Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att upptäcka reaktiva syre arter (ROS) i intestinala murine organoider med kvalitativ avbildning och kvantitativa cytometri analyser. Detta arbete kan potentiellt utvidgas till andra fluorescerande sonder för att testa effekten av valda föreningar på ROS.
Abstract
Reaktiva syrearter (ROS) spelar viktiga roller i intestinal homeostas. ROS är naturliga biprodukter av cellmetabolism. De produceras som svar på infektion eller skada på slemhinnan eftersom de är involverade i antimikrobiella svar och sårläkning. De är också kritiska sekundära budbärare, som reglerar flera vägar, inklusive celltillväxt och differentiering. Å andra sidan leder överdrivna ROS-nivåer till oxidativ stress, vilket kan vara skadligt för celler och gynna tarmsjukdomar som kronisk inflammation eller cancer. Detta arbete ger en enkel metod för att upptäcka ROS i intestinala murin organoider genom levande imaging och flöde cytometri, med hjälp av en kommersiellt tillgänglig fluorogen sond. Här beskriver protokollet att analysera effekten av föreningar som modulerar redoxbalansen i intestinala organoider och detekterar ROS-nivåer i specifika tarmcellstyper, exemplifierat här av analysen av tarmstamcellerna genetiskt märkta med GFP. Detta protokoll kan användas med andra fluorescerande sonder.
Introduction
Reaktiva syrearter (ROS) är naturliga biprodukter av cellulär metabolism. De kan också aktivt produceras av specialiserade enzymatiska komplex som membranbundna NADPH-Oxidaser (NOX) och Dual Oxidases (DUOX), som genererar superoxid anjon och väteperoxid1. Genom att uttrycka antioxidantenzymer och ROS-asätare kan cellerna finjustera sin redoxbalans och därmed skydda vävnadshomeostas2. Även om ROS kan vara mycket giftigt för cellerna och skada DNA, proteiner och lipider, är de avgörande signalmolekyler2. I tarmepitelet krävs måttliga ROS-nivåer för stam- och stamceller spridning3; höga ROS nivåer leder till deras apoptos4. Kronisk oxidativ stress är kopplad till många gastrointestinala sjukdomar, såsom inflammatoriska tarmsjukdomar eller cancer. Som ett exempel, i en musmodell av Wnt-driven tarmcancer, förhöjd ROS produktion genom aktivering av NADPH-oxidaser konstaterades krävas för cancerceller hyperproliferation5,6. Att definiera hur tarmceller, särskilt stamceller, hanterar oxidativ stress och hur cellmiljön kan påverka denna kapacitet är avgörande för att förstå etiologin för denna sjukdom bättre7.
I en vävnad uppvisar olika celltyper ett basalt oxidativt tillstånd som kan variera beroende på deras funktion och ämnesomsättning och uttrycket av olika nivåer av oxidant- och antioxidantmolekyler4,7. Övervakning av ROS in vivo är mycket utmanande. Cellgenomsläppliga färgämnen som avger fluorescens enligt deras redoxtillstånd har utvecklats för att visualisera och mäta cellulär ROS i levande celler och djur. Deras effektivitet beror dock på deras diffusion inuti levande vävnader och deras snabba avläsning, vilket gör dem svåra att använda i djurmodeller8.
Tidigare gjordes studien av effekten av föreningar på ROS-generering med hjälp av cellinjer, men detta kanske inte återspeglar in vivo-situationen . Den intestinala organoidmodellen, utvecklad av gruppen Clevers9, möjliggör tillväxt av intestinala primärceller ex vivo. Kultur av intestinala krypter i matriser, i närvaro av definierade tillväxtfaktorer, leder till tredimensionella strukturer, kallade organoider (mini-gut), som reproducerar crypt-villus-organisationen, med celler från de olika epitelerna som fodrar en inre lumen och tarmstamcellerna som bor i små krypterliknande utskjutningar.
Här, dra nytta av denna modell, beskrivs en enkel metod för att studera oxidativ stress i primära tarmceller vid encellsupplösningen genom att lägga till ett kommersiellt tillgängligt ROS-känsligt färgämne i det organoida odlingsmediet.
Plattläsare används ofta för att upptäcka ROS-produktion i en total population. Detta protokoll använder flödescytometri eller avbildningsanalys för att detektera ROS i en viss celltyp med genetiskt modifierade celler eller specifik antikroppsfärgning. Detta arbete omfattar mus intestinal organoid kultur och ROS visualisering genom confocal imaging och kvantifiering av flöde cytometry. Med hjälp av Lgr5-GFP möss-härledda små intestinala organoider är det möjligt att specifikt analysera nivån av oxidativ stress i intestinala stamceller vid olika behandlingar. Detta protokoll kan anpassas för att testa påverkan av exogena molekyler, såsom mikrobiota-härledd muramyl-dipeptid (MDP)10, på ROS-balansen, efter att ha stimulerat organoider med de valda föreningarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes efter godkännande av Institut Pasteur Use Committee och av det franska jordbruksministeriet nr 2016-0022. Alla steg utförs inuti en vävnadskulturhuv.
1. Beredning av reagenser och material för odling av tarmorganoider
- För att förbereda tillväxtodlingsmedium, blanda avancerad DMEM/F-12 kompletterad med 1x glutamin, 1x penicillin/streptomycin (P/S) lösning, 10 mM HEPES, 50 ng/mL murin EGF, 20 μg/mL murine Noggin 500 ng/mL mus R-Spondin1 (se Tabell över material). Lämna mediet vid rumstemperatur (RT) under kryptans extraktion.
OBS: Frys det oanvända mediet i alikvoter vid -20 °C. Undvik frysning och upptining. - Fyll ett 50 ml-rör med 40 ml avancerat DMEM/F-12 och förvara det på is.
OBS: Håll det oanvända mediet vid 4 °C. Det kommer att användas för organoider passaging. - Förvärm cellodlingsplattorna (μ-Slide 8 brunnskammare och/eller 96-brunn rund botten) i inkubatorn vid 37 °C.
- Tina källarmembranmatris (BMM) (se Materialtabell) alikvoter på is (innan protokollet påbörjas eller minst 1 h innan du pläterar krypter).
OBS: BMM stelnar snabbt om den inte hålls kall. - Förbered tvätt-/spolningslösning som tillsätter 1% penicillin-streptomycinlösning till DPBS (DPBS-P/S).
- Fyll en 100 mm petriskål med 10 ml kall DPBS-P/S. Fyll sex 15 ml rör med 10 ml DPBS och märk dem från F1 till F6.
- Förbered 30 ml 10 mM EDTA-lösning genom utspädning från 0,5 M EDTA i DPBS. Fyll två 15 ml-rör med 10 ml 10 mM EDTA och märk dem E1 och E2.
- Håll alla lösningar förkylda vid 4°C och håll dem på isen under proceduren.
2. Intestinala organoider kultur
- Offra en 8-10 veckor gammal Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) mus enligt nationella regler och förordningar.
- Samla 5-8 cm av jejunumet som omfattar regionen mellan tolvfingertarmen (5 cm från magen) och ileum (10 cm från cecum) och håll i kallt DPBS-P/S på is.
- Rengör tarmhalten genom att spola med 5-10 ml kallt DPBS-P/S.
OBS: Hemgjorda spolsprutor kan erhållas genom att fästa en 200 μL-spets på ett 10 ml sprutmunstycke. - Öppna tarmen längsgående med hjälp av kulspetssaxen (se Materialtabellen) (för att förhindra att vävnaden skadas).
- Överför vävnaden till en petriskål som innehåller kalla DPBS-P/S vid rumstemperatur och skaka den för att skölja.
- Med en pasteurpipeett i plast, ta tag i tarmen genom strävan och överför den till ett 15 ml-rör märkt E1 som innehåller 10 ml kallt 10 mM EDTA.
- Vänd röret 3 gånger och inkubera på is i 10 min.
- Överför vävnaden i rör F1 som innehåller 10 ml DPBS med hjälp av en pasteurpipett av plast. Virvel i 2 min (på normal virvel, hålla röret för hand och se till att tarmarna virvlar fint).
- Lägg 10 μL av fraktionen i en petriskål och utvärdera kvaliteten på fraktionen under ett mikroskop.
OBS: Alla virvelsteg utförs med maximal hastighet och kvaliteten på varje fraktion bör bedömas under mikroskopet (figur 1). - Med en pasteurpipett av plast, ta tag i tarmarna genom strävan och överför den i rör F2 som innehåller 10 ml DPBS och virvel i 2 min.
- Upprepa steg 2.10 och överför vävnaden i rör F3 som innehåller 10 ml DPBS och virvel i 2 minuter.
- Upprepa inkubation av EDTA som i steg 2,6 och överför vävnaden i rör E2 innehållande 10 mM EDTA.
- Vänd röret 3 gånger och inkubera på is i 5 min.
- Upprepa steg 2.10, överför vävnaden i rör F4 som innehåller 10 ml DPBS och virvel i 3 min.
- Upprepa steg 2.14, överför vävnaden i rör F5 innehållande 10 ml DPBS och virvel i 3 min.
- Upprepa steg 2.15 och överför vävnaden i rör F6 som innehåller 10 ml DPBS och virvel i 3 minuter.
- Kombinera de bästa fraktionerna som filtreras efter gravitation genom en 70 μm cellsil i ett 50 ml-rör (på is) för att eliminera villi och betydande skräp.
OBS: Vanligtvis är F5 och F6 fraktionerna som innehåller många krypter och mindre skräp. - Snurra krypterna vid 150 x g vid 4 °C i 3 minuter.
- Töm röret, stör pelleten mekaniskt och tillsätt 5 ml kallt DMEM/F12.
- Lägg 10 μL av suspensionen i en petriskål och räkna antalet krypter som finns i alikvoten manuellt under ett mikroskop.
OBS: Räkna inte enstaka celler eller små skräp. - Beräkna volymen (V) av krypta suspension som krävs i μL, med tanke på att 300 krypter är pläterade per brunn, W är antalet brunnar och N är antalet krypter som räknas ut ur 10 μL av suspensionen. Överför krypterna till ett nytt 15 mL-rör.
OBS: V = 300 x W x 10/N. Om en liten volym används i det planerade experimentet kan ett 1,5 ml centrifugrör användas. - Snurra krypterna vid 200 x g vid 4 °C i 3 min.
- Ta försiktigt bort supernatanten med en pipett.
- Stör pelleten mekaniskt och tillsätt försiktigt tillväxtkulturmedium för att få en koncentration på 90 krypter/μL.
- Tillsätt 2 volymer outspädd BMM för att ha en slutlig koncentration på 30 krypter/μL. Pipettera försiktigt upp och ner utan att föra in luftbubblor i blandningen.
OBS: Håll alltid röret på is för att undvika BMM-stelning. - Platta 10 μL av krypterna/BMM blandas i varje brunn. För flödescytometrianalys, använd rundbottnade 96-brunnsplattor. Fördela 10 μL i mitten av varje brunn samt en kupol. För avbildning, använd μ-slide 8 brunn (se Materialtabell) och deponera 10 μL som ett tunt skikt.
OBS: Plätera organoiderna som ett tunt lager för avbildningsanalysen för att möjliggöra deras djupgående avbildning. - Låt plattan vara i 5 minuter vid RT så att BMM kan stelna. Placera plattan i inkubatorn vid 37 °C och 5% CO2 i 15 min.
- Tillsätt 250 μL tillväxtmedium i varje brunn, var försiktig så att BMM inte lossnar.
- Placera plattorna i inkubatorn vid 37 °C och 5% CO2.
- Utför ROS-analysen mellan kulturdagarna 4 och 6. Annars ändra mediet och dela organoiderna efter utseendet av flera och långa spirande strukturer och när döda celler ackumuleras i organoidernas lumen.
3. Organoider passaging
- Börja passaging små intestinala organoider från den 6: e dagen av kulturen, när betydande spirande strukturer har bildats och organoidernas lumen har blivit mörka.
OBS: Organoidens lumen blir mörk på grund av ackumulering av döda celler, skräp och slem. Undvik att låta organoiderna växa över innan de splittras. Uppdelningsförhållandet beror på organoidernas tillväxt. Passaging organoiderna med ett förhållande på 1:2 på dag 6 och 1:3 på dag 10 rekommenderas. - Fyll ett 15 ml-rör med 4 ml kallt Avancerat DMEM/F-12 och håll det på is.
OBS: Här tillhandahålls volymer för en 96-väl kulturplatta. Om ett annat format används justerar du volymen i enlighet därmed. - Aspirera försiktigt med en pipett eller en vakuumpump från brunnarna utan att röra BMM-kupolerna och kassera det.
- Tillsätt 100 μL kall avancerad DMEM/F-12 per brunn. Pipettera upp och ner för att bryta BMM och överföra brunnens innehåll till 15 ml-röret.
- Tvätta brunnen med 200 μL kall Avancerad DMEM/F-12 och samla den i samma rör.
OBS: Om du kan passa flera brunnar från samma experimentella tillstånd kan innehållet i brunnarna poolas i samma 15 ml insamlingsrör. - Snurra 15 ml uppsamlingsröret vid 100 x g i 5 min vid 4°C.
- Kassera supernatanten och tillsätt 1 mL kall Avancerad DMEM/F-12 till pelleten. Använd en P1000-spets och ta upp en P10-spets (utan filter) och pipetten upp och ner minst 20 gånger.
- Tillsätt 4 ml kall Avancerad DMEM/F-12 i röret. Snurra vid 300 x g i 5 min vid 4°C.
- Aspirera supernatanten med en pipett eller en vakuumpump utan att störa pelleten. Stör sedan pelleten mekaniskt.
- Tillsätt BMM utspädd i tillväxtkulturmedium (2:1-förhållande). Rör försiktigt upp och ner utan att föra in luftbubblor i blandningen.
- Platta 10 μL av krypterna/BMM blandas i varje brunn.
- Håll plattan i 5 min på RT så att BMM kan stelna. Placera plattan i inkubatorn vid 37 °C och 5% CO2 i 15 min.
- Tillsätt 250 μL tillväxtmedium i varje brunn.
OBS: Var försiktig så att du inte lossar BMM: s. - Placera plattorna i inkubatorn vid 37 °C och 5% CO2.
4. Beredning av reagenser och material för att bedöma oxidativ stress i tarmorganoider
- Förbered en 250 mM stamlösning av inhibitor N-acetytystein (NAC) (se Tabell över material), återanvänd 10 mg med 245 μL DPBS. Använd vid 1 mM slutlig koncentration.
- Förbered en 50 mM stamlösning av induceraren Tert-butylhydroperoxid (tBHP), 70% i vatten, späd 3,22 μL med 496,8 μL DPBS. Använd vid 200 μM slutlig koncentration.
- För flowcytometristudien bereder du en 250 μM arbetslösning av en fluorogen sond (se Materialtabell) genom att späda ut stamlösningen 1/10 i DMSO. Använd vid 1 μM slutlig koncentration.
OBS: Som anges i tillverkarens instruktioner är den fluorogena sonden känslig för ljus och syre. Lager och alikvoter bör inte vara öppna och stänga för många gånger. - För avbildningsstudien, förbered en 1,25 mM arbetslösning av den fluorogena sonden genom att späda ut stamlösningen 1/2 i DMSO. Använd vid 5 μM slutlig koncentration.
- Förbered en slutlig lösning på 0,1 μg/ml DAPI i DPBS, som ska användas för dödcellsdiskriminering i analysen av Flow cytometri.
- Späd Hoechst 33342 till 1,25 mg/ml i DPBS. Använd vid 5 μg/ml slutlig koncentration som ska användas för kärnfärgning i avbildningsanalysen.
- Varm DMEM utan fenolrött vid 37 °C.
OBS: Dessa steg beskriver användning av negativa och positiva kontroller som måste inkluderas i eventuella analyser, med hjälp av de villkor som anges i figur 2A. Analysen kan användas för att testa anti- eller pro-oxidantföreningar. Stegen är desamma, och den enda skillnaden är när föreningarna tillsätts innan fluorogen färgämnet används.
5. Visualisering av oxidativ stress i 3D-organoider genom konfokal mikroskopi
- Ta organoiderna pläterade i brunnskamrarna μ-Slide 8 och tillsätt 1 μL NAC-stamlösning i motsvarande brunnar för att få en slutlig koncentration på 1 mM.
- Inkubera i 1 h vid 37 °C och 5% CO2.
- Tillsätt 1 μL tBHP-stamlösning i motsvarande brunnar för att få en slutlig koncentration på 200 μM.
- Inkubera i 30 min vid 37 °C och 5% CO2.
- Tillsätt 1 μL per brunn av den fluorogena sondens utspädning på 1,25 mM för att uppnå en slutlig koncentration på 5 μM.
- Tillsätt 1 μL per brunn av hoeschts utspädning på 1,25 mg/ml för att uppnå en slutlig koncentration på 5 μg/ml.
- Inkubera i 30 min vid 37 °C och 5% CO2.
- Ta bort mediet utan att störa BMM. Tillsätt försiktigt 250 μL varmt DMEM utan fenolrött.
OBS: Om ett långsiktigt förvärv planeras, lägg till tillväxtfaktorföreningar till DMEM utan fenolrött. - Föreställ dig organoiderna med hjälp av ett konfokalt mikroskop utrustat med en termisk kammare och gastillförsel som detekterar den fluorogena sonden (ROS).
OBS: Excitationen/utsläppet (ex/em) för den fluorogena sonden är 644/665, ex/em för Hoechst (atomkärnor) är 361/486 och ex/em för GFP (intestinal stamcell från Lgr5-GFP-mössen) är 488/510. Ett 63x oljesänkningsmål används för att upptäcka signaler i stamceller. Ändra inte laserinställningarna mellan proverna. Ett 20x-mål kan användas för att ge en översikt över ros-produktion. - Använd den positiva kontrollen för att ställa in laserintensitet och tidsexponering för ROS-signalen och kontrollera att denna signal är lägre i den negativa kontrollen.
- Med hjälp av okularskärmen för att identifiera GFP-organoiderna som uttrycker och justerar laserintensiteten.
OBS: Det här steget utförs manuellt. - Definiera positioner för att få en sydd bild av hela organoiden. Ställ in en z-stack på 25 μm (stegstorlek 5 μm) för att få en del av organoiderna som visar ett lager av celler.
OBS: Se mikroskopens användarhandbok för att optimera installationen. Med hjälp av levande celler bör förvärvet göras inom 1 h efter inkubationens slut. - Öppna bilderna i ett program för bildbehandling med öppen källkod (se Materialförteckning).
- Gå igenom z-stacken och välj det avsnitt där mitten av organoiderna är väl representerad och skapa en ny bild med det valda området.
- Kvantifiera bilderna enligt steg 5.15.1 - 5.15.5.
- Välj freehand-linjeverktyget.
- Rita en linje efter kärnorna.
OBS: Välj endast regioner som presenterar GFP-positiva celler om endast stamceller analyseras. - Öka linjebredden för att täcka cellskiktet med linjen utan att inkludera det lysande skräpet.
- Välj kanalen för ROS-signalen och mät fluorescensintensiteten i det valda området och kommentera värdena.
- Rita en linje där det inte finns någon signal och mät den fluorescerande intensiteten i bakgrunden som kommer att subtraheras till föregående värde för att få den slutliga intensiteten.
6. Kvantifiering av den oxidativa stressen på de dissocierade organoiderna med hjälp av flödescytometer
- Tillsätt 1 μL NAC-stamlösning i brunnarna för negativa kontroller för att få en slutlig koncentration på 1 mM.
OBS: Använd organoiderna pläterade i 96-brunnsplattorna med rund botten. - Inkubera i 1 h vid 37 °C och 5% CO2.
- Tillsätt 1 μL tBHP-stamlösning i motsvarande brunnar för att få en slutlig koncentration på 200 μM.
- Inkubera i 30 min vid 37 °C och 5% CO2.
- Med en flerkanalspipett, ta bort mediet utan att störa den bifogade BMM och överför den till en annan 96-bra rund bottenplatta. Håll tallriken åt sidan.
- Tillsätt 100 μL trypsin, och med en flerkanalspipetter, pipetter upp och ner minst fem gånger för att förstöra BMM.
- Inkubera högst 5 min vid 37 °C och 5% CO2.
- Med en flerkanalspipetter, pipetter upp och ner minst fem gånger för att dissociera organoiderna.
- Snurra på 300 x g i 5 min på RT.
- Kassera supernatanten genom att invertera plattan. Tillsätt tillbaka mediet som samlats in i steg 6.3 till motsvarande brunnar och återanvänd cellerna genom pipettering upp och ner 5 gånger.
- Tillsätt den fluorogena sonden vid den slutliga koncentrationen av 1 μM. Tillsätt 1 μL per brunn från utspädningen på 250 μM och inkubera i 30 min vid 37 °C och 5% CO2.
OBS: Tillsätt inte den fluorogena sonden i de brunnar som behövs för instrumentets inställningar (figur 2B). - Snurra på 300 x g i 5 min på RT.
- Återanvänd cellerna med 250 μL 0,1 μg/mL DAPI-lösning. Överför proverna i rätt Flow cytometrirör, håll rören på is och fortsätt med analysen.
OBS: Lägg till PBS i stället för DAPI i de brunnar som behövs för instrumentets inställningar (bild 2B). - Optimera spänningsinställningarna för spänning framåt- och sidospridning på oförstätlig kontroll och laserspänningar för varje fluorofor med hjälp av monofärgade prover.
- Samla in minst 20 000 händelser med hjälp av en lämplig gatingstrategi (figur 4A).
OBS: 50 000 evenemang är att föredra. Detaljerade förvärvsinställningar varierar beroende på vilket instrument som används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som ett bevis på konceptet för det beskrivna protokollet användes de krypter som erhållits från muslinjen Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 där intestinala stamceller visar mosaik GFP-uttryck, som inrättades av Barker et al., för att karakterisera intestinala stamceller10 initialt och tillåta att kartlägga dessa celler baserat på deras GFP-uttryck. Därmed tillhandahålls en modell för att jämföra ROS-nivåer i en specifik celltyppopulation vid olika behandlingar. En ROS-hämmare (NAC) användes, och en inducerare (tBHP), känd för att agera på cellulär ROS för att visualisera förändringar i deras nivåer.
Figurerna 1A och 1B visar representativa bilder av fraktioner F1 och F4 som erhållits under krypt extraktion förfarandet för intestinala organoid kultur. Varje fraktion måste kontrolleras under ett mikroskop eller en kikare under extraktionsförfarandet för att följa krypteravlossning och definiera de fraktioner som berikats i krypter, snarare än villi, enstaka celler eller skräp. De valda fraktionerna slås sedan samman och passerar genom en 70 μm cellsil för att ta bort alla återstående fragment av villi och få en förberedelse med endast krypter (figur 1C). Krypterna börjar stängas inom några timmar efter inbäddning i BMM, och vid D1 observerades runda organoider (figur 1D). Efter 3-5 dagar kommer organoiderna att visas med spirande strukturer som representerar de "nybildade krypterna". Organoiderna är klara för ROS-analys (figurerna 1E och 1F).
I protokollet om avbildning oxidativ stress av confocal mikroskopi, bilden som innehåller organoider, inkuberas med sonden, avbildades med en confocal fluorescens mikroskop utrustad med lasrar och filter för att upptäcka Hoechst (ex/em: 361/486), GFP (ex/em: 488/510) och fluorogen sond (ex/em): 644/665) signaler. Ett konfokalt mikroskop utrustat med 20x luft och 63x oljesänkningsmål tillät visualisering av ROS. Hos Lgr5-GFP-möss är de GFP-positiva cellerna Lgr5-uttryckande tarmstamceller. Kompletterande figur 1 visar representativa bilder som erhållits med 20x-målet som ger en översikt över ROS i flera organoider. Figur 3 visar representativa bilder, erhållna med 63x oljemålet, av intestinala organoider som uttrycker GFP, icke-behandlade (NT) eller förinkuberade eller inte med ROS-hämmaren NAC, och stimuleras eller inte i 30 minuter med ROS-induceraren tBHP.
I närvaro av hämmaren är den enda signalen från de döda cellerna i organoidens lumen synlig. I den icke-behandlade organoiden visas de basala ROS-nivåerna, vilket bevisar att stamceller producerar högre ROS än differentierade celler (enligt mikroskopinställningarna kan ROS-signalen också visualiseras i icke-stamceller). GFP-positiva celler presenterar en mer betydande cytoplasmisk signal med induceraren i närvaro av fluorogen sond, vilket visar att ROS-nivåerna ökar särskilt i stamceller efter behandling.
Figur 4 visar representativa resultat som erhållits vid analys av ROS-produktion i intestinala organoider stimulerade eller inte med ROS-hämmare eller inducerare, med hjälp av en Flow-cytometer utrustad med 405 nm, 488 nm och 630 nm lasrar. Den gitterstrategi som presenteras i figur 4A gör det möjligt att utvärdera produktionen av ros i nivå med hela organoidernas cellpopulation, definiera intakta och levande celler baserat på fysiska parametrar och DAPI-uteslutning (SSC-A vs. FSC-A och DAPI vs. FSC-A) och FSC-H vs. FSC-A) eller endast i tarmstamcellerna, ytterligare gated på celler med GFP hög signal. Figur 4B visar ros-nivåerna i den totala populationen vid insamling av 50 000 evenemang. Basala ROS-nivåer i de icke-behandlade (NT) cellerna minskar efter stimulering med inhibitoren (NAC), och tvärtom, öka efter utmaning med induceraren (tBHP). Celler som förbehandlats med inhibitoren och sedan stimuleras med induceraren uppvisar en lägre nivå än de som stimuleras enbart med induceraren. Resultaten analyserades sedan med hjälp av lämplig programvara, vilket erhöll median fluorescerande intensitet (MFI). De erhållna värdena presenteras som ett förhållande över de icke-behandlade cellerna, vilket visas i diagrammet som presenteras till höger om figur 4B. Figur 4C visar samma parametrar som beskrivs i figur 4B i stamcellerna, gated som GFP-positiva celler, som visar en 3,5-faldig minskning av ROS-nivån vid NAC-behandling och 4-faldig ökning vid tBHP-behandling över icke-stimulerade celler. Detta resultat visar att det enligt detta protokoll är möjligt att kvantifiera skillnader i ROS-nivåer på nivån för hela cellpopulationen eller i GFP-positiva stamceller vid behandling av organoiderna med specifika föreningar.
Figur 1: Representativa bilder av krypter och organoider. (A) Exempel på fraktion F1 som erhållits efter den första inkubationen med EDTA, berikad i villi (kvadrat), med en del skräp (stjärna) och krypter (cirkel). (B) Exempel på fraktion F4 berikad i krypter. C) Suspension som endast presenterar isolerade krypter som erhållits efter filtreringen med en 70 μm cellsil (skalstång, 200 μm). (D, E och F). Typiska organoider erhölls efter 1, 3 respektive 5 dagar, efter inbäddning av krypterna i BMM (skalstapel, 100 μm). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Översikt över den experimentella planen. (A) Villkor som används i detta protokoll som ingår i varje experiment: icke-behandlade brunnar (NT), inducerade brunnar (tert-Butylhydroperoxid - tBHP), inhibitorbehandlade brunnar (N-acetylcystein - NAC) och inhibitor- och inducerbehandlade brunnar (NAC-tBHP). B) Plåtformat för flödescytometrianalysen. Varje tillstånd är pläterat i tre exemplar (linje A). Linjerna B, C och D omfattar brunnar för flödescytometerinställning med endast fluorogen sond, endast DAPI- eller icke-färgade (NS) prover. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativa konfokala bilder av ROS-färgning i organoider. Sydda bilder erhölls med ett konfokalt mikroskop utrustat med en höghastighets EMCCD-kamera, 63x / 1,4 oljemål och slits 35 μm, med hjälp av lasrarna 405, 488, 640 och filter 460/50, 535/50, 700/75 för att förvärva Hoechst, GFP respektive fluorogen sond. Konfokala optiska sektioner av organoider som inte behandlats (NT), behandlade med ROS-hämmaren (NAC), med ROS-induceraren (tBHP) eller förbehandlade med ROS-hämmaren och sedan stimuleras med ROS-induceraren (NAC-tBHP). I grått, kärnor färgade med Hoechst; i gröna, Lgr5-GFP-celler; i rött, den fluorogena sonden (skalstång, 50 μm). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Representativ flöde cytometri analys av ROS i celler som härrör från organoider. (A) Schematisk representation av den gitterstrategi som används vid flödescytometrianalys: gating för cellform (uteslutning av döda celler och skräp som ackumulerats i organoidernas lumen), gating för levande celler (celler som inte innehåller DAPI-laser 405), gating för enstaka celler (dubbel diskriminering) och stamceller (GFP-positiva celler-laser 488) (FSC: framåtspridning, SSC: sidospridning). ROS-signalen har införskaffats med hjälp av 630-lasern. B) Till vänster erhölls histogram med en lämplig programvara som visar intensitetens ROS-signaler för den totala levande befolkningen (efter att ha missat cirka 10 000 händelser per tillstånd) i de olika proverna NT: icke-behandlade; NAC: inhibitorbehandlad. tBHP-inducerare behandlas; NAC-tBHP: inhibitor- och inducerbehandlad. Till höger ett typiskt exempel på det beräknade förhållandet för MFI-värden jämfört med NT-proverna som erhållits under ett experiment som börjar från 3 prover per villkor (medelvärde ± SD) (*** P = 0,0003). (C) Samma som i B för den GFP-positiva populationen (1 000 händelser per tillstånd) (* P = 0,02). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1: Representativa konfokala bilder av ROS-färgning i organoider. Sydda images erhölls med ett konfokalt mikroskop utrustat med en höghastighets EMCCD Kamera, 20x mål, och slits 35 μm, med hjälp av lasrarna 405, 488, 640 och filter 460/50, 535/50, 700/75 för att förvärva Hoechst, GFP respektive fluorogen sond. Konfokala optiska sektioner av organoider som inte behandlats (NT), behandlade med ROS-hämmaren (NAC), med ROS-induceraren (tBHP) eller förbehandlade med ROS-hämmaren och sedan stimuleras med ROS-induceraren (NAC-tBHP). I grått, kärnor färgade med Hoechst; i gröna, Lgr5-GFP-celler; i röd, fluorogen sond (skalstång, 100 μm). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta arbete ger ett steg-för-steg protokoll för att isolera murine jejunal krypter, odla dem i 3D organoider och analysera ROS i organoider genom att kombinera en ROS-känslig fluorogen sond med kvalitativ mikroskopi imaging av hela organoider och kvantitativ ROS mätning med flöde cytometri på enstaka celler efter organoid dissociation.
Det första kritiska steget i den här metoden är kryptextraheringsproceduren. Faktum är att kvaliteten på kryptberedning är nyckeln till framgångsrik organoidbildning. Det är därför viktigt att få fraktioner med berikade krypter och få cellulära skräp eller döende celler. Krypterna kan hittas i olika fraktioner än de som anges i protokollet, eftersom dissociation kan variera med musens ålder och hälsostatus. Antalet EDTA-inkubationer kan ändras i enlighet med detta. Om krypter inte verkar lossna efter bråkdel 4, måste en 3 min EDTA inkubation upprepas. Omvänt, anta att krypter redan lossnar efter den första EDTA-inkubationen. I så fall kan det dröjde inte att den andra EDTA-inkubationen vara nödvändig, och de sekventiella virvelstegen i DPBS bör göras tills fraktioner erhålls med tillräckligt med krypter utan skräp. Om ingen dissociation uppstår, se till att DPBS utan Ca2+ och Mg2+ används för att förbereda uppsamlingsrören och ersätt EDTA med en ny lösning. Krypter är ömtåliga strukturer, så de bör hållas så mycket som möjligt på is och snabbt pläteras efter isolering.
Olika plattor och droppvolymer kan användas för att odla organoider. Till exempel kan krypter också pläteras i 24 eller 48 brunnsplattor efter justering av kryptokoncentrationen, volymen på BMM-droppen och mediet som läggs till i varje brunn. Flera droppar kan pläteras i samma brunn i en 12- eller 6-brunnsplatta. I allmänhet minskar krypter i storlek och avrundar upp för att bilda små runda organoider på kulturdag 1. Bildandet av nya knoppar bör observeras 2-3 dagar efter plätering.
För att studera förändringar i ROS-nivåer i tarmstamceller togs fördelen med muslinjen Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2. En varning för denna modell är den selektiva ljuddämpningen av den knockade allelen och den därav följande mosaicismen i GFP-uttrycket, som kan vara frånvarande i fläckar av stamceller eller hela krypter. Under avbildningsprotokollet kommer inte alla organoider att presentera stamceller som uttrycker GFP; Därför kommer inte alla organoider att övervägas om det inte är möjligt att förlita sig på cellernas rumsliga position. I stället måste detta beaktas vid analys av GFP-negativ cellpopulation i Flödescytometriprotokollet. Eftersom det är omöjligt att förlita sig på den rumsliga positionen kommer den GFP-negativa populationen att bestå av icke-stamceller och GFP-negativa stamceller.
Här tillhandahålls ett protokoll för kvalitativ utvärdering av ROS i intestinala organoider. En kritisk aspekt för denna del är kopplad till arbetsavståndet för de mål som används. Organoiderna odlas i BMM; De är inte fästa vid botten av brunnen, vilket introducerar ett avstånd från den objektiva fokusplanen. Av denna anledning är det viktigt att plätera organoiderna i ett tunt lager av BMM, för att minimera detta problem. Även i denna optimerade inställning kommer inte alla organoider att vara i rätt position för att vara tillräckligt avbildade.
En kvantitativ analys av bilderna kan göras med hjälp av en lämplig bildanalysprogramvara, som utvärderar den genomsnittliga fluorescerande intensiteten hos bilderna i ROS-signalkanalen enligt beskrivningen i protokollet. För detta ändamål är det nödvändigt att skaffa ett stort antal bilder för att få ett tillräckligt antal händelser för att vara statistiskt signifikanta. Som nämnts tidigare, med hjälp av Lgr5-GFP-mössen, kommer inte alla organoider att uttrycka GFP, vilket kräver att ett stort antal prover avbildas.
Under flödescytometriproceduren är ett kritiskt steg dissociationen av organoiderna i enstaka celler. Om dissociationen är för hård kan celler dö och frigöra DNA. En berghämmare, Y-27632, för att motverka anoikis, och DNAse kan läggas till dissociationsbufferten om de inte stör den studerade vägen. Trypsinutspädning eller minskade inkubationstider kan användas.
Slutligen är det viktigt att definiera den bästa tidspunkten för att analysera ROS-produktionen efter de olika behandlingarna (anti- eller pro-oxidant) testade. När det gäller läkemedel som snabbt inducerar ROS inom några minuter eller timmar kan avbildningsanalysen användas för att bestämma när det finns maximal induktion genom att tillsätta den fluorogena sonden före de testade föreningarna. Sondens fluorescensintensitet efter organoidstimulering kan variera mellan experiment som utförs på olika dagar. Därför är det viktigt att alltid beräkna förhållandet med de icke-stimulerade proverna och lägga till kontroller (oxidant / antioxidant) för att verifiera sondens reaktivitet. NAC och tBHP användes som negativa och positiva kontroller eftersom de gav de mest avgörande resultaten. Fortfarande, andra reagenser kan användas, såsom resveratrol som en antioxidant eller parakvat/menadione som oxidanter. Inkubationsceller för länge med den fluorogena sonden kan vara giftigt och till och med ändra cellens redoxbalans, så inkubationstiden måste också kontrolleras noggrant. Celler färgade med sonden kan fixas och analyseras några timmar efter. I detta fall, för flöde cytometri analys, DAPI kan inte diskriminera mellan levande och döda celler. I stället bör ett fixerbart färgämne för levande/död diskriminering användas före fixering.
Organoider kan också odlas i flera dagar (mer än 7), men detta kommer att öka antalet levande och proliferativa celler och de döda cellerna som ackumuleras i organoidernas lumen, vilket genererar hög bakgrund, särskilt i avbildningsanalysen. Om en onormal ökning av den fluorogena sondsignalen observeras, se till att den lösning som används för att återanvända stimulerande föreningar inte är pro-oxidant i sig (dvs. etanol).
Ett problem att tänka på när du använder detta protokoll är att levande avbildning och cell dissociation följt av flöde cytometry kan inducera oxidativ stress i celler och generera en bakgrundssignal. Fixering av organoiderna kan övervägas enligt experimentet. En annan begränsning uppstår från svårigheten i den djupgående avbildningen av organoider som odlas i en 3D-matris. Som nämnts i protokollet bör BMM distribueras på bilden som ett tunt lager för att begränsa denna aspekt.
Här är protokollet utformat med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt fluorogent färgämne. Dess främsta fördel är dess kompatibilitet med flerfärgsfärgning av organoider så att specifika celltyper. Till exempel kan antikroppsfärgning för cellytans markörer omedelbart efter den fluorogena sondinkubationen göras för att upptäcka vissa undertyper. Sonden är dock inte specifik för en specifik ROS-art eftersom den kan upptäcka superoxid, nitritperoxid och väteperoxid11,12,13. Av denna anledning används det i allmänhet för att upptäcka global oxidativ stress. Även om kommersialiseras som en cytosolic-endast sond, kunde den valda fluorogena sonden hittas för att nå mitokondrier14. Eftersom dess specificitet kan variera mellan olika cellulära sammanhang, föreslår vi att du använder andra kompletterande metoder för att mäta ROS när det är möjligt. Alternativa färgämnen som sonder som är specifika för att upptäcka mitokondriergenererade superoxidanjoner kan användas10. En repertoar av chemiluminescent sonder utvecklades också för att upptäcka specifika ROS arter med hög känslighet, såsom luciferin-baserade sonder15,16. Dessa har fördelen att de är kompatibla med in vivo-avbildning men kan inte användas för att kartlägga ROS-produktion med specifika celltyper. Slutligen kan detta protokoll tillämpas på andra typer av organoider, till exempel koloniska organoider som härrör från mänskliga tarmbiopsier. I detta fall bör odlingstillväxtmediet anpassas i enlighet därmed17. För att ytterligare analysera redox maskineri i intestinala celler, organoider kultur och dissociation förfaranden beskrivs i detta protokoll kan kombineras med transkriptomiska och proteomiska metoder på hela organoider eller Fluorescence aktiverade cell sorterade (FACS) organoider celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av det franska nationella forskningsorganet (ANR) anslag 17-CE14-0022 (i-Stress).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
- Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
- Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
- vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
- Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
- Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
- Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
- Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
- Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
- Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).
- Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
