Summary
O presente protocolo descreve um método para detectar espécies reativas de oxigênio (ROS) nos organoides murinas intestinais utilizando imagens qualitativas e ensaios quantitativos de citometria. Este trabalho pode ser potencialmente estendido a outras sondas fluorescentes para testar o efeito de compostos selecionados em ROS.
Abstract
As espécies reativas de oxigênio (ROS) desempenham papéis essenciais na homeostase intestinal. Ros são subprodutos naturais do metabolismo celular. Eles são produzidos em resposta à infecção ou lesão no nível mucosa, pois estão envolvidos em respostas antimicrobianas e cicatrização de feridas. Eles também são mensageiros secundários críticos, regulando vários caminhos, incluindo crescimento celular e diferenciação. Por outro lado, os níveis excessivos de ROS levam ao estresse oxidativo, que pode ser deletério para as células e favorecer doenças intestinais como inflamação crônica ou câncer. Este trabalho fornece um método simples para detectar ROS nos organoides murina intestinais por imagem viva e citometria de fluxo, usando uma sonda fluorogênica comercialmente disponível. Aqui o protocolo descreve o ensaio do efeito de compostos que modulam o equilíbrio redox em organoides intestinais e detectam níveis de ROS em tipos específicos de células intestinais, exemplificados aqui pela análise das células-tronco intestinais geneticamente rotuladas com GFP. Este protocolo pode ser usado com outras sondas fluorescentes.
Introduction
Espécies reativas de oxigênio (ROS) são subprodutos naturais do metabolismo celular. Eles também podem ser produzidos ativamente por complexos enzimáticos especializados, como os NADPH-Oxidases (NOX) e Dual Oxidases (DUOX), que geram ânion de superóxido e peróxido de hidrogênio1. Ao expressar enzimas antioxidantes e catadores ros, as células podem ajustar finamente seu equilíbrio redox, protegendo assim a homeostase tecidual2. Embora o ROS possa ser altamente tóxico para as células e danificar DNA, proteínas e lipídios, eles são moléculas de sinalização cruciais2. No epitélio intestinal, são necessários níveis de ROS moderados para a proliferação de células-tronco e progenitoras3; altos níveis de ROS levam à sua apoptose4. O estresse oxidativo crônico está ligado a muitas doenças gastrointestinais, como doenças inflamatórias intestinais ou câncer. Como exemplo, em um modelo de camundongo de câncer intestinal orientado por Wnt, a produção elevada de ROS através da ativação de NADPH-oxidases foi considerada necessária para as células cancerosas hiperproliferation5,6. Definir como as células intestinais, em particular as células-tronco, as células-tronco gerenciam o estresse oxidativo e como o ambiente celular pode impactar essa capacidade é essencial para entender melhor a etiologia dessa doença7.
Em um tecido, diferentes tipos celulares apresentam um estado oxidativo basal que pode variar de acordo com sua função e metabolismo e a expressão de diferentes níveis de moléculas oxidantes e antioxidantes4,7. Monitorar a ROS in vivo é muito desafiador. Corantes permeáveis celulares que emitem fluorescência de acordo com seu estado redox foram desenvolvidos para visualizar e medir ros celular em células vivas e animais. No entanto, sua eficácia depende de sua difusão dentro de tecidos vivos e sua leitura rápida, tornando-os difíceis de usar em modelos animais8.
No passado, o estudo do efeito dos compostos na geração ROS foi feito utilizando linhas celulares, mas isso pode não refletir a situação in vivo . O modelo organoide intestinal, desenvolvido pelo grupo de Clevers9, permite o crescimento de células primárias intestinais ex vivo. A cultura de criptas intestinais em matrizes, na presença de fatores de crescimento definidos, leva a estruturas tridimensionais, chamadas organoides (mini-intestino), que reproduzem a organização cript-villus, com células das diferentes linhagens epiteliais que revestem um lúmen interno, e as células-tronco intestinais residentes em pequenas saliências como criptas.
Aqui, aproveitando este modelo, um método simples é descrito para estudar o estresse oxidativo em células intestinais primárias na resolução unicelular, adicionando um corante sensível a ROS comercialmente disponível no meio da cultura organoide.
Leitores de placas são frequentemente usados para detectar a produção de ROS em uma população total. Este protocolo usa citometria de fluxo ou ensaio de imagem para detectar ROS em um determinado tipo de célula com células geneticamente modificadas ou coloração específica de anticorpos. Este trabalho envolve a cultura organoide intestinal do camundongo e a visualização ros por imagem confocal e quantificação por citometria de fluxo. Usando organoides intestinais pequenos derivados de camundongos LGR5-GFP, é possível analisar especificamente o nível de estresse oxidativo em células-tronco intestinais em diferentes tratamentos. Este protocolo pode ser adaptado para testar a influência de moléculas exógenas, como o muramyl-dipeptida derivado da microbiota (MDP)10, no equilíbrio ROS, após estimular organoides com os compostos selecionados.
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Protocol
Todos os experimentos em animais foram realizados após aprovação do Comitê de Uso do Institut Pasteur e do Ministério da Agricultura francês nº 2016-0022. Todas as etapas são realizadas dentro de uma capa de cultura de tecido.
1. Preparação de reagentes e materiais para cultivo de organoides intestinais
- Para preparar o meio de cultura de crescimento, misturar solução avançada DMEM/F-12 suplementada com 1x glutamina, 1x penicilina/estreptomicina (P/S), 10 mM de HEPES, 50 ng/mL de murina EGF, 20 μg/mL de murine Noggin 500 ng/mL de mouse R-Sdin1 (ver Tabela de Materiais). Deixe o meio em temperatura ambiente (RT) durante a extração da cripta.
NOTA: Congele o meio nãoutado em alíquotas a -20 °C. Evite congelar e descongelar. - Encha um tubo de 50 mL com 40 mL de DMEM/F-12 avançado e mantenha-o no gelo.
NOTA: Mantenha o meio nãouscado a 4 °C. Será usado para a passagem de organoides. - Pré-aqueça as placas de cultura celular (μ-Slide 8 câmaras de poço e/ou fundo redondo de 96 poços) na incubadora a 37 °C.
- Descongelar a matriz da membrana do porão (BMM) (ver Tabela de Materiais) alíquotas no gelo (antes de iniciar o protocolo ou pelo menos 1h antes de emplaar as criptas).
NOTA: O BMM solidificará rapidamente se não for mantido frio. - Prepare a solução de lavagem/lavagem adicionando 1% de solução de penicilina-estreptomicina ao DPBS (DPBS-P/S).
- Encha uma placa de petri de 100 mm com 10 mL de DPBS-P/S. Encha seis tubos de 15 mL com 10 mL de DPBS e rotule-os de F1 a F6.
- Prepare 30 mL de solução EDTA de 10 mM por diluição a partir de 0,5 M EDTA em DPBS. Encha dois tubos de 15 mL com 10 mL de 10 mM EDTA, e rotule-os como E1 e E2.
- Mantenha todas as soluções pré-resfriadas a 4°C e mantenha-as no gelo durante o procedimento.
2. Cultura de organoides intestinais
- Sacrifique um mouse Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) de 8 a 10 semanas de idade de acordo com as regras e regulamentos nacionais.
- Coletar 5-8 cm do jejunum que abrange a região entre o duodeno (5 cm do estômago) e o íleo (10 cm do ceco) e manter em dpbs-P/S frio no gelo.
- Limpe o conteúdo intestinal lavando com 5-10 mL de DPBS-P/S frio.
NOTA: As seringas de descarga caseiras podem ser obtidas conectando uma ponta de 200 μL em um bocal de seringa de 10 mL. - Abra o intestino longitudinalmente usando uma tesoura de ponta de bola (ver Tabela de Materiais) (para evitar danificar o tecido).
- Usando fórceps, transfira o tecido para uma placa de petri contendo DPBS-P/S frio à temperatura ambiente e agite-o para enxaguar.
- Com uma pipeta Pasteur de plástico, pegue o intestino por aspiração e transfira-o para um tubo de 15 mL rotulado E1 contendo 10 mL frio 10 mM EDTA.
- Inverta o tubo 3 vezes e incuba no gelo por 10 minutos.
- Usando uma pipeta pasteur de plástico, transfira o tecido no tubo F1 contendo 10 mL DPBS. Vórtice por 2 min (no vórtice normal, segurando o tubo à mão e garantindo que o intestino gire bem).
- Coloque 10 μL da fração em uma placa de petri e avalie a qualidade da fração sob um microscópio.
NOTA: Todas as etapas do vórtice são executadas em velocidade máxima, e a qualidade de cada fração deve ser avaliada sob o microscópio (Figura 1). - Com uma pipeta Pasteur de plástico, pegue o intestino por aspiração e transfira-o no tubo F2 contendo 10 mL DPBS e vórtice por 2 min.
- Repita o passo 2.10, transferindo o tecido no tubo F3 contendo DPBS de 10 mL e vórtice por 2 min.
- Repita a incubação de EDTA como na etapa 2.6, transferindo o tecido no tubo E2 contendo 10 mM EDTA.
- Inverta o tubo 3 vezes e incuba no gelo por 5 minutos.
- Repita o passo 2.10, transferindo o tecido no tubo F4 contendo 10 mL DPBS e vórtice por 3 min.
- Repita o passo 2.14, transferindo o tecido no tubo F5 contendo DPBS de 10 mL e vórtice por 3 min.
- Repita o passo 2.15, transferindo o tecido no tubo F6 contendo DPBS de 10 mL e vórtice por 3 min.
- Combine as melhores frações filtrando por gravidade através de um coador de células de 70 μm em um tubo de 50 mL (no gelo) para eliminar villi e detritos significativos.
NOTA: Normalmente, F5 e F6 são as frações que contêm numerosas criptas e menos detritos. - Gire as criptas a 150 x g a 4 °C por 3 min.
- Esvazie o tubo, interrompa a pelota mecanicamente e adicione 5 mL de DMEM/F12 frio.
- Coloque 10 μL da suspensão em uma placa de petri e conte o número de criptas presentes na alíquota manualmente sob um microscópio.
NOTA: Não conte células únicas ou pequenos detritos. - Calcule o volume (V) de suspensão de criptas exigida em μL, considerando que 300 criptas são emplacar por poço, W é o número de poços, e N é o número de criptas contadas a partir de 10 μL da suspensão. Transfira as criptas para um novo tubo de 15 mL.
NOTA: V = 300 x W x 10/N. Se um pequeno volume for usado no experimento planejado, um tubo de centrífuga de 1,5 mL pode ser usado. - Gire as criptas a 200 x g a 4 °C por 3 min.
- Remova cuidadosamente o supernatante usando uma pipeta.
- Interrompa mecanicamente a pelota e adicione suavemente o meio de cultura de crescimento para obter uma concentração de 90 criptas/μL.
- Adicione 2 volumes de BMM não diluídos para ter uma concentração final de 30 criptas/μL. Cuidadosamente pipeta para cima e para baixo sem introduzir bolhas de ar na mistura.
NOTA: Mantenha sempre o tubo no gelo para evitar a solidificação do BMM. - Placa 10 μL da mistura criptas/BMM em cada poço. Para análise de citometria flow, use placas de fundo redondo de 96 poços. Distribua 10 μL no centro de cada um, bem como uma cúpula. Para imagem, use μ-slide 8 bem (ver Tabela de Materiais) e deposite os 10 μL como uma camada fina.
NOTA: Coloque os organoides como uma camada fina para o ensaio de imagem para permitir sua imagem aprofundada. - Deixe a placa por 5 minutos no RT para permitir que o BMM se solidifique. Coloque a placa na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por 15 min.
- Adicione 250 μL de meio de crescimento em cada poço, tomando cuidado para não desacoplar o BMM.
- Coloque as placas na incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
- Realizar a análise ROS entre os dias 4 e 6 da cultura. Caso contrário, mude o meio e divida os organoides após o aparecimento de várias e longas estruturas de brotamento e quando as células mortas se acumulam nos lúmens organoides.
3. Passagem de organoides
- Comece a passar pequenos organoides intestinais a partir do 6º dia de cultura, quando estruturas significativas se formaram, e os lúmens organoides se tornaram escuros.
NOTA: O lúmen organoide fica escuro devido ao acúmulo de células mortas, detritos e muco. Evite deixar os organoides crescerem demais antes de se separarem. A razão de divisão depende do crescimento dos organoides. Recomenda-se a passagem dos organoides com uma razão de 1:2 no dia 6 e 1:3 no dia 10. - Encha um tubo de 15 mL com 4 mL de DMEM avançado frio/F-12 e mantenha-o no gelo.
NOTA: Aqui, são fornecidos volumes para uma placa de cultura de 96 poços. Se um formato diferente for usado, ajuste o volume de acordo. - Aspire cuidadosamente o meio com uma pipeta ou uma bomba de vácuo dos poços sem tocar nas cúpulas BMM e descarte-o.
- Adicione 100 μL de DMEM avançado frio/F-12 por poço. Pipeta para cima e para baixo para quebrar o BMM e transferir o conteúdo do poço para o tubo de 15 mL.
- Lave o poço com 200 μL frio Avançado DMEM/F-12 e colete-o no mesmo tubo.
NOTA: Se passar vários poços da mesma condição experimental, o conteúdo dos poços pode ser agrupado no mesmo tubo coletor de 15 mL. - Gire o tubo coletor de 15 mL a 100 x g por 5 min a 4°C.
- Descarte o supernatante e adicione 1mL de DMEM avançado frio/F-12 à pelota. Usando uma ponta P1000, pegue uma ponta P10 (sem filtro) e pipeta para cima e para baixo pelo menos 20 vezes.
- Adicione 4 mL de DMEM avançado frio/F-12 ao tubo. Gire a 300 x g por 5 min a 4°C.
- Aspire o supernatante com uma pipeta ou uma bomba de vácuo sem perturbar a pelota. Em seguida, interrompa a pelota mecanicamente.
- Adicionar BMM diluído em meio de cultura de crescimento (proporção 2:1). Pipeta cuidadosamente para cima e para baixo sem introduzir bolhas de ar na mistura.
- Placa 10 μL da mistura criptas/BMM em cada poço.
- Mantenha a placa por 5 minutos no RT para permitir que o BMM se solidifique. Coloque a placa na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por 15 min.
- Adicione 250 μL de meio de crescimento em cada poço.
NOTA: Tenha cuidado para não desprender o BMM. - Coloque as placas na incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
4. Preparação de reagentes e materiais para avaliar o estresse oxidativo em organoides intestinais
- Prepare uma solução de estoque de 250 mM do inibidor N-acetilcisteína (NAC) (ver Tabela de Materiais), resuspend 10 mgs com 245 μL de DPBS. Use em 1 mM de concentração final.
- Prepare uma solução de estoque de 50 mM de hidroperóxido tert-butyl (tBHP), 70% em água, diluir 3,22 μL com 496,8 μL de DPBS. Use a 200 μM concentração final.
- Para o estudo de citometria Flow, prepare uma solução de trabalho de 250 μM de uma sonda fluorogênica (ver Tabela de Materiais) diluindo a solução de estoque 1/10 em DMSO. Use em 1 μM de concentração final.
NOTA: Conforme indicado nas instruções do fabricante, a sonda fluorogênica é sensível à luz e ao oxigênio. Ações e alíquotas não devem estar abertas e fechar muitas vezes. - Para o estudo de imagem, prepare uma solução de trabalho de 1,25 mM da sonda fluorogênica diluindo a solução de estoque 1/2 no DMSO. Use em 5 μM de concentração final.
- Prepare uma solução final de 0,1 μg/mL DAPI em DPBS, a ser usada para discriminação de células mortas no ensaio de citometria de fluxo.
- Diluir Hoechst 33342 a 1,25 mg/mL em DPBS. Use a 5 μg/mL de concentração final para ser usado para coloração nuclear no ensaio de imagem.
- DMEM quente sem fenol vermelho a 37 °C.
NOTA: Estas etapas descrevem o uso de controles negativos e positivos que devem ser incluídos em quaisquer ensaios, utilizando as condições indicadas na Figura 2A. O ensaio pode ser usado para testar compostos anti ou pró-oxidantes. Os passos são os mesmos, e a única diferença é quando os compostos são adicionados antes de usar o corante fluorogênico.
5. Visualização do estresse oxidativo em organoides 3D por microscopia confocal
- Pegue os organoides banhados nas câmaras de poços μ-Slide 8 e adicione 1 μL solução de estoque NAC nos poços correspondentes para obter uma concentração final de 1 mM.
- Incubar por 1h a 37 °C e 5% de CO2.
- Adicione 1 solução de estoque tBHP de 1 μL nos poços correspondentes para obter uma concentração final de 200 μM.
- Incubar por 30 min a 37 °C e 5% de CO2.
- Adicione 1 μL por poço da diluição de 1,25 mM da sonda fluorogênica para obter uma concentração final de 5 μM.
- Adicione 1 μL por poço da diluição de 1,25 mg/mL de Hoescht para obter uma concentração final de 5 μg/mL.
- Incubar por 30 min a 37 °C e 5% de CO2.
- Remova o meio sem perturbar o BMM. Suavemente, adicione 250μL de DMEM quente sem vermelho fenol.
NOTA: Se uma aquisição de longo prazo for planejada, adicione compostos de fatores de crescimento ao DMEM sem vermelho fenol. - Imagem dos organoides usando um microscópio confocal equipado com uma câmara e fornecimento de gás que detecta a sonda fluorogênica (ROS).
NOTA: A excitação/emissão (ex/em) para a sonda fluorogênica é 644/665, ex/em para Hoechst (núcleos) é 361/486, e ex/em para GFP (célula-tronco intestinal dos camundongos Lgr5-GFP) é 488/510. Um objetivo de imersão em óleo de 63x é usado para detectar sinais em células-tronco. Não altere as configurações de laser entre as amostras. Um objetivo de 20x pode ser usado para permitir uma visão geral da produção ros. - Use o controle positivo para configurar a intensidade do laser e a exposição ao tempo para o sinal ROS e verificar se este sinal é menor no controle negativo.
- Usando a tela da ocular, o slide para identificar os organoides GFP expressando e ajustar a intensidade do laser.
NOTA: Esta etapa é realizada manualmente. - Defina posições para obter uma imagem costurada de todo o organoide. Configure uma pilha z de 25 μm (tamanho de etapa 5 μm) para obter uma seção dos organoides mostrando uma camada de células.
NOTA: Consulte o manual do usuário do microscópio para otimizar a configuração. Utilizando células vivas, a aquisição deve ser feita dentro de 1h após o término da incubação. - Abra as imagens em um software de processamento de imagem de código aberto (ver Tabela de Materiais).
- Passe pela pilha z e escolha a seção em que o meio dos organoides está bem representado e crie uma nova imagem com a área selecionada.
- Quantifique as imagens conforme as etapas 5.15.1 - 5.15.5.
- Selecione a ferramenta de linha à mão livre.
- Desenhe uma linha seguindo os núcleos.
NOTA: Selecione apenas regiões com células positivas de GFP se apenas forem analisadas células-tronco. - Aumente a largura da linha para cobrir a camada celular com a linha sem incluir os detritos luminosos.
- Selecione o canal para o sinal ROS e meça a intensidade da fluorescência na região selecionada e anote os valores.
- Desenhe uma linha onde não haja sinal e meça a intensidade fluorescente do fundo que será subtraída ao valor anterior para obter a intensidade final.
6. Quantificação do estresse oxidativo nos organoides dissociados usando citômetro de fluxo
- Adicione 1 solução de estoque NAC de 1 μL nos poços para controles negativos para obter uma concentração final de 1 mM.
NOTA: Use os organoides emplacados nas placas de fundo redondo de 96 poços. - Incubar por 1h a 37 °C e 5% de CO2.
- Adicione 1 solução de estoque tBHP de 1 μL nos poços correspondentes para obter uma concentração final de 200 μM.
- Incubar por 30 min a 37 °C e 5% de CO2.
- Com uma pipeta multicanal, remova o meio sem perturbar o BMM anexado e transfira-o para outra placa inferior redonda de 96 poços. Mantenha este prato de lado.
- Adicione 100 μL de trippsina, e com uma pipeta multicanal, pipeta para cima e para baixo pelo menos cinco vezes para destruir o BMM.
- Incubar por no mínimo 5 min a 37 °C e 5% de CO2.
- Com uma pipeta multicanal, pipeta para cima e para baixo pelo menos cinco vezes para dissociar os organoides.
- Gire a 300 x g por 5 min no RT.
- Descarte o supernatante invertendo a placa. Adicione de volta o meio coletado na etapa 6.3 aos poços correspondentes e resuspense as células ao tubular para cima e para baixo 5 vezes.
- Adicione a sonda fluorogênica na concentração final de 1 μM. Adicione 1 μL por poço a partir da diluição de 250 μM e incubar por 30 min a 37 °C e 5% de CO2.
NOTA: Não adicione a sonda fluorogênica aos poços necessários para as configurações do instrumento (Figura 2B). - Gire a 300 x g por 5 min no RT.
- Resuspenja as células com 250 μL de solução DAPI de 0,1 μg/mL. Transfira as amostras nos tubos de citometria de fluxo adequados, mantenha os tubos no gelo e prossiga com a análise.
NOTA: Adicione PBS em vez de DAPI aos poços necessários para as configurações do instrumento (Figura 2B). - Otimize as configurações de tensão de dispersão dianteira e lateral em tensões de controle e laser não manchadas para cada fluoróforo usando amostras mono-manchadas.
- Utilizando uma estratégia de gating apropriada (Figura 4A), colete um mínimo de 20.000 eventos.
NOTA: 50.000 eventos são preferidos. As configurações detalhadas de aquisição variam de acordo com o instrumento utilizado.
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Representative Results
Como prova do conceito do protocolo descrito, foram utilizadas as criptas obtidas da linha de camundongos Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2, na qual as células-tronco intestinais exibem a expressão GFP do mosaico, que foi estabelecida por Barker et al., para caracterizar células-tronco intestinais10 inicialmente e permitir mapear essas células com base em sua expressão GFP. Assim, é fornecido um modelo para comparar os níveis de ROS em uma população específica do tipo celular em diferentes tratamentos. Foi utilizado um inibidor ros (NAC) e um indutor (tBHP), conhecido por atuar em ROS celular para visualizar mudanças em seus níveis.
As figuras 1A e 1B mostram imagens representativas das frações F1 e F4 obtidas durante o procedimento de extração de criptas para a cultura organoide intestinal. Cada fração deve ser verificada sob um microscópio ou binóculo durante o procedimento de extração para seguir o desprendimento das criptas e definir essas frações enriquecidas em criptas, em vez de villi, células únicas ou detritos. As frações escolhidas são então agrupadas e passadas através de um coador de células de 70 μm para remover todos os fragmentos restantes de villi e obter uma preparação apenas com criptas (Figura 1C). As criptas começam a fechar dentro de algumas horas após a incorporação em BMM, e na D1, organoides redondos foram observados (Figura 1D). Após 3-5 dias, os organoides aparecerão com estruturas brotantes representando as "criptas recém-formadas". Os organoides estão prontos para análise ros (Figuras 1E e 1F).
No protocolo de estresse oxidativo por imagem por microscopia confocal, o slide contendo os organoides, incubados com a sonda, foi imageado com um microscópio de fluorescência confocal equipado com lasers e filtros para detectar os sinais Hoechst (ex/em: 361/486), o GFP (ex/em: 488/510) e a sonda fluorogênica (ex/em): 644/665). Um microscópio confocal equipado com ar 20x e objetivo de imersão em óleo de 63x permitiu a visualização de ROS. Em camundongos LGR5-GFP, as células GFP-positivas são células-tronco intestinais que expressam LGR5. Figura suplementar 1 mostra imagens representativas obtidas com o objetivo de 20x proporcionando uma visão geral da ROS em diversos organoides. A Figura 3 mostra imagens representativas, obtidas com o objetivo do óleo de 63x, de organoides intestinais expressando GFP, não tratados (NT), ou pré-incubados ou não com o inibidor ROS NAC, e estimulados ou não por 30 minutos com o indutor ROS tBHP.
Na presença do inibidor, o único sinal das células mortas contidas no lúmen do organoide é visível. No organoide não tratado, os níveis basais de ROS são mostrados, provando que as células-tronco produzem ROS maior do que as células diferenciadas (de acordo com as configurações do microscópio, o sinal ROS também pode ser visualizado em células não-tronco). As células positivas do GFP apresentam um sinal citoplasmado mais significativo com o indutor na presença da sonda fluorogênica, demonstrando que os níveis de ROS aumentam particularmente em células-tronco após o tratamento.
A Figura 4 mostra resultados representativos obtidos ao analisar a produção de ROS em organoides intestinais estimulados ou não com inibidor ou indutor ROS, utilizando um citômetro Flow equipado com lasers de 405 nm, 488 nm e 630 nm. A estratégia de gating apresentada na Figura 4A permite avaliar a produção de ROS no nível de toda a população celular organoides, definindo células intactas e vivas com base em parâmetros físicos e exclusão de DAPI (SSC-A vs. FSC-A e DAPI vs. FSC-A) e FSC-H vs. FSC-A) ou apenas nas células-tronco intestinais, ainda mais fechadas em células com sinal alto do GFP. A Figura 4B mostra os níveis de ROS na população total após a coleta de 50.000 eventos. Os níveis de ROS basal nas células não tratadas (NT) diminuem após a estimulação com o inibidor (NAC), e pelo contrário, aumentam após desafio com o indutor (tBHP). As células pré-tratadas com o inibidor e estimuladas com o indutor apresentam um nível menor do que aquelas estimuladas apenas com o indutor. Os resultados foram então analisados utilizando-se software adequado, obtendo a intensidade fluorescente mediana (FIM). Os valores obtidos são apresentados como razão sobre as células não tratadas, como mostra o gráfico apresentado à direita da Figura 4B. A Figura 4C mostra os mesmos parâmetros descritos na Figura 4B nas células-tronco, fechados como células positivas de GFP, mostrando uma diminuição de 3,5 vezes no nível ros após o tratamento de NAC e aumento de 4 vezes após o tratamento tBHP sobre células não estimuladas. Este resultado demonstra que, seguindo este protocolo, é possível quantificar diferenças nos níveis de ROS no nível de toda a população celular ou em células-tronco positivas GFP após o tratamento dos organoides com compostos específicos.
Figura 1: Imagens representativas de criptas e organoides. (A) Exemplo de fração F1 obtida após a primeira incubação com EDTA, enriquecida em villi (quadrado), com alguns detritos (estrela) e criptas (círculo). (B) Exemplo de fração F4 enriquecida em criptas. (C) Suspensão apresentando apenas criptas isoladas obtidas após a filtragem com um coador de células de 70 μm (barra de escala, 200 μm). (D, E e F). Organoides típicos foram obtidos após 1, 3 e 5 dias, respectivamente, após a incorporação das criptas em BMM (barra de escala, 100 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esboço do plano experimental. (A) Condições utilizadas neste protocolo incluídas em cada experimento: poços não tratados (NT), poços tratados com indutores (hidroperóxido tert-butyl - tBHP), poços tratados com inibidores (N-acetyl cysteine - NAC) e poços tratados com inibidores e indutores (NAC-tBHP). (B) Formato de placa para o ensaio de citometria de fluxo. Cada condição é banhada em triplicado (linha A). As linhas B, C e D incluem poços para ajuste de citômetro de fluxo com apenas a sonda fluorogênica, apenas amostras de DAPI ou não manchadas (NS). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens confocal representativas da coloração ros em organoides. Imagens costuradas foram obtidas com um microscópio confocal equipado com uma câmera EMCCD de alta velocidade, 63x/1.4 objetivo de óleo, e fenda 35 μm, utilizando os lasers 405, 488, 640, e filtros 460/50, 535/50, 700/75 para adquirir Hoechst, GFP e fluoro probegênico, respectivamente. Seções ópticas confocal de organoides não tratados (NT), tratadas com o inibidor ros (NAC), com o indutor ros (tBHP), ou pré-tratadas com o inibidor ros e depois estimuladas com o indutor ros (NAC-tBHP). Em cinza, núcleos manchados com Hoechst; em células lgr5-GFP verdes; em vermelho, a sonda fluorogênica (barra de escala, 50 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise representativa da citometria de fluxo de ROS em células derivadas de organoides. (A) Representação esquemática da estratégia de gating utilizada na análise da citometria de fluxo: gating para forma celular (exclusão de células mortas e detritos acumulados no lúmen organoides), gating para células vivas (células que não incorporam DAPI-laser 405), gating para células únicas (discriminação de doublet) e células-tronco (GFP células positivas-laser 488) (FSC: dispersão, SSC: dispersão lateral). O sinal ROS foi adquirido usando o laser 630. (B) À esquerda, foram obtidos histogramas com um software adequado mostrando a intensidade dos sinais ROS para a população viva total (após a amostra em torno de 10.000 eventos por condição) nas diferentes amostras NT: não tratada; NAC: inibidor tratado; tBHP indutor-tratado; NAC-tBHP: inibidor e indutor-tratado. À direita, um exemplo típico da razão calculada para valores de FI sobre as amostras de NT obtidas durante um experimento a partir de 3 amostras por condição (média ± SD) (*** P = 0,0003). (C) Mesmo que em B para a população positiva do GFP (1.000 eventos por condição) (* P = 0,02). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Imagens confocal representativas da coloração ros em organoides. Os images costurados foram obtidos com um microscópio confocal equipado com uma Câmera EMCCD de alta velocidade, objetivo de 20x e fenda de 35 μm, utilizando os lasers 405, 488, 640 e filtros 460/50, 535/50, 700/75 para adquirir a sonda Hoechst, GFP e fluorogênica, respectivamente. Seções ópticas confocal de organoides não tratados (NT), tratadas com o inibidor ros (NAC), com o indutor ros (tBHP), ou pré-tratadas com o inibidor ros e depois estimuladas com o indutor ros (NAC-tBHP). Em cinza, núcleos manchados com Hoechst; em células lgr5-GFP verdes; em vermelho, sonda fluorogênica (barra de escala, 100 μm). Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Este trabalho fornece um protocolo passo-a-passo para isolar criptas jejunal murinas, cultuá-las em organoides 3D e analisar ROS em organoides, combinando uma sonda fluorogênica sensível à ROS com imagens de microscopia qualitativa de organoides inteiros e medição quantitativa de ROS usando citometria de fluxo em células únicas após a dissooididade organoidativa.
O primeiro passo crítico neste método é o procedimento de extração de criptas. De fato, a qualidade da preparação das criptas é a chave para a formação bem sucedida de organoides. Por isso, é essencial obter frações com criptas enriquecidas e poucos detritos celulares ou células moribundas. As criptas podem ser encontradas em diferentes frações às indicadas no protocolo, pois a dissociação pode variar com a idade e o estado de saúde do mouse. O número de incubações EDTA pode ser modificado em conformidade. Se as criptas não parecem estar se desprendendo após a fração 4, uma incubação EDTA de 3 min precisa ser repetida. Inversamente, suponha que as criptas já se desprendem após a primeira incubação edta. Nesse caso, a segunda incubação edta pode não ser necessária, e as etapas sequenciais de vórtice em DPBS devem ser feitas até que as frações sejam obtidas com criptas suficientes desprovidas de detritos. Se não ocorrer dissociação, certifique-se de que o DPBS sem Ca2+ e Mg2+ seja usado para preparar os tubos de coleta e substituir o EDTA por uma nova solução. Criptas são estruturas frágeis, por isso devem ser mantidas o máximo possível no gelo e rapidamente banhadas após o isolamento.
Diferentes placas e volumes de gota podem ser usados para cultivar organoides. Por exemplo, as criptas também podem ser emplacar em 24 ou 48 placas de poço depois de ajustar a concentração de criptas, o volume da queda de BMM e o meio adicionado em cada poço. Várias gotas podem ser banhadas no mesmo poço em uma placa de 12 ou 6 poços. Geralmente, as criptas diminuem de tamanho e se aproximam para formar pequenos organoides redondos no primeiro dia de cultura. A formação de novos botões deve ser observada 2-3 dias após o revestimento.
Para o estudo de alterações nos níveis de ROS em células-tronco intestinais, foi tomada a vantagem da linha de mouses Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2. Uma ressalva deste modelo é o silenciamento seletivo do alelo batido e o consequente mosaico da expressão GFP, que pode estar ausente em remendos de células-tronco ou criptas inteiras. Durante o protocolo de imagem, nem todos os organoides apresentarão células-tronco expressando GFP; portanto, nem todos os organoides serão considerados a menos que seja possível confiar na posição espacial das células. Em vez disso, isso deve ser considerado ao analisar a população celular negativa do GFP no protocolo de citometria de fluxo. De fato, como é impossível confiar na posição espacial, a população GFP-negativa será composta de células-tronco não-tronco e células-tronco GFP-negativas.
Aqui é fornecido um protocolo para a avaliação qualitativa da ROS em organoides intestinais. Um aspecto crítico para esta parte está ligado à distância de trabalho dos objetivos utilizados. Os organoides são cultivados em BMM; eles não estão ligados à parte inferior do poço, introduzindo uma distância do plano de foco objetivo. Por essa razão, é fundamental emplacar os organoides em uma fina camada de BMM, para minimizar esse problema. Mesmo neste ambiente otimizado, nem todos os organoides estarão na posição correta para serem adequadamente imagedos.
Uma análise quantitativa das imagens pode ser feita utilizando um software adequado de análise de imagem, avaliando a intensidade fluorescente média das imagens no canal de sinal ROS, conforme descrito no protocolo. Para isso, é necessário adquirir um alto número de imagens para obter um número suficiente de eventos para ser estatisticamente significativo. Como mencionado anteriormente, usando os camundongos Lgr5-GFP, nem todos os organoides expressarão GFP, exigindo um número considerável de amostras para serem imagens.
Durante o procedimento de citometria de fluxo, um passo crítico é a dissociação dos organoides em células únicas. Se a dissociação for muito dura, as células podem morrer e liberar DNA. Um inibidor de rochas, Y-27632, para neutralizar anoikis, e DNAse pode ser adicionado ao tampão de dissociação se eles não interferirem com o caminho estudado. Podem ser usados tempos de diluição de trippsina ou redução dos tempos de incubação.
Por fim, é crucial definir o melhor ponto de tempo para analisar a produção de ROS após os diferentes tratamentos (anti ou pró-oxidante) testados. No caso de drogas que induzem rapidamente ros em minutos ou horas, o ensaio de imagem pode ser usado para determinar quando há a indução máxima adicionando a sonda fluorogênica antes dos compostos testados. A intensidade da fluorescência da sonda após a estimulação dos organoides pode variar entre experimentos realizados em dias diferentes. Portanto, é crucial sempre calcular a razão com as amostras não estimuladas e adicionar controles (oxidante/antioxidante) para verificar a reatividade da sonda. O NAC e o TBHP foram utilizados como controles negativos e positivos, pois deram os resultados mais conclusivos. Ainda assim, outros reagentes podem ser usados, como o resveratrol como antioxidante ou paraquat/menadiona como oxidantes. A incubação de células por muito tempo com a sonda fluorogênica pode ser tóxica e até mesmo modificar o equilíbrio de redox celular, por isso os tempos de incubação também devem ser fortemente controlados. As células manchadas com a sonda podem ser fixadas e analisadas algumas horas depois. Neste caso, para a análise da citometria de fluxo, o DAPI não pode discriminar entre células vivas e mortas. Em vez disso, um corante fixável para discriminação viva/morta deve ser usado antes da fixação.
Organoides também podem ser cultivados por vários dias (mais de 7), mas isso aumentará o número de células vivas e proliferativas e as células mortas que se acumulam nos lúmens organoides, gerando alto histórico, particularmente no ensaio de imagem. Se for observado um aumento anormal no sinal da sonda fluorogênica, certifique-se de que a solução usada para resuspendar compostos estimulantes não seja pró-oxidante em si (ou seja, etanol).
Uma preocupação a considerar ao usar este protocolo é que a imagem viva e a dissociação celular seguida de citometria de fluxo podem induzir o estresse oxidativo nas células e gerar um sinal de fundo. A fixação dos organoides pode ser considerada de acordo com o experimento. Outra limitação surge da dificuldade na imagem aprofundada dos organoides cultivados em uma matriz 3D. Como mencionado no protocolo, o BMM deve ser distribuído no slide como uma camada fina para limitar esse aspecto.
Aqui, o protocolo é projetado usando um corante fluorogênico comercialmente disponível. Sua principal vantagem é sua compatibilidade com a coloração multicolorida de organoides para que tipos de células específicas. Por exemplo, a coloração de anticorpos para marcadores de superfície celular imediatamente após a incubação da sonda fluorogênica pode ser feita para detectar subtipos específicos. No entanto, a sonda não é específica para uma espécie ros específica, pois pode detectar superóxido, peróxido de nitrito e peróxido de hidrogênio11,12,13. Por essa razão, é geralmente usado para detectar estresse oxidativo global. Embora comercializada como uma sonda somente citosolástica, a sonda fluorogênica selecionada poderia ser encontrada para alcançar mitocôndrias14. Como sua especificidade pode variar entre diferentes contextos celulares, sugerimos o uso de outras abordagens complementares para medir a ROS quando possível. Corantes alternativos, como sondas específicas para detectar ânions de superóxido gerados por mitocôndrias, poderiam ser usados10. Um repertório de sondas quemiluminescentes também foi desenvolvido para detectar espécies específicas de ROS com alta sensibilidade, como sondas baseadas em luciferina15,16. Estes têm a vantagem de serem compatíveis com imagens in vivo, mas não podem ser usados para mapear a produção de ROS com tipos de células específicas. Finalmente, este protocolo pode ser aplicado a outros tipos de organoides, por exemplo, organoides colonicos derivados de biópsias humanas. Neste caso, o meio de crescimento da cultura deve ser adaptado em conformidade17. Para analisar melhor o maquinário de redox dentro das células intestinais, os procedimentos organoides de cultura e dissociação descritos neste protocolo podem ser combinados com abordagens transcriômicas e proteômicas em células organoides inteiras ou células organoides ativadas por Fluorescência (FACS).
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Agência Nacional de Pesquisa Francesa (ANR) 17-CE14-0022 (i-Stress).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
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