Summary
Den foreliggende protokol beskriver en metode til påvisning af reaktive iltarter (ROS) i tarmmurineorganoiderne ved hjælp af kvalitativ billeddannelse og kvantitative cytometriassays. Dette arbejde kan potentielt udvides til andre fluorescerende sonder for at teste effekten af udvalgte forbindelser på ROS.
Abstract
Reaktive iltarter (ROS) spiller væsentlige roller i intestinal homeostase. ROS er naturlige biprodukter af cellemetabolisme. De produceres som reaktion på infektion eller skade på slimhindeniveau, da de er involveret i antimikrobielle reaktioner og sårheling. De er også kritiske sekundære budbringere, der regulerer flere veje, herunder cellevækst og differentiering. På den anden side fører overdrevne ROS-niveauer til oxidativ stress, som kan være skadelig for celler og favorisere tarmsygdomme som kronisk betændelse eller kræft. Dette arbejde giver en ligetil metode til at detektere ROS i tarmmurinorganoiderne ved levende billeddannelse og flowcytometri ved hjælp af en kommercielt tilgængelig fluorogen sonde. Her beskriver protokollen analysen af effekten af forbindelser, der modulerer redoxbalancen i tarmorganoider og detekterer ROS-niveauer i specifikke tarmcelletyper, her eksemplificeret ved analysen af tarmstamcellerne, der er genetisk mærket med GFP. Denne protokol kan anvendes sammen med andre fluorescerende sonder.
Introduction
Reaktive iltarter (ROS) er naturlige biprodukter af cellulær metabolisme. De kan også produceres aktivt af specialiserede enzymatiske komplekser såsom de membranbundne NADPH-oxidaser (NOX) og dualoxidaser (DUOX), som genererer superoxidaniion og hydrogenperoxid1. Ved at udtrykke antioxidantenzymer og ROS-ådselædere kan cellerne finjustere deres redoxbalance og derved beskytte vævets homeostase2. Selvom ROS kan være meget giftigt for cellerne og beskadige DNA, proteiner og lipider, er de afgørende signalmolekyler2. I tarmepitelet kræves moderate ROS-niveauer til spredning af stam- og stamceller3; høje ROS-niveauer fører til deres apoptose4. Kronisk oxidativ stress er forbundet med mange gastrointestinale sygdomme, såsom inflammatoriske tarmsygdomme eller kræft. Som et eksempel, i en musemodel af Wnt-drevet tarmkræft, blev forhøjet ROS-produktion gennem aktivering af NADPH-oxidaser fundet at være nødvendig for kræftceller hyperproliferation5,6. Det er vigtigt at definere, hvordan tarmceller, især stamceller, håndterer oxidativ stress, og hvordan det cellulære miljø kan påvirke denne kapacitet, for bedre at forstå ætiologien af denne sygdom7.
I et væv præsenterer forskellige celletyper en basal oxidativ tilstand, der kan variere afhængigt af deres funktion og metabolisme og ekspressionen af forskellige niveauer af oxidant- og antioxidantmolekyler4,7. Overvågning af ROS in vivo er meget udfordrende. Cellegennemtrængelige farvestoffer, der udsender fluorescens i henhold til deres redoxtilstand, er udviklet til at visualisere og måle cellulær ROS i levende celler og dyr. Deres effektivitet afhænger dog af deres diffusion inde i levende væv og deres hurtige udlæsning, hvilket gør dem vanskelige at bruge i dyremodeller8.
Tidligere blev undersøgelsen af virkningen af forbindelser på ROS-generering udført ved hjælp af cellelinjer, men dette afspejler muligvis ikke in vivo-situationen . Tarmorganoidmodellen, udviklet af gruppen Clevers9, muliggør vækst af intestinale primære celler ex vivo. Kultur af tarmkrypter i matricer, i nærvær af definerede vækstfaktorer, fører til tredimensionelle strukturer, kaldet organoider (mini-tarm), som reproducerer krypt-villus-organisationen, med celler fra de forskellige epitelafstamninger, der forer et indre lumen, og tarmstamcellerne, der er bosiddende i små kryptlignende fremspring.
Her beskrives en simpel metode til at studere oxidativ stress i primære tarmceller ved enkeltcelleopløsningen ved at tilføje et kommercielt tilgængeligt ROS-følsomt farvestof til organoidkulturmediet.
Pladelæsere bruges ofte til at detektere ROS-produktion i en samlet befolkning. Denne protokol bruger flowcytometri eller billeddannelsesassay til at detektere ROS i en bestemt celletype med genetisk modificerede celler eller specifik antistoffarvning. Dette arbejde involverer musetarmorganoidkultur og ROS-visualisering ved konfokal billeddannelse og kvantificering ved flowcytometri. Ved hjælp af Lgr5-GFP-mus-afledte tyndtarmsorganoider er det muligt specifikt at analysere niveauet af oxidativt stress i tarmstamceller ved forskellige behandlinger. Denne protokol kan tilpasses til at teste indflydelsen af eksogene molekyler, såsom mikrobiota-afledt muramyl-dipeptid (MDP)10, på ROS-balancen efter stimulering af organoider med de udvalgte forbindelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført efter godkendelse af Institut Pasteur Use Committee og af det franske landbrugsministerium nr. 2016-0022. Alle trin udføres inde i en vævskulturhætte.
1. Fremstilling af reagenser og materialer til dyrkning af tarmorganoider
- For at forberede vækstkulturmedium blandes avanceret DMEM/F-12 suppleret med 1x glutamin, 1x penicillin/streptomycin (P/S)-opløsning, 10 mM HEPES, 50 ng/ml murin EGF, 20 μg/ml murine Noggin 500 ng/ml mus R-Spondin1 (se materialetabellen). Lad mediet stå ved stuetemperatur (RT) under kryptens ekstraktion.
BEMÆRK: Det ubrugte medium fryses i alikvoter ved -20 °C. Undgå at fryse og tø op. - Fyld et 50 ml rør med 40 ml avanceret DMEM/F-12 og opbevar det på is.
BEMÆRK: Opbevar det ubrugte medium ved 4 °C. Det vil blive brugt til organoider, der passerer. - Forvarm cellekulturpladerne (μ-Slide 8 brøndkamre og/eller 96-brønds rund bund) i inkubatoren ved 37 °C.
- Optøning af kældermembranmatrix (BMM) (se tabel over materialer) alikvoter på is (inden protokollen påbegyndes eller mindst 1 time før plettering af krypter).
BEMÆRK: BMM vil hurtigt størkne, hvis den ikke holdes kold. - Vask/skylleopløsning tilsætning af 1 % penicillin-streptomycinopløsning til DPBS (DPBS-P/S) til forberedes.
- Fyld en 100 mm petriskål med 10 ml kold DPBS-P/S. Fyld seks 15 ml rør med 10 ml DPBS og mærk dem fra F1 til F6.
- Der fremstilles 30 ml 10 mM EDTA-opløsning ved fortynding fra 0,5 M EDTA i DPBS. Fyld to 15 ml rør med 10 ml 10 mM EDTA, og mærk dem E1 og E2.
- Hold alle opløsninger forkølet ved 4 ° C, og opbevar dem på isen under proceduren.
2. Tarmorganoidkultur
- Ofre en 8-10 uger gammel Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) mus i henhold til de nationale regler og forskrifter.
- Saml 5-8 cm af jejunum, der omfatter området mellem tolvfingertarmen (5 cm fra maven) og ileum (10 cm fra cecum) og opbevar i koldt DPBS-P/S på is.
- Rengør tarmindholdet ved at skylle med 5-10 ml kold DPBS-P/S.
BEMÆRK: Hjemmelavede skyllesprøjter kan opnås ved at tilslutte en 200 μL spids til en 10 ml sprøjtedyse. - Åbn tarmen i længderetningen ved hjælp af kuglespidssaks (se Materialetabel) (for at forhindre beskadigelse af vævet).
- Brug tang til at overføre vævet til en petriskål indeholdende kold DPBS-P/S ved stuetemperatur og ryst det for at skylle.
- Med en plastpasteurpipette skal du gribe tarmen ved aspiration og overføre den til et 15 ml rør mærket E1 indeholdende 10 ml kold 10 mM EDTA.
- Omvendt røret 3 gange og inkuber på is i 10 minutter.
- Brug en plastpasteurpipette til at overføre vævet i rør F1 indeholdende 10 ml DPBS. Vortex i 2 min (på normal hvirvel, holde røret i hånden og sikre, at tarmen hvirvler pænt).
- Sæt 10 μL af fraktionen i en petriskål og vurder kvaliteten af fraktionen under et mikroskop.
BEMÆRK: Alle hvirveltrin udføres ved maksimal hastighed, og kvaliteten af hver fraktion skal vurderes under mikroskopet (figur 1). - Med en plastpasteurpipette skal du gribe tarmen ved aspiration og overføre den i rør F2 indeholdende 10 ml DPBS og hvirvel i 2 minutter.
- Gentag trin 2.10, overfør vævet i rør F3 indeholdende 10 ml DPBS og hvirvel i 2 minutter.
- Gentag EDTA-inkubation som i trin 2.6, og overfør vævet i rør E2 indeholdende 10 mM EDTA.
- Omvendt røret 3 gange og inkuber på is i 5 minutter.
- Gentag trin 2.10, overførsel af vævet i rør F4 indeholdende 10 ml DPBS og hvirvel i 3 minutter.
- Gentag trin 2.14, overførsel af vævet i rør F5 indeholdende 10 ml DPBS og hvirvel i 3 minutter.
- Gentag trin 2.15, overførsel af vævet i rør F6 indeholdende 10 ml DPBS og hvirvel i 3 minutter.
- Kombiner de bedste fraktioner, der filtreres efter tyngdekraften gennem en 70 μm cellesil, til et 50 ml rør (på is) for at eliminere villi og betydeligt affald.
BEMÆRK: Normalt er F5 og F6 de fraktioner, der indeholder adskillige krypter og mindre affald. - Spin krypterne ved 150 x g ved 4 ° C i 3 minutter.
- Tøm røret, forstyr pelleten mekanisk, og tilsæt 5 ml kold DMEM / F12.
- Sæt 10 μL af suspensionen i en petriskål og tæl antallet af krypter, der er til stede i aliquoten manuelt under et mikroskop.
BEMÆRK: Tæl ikke enkeltceller eller små snavs. - Beregn volumen (V) af kryptsuspension, der kræves i μL, i betragtning af at 300 krypter er belagt pr. Brønd, W er antallet af brønde, og N er antallet af krypter, der tælles ud af 10 μL af suspensionen. Overfør krypterne til et nyt 15 ml rør.
BEMÆRK: V = 300 x B x 10/N. Hvis der anvendes et lille volumen i det planlagte forsøg, kan der anvendes et 1,5 ml centrifugerør. - Spin krypterne ved 200 x g ved 4 ° C i 3 minutter.
- Fjern forsigtigt supernatanten ved hjælp af en pipette.
- Mekanisk forstyrre pelleten og forsigtigt tilføje vækstkulturmedium for at opnå en koncentration på 90 krypter / μL.
- Tilsæt 2 volumener ufortyndet BMM for at få en endelig koncentration på 30 krypter / μL. Pipetter forsigtigt op og ned uden at indføre luftbobler i blandingen.
BEMÆRK: Opbevar altid røret på is for at undgå BMM-størkning. - Plade 10 μL af krypterne / BMM blandes i hver brønd. Til Flowcytometrianalyse skal du bruge rundbundede 96-brøndsplader. Fordel 10 μL i midten af hver brønd som en kuppel. Til billeddannelse skal du bruge μ-slide 8-brønd (se materialetabel) og deponere 10 μL som et tyndt lag.
BEMÆRK: Plade organoiderne som et tyndt lag til billeddannelsesassayet for at muliggøre deres dybdegående billeddannelse. - Lad pladen stå i 5 minutter ved RT for at lade BMM størkne. Anbring pladen i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2 i 15 minutter.
- Tilsæt 250 μL vækstmedium i hver brønd, og pas på ikke at løsne BMM.
- Anbring pladerne i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2.
- Udfør ROS-analysen mellem dag 4 og 6 i kulturen. Ellers skal du ændre mediet og opdele organoiderne efter udseendet af flere og lange spirende strukturer, og når døde celler akkumuleres i organoiderne lumen.
3. Organoider, der passerer
- Begynd at passere tyndtarmsorganoider fra den 6. kulturdag, når der er dannet betydelige spirende strukturer, og organoiderne lumen er blevet mørke.
BEMÆRK: Organoidens lumen bliver mørkt på grund af ophobning af døde celler, snavs og slim. Undgå at lade organoiderne vokse over, før de splittes. Opdelingsforholdet afhænger af organoidernes vækst. Det anbefales at passere organoiderne med et forhold på 1:2 på dag 6 og 1:3 på dag 10. - Fyld et 15 ml rør med 4 ml koldt avanceret DMEM/F-12 og opbevar det på is.
BEMÆRK: Her leveres mængder til en 96-brønds kulturplade. Hvis der anvendes et andet format, skal du justere lydstyrken i overensstemmelse hermed. - Aspirer forsigtigt mediet med en pipette eller en vakuumpumpe fra brøndene uden at røre ved BMM-kuplerne, og kassér det.
- Tilsæt 100 μL kold avanceret DMEM/F-12 pr. brønd. Pipette op og ned for at bryde BMM og overføre brøndens indhold til 15 ml røret.
- Vask brønden med 200 μL kold Advanced DMEM/F-12 og saml den i samme rør.
BEMÆRK: Ved passage af flere brønde fra samme forsøgstilstand kan brøndenes indhold samles i det samme 15 ml opsamlingsrør. - Spin 15 ml opsamlingsrøret ved 100 x g i 5 minutter ved 4 ° C.
- Kassér supernatanten, og tilsæt 1 ml kold avanceret DMEM / F-12 til pelleten. Brug en P1000-spids til at tage en P10-spids op (uden filter) og pipette op og ned mindst 20 gange.
- Tilsæt 4 ml kold Advanced DMEM/F-12 til røret. Spin ved 300 x g i 5 minutter ved 4 ° C.
- Aspirer supernatanten med en pipette eller en vakuumpumpe uden at forstyrre pillen. Derefter forstyrre pelleten mekanisk.
- Tilsæt BMM fortyndet i vækstkulturmedium (2:1 forhold). Pipetter forsigtigt op og ned uden at indføre luftbobler i blandingen.
- Plade 10 μL af krypterne / BMM blandes i hver brønd.
- Opbevar pladen i 5 minutter ved RT, så BMM'en størkner. Anbring pladen i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2 i 15 minutter.
- Tilsæt 250 μL vækstmedium i hver brønd.
BEMÆRK: Pas på ikke at aflede BMM. - Anbring pladerne i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2.
4. Fremstilling af reagenser og materialer til vurdering af oxidativ stress i tarmorganoider
- Der fremstilles en 250 mM stamopløsning af inhibitor N-acetylcystein (NAC) (se materialetabel), resupend 10 mg med 245 μL DPBS. Anvendes ved 1 mM endelig koncentration.
- Der fremstilles en 50 mM stamopløsning af inducer tert-butylhydroperoxid (tBHP), 70% i vand, fortyndes 3,22 μL med 496,8 μL DPBS. Anvendes ved 200 μM endelig koncentration.
- Til Flowcytometri-undersøgelsen fremstilles en 250 μM arbejdsløsning af en fluorogen sonde (se tabel over materialer) ved fortynding af stamopløsningen 1/10 i DMSO. Anvendes ved 1 μM endelig koncentration.
BEMÆRK: Som angivet i producentens anvisninger er den fluorogene sonde følsom over for lys og ilt. Aktier og aliquoter bør ikke være åbne og lukke for mange gange. - Til billeddannelsesundersøgelsen fremstilles en 1,25 mM arbejdsløsning af den fluorogene sonde ved fortynding af stamopløsningen 1/2 i DMSO. Anvendes ved 5 μM endelig koncentration.
- Der fremstilles en endelig opløsning på 0,1 μg/ml DAPI i DPBS, der skal anvendes til diskrimination af døde celler i flowcytometriassayet.
- Hoechst 33342 fortyndes til 1,25 mg/ml i DPBS. Anvendes ved en slutkoncentration på 5 μg/ml, der skal anvendes til nuklear farvning i billedanalysen.
- Varm DMEM uden phenolrød ved 37 °C.
BEMÆRK: Disse trin beskriver brugen af negative og positive kontroller, der skal medtages i eventuelle analyser, ved hjælp af de betingelser, der er angivet i figur 2A. Assayet kan bruges til at teste anti- eller pro-oxidantforbindelser. Trinene er de samme, og den eneste forskel er, når forbindelserne tilsættes, før det fluorogene farvestof anvendes.
5. Visualisering af oxidativ stress i 3D-organoider ved konfokal mikroskopi
- Der tages organoider belagt i de μ-Slide 8 brøndkamre og tilsættes 1 μL NAC stamopløsning i de tilsvarende brønde for at opnå en endelig koncentration på 1 mM.
- Inkuber i 1 time ved 37 °C og 5 % CO2.
- Der tilsættes 1 μL tBHP-stamopløsning i de tilsvarende brønde for at opnå en endelig koncentration på 200 μM.
- Inkuber i 30 minutter ved 37 °C og 5 % CO2.
- Der tilsættes 1 μL pr. brønd af fortyndingen af den fluorogene sonde på 1,25 mM for at opnå en endelig koncentration på 5 μM.
- Der tilsættes 1 μL pr. brønd af fortyndingen af Hoescht på 1,25 mg/ml for at opnå en endelig koncentration på 5 μg/ml.
- Inkuber i 30 minutter ved 37 °C og 5 % CO2.
- Fjern mediet uden at forstyrre BMM. Tilsæt forsigtigt 250 μL varm DMEM uden phenolrød.
BEMÆRK: Hvis der er planlagt en langsigtet erhvervelse, skal du tilføje vækstfaktorforbindelser til DMEM uden phenolrød. - Forestil dig organoiderne ved hjælp af et konfokalmikroskop udstyret med et termisk kammer og gasforsyning, der detekterer den fluorogene sonde (ROS).
BEMÆRK: Excitationen/emissionen (ex/em) for den fluorogene sonde er 644/665, ex/em for Hoechst (kerner) er 361/486, og ex/em for GFP (tarmstamcelle fra Lgr5-GFP-musene) er 488/510. Et 63x olienedsænkningsmål bruges til at detektere signaler i stamceller. Skift ikke laserindstillinger mellem prøverne. Et 20x mål kan bruges til at give et overblik over ROS-produktionen. - Brug den positive kontrol til at indstille laserintensitet og tidseksponering for ROS-signalet, og kontroller, at dette signal er lavere i den negative kontrol.
- Ved hjælp af okularskærm glideren til at identificere GFP-organoiderne, der udtrykker og justerer laserintensiteten.
BEMÆRK: Dette trin udføres manuelt. - Definer positioner for at opnå et syet billede af hele organoiden. Opsæt en z-stak på 25 μm (trinstørrelse 5 μm) for at få en sektion af organoiderne, der viser et lag af celler.
BEMÆRK: Se brugervejledningen til mikroskopet for at optimere opsætningen. Ved hjælp af levende celler skal erhvervelsen ske inden for 1 time efter inkubationens afslutning. - Åbn billederne i en open source-billedbehandlingssoftware (se Tabel over materialer).
- Gå gennem z-stakken og vælg det afsnit, hvor midten af organoiderne er godt repræsenteret, og opret et nyt billede med det valgte område.
- Kvantificer billederne i henhold til trin 5.15.1 - 5.15.5.
- Vælg frihåndslinjeværktøjet.
- Tegn en linje efter kernerne.
BEMÆRK: Vælg kun områder, der præsenterer GFP-positive celler, hvis kun stamceller analyseres. - Forøg linjebredden for at dække cellelaget med linjen uden at inkludere luminalaffaldet.
- Vælg kanalen for ROS-signalet, og mål fluorescensintensiteten i det valgte område, og kommenter værdierne.
- Tegn en linje, hvor der ikke er noget signal, og mål den fluorescerende intensitet af baggrunden, der trækkes fra den foregående værdi for at få den endelige intensitet.
6. Kvantificering af den oxidative stress på de dissocierede organoider ved hjælp af flowcytometer
- Der tilsættes 1 μL NAC-stamopløsning i brøndene til negativ kontrol for at opnå en endelig koncentration på 1 mM.
BEMÆRK: Brug de organoider, der er belagt i de 96-brønds runde bundplader. - Inkuber i 1 time ved 37 °C og 5 % CO2.
- Der tilsættes 1 μL tBHP-stamopløsning i de tilsvarende brønde for at opnå en endelig koncentration på 200 μM.
- Inkuber i 30 minutter ved 37 °C og 5 % CO2.
- Fjern mediet med en flerkanalspipette uden at forstyrre den vedhæftede BMM og overfør den til en anden rund bundplade med 96 brønde. Hold denne plade til side.
- Tilsæt 100 μL trypsin, og med en flerkanalspipette pipette pipette op og ned mindst fem gange for at ødelægge BMM.
- Inkuber i højst 5 minutter ved 37 °C og 5 % CO2.
- Med en flerkanalspipette pipette pipette op og ned mindst fem gange for at adskille organoiderne.
- Spin ved 300 x g i 5 min ved RT.
- Kassér supernatanten ved at vende pladen om. Tilsæt det medium, der er indsamlet i trin 6.3, til de tilsvarende brønde, og ophænd cellerne igen ved at pipettere op og ned 5 gange.
- Den fluorogene sonde tilsættes ved den endelige koncentration på 1 μM. Der tilsættes 1 μL pr. brønd fra fortyndingen på 250 μM, og der udruberes i 30 minutter ved 37 °C og 5 % CO2.
BEMÆRK: Tilsæt ikke den fluorogene sonde til de brønde, der er nødvendige for instrumentets indstillinger (figur 2B). - Spin ved 300 x g i 5 min ved RT.
- Resuspend cellerne med 250 μL 0,1 μg/ml DAPI-opløsning. Overfør prøverne i de korrekte Flow cytometrirør, hold rørene på is, og fortsæt med analysen.
BEMÆRK: Tilføj PBS i stedet for DAPI til de brønde, der er nødvendige for instrumentets indstillinger (figur 2B). - Optimer indstillingerne for spredning fremad og side på ikke-plettet kontrol og laserspændinger for hver fluorofor ved hjælp af monofarvede prøver.
- Brug en passende gating-strategi (figur 4A) til at indsamle mindst 20.000 hændelser.
BEMÆRK: 50.000 arrangementer foretrækkes. Detaljerede anskaffelsesindstillinger varierer afhængigt af det anvendte instrument.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som et bevis på konceptet for den beskrevne protokol blev krypterne opnået fra Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 muselinjen anvendt, hvor intestinale stamceller viser mosaik GFP-ekspression, som blev etableret af Barker et al., for at karakterisere intestinale stamceller10 oprindeligt og tillade at kortlægge disse celler baseret på deres GFP-ekspression. Der tilvejebringes der derved en model til sammenligning af ROS-niveauer i en bestemt celletypepopulation ved forskellige behandlinger. En ROS-hæmmer (NAC) blev anvendt, og en inducer (tBHP), der vides at virke på cellulær ROS for at visualisere ændringer i deres niveauer.
Figur 1A og 1B viser repræsentative billeder af fraktionerne F1 og F4 opnået under kryptekstraktionsproceduren for tarmorganoidkulturen. Hver fraktion skal kontrolleres under et mikroskop eller en kikkert under ekstraktionsproceduren for at følge krypternes løsrivelse og definere de fraktioner, der er beriget i krypter, snarere end villi, enkeltceller eller snavs. De valgte fraktioner samles derefter sammen og føres gennem en 70 μm cellesil for at fjerne alle de resterende fragmenter af villi og opnå et præparat med kun krypter (figur 1C). Krypterne begynder at lukke inden for få timer efter indlejring i BMM, og ved D1 blev der observeret runde organoider (figur 1D). Efter 3-5 dage vises organoiderne med spirende strukturer, der repræsenterer de "nydannede krypter". Organoiderne er klar til ROS-analyse (figur 1E og 1F).
I protokollen for billeddannelse af oxidativ stress ved konfokal mikroskopi blev diaset indeholdende organoiderne, inkuberet med sonden, afbildet med et konfokalt fluorescensmikroskop udstyret med lasere og filtre til påvisning af Hoechst (ex / em: 361/486), GFP (ex / em: 488/510) og fluorogen sonde (ex / em): 644/665) signaler. Et konfokalmikroskop udstyret med 20x luft og 63x olienedsænkningsmål tillod visualisering af ROS. I Lgr5-GFP-mus er de GFP-positive celler Lgr5-ekspressionerende tarmstamceller. Supplerende figur 1 viser repræsentative billeder opnået med 20x-målet, der giver et overblik over ROS i flere organoider. Figur 3 viser repræsentative billeder, opnået med 63x oliemålet, af tarmorganoider, der udtrykker GFP, ikke-behandlet (NT) eller præinkkuberet eller ej med ROS-hæmmeren NAC, og stimuleret eller ej i 30 minutter med ROS-induktoren tBHP.
I nærvær af inhibitoren er det eneste signal fra de døde celler indeholdt i organoidens lumen synligt. I den ikke-behandlede organoid vises de basale ROS-niveauer, hvilket beviser, at stamceller producerer højere ROS end differentierede celler (ifølge mikroskopindstillingerne kan ROS-signalet også visualiseres i ikke-stamceller). GFP-positive celler præsenterer et mere signifikant cytoplasmatisk signal med induktoren i nærvær af den fluorogene sonde, hvilket viser, at ROS-niveauerne stiger især i stamceller efter behandling.
Figur 4 viser repræsentative resultater opnået ved analyse af ROS-produktion i intestinale organoider stimuleret eller ej med ROS-hæmmer eller inducer ved anvendelse af et flowcytometer udstyret med 405 nm, 488 nm og 630 nm lasere. Gating-strategien, der præsenteres i figur 4A , gør det muligt at evaluere ROS-produktionen på niveau med hele organoidcellepopulationen, definere intakte og levende celler baseret på fysiske parametre og DAPI-udelukkelse (SSC-A vs. FSC-A og DAPI vs. FSC-A) og FSC-H vs. FSC-A) eller kun i tarmstamcellerne, yderligere gated på celler med GFP højt signal. Figur 4B viser ROS-niveauerne i den samlede befolkning ved indsamling af 50.000 hændelser. Basal ROS-niveauerne i de ikke-behandlede (NT) celler falder efter stimulering med inhibitoren (NAC) og tværtimod stiger efter udfordring med induktoren (tBHP). Celler, der er forbehandlet med hæmmeren og derefter stimuleret med induktoren, har et lavere niveau end dem, der stimuleres med induktoren alene. Resultaterne blev derefter analyseret ved hjælp af passende software, der opnåede median fluorescerende intensitet (MFI). De opnåede værdier præsenteres som et forhold over de ikke-behandlede celler, som vist i grafen til højre for figur 4B. Figur 4C viser de samme parametre beskrevet i figur 4B i stamcellerne, gated som GFP-positive celler, der viser et 3,5 gange fald i ROS-niveauet ved NAC-behandling og 4 gange stigning ved tBHP-behandling over ikke-stimulerede celler. Dette resultat viser, at det efter denne protokol er muligt at kvantificere forskelle i ROS-niveauer på niveauet for hele cellepopulationen eller i GFP-positive stamceller ved deres behandling af organoiderne med specifikke forbindelser.
Figur 1: Repræsentative billeder af krypter og organoider. (A) Eksempel på fraktion F1 opnået efter den første inkubation med EDTA, beriget med villi (firkant), med noget snavs (stjerne) og krypter (cirkel). (B) Eksempel på fraktion F4 beriget med krypter. (C) Suspension, der kun præsenterer isolerede krypter opnået efter filtreringen med en 70 μm cellesil (skalastang, 200 μm). (D, E og F). Typiske organoider blev opnået efter henholdsvis 1, 3 og 5 dage efter indlejring af krypterne i BMM (skalabjælke, 100 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Oversigt over forsøgsplanen. (A) Betingelser, der anvendes i denne protokol, og som indgår i hvert forsøg: ikke-behandlede brønde (NT), induktorbehandlede brønde (tert-butylhydroperoxid - tBHP), inhibitorbehandlede brønde (N-acetylcystein - NAC) og inhibitor- og inducerbehandlede brønde (NAC-tBHP). B) Pladeformat til flowcytometriassay. Hver betingelse er belagt i tre eksemplarer (linje A). Linjerne B, C og D inkluderer brønde til indstilling af flowcytometer med kun den fluorogene sonde, kun DAPI eller ikke-farvede (NS) prøver. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative konfokale billeder af ROS-farvning i organoider. Syede billeder blev opnået med et konfokalmikroskop udstyret med et højhastigheds EMCCD-kamera, 63x / 1,4 oliemål og spalte 35 μm ved hjælp af laserne 405, 488, 640 og filtre 460/50, 535/50, 700/75 til at erhverve henholdsvis Hoechst, GFP og den fluorogene sonde. Konfokale optiske sektioner af organoider, der ikke er behandlet (NT), behandlet med ROS-hæmmeren (NAC), med ROS-induktoren (tBHP) eller forbehandlet med ROS-hæmmeren og derefter stimuleret med ROS-induktoren (NAC-tBHP). I grå, kerner farvet med Hoechst; i grønne, Lgr5-GFP-celler; i rødt, den fluorogene sonde (skalastang, 50 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentativ flowcytometrianalyse af ROS i celler afledt af organoider. (A) Skematisk repræsentation af gating-strategien, der anvendes i flowcytometrianalyse: gating for celleform (udelukkelse af døde celler og snavs akkumuleret i organoidernes lumen), gating for levende celler (celler, der ikke indeholder DAPI-laser 405), gating for enkeltceller (doublet diskrimination) og stamceller (GFP positive celler-laser 488) (FSC: forward scatter, SSC: side scatter). ROS-signalet er erhvervet ved hjælp af 630-laseren. (B) Til venstre blev histogrammer opnået med en passende software, der viser intensiteten ROS-signaler for den samlede levende befolkning (efter gating omkring 10.000 hændelser pr. Tilstand) i de forskellige prøver NT: ikke-behandlet; NAC: inhibitorbehandlet; tBHP-inducerbehandlet; NAC-tBHP: inhibitor- og inducerbehandlet. Til højre et typisk eksempel på det beregnede forhold for MFI-værdier over NT-prøverne opnået under et forsøg ud fra 3 prøver pr. betingelse (gennemsnit ± SD) (*** P = 0,0003). (C) Samme som i B for den GFP-positive population (1.000 hændelser pr. tilstand) (* P = 0,02). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Repræsentative konfokale billeder af ROS-farvning i organoider. Syede images blev opnået med et konfokalmikroskop udstyret med et højhastigheds EMCCD-kamera, 20x mål og spalte 35 μm ved hjælp af laserne 405, 488, 640 og filtre 460/50, 535/50, 700/75 til at erhverve henholdsvis Hoechst, GFP og fluorogen sonde. Konfokale optiske sektioner af organoider, der ikke er behandlet (NT), behandlet med ROS-hæmmeren (NAC), med ROS-induktoren (tBHP) eller forbehandlet med ROS-hæmmeren og derefter stimuleret med ROS-induktoren (NAC-tBHP). I grå, kerner farvet med Hoechst; i grønne, Lgr5-GFP-celler; i rød, fluorogen sonde (skalabjælke, 100 μm). Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbejde giver en trinvis protokol til at isolere murine jejunal krypter, dyrke dem i 3D-organoider og analysere ROS i organoider ved at kombinere en ROS-følsom fluorogen sonde med kvalitativ mikroskopi billeddannelse af hele organoider og kvantitativ ROS-måling ved hjælp af flowcytometri på enkeltceller efter organoid dissociation.
Det første kritiske skridt i denne metode er krypter ekstraktion procedure. Faktisk er kvaliteten af kryptforberedelse nøglen til vellykket dannelse af organoider. Det er derfor vigtigt at opnå fraktioner med berigede krypter og få cellulære affald eller døende celler. Krypterne kan findes i forskellige fraktioner end dem, der er angivet i protokollen, da dissociation kan variere med musens alder og sundhedsstatus. Antallet af EDTA-inkubationer kan ændres i overensstemmelse hermed. Hvis krypter ikke ser ud til at løsne sig efter fraktion 4, skal en 3 minutters EDTA-inkubation gentages. Antag omvendt, at krypter allerede løsnes efter den første EDTA-inkubation. I så fald er den anden EDTA-inkubation muligvis ikke nødvendig, og de sekventielle hvirveltrin i DPBS skal udføres, indtil fraktioner opnås med nok krypter uden snavs. Hvis der ikke opstår dissociation, skal du sørge for, at DPBS uden Ca2+ og Mg2+ bruges til at forberede opsamlingsrørene og erstatte EDTA med en ny opløsning. Krypter er skrøbelige strukturer, så de skal opbevares så meget som muligt på is og hurtigt belægges efter isolering.
Forskellige plader og dråbevolumener kan anvendes til at dyrke organoider. For eksempel kan krypter også belægges i 24 eller 48 brøndplader efter justering af kryptkoncentrationen, volumenet af BMM-dråben og mediet tilføjet i hver brønd. Flere dråber kan være belagt i samme brønd i en 12- eller 6-brønds plade. Generelt falder krypter i størrelse og afrundes for at danne små runde organoider på kulturdagen 1. Dannelse af nye knopper skal observeres 2-3 dage efter pletteringen.
For at studere ændringer i ROS-niveauer i intestinale stamceller blev fordelen ved Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 muselinjen taget. En advarsel ved denne model er den selektive dæmpning af den bankede allel og den deraf følgende mosaik af GFP-udtrykket, som kan være fraværende i pletter af stamceller eller hele krypter. Under billeddannelsesprotokollen vil ikke alle organoider præsentere stamceller, der udtrykker GFP; derfor vil ikke alle organoider blive overvejet, medmindre det er muligt at stole på cellernes rumlige position. I stedet skal dette overvejes, når man analyserer den GFP-negative cellepopulation i Flowcytometriprotokollen. Da det er umuligt at stole på den rumlige position, vil den GFP-negative population faktisk bestå af ikke-stamceller og GFP-negative stamceller.
Her er der tilvejebragt en protokol til kvalitativ evaluering af ROS i intestinale organoider. Et kritisk aspekt for denne del er knyttet til arbejdsafstanden for de mål, der anvendes. Organoiderne dyrkes i BMM; de er ikke fastgjort til bunden af brønden, hvilket introducerer en afstand fra den objektive fokusplan. Af denne grund er det vigtigt at plade organoiderne i et tyndt lag BMM for at minimere dette problem. Selv i denne optimerede indstilling vil ikke alle organoiderne være i den rigtige position for at blive tilstrækkeligt afbildet.
En kvantitativ analyse af billederne kan udføres ved hjælp af en passende billedanalysesoftware, der evaluerer den gennemsnitlige fluorescerende intensitet af billederne i ROS-signalkanalen som beskrevet i protokollen. Til dette formål er det nødvendigt at erhverve et stort antal billeder for at få et tilstrækkeligt antal begivenheder til at være statistisk signifikante. Som tidligere nævnt vil ikke alle organoiderne ved hjælp af Lgr5-GFP-musene udtrykke GFP, hvilket kræver, at et betydeligt antal prøver afbildes.
Under flowcytometriproceduren er et kritisk trin dissociationen af organoiderne i enkeltceller. Hvis dissociationen er for hård, kan celler dø og frigive DNA. En stenhæmmer, Y-27632, til at modvirke anoikis, og DNAse kan tilsættes til dissociationsbufferen, hvis de ikke forstyrrer den undersøgte vej. Trypsinfortynding eller reducerede inkubationstider kan anvendes.
Endelig er det afgørende at definere det bedste tidspunkt for at analysere ROS-produktionen efter de forskellige behandlinger (anti- eller pro-oxidant) testet. I tilfælde af lægemidler, der hurtigt inducerer ROS inden for få minutter eller timer, kan billeddannelsesassayet bruges til at bestemme, hvornår der er den maksimale induktion ved at tilsætte den fluorogene sonde før de testede forbindelser. Fluorescensintensiteten af sonden efter organoidstimulering kan variere mellem eksperimenter udført på forskellige dage. Derfor er det afgørende altid at beregne forholdet med de ikke-stimulerede prøver og tilføje kontroller (oxidant / antioxidant) for at verificere sondens reaktivitet. NAC og tBHP blev brugt som negative og positive kontroller, da de gav de mest afgørende resultater. Alligevel kan andre reagenser anvendes, såsom resveratrol som en antioxidant eller paraquat / menadion som oxidanter. Inkubation af celler for længe med den fluorogene sonde kan være giftig og endda ændre celleredoxbalancen, så inkubationstiderne skal også kontrolleres tæt. Celler farvet med sonden kan fastgøres og analyseres et par timer efter. I dette tilfælde kan DAPI for flowcytometrianalysen ikke diskriminere mellem levende og døde celler. I stedet bør et fikseringsbart farvestof til levende / død diskrimination anvendes før fiksering.
Organoider kan også dyrkes i flere dage (mere end 7), men dette vil øge antallet af levende og proliferative celler og de døde celler, der akkumuleres i organoidernes lumen, hvilket genererer høj baggrund, især i billeddannelsesanalysen. Hvis der observeres en unormal stigning i det fluorogene sondesignal, skal det sikres, at den opløsning, der anvendes til at resuspendre stimulerende forbindelser, ikke er pro-oxidant i sig selv (dvs. ethanol).
En bekymring at overveje, når du bruger denne protokol, er, at levende billeddannelse og celle dissociation efterfulgt af flowcytometri kan fremkalde oxidativ stress i celler og generere et baggrundssignal. Fiksering af organoiderne kan overvejes i henhold til eksperimentet. En anden begrænsning stammer fra vanskeligheden ved den dybtgående billeddannelse af organoider dyrket i en 3D-matrix. Som nævnt i protokollen skal BMM fordeles på diaset som et tyndt lag for at begrænse dette aspekt.
Her er protokollen designet ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt fluorogent farvestof. Dens primære fordel er dens kompatibilitet med flerfarvet farvning af organoider, således at specifikke celletyper. For eksempel kan antistoffarvning til celleoverflademarkører umiddelbart efter den fluorogene sondeinkubation udføres for at detektere bestemte undertyper. Sonden er dog ikke specifik for en bestemt ROS-art, da den kan detektere superoxid, nitritperoxid og hydrogenperoxid11,12,13. Af denne grund bruges det generelt til at detektere global oxidativ stress. Selvom den blev kommercialiseret som en cytosolisk sonde, kunne den valgte fluorogene sonde vise sig at nå mitokondrier14. Da dens specificitet kan variere mellem forskellige cellulære sammenhænge, foreslår vi at bruge andre komplementære tilgange til at måle ROS, når det er muligt. Alternative farvestoffer såsom sonder, der er specifikke til påvisning af mitokondrier-genererede superoxid-anioner, kan anvendes10. Et repertoire af kemiluminescerende sonder blev også udviklet til at detektere specifikke ROS-arter med høj følsomhed, såsom luciferinbaserede sonder15,16. Disse har den fordel, at de er kompatible med in vivo-billeddannelse, men kan ikke bruges til at kortlægge ROS-produktion med specifikke celletyper. Endelig kan denne protokol anvendes på andre typer organoider, for eksempel kolonorganoider afledt af humane biopsier. I dette tilfælde bør kulturvækstmediet tilpasses i overensstemmelse hermed17. For yderligere at analysere redoxmaskineriet i tarmceller kan organoidkulturen og dissociationsprocedurerne beskrevet i denne protokol kombineres med transkriptomiske og proteomiske tilgange på hele organoider eller fluorescensaktiverede celle sorterede (FACS) organoidceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af det franske nationale forskningsagenturs (ANR) bevilling 17-CE14-0022 (i-Stress).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
- Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
- Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
- vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
- Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
- Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
- Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
- Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
- Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
- Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).
- Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
