Summary
본 프로토콜은 질적 이미징 및 정량적 세포 분석 분석법을 사용하여 장 내 뮤뇨 오르노이드에서 반응성 산소 종(ROS)을 검출하는 방법을 설명합니다. 이 작업은 잠재적으로 ROS에 선택된 화합물의 효력을 시험하기 위하여 그밖 형광 탐사선으로 확장될 수 있습니다.
Abstract
반응성 산소 종 (ROS)은 장 집상성에서 필수적인 역할을합니다. ROS는 세포 대사의 천연 부산물입니다. 그들은 항균 반응 및 상처 치유에 관여로 점막 수준에서 감염 또는 부상에 대 한 응답으로 생산 됩니다. 그(것)들은 또한 세포 성장 및 분화를 포함하여 몇몇 통로를 통제하는 중요한 이차 메신저입니다. 다른 한편으로는, 과도한 ROS 수준은 산화 스트레스로 이끌어 내고, 이는 세포에 대한 해로운 일 수 있고 만성 염증 또는 암 같이 장 질병을 선호할 수 있습니다. 이 작품은 상업적으로 이용 가능한 불소 성 프로브를 사용하여 살아있는 화상 진찰 및 유동 세포측정에 의하여 장 내 뮤뇨 오르가노이드에서 ROS를 검출하는 간단한 방법을 제공합니다. 여기서 프로토콜은 장 가구형에서 레독스 균형을 조절하고 특정 장 세포 유형에서 ROS 수준을 검출하는 화합물의 효과를 분석하며, 여기에 GFP로 유전적으로 표지된 장 줄기 세포의 분석에 의해 예시된다. 이 프로토콜은 다른 형광 프로브와 함께 사용될 수 있다.
Introduction
반응성 산소 종 (ROS) 세포 대사의 자연 부산물. 또한 초산화화물 음이온 및 과산화수소를 생성하는 멤브레인 바인딩 NADPH-Oxidases (NOX) 및 듀얼 옥시다제 (DUOX)와 같은 특수 효소 복합체에 의해 적극적으로 생성 될 수 있습니다. 항산화 효소와 ROS 청소부를 발현함으로써 세포는 레독스 균형을 미세조정하여 조직 항상성을 보호할 수 있습니다2. ROS는 세포에 매우 독성이 있고 DNA, 단백질 및 지질을 손상시킬 수 있지만 중요한 신호 분자2입니다. 장 상피에서, 중간 정도의 ROS 수준은 줄기 및 전구 세포 증식에 필요합니다3; 높은 ROS 수준은 그들의 apoptosis4로 이끌어 내는. 만성 산화 스트레스는 염증성 장 질환이나 암과 같은 많은 위장 질환과 관련이 있습니다. 예를 들어, Wnt 구동 장암의 마우스 모델에서 NADPH-산화제의 활성화를 통한 ROS 생산이 상승하여 암세포 과확산5,6에 요구되는 것으로 나타났다. 장 세포, 특히 줄기 세포가 산화 스트레스를 관리하는 방법과 세포 환경이이 용량에 미치는 영향을 정의하는 것은이 질병의 병인을 더 잘 이해하는 데 필수적입니다7.
조직에서, 다른 세포 모형은 그들의 기능 및 물질 대사 및 산화제 와 항 산화 분자의 다양한 수준의 표현에 따라 다를 수 있는 기저 산화 상태를 제시4,7. 생체 내에서 ROS를 모니터링하는 것은 매우 어렵습니다. 그들의 redox 상태에 따라 형광을 방출하는 세포 투과성 염료는 살아있는 세포 및 동물에 있는 세포 ROS를 구상하고 측정하기 위하여 개발되었습니다. 그러나, 그들의 효능은 살아있는 조직 내부의 확산과 그들의 급속한 판독에 따라 달라 집니다., 동물 모델에서 사용 하기 어려운 만들기8.
과거에는, ROS 생성에 화합물의 효과의 연구는 세포주를 사용하여 수행되었지만, 이것은 생체 내 상황을 반영하지 않을 수 있다. Clevers9의 그룹에 의해 개발된 장 기관지성 모델은 장 1차 세포의 성장을 가능하게 합니다. 행렬에서 장 토굴의 문화, 정의 된 성장 인자의 존재, 3 차원 구조로 이어질, 라는 오가노이드 (미니 창자), 이는 내부 루멘을 안감 다른 상피 혈통에서 세포와, 그리고 소장 줄기 세포는 작은 crypts 같은 돌출에 거주.
여기서, 본 모델을 활용하면, 단세포 배양 배지에 상업적으로 이용 가능한 ROS 에 민감한 염료를 첨가함으로써 단세포 분해능에서 1차 장 세포에서 산화적 스트레스를 연구하는 간단한 방법이 기재된다.
플레이트 판독기는 종종 총 인구에서 ROS 생산을 감지하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 유동 세포 분석 또는 이미징 분석체를 사용하여 유전자 변형 세포 또는 특정 항체 염색을 가진 특정 세포 유형에서 ROS를 검출합니다. 이 작품은 유동 세포측정에 의한 공초점 화상 진찰 및 정량화에 의한 마우스 장 기관가성 배양 및 ROS 시각화를 포함합니다. Lgr5-GFP 마우스 유래 소장 오르가노이드를 사용하여, 상이한 치료법에 따라 장 줄기 세포에서 산화 스트레스의 수준을 구체적으로 분석할 수 있다. 이러한 프로토콜은 선택된 화합물로 오르가노이드를 자극한 후 ROS 균형에 미생물-유래 무라밀-디펩티드(MDP)10과 같은 외인성 분자의 영향을 테스트하도록 조정할 수 있다.
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Protocol
모든 동물 실험은 2016-0022년 프랑스 농무부의 승인 후 수행되었다. 모든 단계는 조직 배양 후드 내부에서 수행됩니다.
1. 장 내장을 배양하기 위한 시약 및 재료 준비
- 성장 배양 배지를 준비하려면 1x 글루타민, 1배 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 용액, HEPES 10mMM, 뮤린 EGF 50ng/mL, 뮤린 노긴 500 ng/mL(R-Spond)의 20 μg/mL(R-Spond1)를 혼합하여 R-Spond 1의 암조를 준비 한다. 지하실을 추출하는 동안 심열(RT)을 실온(RT)에 둡니다.
참고: -20°C에서 알리쿼트에서 사용하지 않은 배지를 동결합니다. 동결 및 해동을 피하십시오. - 고급 DMEM/F-12의 40mL로 50mL 튜브를 채우고 얼음 위에 보관하십시오.
참고: 사용하지 않은 배지를 4°C로 유지합니다. 그것은 유기 체 패시징에 사용 됩니다. - 37°C에서 인큐베이터에서 세포 배양 플레이트(μ-슬라이드 8 웰 챔버 및/또는 96웰 원형 바닥)를 미리 데워십시오.
- 해동 지하 멤브레인 매트릭스 (BMM) ( 재료의 표 참조) 얼음에 알리쿼트 (프로토콜을 시작하기 전에 또는 적어도 1 h 도금 토굴 전에 h).
참고: BMM은 차갑게 유지되지 않으면 빠르게 굳어집니다. - DPBS(DPBS-P/S)에 1% 페니실린-연쇄절제술 용액을 추가하는 세척/플러싱 솔루션을 준비합니다.
- 100mm 페트리 접시에 10mL의 차가운 DPBS-P/S. 10mL의 DPBS로 6개의 15mL 튜브를 채우고 F1에서 F6로 라벨을 붙입니다.
- DPBS에서 0.5M EDTA에서 희석하여 10mM EDTA 용액 30mL를 준비합니다. 10mM EDTA의 10mL로 15mL 튜브 2개를 채우고 E1 및 E2로 레이블을 지정합니다.
- 모든 솔루션을 4°C에서 미리 냉각하고 시술 중에 얼음 위에 보관하십시오.
2. 장 내장 배양
- 국가 규칙 및 규정에 따라 8-10 주 된 Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) 마우스를 희생하십시오.
- 십이지장(위장에서 5cm)과 일레움(10cm)을 아우르는 제주5-8cm를 모아 차가운 DPBS-P/S를 얼음 위에 보관한다.
- 차가운 DPBS-P/S의 5-10 mL로 플러시하여 장 함량을 청소하십시오.
참고: 200 μL 팁을 10mL 주사기 노즐에 연결하여 집에서 만든 플러싱 주사기를 얻을 수 있습니다. - 공 팁 가위를 사용하여 세로로 장들을 엽니다( 재료표 참조) (조직을 손상시키지 않도록).
- 집게를 사용하여, 실온에서 차가운 DPBS-P/S를 포함하는 페트리 접시에 조직을 옮기고 헹구기 위하여 흔들어.
- 플라스틱 파스퇴르 파이펫으로, 포부로 내장을 잡고 10mL 콜드 10mMM EDTA가 들어있는 15mL 튜브 로 전송합니다.
- 튜브를 3번 반전시키고 얼음에 10분 동안 배양합니다.
- 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 10mL DPBS를 함유한 튜브 F1 에서 조직을 이송합니다. 2 분 동안 소용돌이 (정상적인 소용돌이에서 튜브를 손으로 잡고 창자가 잘 소용돌이지 확인).
- 페트리 접시에 분획의 10 μL을 넣고 현미경으로 분수의 품질을 평가합니다.
참고: 모든 소용돌이 단계는 최대 속도로 수행되며, 각 분획의 품질은 현미경(그림 1)에서 평가되어야 합니다. - 플라스틱 파스퇴르 파이펫으로, 포부로 내장을 잡고 2 분 동안 10 mL DPBS와 소용돌이가 들어있는 튜브 F2 로 전송하십시오.
- 반복 단계 2.10, 튜브 F3 에서 조직을 전송하여 10mL DPBS 및 소용돌이를 2 분 동안 함유한다.
- 10mM EDTA를 포함하는 튜브 E2 에서 조직을 이송하는 단계 2.6에서와 같이 EDTA 인큐베이션을 반복한다.
- 튜브를 3번 반전시키고 얼음에 5분 동안 배양합니다.
- 반복 단계 2.10, 튜브 F4 에서 조직을 전송하여 10mL DPBS 및 소용돌이를 3 분 동안 함유한다.
- 반복 단계 2.14, 튜브 F5 에서 조직을 전송하여 10mL DPBS 및 소용돌이를 3 분 동안 함유한다.
- 반복 단계 2.15, 튜브 F6 에서 조직을 전송하여 10mL DPBS 및 소용돌이를 3 분 동안 함유한다.
- 70 μm 셀 스트레이너를 통해 중력에 의해 필터링되는 최고의 분수를 50mL 튜브(얼음 위)에 결합하여 사악하고 중요한 이물질을 제거합니다.
참고 : 일반적으로 F5와 F6는 수많은 토굴과 적은 파편을 포함하는 분수입니다. - 4°C에서 150xg 에서 3분 동안 토굴을 회전시합니다.
- 튜브를 비우고 펠릿을 기계적으로 방해하고 차가운 DMEM /F12 5 mL을 추가하십시오.
- 페트리 접시에 서스펜션의 10 μL을 넣고 현미경으로 수동으로 알리쿼트에 존재하는 토굴의 수를 계산합니다.
참고: 단일 셀이나 작은 파편을 계산하지 마십시오. - 300개의 토굴이 우물당 도금되고, W는 우물의 수이고, N은 서스펜션의 10μL 중계산된 토굴의 수입니다. 새로운 15mL 튜브로 토굴을 전송합니다.
참고: V = 300 x W x 10/N. 계획된 실험에서 소량의 부피를 사용하는 경우 1.5mL 원심분리기 튜브를 사용할 수 있습니다. - 4°C에서 200 x g 에서 3분 동안 토굴을 회전시합니다.
- 파이펫을 사용하여 상체를 조심스럽게 제거합니다.
- 기계적으로 펠릿을 방해하고 부드럽게 90 지하실 / μL의 농도를 얻기 위해 성장 배양 매체를 추가합니다.
- 2부량의 희석되지 않은 BMM을 추가하여 30개의 지하실/μL의 최종 농도를 갖습니다.
참고: BMM 응고를 피하기 위해 항상 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. - 소굴의 10 μL/BMM 믹스를 각 우물에 넣습니다. 유동 세포 측정 해석의 경우 라운드 하단 96웰 플레이트를 사용합니다. 각각의 중앙에 10 μL과 돔을 분배합니다. 이미징의 경우 μ 슬라이드 8을 잘 사용하고( 재료 표 참조)를 사용하여 10 μL을 얇은 층으로 증착합니다.
참고: 내장 분석의 얇은 층으로 오르가노이드를 플레이트하여 심층 이미징을 가능하게 합니다. - BMM이 고화될 수 있도록 RT에 5분 동안 플레이트를 둡니다. 플레이트를 인큐베이터에 37°C, CO25 %에 15분 동안 놓습니다.
- BMM을 분리하지 않도록 주의하여 각 우물에 250 μL의 성장 매체를 추가합니다.
- 인큐베이터에 플레이트를 37°C 및 5% CO2로 놓습니다.
- 문화의 4일과 6일 사이에 ROS 분석을 수행합니다. 그렇지 않으면, 배지를 변경하고 여러 긴 신진 구조의 출현 후 및 죽은 세포가 오르가노이드 루멘에 축적 될 때 오르가노이드를 분할.
3. 오르가노이드 패시징
- 중요한 신진 구조가 형성되고 오르가노이드 루멘이 어두워진 문화 6일째 부터 소장 오르가노이드를 전달하기 시작합니다.
참고: 유기체의 루멘은 죽은 세포, 파편 및 점액의 축적으로 인해 어두워집니다. 분할하기 전에 오르가노이드가 과도하게 자라지 않도록 하십시오. 분할 비율은 오르가노이드의 성장에 따라 달라집니다. 10일째에 1:2, 1:3의 비율로 오르가노이드를 전달하는 것이 좋습니다. - 차가운 고급 DMEM / F-12의 4 mL로 15 mL 튜브를 채우고 얼음에 보관하십시오.
참고 : 여기에 96 웰 문화 판에 대한 볼륨이 제공됩니다. 다른 형식을 사용하는 경우 볼륨을 적절하게 조정합니다. - BMM 돔을 건드리지 않고 우물에서 파이펫이나 진공 펌프로 매체를 조심스럽게 흡인하고 폐기하십시오.
- 100 μL의 콜드 어드밴스드 DMEM/F-12를 잘 넣습니다. 파이펫은 BMM을 분해하고 우물의 함량을 15mL 튜브로 전송합니다.
- 200 μL 콜드 어드밴스드 DMEM/F-12로 우물을 씻고 동일한 튜브로 수집합니다.
참고: 동일한 실험 조건에서 여러 우물을 전달하는 경우, 우물의 내용물도 동일한 15mL 수집 튜브로 풀릴 수 있습니다. - 15mL 수집 튜브를 100 x g 에서 4°C에서 5분 동안 회전합니다.
- 상체를 버리고 1mL의 콜드 어드밴스드 DMEM/F-12를 펠릿에 넣습니다. P1000 팁을 사용하여 P10 팁(필터 제외)과 파이펫을 20회 이상 위아래로 차지합니다.
- 튜브에 차가운 고급 DMEM / F-12의 4 mL을 추가합니다. 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 회전합니다.
- 펠릿을 방해하지 않고 파이펫이나 진공 펌프로 슈퍼너티드를 흡인합니다. 그런 다음 펠릿을 기계적으로 방해합니다.
- 성장 배양 배지에 희석된 BMM을 추가합니다(2:1 비율). 거품을 믹스에 도입하지 않고 조심스럽게 위아래로 피펫.
- 소굴의 10 μL/BMM 믹스를 각 우물에 넣습니다.
- BMM이 고화될 수 있도록 RT에서 5분 동안 플레이트를 유지합니다. 플레이트를 인큐베이터에 37°C, CO25 %에 15분 동안 놓습니다.
- 각 우물에 250 μL의 성장 매체를 추가합니다.
참고: BMM을 분리하지 않도록 주의하십시오. - 인큐베이터에 플레이트를 37°C 및 5% CO2로 놓습니다.
4. 장 내장 에서 산화 스트레스를 평가하기 위해 시약 및 재료의 준비
- 억제제 N-아세틸시스테인(NAC)의 250mM 스톡 용액을 준비하여( 재료표 참조), DPBS 245 μL로 10 mg을 재차판시합니다. 1 mM 최종 농도에서 사용하십시오.
- 유도자 테르트 부틸 하이드로퍼산화물(tBHP)의 50mM 스톡 솔루션을 준비하여 물 속 70%를, DPBS의 496.8 μL로 3.22 μL을 희석시다. 200 μM 최종 농도에서 사용하십시오.
- 유동 세포측정 연구의 경우, DMSO에서 주식 용액 1/10을 희석하여 불소 물질 프로브의 250 μM 작업 용액( 재료 표 참조)을 준비하십시오. 1 μM 최종 농도에서 사용하십시오.
참고: 제조업체의 지침에 명시된 바와 같이, 불소 성 프로브는 빛과 산소에 민감합니다. 주식과 알리쿼트가 열리고 너무 여러 번 닫아서는 안됩니다. - 이미징 연구를 위해, DMSO에서 스톡 용액 1/2를 희석시킴으로써 불소 성 프로브의 1.25 mM 작업 용액을 준비하십시오. 5 μM 최종 농도에서 사용하십시오.
- DPBS에서 0.1 μg/mL DAPI의 최종 솔루션을 준비하여 유동 세포 분석에서 사세포 차별에 사용할 수 있습니다.
- 희석 Hoechst 33342 받는 방법 1.25 DPBS에서 mg/mL. 5 μg/mL 최종 농도에서 사용하여 이미징 분석에서 핵 염색에 사용하십시오.
- 37 °C에서 페놀 레드없이 따뜻한 DMEM.
참고: 이러한 단계는 그림 2A에 표시된 조건을 사용하여 모든 분석서에 포함해야 하는 음수 및 양수 컨트롤을 사용하여 설명합니다. 분석은 항 산화 화합물 또는 프로 산화 화합물을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다. 단계는 동일하며, 유일한 차이점은 불소염염을 사용하기 전에 화합물을 첨가할 때입니다.
5. 공초점 현미경검사법에 의한 3D 오르가노이드의 산화 스트레스 시각화
- μ-슬라이드 8 웰 챔버에서 도금된 오르가노이드를 가져와 해당 우물에 1 μL NAC 스톡 용액을 추가하여 최종 농도를 1mM로 얻습니다.
- 37°C에서 1h 및 5% CO2에 대한 배양.
- 해당 우물에 1 μL tBHP 스톡 솔루션을 추가하여 200 μM의 최종 농도를 얻습니다.
- 37°C에서 30분, CO2 5% 배양합니다.
- 불소형 프로브의 1.25 mM 희석의 우물 당 1 μL을 추가하여 5 μM의 최종 농도를 얻습니다.
- Hoescht의 1.25 mg/mL 희석의 우물 당 1 μL을 추가하여 5 μg/mL의 최종 농도를 얻습니다.
- 37°C에서 30분, CO2 5% 배양합니다.
- BMM을 방해하지 않고 매체를 제거합니다. 페놀 레드 없이 따뜻한 DMEM 250μL을 부드럽게 넣으세요.
참고: 장기 인수를 계획하는 경우 페놀 레드 없이 DMEM에 성장 인자 화합물을 추가합니다. - 불소 질(ROS)을 검출하는 저혈챔버 및 가스 공급이 장착된 공초점 현미경을 사용하여 유기체를 이미지합니다.
참고: 불소 발생 프로브에 대한 흥분/방출(ex/em)은 644/665, Hoechst(nuclei)에 대한 ex/em은 361/486이며, GFP에 대한 전/em(Lgr5-GFP 마우스의 장 줄기 세포)은 488/510이다. 63배 오일 침수 목표는 줄기 세포의 신호를 감지하는 데 사용됩니다. 샘플 간에 레이저 설정을 변경하지 마십시오. ROS 프로덕션에 대한 개요를 허용하는 데 20배 목표를 사용할 수 있습니다. - 양수 제어를 사용하여 ROS 신호에 대한 레이저 강도 및 시간 노출을 설정하고 이 신호가 음수 제어에서 더 낮은지 확인합니다.
- 안면 화면을 사용하여 슬라이드를 사용하여 레이저 강도를 표현하는 GFP 오르가노이드를 식별하고 조정합니다.
참고: 이 단계는 수동으로 수행됩니다. - 위치를 정의하여 전체 오르가노이드의 스티치 이미지를 얻습니다. 25 μm (단계 크기 5 μm)의 z 스택을 설정하여 세포의 한 층을 보여주는 오르가노이드의 단면을 얻습니다.
참고: 현미경 사용자 설명서를 참조하여 설정을 최적화합니다. 살아있는 세포를 사용하여, 취득은 인큐베이션의 끝 후에 1 시간 안에 행해져야 합니다. - 오픈 소스 이미지 처리 소프트웨어에서 이미지를 엽니 다(재료 표 참조).
- z 스택을 살펴보고 오르가노이드의 중간이 잘 표현되는 섹션을 선택하고 선택한 영역을 사용하여 새 이미지를 만듭니다.
- 단계 당 이미지를 정량화 5.15.1 - 5.15.5.
- 프리핸드 라인 도구를 선택합니다.
- 핵 다음에 선을 그립니다.
참고: 줄기 세포만 분석하는 경우 GFP 양성 세포를 나타내는 영역만 선택합니다. - 선 폭을 늘려 발광 파편을 포함하지 않고 선으로 세포층을 덮습니다.
- ROS 신호에 대한 채널을 선택하고 선택한 영역의 형광 강도를 측정하고 값에 인음을 추가합니다.
- 신호가 없는 선을 그리고 최종 강도를 얻기 위해 이전 값으로 빼는 배경의 형광 강도를 측정합니다.
6. 유동 세포계를 사용하여 해리된 오르가노이드에 산화 스트레스의 정량화
- 음수 컨트롤을 위해 우물에 1 μL NAC 스톡 솔루션을 추가하여 최종 농도가 1mM입니다.
참고: 96웰의 라운드 하단 플레이트에 도금된 오르가노이드를 사용합니다. - 37°C에서 1h 및 5% CO2에 대한 배양.
- 해당 우물에 1 μL tBHP 스톡 솔루션을 추가하여 200 μM의 최종 농도를 얻습니다.
- 37°C에서 30분, CO2 5% 배양합니다.
- 멀티채널 파이펫을 사용하면 연결된 BMM을 방해하지 않고 매체를 제거하고 다른 96웰 라운드 하단 플레이트로 전송합니다. 이 접시를 따로 두십시오.
- 트립신 100 μL을 추가하고 멀티 채널 파이펫으로 피펫을 5회 이상 위아래로 추가하여 BMM을 파괴합니다.
- 37°C 및 5% CO2에서 5분 이상 인큐베이션을 합니다.
- 멀티채널 파이펫을 사용하면 오가노이드를 해리하기 위해 피펫을 적어도 5배 이상 위아래로 제거합니다.
- RT에서 5 분 동안 300 x g 에서 회전하십시오.
- 플레이트를 반전시켜 상체를 폐기합니다. 해당 우물에 6.3 단계에서 수집된 배지를 다시 추가하고 5회 위아래로 피펫팅하여 세포를 다시 중단합니다.
- 1 μM의 최종 농도에서 불소 발생 프로브를 추가합니다. 250 μM 희석에서 우물당 1 μL을 추가하고 37°C에서 30분 동안 배양하고 5% CO2로 배양한다.
참고: 악기 설정에 필요한 우물에 형광 프로브를 추가하지 마십시오(그림 2B). - RT에서 5 분 동안 300 x g 에서 회전하십시오.
- 0.1 μg/mL DAPI 용액의 250 μL로 셀을 다시 일시 중지합니다. 적절한 유동 세포측정관에서 샘플을 옮기고, 튜브를 얼음 위에 보관하고, 분석을 진행한다.
참고: 기기 설정에 필요한 웰에 DAPI 대신 PBS를 추가합니다(그림 2B). - 모노 스테인드 샘플을 사용하여 각 불소에 대한 스테인드 컨트롤 및 레이저 전압에서 전방 및 측면 산란 전압 설정을 최적화합니다.
- 적절한 게이팅 전략(그림 4A)을 사용하여 최소 20,000개의 이벤트를 수집합니다.
참고: 50,000개의 이벤트가 선호됩니다. 자세한 획득 설정은 사용되는 계측기에 따라 다릅니다.
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Representative Results
설명된 프로토콜의 개념 증명으로서, 장줄기 세포가 바커 등에서 확립한 모자이크 GFP 발현을 표시하는 Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 마우스 라인에서 얻은 토굴은 처음에 장 줄기 세포를 특성화하고 GFP 발현에 기초하여 이러한 세포를 매핑할 수 있도록 사용되었다. 모델은 상이한 처리시 특정 세포 유형 집단에서 ROS 수준을 비교하기 위하여 제공됩니다. ROS 억제제(NAC)가 사용되었고, 유도제(tBHP)가 세포로 작용하여 레벨의 변화를 시각화하는 것으로 알려져 있다.
도 1A 및 1B 는 장 가구 배양에 대한 암호화 추출 절차 중에 얻은 분수 F1 및 F4의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 각 분획은 추출 절차 중에 현미경 또는 쌍안경으로 검사해야 만 소굴 분리를 따르고 사악, 단일 세포 또는 파편이 아닌 토굴로 농축된 분수를 정의해야 합니다. 선택한 분수는 함께 풀을 풀고 70 μm 셀 스트레이너를 통과하여 나머지 모든 조각의 빌리조각을 제거하고 지하실만 으로 준비합니다(그림 1C). 지하실은 BMM에 포함된 후 몇 시간 이내에 닫히기 시작하고 D1에서는 둥근 오르가노이드가 관찰되었습니다(그림 1D). 3-5일 후에 는 오르가노이드가 "새로 형성된 토굴"을 나타내는 신진 구조와 함께 나타납니다. 오르가노이드는 ROS 분석(그림 1E 및 1F)에 대한 준비가 되어 있습니다.
공초점 현미경 검사법에 의한 산화 스트레스 영상 프로토콜에서, 프로브와 함께 배양된 오르가노이드를 함유한 슬라이드는 Hoechst(ex/em: 361/486), GFP(ex/em: 488/510) 및 플루오로겐성 프로브(ex/em 64)를 검출하기 위해 레이저및 필터가 장착된 공초점 형광 현미경으로 이미지되었습니다. 20배 공기와 63배의 오일 침지 목표를 갖춘 공초점 현미경으로 ROS의 시각화를 허용했습니다. Lgr5-GFP 마우스에서, GFP 양성 세포는 Lgr5 발현 장 줄기 세포이다. 보조 도 1 은 여러 유기체에서 ROS의 개요를 제공하는 20배 의 목표로 얻은 대표적인 이미지를 보여줍니다. 도 3 는 63x 오일 목표, GFP, 비처리(NT) 또는 ROS 억제제 NAC로 사전 배양또는 하지 않는 장 장기형의 대표적인 이미지를 나타내며, ROS 유도제 tBHP로 30분 동안 자극되거나 자극되지 않는다.
억제제의 존재에서, 오르가노이드의 루멘에 포함 된 죽은 세포로부터의 유일한 신호가 볼 수 있습니다. 비처리 된 오르가노이드에서, 기저 ROS 수준은 줄기 세포가 분화 된 세포보다 더 높은 ROS를 생성한다는 것을 증명합니다 (현미경 설정에 따라, ROS 신호는 또한 비 줄기 세포에서 시각화 될 수 있습니다). GFP 양성 세포는 형광성 프로브의 존재시 유도체와 함께 보다 중요한 세포질 신호를 제시하며, 치료 후 줄기 세포에서 특히 ROS 수치가 증가한다는 것을 입증한다.
도 4 는 405nm, 488nm 및 630 nm 레이저를 장착한 유량 세포계를 사용하여 ROS 억제제 또는 유도기로 자극되거나 자극되지 않는 장 기관가에서 ROS 생산을 분석할 때 얻은 대표적인 결과를 나타낸다. 도 4A 에 제시된 게이팅 전략은 물리적 매개 변수 및 DAPI 배제(SSC-A 대 FSC-A 및 DAPI 대 FSC-A) 및 FSC-H 대 FSC-A 대 FSC-A 를 기반으로 온전하고 살아있는 세포를 정의하는 전체 오르가노이드 세포 집단의 수준에서 ROS 생산을 평가할 수 있게 해주며, 또는 FSC-H 대 FSC-A 에서 만 더 높은 신호 문, GFP 의 높은 신호 문에서 만 평가할 수 있습니다. 그림 4B 는 50,000개의 이벤트를 수집하면 총 인구의 ROS 수준을 보여줍니다. 비처리(NT) 세포에서 기저 ROS 수준은 억제제(NAC)를 가진 자극 후 감소하고, 반대로, 유도제(tBHP)와의 도전 후 증가한다. 억제제로 사전 처리된 다음 유도인으로 자극된 세포는 유도제단독으로 자극된 세포보다 낮은 수준을 제시한다. 그 결과 적절한 소프트웨어를 사용하여 분석하여 중간 형광 강도(MFI)를 얻었다. 얻어진 값은 도 4B의 오른쪽에 제시된 그래프와 같이 비처리된 세포에 비해 비율로 제시된다. 도 4C 는 줄기 세포에서 도 4B 에 기재된 동일한 파라미터를 나타내며, GFP 양성 세포로 게이트되어 NAC 처리 시 ROS 레벨의 3.5배 감소및 비자극세포에 비해 tBHP 치료에 4배 증가한다. 이 결과는 이 프로토콜에 따라, 특정 화합물을 가진 오르가노이드의 그들의 처리에 전체 세포 집단 의 수준 또는 GFP 양성 줄기 세포의 수준에서 ROS 수준에 있는 다름을 정량화할 수 있다는 것을 보여줍니다.
그림 1: 토굴과 오르가노이드의 대표적인 이미지. (A) EDTA를 가진 첫 번째 인큐베이션 후 얻은 분수 F1의 예로, 일부 파편(별) 및 토굴(원)이 있는 빌리(square)로 농축된다. (B) 지하실에 농축된 분수 F4의 예입니다. (C) 70 μm 셀 스트레이너 (스케일 바, 200 μm)로 여과 후 얻은 격리 된 토굴만 제시하는 서스펜션. (D, E 및 F). 일반적인 오르가노이드는 BMM(스케일 바, 100 μm)에 토굴을 내장한 후 각각 1, 3 및 5일 후에 수득하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 실험 계획의 개요입니다. (A) 각 실험에 포함된 이 프로토콜에 사용되는 조건: 비처리 우물(NT), 유도제 처리 우물(tert-부틸 하이드로퍼산화물-tBHP), 억제제 처리웰(N-아세틸 시스테인-NAC), 및 억제제-및 유도제 처리웰(NAC-tBHP). (B) 유동 세포 분석에 대한 플레이트 포맷. 각 조건은 트리플리케이트(라인 A)로 도금됩니다. 라인 B, C 및 D는 불소 질 프로브, DAPI 또는 비염색(NS) 샘플만으로 유동 사이토미터 설정을 위한 우물을 포함한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 오르가노이드에 얼룩진 ROS의 대표적인 공초점 이미지. 스티치 이미지는 고속 EMCCD 카메라, 63x/1.4 오일 목표 및 슬릿 35 μm을 장착한 공초점 현미경으로 얻어졌으며, 레이저 405, 488, 640 및 필터 460/50, 535/50, 700/75를 사용하여 Hoechst, GFP, GFP, 플루아를 획득하였다. 비처리(NT)의 공초점 광학 섹션은 ROS-유도제(tBHP)로 처리된 ROS-억제제(NAC)로 처리된 후 ROS 유도제(NAC-tBHP)로 자극하였다. 회색에서, Hoechst로 염색된 핵; 녹색, Lgr5-GFP 세포; 빨간색, 불소 발포 프로브 (스케일 바, 50 μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 장기로부터 유래된 세포에서 ROS의 대표적인 유동 세포측정 분석. (A) 유동 세포 측정 분석에 사용되는 게이팅 전략의 회로도 표현: 세포 형상에 대한 게이팅(장기성 루멘에 축적된 죽은 세포 및 파편 의 배제), 살아있는 세포(DAPI-레이저 405를 통합하지 않은 세포), 단일 세포(이중 차별) 및 줄기 세포(GFP 양성 세포-레이저 488) (FFp 양성 세포-레이저 488) (FFp 양성 세포-레이저 488) (FSC: 분산) ROS 신호는 630 레이저를 사용하여 획득되었습니다. (B) 왼쪽에, 히스토그램은 NT의 상이한 샘플에서 전체 생활 집단(조건당 약 10,000개의 이벤트를 게이팅한 후)에 대한 강도 ROS 신호를 나타내는 적절한 소프트웨어로 수득하였다: 비처리; NAC: 억제제 처리; tBHP 유도제-치료; NAC-tBHP: 억제제 및 유도제 처리. 오른쪽에서는 조건당 3개의 샘플(평균 ± SD)(평균 SD)(*** P = 0.0003)에서 시작되는 실험 중에 얻은 NT 샘플에 대한 MFI 값에 대한 계산된 비율의 전형적인 예입니다. (C) GFP 양성 인구(조건당 1,000이벤트)의 B와 동일합니다(* P = 0.02). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: 오르가노이드에 염색 된 ROS의 대표적인 공초점 이미지. 스티치 이마지는 고속 EMCCD 카메라, 20배 목표 및 슬릿 35 μm을 장착한 공초점 현미경으로 얻어졌으며, 레이저 405, 488, 640, 필터 460/50, 535/50, 700/75를 사용하여 Hoechst, GFP 및 플루오를 획득하였다. 비처리(NT)의 공초점 광학 섹션은 ROS-유도제(tBHP)로 처리된 ROS-억제제(NAC)로 처리된 후 ROS 유도제(NAC-tBHP)로 자극하였다. 회색에서, Hoechst로 염색된 핵; 녹색, Lgr5-GFP 세포; 빨간색, 불소 발성 프로브 (스케일 바, 100 μm). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 작품은 뮤직 제주네아네아의 토굴을 분리하고, 3D 오르간노이드로 배양하고, ROS에 민감한 플루오로겐성 프로브를 전체 오르가노이드의 질적 현미경 영상과 결합하여 오르가노이드 변화 후 단일 세포에 대한 유동 세포측정을 사용하여 분석하는 단계별 프로토콜을 제공한다.
이 방법의 첫 번째 중요한 단계는 암호화 추출 프로시저입니다. 실제로, 토굴 준비의 품질은 성공적인 오르가노이드 형성의 열쇠입니다. 따라서 농축 된 지하실과 셀룰러 파편 이나 죽어가는 세포가 거의없는 분획을 얻는 것이 필수적입니다. 소굴은 마우스의 연령 및 상태와 다를 수 있으므로 프로토콜에 표시된 것과 다른 분획에서 발견될 수 있습니다. EDTA 인큐베이션의 수는 그에 따라 수정될 수 있다. 4분 후 암호가 분리되지 않는 경우 3분 EDTA 배양을 반복해야 합니다. 반대로 첫 번째 EDTA 인큐베이션 이후에 이미 분리된 토굴을 가정합니다. 이 경우 두 번째 EDTA 인큐베이션이 필요하지 않을 수 있으며, DPBS의 순차 적인 소용돌이 단계는 파편이 없는 충분한 토굴로 분획을 얻을 때까지 수행해야 합니다. 해리가 발생하지 않으면 Ca2+ 와 Mg2+ 가 없는 DPBS가 수집 튜브를 준비하는 데 사용되고 EDTA를 새로운 솔루션으로 교체하십시오. 지하실은 깨지기 쉬운 구조이므로 얼음 위에 가능한 한 많이 보관하고 격리 후 빠르게 도금되어야 합니다.
상이한 플레이트 및 드롭 볼륨은 오르가노이드를 재배하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 토굴농도, BMM 낙하량 및 각 우물에 첨가된 배지를 조정한 후 24 또는 48개의 웰 플레이트로 도금될 수도 있다. 다중 방울은 12- 또는 6-웰 플레이트에서 동일한 우물로 도금될 수 있다. 일반적으로, 지하실은 크기가 감소하고 문화의 1 일째에 작은 둥근 오르가노이드를 형성하기 위해 반올림. 새로운 싹의 형성은 도금 후 2-3 일을 관찰해야합니다.
장 내 줄기 세포에서 ROS 수준의 변화를 연구하기 위해 Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 마우스 라인의 장점을 취했습니다. 이 모델의 주의 사항은 줄기 세포 또는 전체 토굴의 패치에 결석 할 수있는 GFP 발현의 노크 인 진열및 결과모자이크의 선택적 침묵이다. 이미징 프로토콜 동안 모든 오르가노이드가 GFP를 발현하는 줄기 세포를 제시하는 것은 아닙니다. 따라서 세포의 공간 위치에 의존할 수 있는 경우가 아니면 모든 오르가노이드가 고려되는 것은 아닙니다. 대신, 유동 세포 측정 프로토콜에서 GFP 음성 세포 집단을 분석할 때 고려해야 합니다. 실제로, 공간 위치에 의존하는 것은 불가능하기 때문에, GFP 음성 인구는 비 줄기 세포 및 GFP 음성 줄기 세포로 구성될 것이다.
여기서 는 장 가구에서 ROS의 질적 평가를 위한 프로토콜이 제공됩니다. 이 부품의 중요한 측면은 사용되는 목표의 작업 거리와 연결됩니다. 오르가노이드는 BMM에서 재배됩니다. 그들은 우물의 바닥에 부착되지 않습니다, 객관적인 초점 계획에서 거리를 소개. 이러한 이유로, 이 문제를 최소화하기 위해, BMM의 얇은 층에서 오르가노이드를 판화하는 것이 중요합니다. 이 최적화된 설정에서도 모든 오르가노이드가 올바른 위치에 있는 것은 아닙니다.
이미지의 정량적 분석은 적절한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있으며, 프로토콜에 설명된 대로 ROS 신호 채널에서 이미지의 평균 형광 강도를 평가할 수 있다. 이를 위해 통계적으로 유의할 수 있는 충분한 수의 이벤트를 얻기 위해 많은 수의 이미지를 수집해야 합니다. 앞서 언급했듯이, Lgr5-GFP 마우스를 사용하는 것은 모든 오르가노이드가 GFP를 발현하는 것은 아니며, 상당한 수의 샘플을 이미지화할 것을 요구합니다.
유동 세포측정 절차 동안, 중요한 단계는 단일 세포로 유기체의 해리입니다. 해리가 너무 가혹한 경우에, 세포는 정지하고 DNA를 풀어 놓일 수 있습니다. 암억제제, Y-27632, 아노이키스에 대항하기 위해, 및 DNAse는 연구된 통로를 방해하지 않으면 해리 버퍼에 첨가될 수 있다. 트립신 희석 또는 감소 된 배양 시간이 사용될 수있다.
마지막으로, 다른 치료 후 ROS 생산을 분석 하는 가장 좋은 시간 지점을 정의 하는 것이 중요 하다 (항 산화) 테스트. 분 또는 시간 내에 ROS를 빠르게 유도하는 약물의 경우, 이미징 분석은 테스트된 화합물 앞에 형광성 프로브를 추가하여 최대 유도가 있을 때를 결정하는 데 사용될 수 있다. 오르가노이드 자극 후 프로브의 형광 강도는 다른 날에 수행 된 실험 사이에 다를 수 있습니다. 따라서, 항상 비자극된 시료와의 비율을 계산하고 프로브의 반응성을 확인하기 위해 컨트롤(산화/항산화제)을 추가하는 것이 중요합니다. NAC와 tBHP는 가장 결정적인 결과를 제공하면서 음수 및 긍정적 인 컨트롤로 사용되었습니다. 여전히, 다른 시약 사용할 수 있습니다., 산화 로 산화 또는 파라 쿼트/menadione로 레스베라트롤 등 산화 제로. 불소 성 프로브를 가진 너무 오래 세포를 배양하는 것은 독성이 있을 수 있고 세포 redox 균형을 수정하기도 하므로 배양 시간도 엄격하게 제어되어야 합니다. 프로브로 염색된 세포는 몇 시간 후에 고정및 분석될 수 있다. 이 경우, 유동 세포측정 분석을 위해, DAPI는 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별할 수 없다. 대신, 라이브/죽은 차별에 대 한 고정 된 염료는 고정 하기 전에 사용 해야 합니다.
오르가노이드는 또한 며칠 동안 재배 될 수있다 (이상 7), 그러나 이것은 살아있는 및 증식 세포와 오르가노이드 루멘에 축적 죽은 세포의 수를 증가시킬 것이다, 특히 이미징 분석에서 높은 배경을 생성. 형광 프로브 신호의 비정상적인 증가가 관찰되는 경우 자극 화합물을 재일시 중단하는 데 사용되는 용액이 se(즉, 에탄올)당 프로 산화제가 아님을 확인하십시오.
이 프로토콜을 사용할 때 고려해야 할 한 가지 관심사는 유동 세포측정에 선행된 살아있는 이미징 및 세포 해리가 세포에서 산화 스트레스를 유발하고 배경 신호를 생성할 수 있다는 것입니다. 장기의 고정은 실험에 따라 고려될 수 있다. 또 다른 제한은 3D 매트릭스에서 자란 오르가노이드의 심층 이미징의 어려움에서 비롯됩니다. 프로토콜에서 언급했듯이 BMM은 이 측면을 제한하기 위해 슬라이드에 얇은 레이어로 분산되어야 합니다.
여기서, 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 불소염 염료를 사용하여 설계된다. 그것의 주요 장점은 특정 세포 모형을 이렇게 organoids의 다중 색깔 염색과의 호환성입니다. 예를 들어, 불소성 프로브 인큐베이션 직후 세포 표면 마커에 대한 항체 염색은 특정 하위 유형을 검출하기 위해 수행될 수 있다. 그러나, 프로브는 과산화수소, 아산화질소 및 과산화수소11,12,13을 검출할 수 있기 때문에 특정 ROS 종에 만성되지 않는다. 이러한 이유로, 그것은 일반적으로 글로벌 산화 스트레스를 감지 하는 데 사용 됩니다. 사이토솔릭 전용 프로브로 상용화되었지만 선택된 플루오로겐성 프로브는 미토콘드리아14에 도달하는 것으로 나타났습니다. 그것의 특이성은 다른 세포 문맥 사이에서 다를 수 있기 때문에, 우리는 가능하면 ROS를 측정하기 위하여 그밖 보완적인 접근법을 사용하는 것이 좋습니다. 미토콘드리아 생성 된 초산화질소 음이온을 검출하기 위해 특정 프로브와 같은 대체 염료를 사용할 수 10. 화학 발광 프로브의 레퍼토리는 또한 루시페린 기반 프로브15,16과 같은 고감도특정 ROS 종을 검출하기 위해 개발되었다. 이들은 생체 내 화상 진찰과 호환되는 이점이 있습니다 그러나 특정 세포 모형을 가진 ROS 생산을 지도하기 위하여 이용될 수 없습니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 인간 생검에서 파생된 식민지 오르가노이드와 같은 다른 유형의 오르가노이드에 적용될 수 있습니다. 이 경우 배양성장 배지는 이에 따라 적응해야 한다17. 장 내의 레독스 기계를 더욱 분석하기 위해, 이 프로토콜에 기재된 오르가노이드 배양 및 해리 절차는 전체 유기체 또는 형광 활성화 세포 정렬(FACS) 오르가노이드 세포에 대한 전사 및 프로테오믹 접근법과 결합될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 프랑스 국립 연구 기관 (ANR) 보조금 17-CE14-0022 (i-스트레스)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
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