ثانية.وبالتالي ، يجب إخراج الماوس من غرفة الحرارة ووضعه على وسادة التبريد في غضون 60 ثانية من بدء نوبة النوبة الناجمة عن الحرارة. - انتظر حتى تنخفض درجة حرارة جسم الماوس إلى 36-37 درجة مئوية ، قبل نقلها إلى قفص الاسترداد. يتم وضع ماوس واحد فقط في قفص الاسترداد في وقت واحد.
ملاحظة: لا تخلط الفئران التي لم يتم استخدامها بعد للفحص الناجم عن الحرارة مع الفأر الذي عانى بالفعل من تجربة النوبات الناجمة عن الحرارة. - بلطف وبعناية ، قم بقطع الشريط بين ذيل الماوس وسلك مسبار المستقيم بزوج من المقصات لإزالة مسبار المستقيم من الماوس.
- امسح الطرف المعدني لمسبار المستقيم باستخدام 70٪ من الكحول ومناديل الأنسجة الرخوة لإبقائه جاهزا للتجربة التالية.
- استمر في مراقبة الماوس في قفص الاسترداد حتى يستأنف نشاطه الطبيعي (المشي ، الاستمالة ، إلخ) ، قبل إعادة الماوس إلى قفصه المنزلي. يمثل هذا نهاية تجربة التجربة لهذا الماوس.
- تسجيل حالة الحيوان بعد الفحص حيا وتعافى من جلسة الاختبار أو ميتا. يمكن أن تؤدي النوبات عالية الكثافة التي تنطوي على القفز غير المنضبط والنوبات المنشطة / الكلاونية المعممة في بعض الأحيان إلى وفاة الفأر.
- إذا لم يتعرض الفأر لنوبات ناجمة عن الحرارة خلال فترة المراقبة التي تبلغ 30 دقيقة أو وصلت درجة حرارة جسم الماوس إلى 44 درجة مئوية ، فقم بإزالة الماوس من غرفة الحرارة وضعه على وسادة التبريد حتى تعود درجة حرارة جسم الماوس إلى 36-37 درجة مئوية.
- أعد ضبط درجة حرارة غرفة حرارة الماوس إلى 50 درجة مئوية واتركها تتوازن حتى تظهر درجة حرارة العرض على وحدة التحكم الرقمية في درجة الحرارة 50 درجة مئوية.
- تغيير فراش قطعة خبز بين تجارب الماوس الفردية.
- قم بإعداد الماوس التالي لفحص التجربة كما هو موضح في القسم 2 وكرر الخطوات من القسم 3.
4. القتل الرحيم للحيوانات
- على الرغم من أن معظم الحيوانات تتعافى بعد النوبات الناجمة عن الحرارة ، في تجربتنا ، يخضع عدد قليل من الفئران ل SUDEP (الموت المفاجئ غير المبرر في EPilepsy) في قفصها المنزلي في غضون 24-48 ساعة من النوبات الناجمة عن الحرارة. بعد الانتهاء من الفحص على جميع الفئران بشكل فردي بحثا عن النوبات الناجمة عن الحرارة بعد تجربة 30 دقيقة ، قم بالقتل الرحيم لجميع الفئران وفقا لإرشادات IACUC الخاصة بالمؤسسة.
5. تحليل بيانات النوبات الناجمة عن الحرارة
- بعد الانتهاء من فحص مجموعة من الحيوانات، احسب النسبة المئوية للفئران في نمط وراثي معين تظهر نوبات باستخدام الصيغة التالية:
- تقدير متوسط درجة حرارة عتبة النوبة لدى الفئران ضمن نمط وراثي معين عن طريق حساب متوسط درجة حرارة عتبة النوبة لجميع الفئران (المشار إليها في الخطوة 3.7) في ذلك النمط الوراثي الذي يظهر نوبات ناجمة عن الحرارة.
- بينما لا تزال عمياء عن الهوية والنمط الوراثي ، أعد تشغيل تسجيلات الفيديو لكل من الفأر أثناء فحص فحص النوبات الناجم عن الحرارة على شاشة الكمبيوتر لتسجيل شدة نوبات النوبات.
- أعط درجات للفأر الفردي الذي يظهر سلوك النوبات الناجم عن الحرارة باستخدام مقياس راسين المعدل13 كما هو موضح في الدراسات السابقة13،14. انظر الجدول 1 للحصول على التفاصيل.
- إذا كان الفأر ، أثناء تعرضه لنوبات ناجمة عن الحرارة ، يظهر فقط إيماءة الرأس ، فأعطه درجة 2. إذا بدأ الفأر نوبة نوبة مع إيماء الرأس ولكنه يظهر أيضا كلونوس الطرف الأمامي ، فإن السقوط و / أو القفز يعطيه درجة 5.
- سجل الحد الأقصى للنقاط لكل ماوس باستخدام مقياس Racine المعدل13 كما هو موضح أعلاه.
- ارسم رسما بيانيا مبعثرا لدرجات راسين القصوى التي أظهرتها جميع الفئران في نمط وراثي معين.
- قارن إحصائيا الحد الأقصى لدرجات راسين بين مجموعات الفئران المختلفة كوسيلة لتحديد شدة النوبات السلوكية مثل النوبات الناجمة عن الحرارة.
ملاحظة: درجات راسين مفيدة لمقارنة خصائص النوبات بين مجموعات الفئران المتحولة المختلفة أو الأنماط الجينية. ومن المتوقع ألا تخضع الفئران من النوع البري لنوبات ناجمة عن الحرارة ولن يكون من الضروري النظر فيها في مقارنات درجات راسين. - استنادا إلى التصميم التجريبي ، قم بإجراء تحليل إحصائي مناسب لتحديد ما إذا كانت النسبة المئوية للفئران التي تظهر نوبات بين الفئران البرية والمتحورة ، وقيم درجة حرارة عتبة النوبة المتوسطة تختلف اختلافا كبيرا عن بعضها البعض.
| راسين النتيجة | خصائص النوبة | ||
| 0 | لا توجد نوبات | ||
| 1 | حركات الفم والوجه | ||
| 2 | إيماءة الرأس | ||
| 3 | كلونو الطرف الأمامي، عادة ما يكون أحد أطرافه | ||
| 4 | Forelimb clonus مع التربية | ||
| 5 | نوبة منشط معممة ، تربية ، قفز ، سقوط فوق | ||
الجدول 1: درجات راسين.
Representative Results
من المتوقع أن تخضع النماذج الحيوانية ذات طفرات النوبات الحموية لنوبات ناجمة عن الحرارة في درجات حرارة الجسم المرتفعة التي لا تحفز النوبات في زملاء القمامة من النوع البري. تم ربط طفرات SCN1A بالنوبات الحموية، بما في ذلك مرضى K1270T GEFS+ الذين يظهرون نوبات معممة حموية وأفبريل7. قمنا بفحص الفئران الطافرة SCN1A K1270T GEFS + التي تم وصفها مؤخرا في دراسة14 لحدوث نوبات الحرارة في خلفيتين وراثيتين - مقاومة للنوبات 129X1 / SvJ (129X1) وخلفيات C57BL / NJ (B6N) الحساسة للنوبات. تتطابق مع العمر من النوع البري في غرفة حرارة الفئران التي لا تؤوي أي طفرات GEFS + وبالتالي ، لا يتوقع أن تظهر نوبات ناجمة عن الحرارة ، بمثابة المجموعة الضابطة. تم تقييم معدل تغير درجة حرارة الجسم بمرور الوقت عن طريق رسم متوسط درجة حرارة جسم الفئران المسجلة كل دقيقة أثناء الفحص. لم يكن هناك فرق في معدل تغير درجة حرارة الجسم بين الفئران المتحولة غير المتجانسة الزيجوت وزملاء القمامة من النوع البري الذين تم اختبارهم في الخلفيات الجينية 129X1 و B6N (الشكل 2B ، C). هذا يشير إلى أن التنظيم الحراري لا يتغير في الفئران المتحولة غير المتجانسة K1270T GEFS + غير المتجانسة.
أظهرت جميع الفئران المتحولة غير المتجانسة الزيجوت من 129X1 (n = 15) أو B6N (n = 9) خلفيات وراثية نوبات ناجمة عن الحرارة (الشكل 2D). لم تظهر أي من الفئران من النوع البري في الخلفية المخصبة 129X1 (n = 13) نوبات ناجمة عن الحرارة (الشكل 2D). في المقابل ، أظهر ثلث الفئران التي تم اختبارها (n = 3 من أصل 9 فئران) في خلفية B6N الحساسة للنوبات نوبات ناجمة عن الحرارة. وتبين المقارنة الإحصائية أن النسبة المئوية للفئران المتحولة غير المتجانسة الزيجوت التي تظهر نوبات ناجمة عن الحرارة كانت أعلى بكثير من نظيراتها من الفئران من النوع البري في كل من الخلفيات الجينية 129X1 و B6N (الشكل 2D، اختبار فيشر الدقيق، 129X1 p < 0.0001; B6NJ p = 0.009). كان متوسط درجة حرارة عتبة النوبة بين الفئران المتحولة غير المتجانسة في الخلفيات الجينية 129X1 و B6N متشابها. الفئران المتحولة 129X1 لديها متوسط درجة حرارة عتبة النوبة من 42.6 ± 0.20 درجة مئوية ، والتي لم تكن مختلفة اختلافا كبيرا عن متوسط درجة حرارة عتبة النوبة من 42.7 ± 0.06 درجة مئوية شوهدت في الفئران B6N (الشكل 2E ؛ اختبار t للطالب غير المقترن ثنائي الذيل ، p = 0.782). من المهم ملاحظة أن متوسط درجة حرارة عتبة النوبة لثلاثة فئران من النوع البري B6N أظهرت نوبات ناجمة عن الحرارة كانت 43.7 ± 0.08 درجة مئوية وأعلى بكثير من متوسط عتبة النوبة البالغة 42.7 ± 0.06 درجة مئوية التي أظهرتها الفئران المتحولة غير المتجانسة B6N (الشكل 2E ، اختبار t للطالب غير المقترن ذو الذيل المزدوج ، p < 0.0001).
يتيح الجزء الأمامي من زجاج شبكي للغرفة إجراء تسجيلات فيديو مستمرة أثناء الفحص يمكن استخدامها لاحقا لتسجيل شدة النوبة في كل ماوس على مقياس راسين معدل كما هو موضح سابقا14,20. أثناء الفحص النموذجي، ستعرض الفئران المتحولة غير المتجانسة الزيجوت نوبات ناجمة عن الحرارة مع النطق و / أو الإيماء بالرأس (درجة راسين 2)، والانتقال بسرعة إلى كلونس الطرف الأمامي، والسقوط على الجانب، والقفز، وتمديد الأطراف الخلفية، و / أو نوبات منشط / كلونيك معمم (درجات راسين 3-5) عندما تصل درجة حرارة الجسم إلى حوالي 42 درجة مئوية. يمثل الحد الأقصى لدرجة راسين سلوك النوبات الأكثر شدة الناجم عن الحرارة بين الفئران المتحولة. الحد الأقصى لدرجة راسين للفئران المتحولة غير المتجانسة في الخلفية المخصبة 129X1 (n = 15) لا يختلف عن الفئران المتحولة غير المتجانسة في B6N (n = 9) الخلفية الجينية (الشكل 2F; اختبار مان ويتني ، ص > 0.9999). هذا يشير إلى أن خصائص سلوك النوبات الناجمة عن الحرارة في الفئران المتحورة K1270T GEFS + مستقلة عن خلفية السلالة.
تظهر البيانات مجتمعة أن جميع الفئران المتحولة تظهر نوبات ناجمة عن الحرارة بتردد مماثل ، ودرجة حرارة عتبة النوبة ، وشدة النوبات السلوكية بطريقة مستقلة عن الإجهاد. غالبية زملاء القمامة من النوع البري لا يظهرون مثل هذه النوبات عند أو أقل من 44 درجة مئوية. حوالي ثلث الفئران الضابطة من النوع البري في خلفية B6N الحساسة للنوبات أظهرت نوبات ناجمة عن الحرارة (ربما بسبب تأثيرات الخلفية الوراثية) ولكن درجة حرارة عتبة النوبة كانت أعلى بكثير مقارنة بالفئران المتحولة في نفس الخلفية. تشير هذه النتائج إلى أن الفئران الطافرة في الخلفية الجينية B6N عرضة للنوبات الناجمة عن الحرارة عند عتبات درجات حرارة أقل بسبب طفرة SCN1A GEFS + التي تؤويها. وبالتالي ، باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن للمرء تقييم النوبات الناجمة عن الحرارة في الفئران المتحولة الصرع والتمييز عن الفئران المتطايرة من النوع البري ، والتي إما لا تخضع لنوبات ناجمة عن الحرارة أو تعرض نوبات حرارية في درجات حرارة أعلى بكثير.
الشكل 2: تظهر الفئران المتحولة نوبات ناجمة عن الحرارة. (أ) بروتوكول التسخين للفحص السلوكي للنوبات الناجمة عن الحرارة في الفئران. (ب-ج) متوسط درجة حرارة جسم الفئران عبر الزمن في النوع البري (Scn1a+/+ - المثلثات السوداء) والفئران المتحورة غير المتجانسة (Scn1aKT/+ - الدوائر البرتقالية) في خلفيتين وراثيتين 129X1 و B6N ، على التوالي. (د) النسبة المئوية للفئران التي تظهر نوبات ناجمة عن الحرارة في كلتا الخلفيتين الوراثيتين. يتم تمثيل الفئران من النوع البري (Scn1a+/+) والفئران غير المتجانسة الزيجوت (Scn1aKT / +) بأشرطة سوداء وبرتقالية ، على التوالي. تظهر الطفرات غير المتجانسة في خلفيات 129X1 و B6N في قضبان صلبة برتقالية وقضبان برتقالية مع خطوط سوداء ، على التوالي. (ه) عتبة درجة حرارة النوبة إلى النوبات الناجمة عن الحرارة في الفئران البرية (Scn1a+/+) والمتحورة غير المتجانسة (Scn1aKT/+) في كلتا السلالتين. (و) التوزيع المبعثر لدرجات راسين القصوى من النوبات المستحثة بالحرارة التي أظهرتها الفئران غير المتجانسة الزيجوت (Scn1aKT/+) في كلتا الخلفيتين الوراثيتين. تمثل كل نقطة الحد الأقصى لدرجة راسين في ماوس واحد. يظهر عدد الحيوانات في كل نمط وراثي بين قوسين. البيانات المعروضة في اللوحات B-F هي متوسطة ± S.E.M. تم تعديل هذا الرقم من الشكل 3 في Das et al.، 2021، eNeuro14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
نحن نصف بروتوكولا بسيطا وفعالا للكشف عن حدوث نوبات ناجمة عن الحرارة في الفئران ، وهو المكافئ السلوكي للنوبات الحموية في المرضى من البشر. يقيم الفحص العديد من المعلمات - بما في ذلك النسبة المئوية للفئران التي تظهر نوبات ، وعتبة النوبات ، وشدة النوبات على مقياس راسين ، من أجل مقارنة حساسية مجموعات الفئران الضابطة واختبارها مع الزيادات في درجة حرارة الجسم.
تتضمن الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول زيادة الحرارة في الغرفة مع المراقبة المستمرة لدرجة حرارة جسم الماوس. من الضروري أن تكون درجة حرارة الجسم القصوى التي ستواجهها الفئران في هذه الفحوصات هي 44 درجة مئوية لأن الحيوانات من النوع البري يمكن أن تخضع لنوبات ناجمة عن الحرارة في درجات حرارة الجسم >44 درجة مئوية. قد تؤدي المعالجة المسبقة بالتخدير العام أو المسكنات إلى تقليل درجة حرارة الجسم الأساسية للحيوانات أو تتداخل مع التنظيم الحراري ، مما يؤدي بدوره إلى إرباك جمع بيانات درجة حرارة عتبة النوبات. وبالتالي ، لم يكن من الممكن تزويد الفئران بموجب بروتوكول الفحص هذا بهذه العوامل خلال نافذة التجربة التي تستغرق 30 دقيقة. يجب الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة IACUC التابعة للمؤسسة. لضمان المراقبة المستمرة لدرجة حرارة الجسم الأساسية للفأر أثناء الفحص ، قم بربط مسبار درجة حرارة المستقيم بشكل آمن بذيل الفئران. إذا تم العثور على درجة حرارة جسم الفأر أثناء الفحص دون تغيير لفترات طويلة من الزمن حتى بعد زيادة درجة حرارة غرفة الماوس ، فتأكد من أن مسبار درجة حرارة المستقيم لم يخرج من الماوس أو يتم توصيله بشكل فضفاض بالذيل.
يمكن أن تؤثر الخلفية الجينية لنماذج الفئران على الحساسية لطفرة SCN1A والنوبات المستحثة دوائيا18،25،26،27. كما نوقش في النتائج أعلاه ، يمكن أن تؤثر الخلفية الجينية للفئران على قابليتها للنوبات الناجمة عن الحرارة. Scn1a تم اختبار الفئران الطافرة K1270T GEFS + في خلفيتين وراثيتين - 129X1 و B6NJ ، كما لوحظ أن نسبة صغيرة من الفئران من النوع البري (33٪) في خلفية B6NJ الحساسة للنوبات ، تخضع لنوبات ناجمة عن الحرارة. ومع ذلك ، بالمقارنة مع الفئران المتحورة غير المتجانسة Scn1aKT / + ، عانت الفئران من النوع البري B6NJ من نوبات ناجمة عن الحرارة عند عتبة درجة حرارة أعلى بكثير. وهذا يؤكد أن الطفرة الجينية (Scn1a K1270T) التي تم إدخالها بواسطة تقنية كريسبر تجعل الفئران المتحولة أكثر عرضة للنوبات الناجمة عن ارتفاع الحرارة.
هناك العديد من المزايا لاعتماد هذا البروتوكول ، والتي يتم تلخيصها أدناه. أولا ، على عكس استخدام تيار الهواء الجاف أو المصابيح الساخنة ، فإن الهواء القسري الذي يتم التحكم في درجة حرارته والذي يتم إعداده داخل مساحة مغلقة يوفر للمجرب مزيدا من التحكم في تسخين ساحة الاختبار بالمعدل المطلوب. يمكن تعديل الخطوات في بروتوكول التسخين بسهولة لزيادة / تقليل درجة حرارة البداية ، ومدة كل خطوة ، وما إلى ذلك لفحص الفئران الأكبر سنا التي هي قوارض أثقل أو أكبر مثل الفئران. ثانيا ، المراقبة المستمرة لدرجة حرارة جسم الفأر عبر مسبار المستقيم المرفق ، تعطي معلومات قيمة حول معدل تغير درجة حرارة الجسم في الفأر الفردي ، طوال فترة الفحص. هذا يسمح للمجرب بمراقبة أن معدل تغير درجة الحرارة في الماوس لا يتجاوز 0.25-0.5 درجة مئوية / دقيقة (والتي قد تكون مرهقة للحيوانات) ، عند تكييف هذا البروتوكول مع ساحات الاختبار الأخرى. الأهم من ذلك ، أن معدل تغير درجة حرارة الجسم عبر الزمن في مجموعات الفئران المختلفة يمكن أن يلقي الضوء على قدرتها على التنظيم الحراري ويمكن أن يكون مفيدا لفهم ما إذا كانت النوبات الحموية المسببة للطفرات تغير أيضا التنظيم الحراري في الفئران. ثالثا ، تضمن المراقبة المستمرة لدرجة حرارة الجسم دقة قياسات درجة حرارة عتبة النوبة باستخدام هذا البروتوكول ، حيث يتم تسجيلها بالتزامن مع النوبة الأولى من النوبة التي يتعرض لها الماوس. إذا لم تتم مراقبة درجة حرارة جسم الحيوان بشكل مستمر أو تم قياس درجة حرارة عتبة النوبة بعد إخراج الحيوان من ساحة الاختبار ، فقد تختلف قيم عتبة النوبة بسبب الوقت المستغرق للتعامل مع الفئران بعد النوبات. وأخيرا ، تتحايل هذه الطريقة على الحاجة إلى استخدام طرق غازية للحث على الحمى (عن طريق حقن مسببات الأمراض) في الفئران لتقليد النوبات الحموية في المرضى من البشر.
أحد قيود هذا البروتوكول هو أنه من الصعب فحص الفئران اليافعة (أقل من P30 في العمر) بحثا عن النوبات الناجمة عن الحرارة. تم تطوير البروتوكول للكشف عن حساسية الفئران البالغة (P30-P40 وما فوق) للنوبات الناجمة عن الحرارة أو ارتفاع الحرارة. في تجربتنا ، فإن الفئران الأصغر سنا من النوع البري ، وخاصة تلك التي يقل وزنها عن 15 جم ، هي أكثر عرضة للخضوع لنوبات ناجمة عن الحرارة ، والتي قد تكون بسبب آليات التنظيم الحراري المتخلفة ، أو الإجهاد الحراري الفسيولوجي ، أو مزيج من الاثنين معا. وبالتالي ، ليس من المثالي إجراء فحص النوبات الناجم عن الحرارة على الفئران الأحداث باستخدام هذا البروتوكول.
يمكن للدراسات المستقبلية التي تجمع بين مراقبة EEG أثناء تعريض الفأر للنوبات الناجمة عن الحرارة أن تلقي الضوء على أنماط نوبات EEG للنوبات الناجمة عن الحرارة ، على غرار دراسة سابقة19. يمكن تتبع النشاط العصبي في مناطق محددة في دماغ الفأر من خلال الجمع بين النهج البصرية الجينية والدراسات القائمة على الكيمياء النسيجية المناعية بعد حصاد أنسجة المخ. أيضا ، يمكن تقييم آثار الأنظمة الغذائية التقييدية مثل نظام كيتو الغذائي على الحد من النوبات الحموية عن طريق إخضاع الفئران التي تتغذى على الكيتو والفئران العادية التي تتغذى على تشاو لبروتوكول النوبات الناجم عن الحرارة. وبالمثل ، يمكن تطوير نماذج فحص أدوية الصرع لاختبار وتحديد الأدوية المرشحة المضادة للصرع التي تخفف أو تقمع النوبات الناجمة عن الحرارة في الفئران التي تتغذى على المخدرات أو المعالجة عند مقارنتها بالفئران التي تتغذى على المركبات أو تتحكم فيها.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر كونور ج. سميث على مساعدته في بناء غرفة حرارة الماوس المخصصة. نحن نعترف بمساعدة أعضاء مختبر O'Dowd ، Lisha Zeng و Andrew Salgado لتوحيد بروتوكول التدفئة خلال المراحل المبكرة من تطوير الفحص. كما نشكر داني بينافيديس وكومار بيرينبام على تسجيل أجزاء الفيديو من الإجراء التجريبي للمخطوطة. تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة (NS083009) الممنوحة ل D.O.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axial fan | Farnam | AF20-200-120-xx10-3.1 | Farnam custom products -Axial Fan Heater with Fan |
| Digital temperature controller | Inkbird | ITC-100RH | Inkbird digital PID temperature controller ITC-100RH with K thermocouple |
| Mouse rectal temperature probe | ThermoWorks, Braintree Scientific, Inc | RET-3 | Mouse rectal temperature probe with thermometer |
References
- Hirtz, D., et al. How common are the 'common' neurologic disorders. Neurology. 68, 326-337 (2007).
- Catterall, W. A. Sodium Channel Mutations and Epilepsy. Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies. , Center for Biotechnology Information. US. Internet (2012).
- Mantegazza, M., Broccoli, V. SCN 1A /Na V 1.1 channelopathies: Mechanisms in expression systems, animal models, and human iPSC models. Epilepsia. 60, (2019).
- Stafstrom, C. E. Persistent Sodium Current and Its Role in Epilepsy. Epilepsy Currents. 7, 15-22 (2007).
- Schutte, S. S., Schutte, R. J., Barragan, E. V., O'Dowd, D. K. Model systems for studying cellular mechanisms of SCN1A-related epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115, 1755-1766 (2016).
- Wei, F., et al. Ion Channel Genes and Epilepsy: Functional Alteration, Pathogenic Potential, and Mechanism of Epilepsy. Neuroscience Bulletin. 33, 455-477 (2017).
- Abou-Khalil, B., et al. Partial and generalized epilepsy with febrile seizures plus and a novel SCN1A mutation. Neurology. 57, 2265-2272 (2001).
- Zhang, Y. -H., et al. Genetic epilepsy with febrile seizures plus: Refining the spectrum. Neurology. 89, 1210-1219 (2017).
- Patterson, K. P., et al. Enduring memory impairments provoked by developmental febrile seizures are mediated by functional and structural effects of neuronal restrictive silencing factor. Journal of Neuroscience. 37, 3799-3812 (2017).
- Rossi, M. A. SCN1A and febrile seizures in mesial temporal epilepsy: An early signal to guide prognosis and treatment. Epilepsy Currents. 14, 189-190 (2014).
- Zhang, Y., et al. Altered gut microbiome composition in children with refractory epilepsy after ketogenic diet. Epilepsy Research. 145, 163-168 (2018).
- Meng, H., et al. The SCN1A mutation database: Updating information and analysis of the relationships among genotype, functional alteration, and phenotype. Human Mutation. 36, 573-580 (2015).
- Cheah, C. S., et al. Specific deletion of NaV1.1 sodium channels in inhibitory interneurons causes seizures and premature death in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 109, 14646-14651 (2012).
- Das, A., et al. Interneuron dysfunction in a new mouse model of SCN1A GEFS. eNeuro. , (2021).
- Kalume, F., et al. Sudden unexpected death in a mouse model of Dravet syndrome. Journal of Clinical Investigations. 123, 1798-1808 (2013).
- Martin, M. S., et al. Altered function of the SCN1A voltage-gated sodium channel leads to gamma-aminobutyric acid-ergic (GABAergic) interneuron abnormalities. Journal of Biological Chemistry. 285, 9823-9834 (2010).
- Rubinstein, M., et al. Dissecting the phenotypes of Dravet syndrome by gene deletion. Brain. 138, 2219-2233 (2015).
- Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nature Neuroscience. 9, 1142-1149 (2006).
- Dutton, S. B. B., et al. Early-life febrile seizures worsen adult phenotypes in Scn1a mutants. Experimental Neurology. 293, 159-171 (2017).
- Cheah, C. S., et al. Specific deletion of NaV1.1 sodium channels in inhibitory interneurons causes seizures and premature death in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 109, 14646-14651 (2012).
- Oakley, J. C., Cho, A. R., Cheah, C. S., Scheuer, T., Catterall, W. A. Synergistic GABA-enhancing therapy against seizures in a mouse model of Dravet Syndrome. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 345, 215-224 (2013).
- Ricobaraza, A., et al. Epilepsy and neuropsychiatric comorbidities in mice carrying a recurrent Dravet syndrome SCN1A missense mutation. Scientific Reports. 9, (2019).
- Warner, T. A., Liu, Z., Macdonald, R. L., Kang, J. -Q. Heat induced temperature dysregulation and seizures in Dravet Syndrome/GEFS+ Gabrg2+/Q390X mice. Epilepsy Research. 134, 1-8 (2017).
- Eun, B. -L., Abraham, J., Mlsna, L., Kim, M. J., Koh, S.
- Miller, A. R., Hawkins, N. A., McCollom, C. E., Kearney, J. A. Mapping genetic modifiers of survival in a mouse model of Dravet syndrome. Genes Brain and Behavior. 13, 163-172 (2013).
- Mistry, A. M., et al. Strain- and age-dependent hippocampal neuron sodium currents correlate with epilepsy severity in Dravet syndrome mice. Neurobiology of Disease. 65, 1-11 (2014).
- Ogiwara, I., et al. Nav1.1 localizes to axons of parvalbumin-positive inhibitory interneurons: a circuit basis for epileptic seizures in mice carrying an Scn1a gene mutation. Journal of Neuroscience. 27, 5903-5914 (2007).
