Summary
מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה-רדיוליגנד ורקמה מטופלת (FACS-RTT) הוא כלי רב עוצמה לחקר תפקידו של חלבון טרנסלוקטור 18 kDa או ביטוי קולטן סרוטונין 5HT2A במחלת אלצהיימר בקנה מידה תאי. פרוטוקול זה מתאר את יישום ex-vivo של FACS-RTT במודל חולדות TgF344-AD.
Abstract
לתאי גליה יש כנראה השלכה ניכרת בפתופיזיולוגיה של הפרעות נוירודגנרטיביות, כגון מחלת אלצהיימר (AD). השינויים שלהם קשורים אולי למצב פרו-דלקתי. זן החולדה TgF344-AD תוכנן לבטא את הגנים האנושיים APP ו-PS1ΔE9 אנושיים, המקודדים עבור חלבוני עמילואיד Aβ-40 ו-Aβ-42 ומציג פתולוגיה של עמילואידים וליקויים קוגניטיביים עם הזדקנות. מודל החולדה TgF344-AD משמש במחקר זה כדי להעריך את המקור התאי של חלבון הטרנסלוקטור 18 kDa (TSPO, סמן להפעלת תאי גליה) הקושר, ואת רמות קולטן הסרוטונין של 5HT2A (5HT2AR) שעלולות להיות מופרעות באלצהיימר. הטכניקה המוצגת כאן היא מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה לרקמות מטופלות רדיוליגנד (FACS-RTT), טכניקה כמותית ספציפית לסוג התא המשלימה לטכניקות אוטורדיוגרפיה של IN vivo PET או SPECT או ex vivo/in vitro . הוא מכמת את אותו עקיבה עם תווית רדיו ששימשה קודם להדמיה, תוך שימוש במונה γ לאחר מיון תאי ציטומטריה. זה מאפשר לקבוע את המקור התאי של החלבון בעל התווית הרדיולית עם ספציפיות תאית גבוהה ורגישות. לדוגמה, מחקרים עם FACS-RTT הראו כי (1) העלייה בקשירת TSPO נקשרה למיקרוגליה במודל חולדה של דלקת עצבית הנגרמת על ידי ליפופוליסכריד (LPS), (ii) עלייה בקשירת TSPO ב-12 ו-18 חודשים נקשרה תחילה לאסטרוציטים, ולאחר מכן למיקרוגליה בחולדות TgF344-AD בהשוואה לחולדות מסוג בר (WT), ו-(iii) צפיפות הסטריאטים של 5HT2A R יורד באסטרוציטים לאחר 18 חודשים באותו מודל AD של חולדה. מעניין, טכניקה זו ניתן להרחיב כמעט לכל radiotracers.
Introduction
מחלות נוירודגנרטיביות, כגון מחלת אלצהיימר (AD), מאופיינות באובדן עצבי הקשור לתסמינים מוגברים. AD, הגורם השכיח ביותר לדמנציה, המהווה 60%-70% מהמקרים, משפיע על כ -50 מיליון אנשים ברחבי העולם1. ברמה הנוירופתולוגית, שני המאפיינים העיקריים של AD הם הצטברות של רבדים חוץ-תאיים β עמילואיד (Aβ) וסבכים נוירופיברילריים תוך תאיים של טאו. שינויים בתאי גליה נקשרו גם ל-AD2 ולהפרעה אפשרית של מספר מערכות מוליכים עצביים 3,4.
קו העכברושים TgF344-AD שונה למודל AD על ידי ביטוי טרנסג'נים אנושיים של APP ו-PS1ΔE9, מה שמוביל לביטוי Aβ-40 ו-Aβ-42 מסיסים ובלתי מסיסים ולהיווצרות רובד עמילואיד5. הוא גם מציג את הצטברות הצורות ההיפר-פוספוריות של חלבון הטאו המובילות לטאופתיה. מגיל 9-24 חודשים, החולדות מפתחות בהדרגה את סימני ההיכר הפתולוגיים של אלצהיימר ופגיעה קוגניטיבית 5,6,7,8,9.
טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET), טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון יחיד (SPECT) ואוטורדיוגרפיה הן טכניקות המבוססות על פליטה וכימות של קרניים γ. רדיוטראקרים מכמתים את in vivo (PET ו-SPECT) או את ה-ex vivo/in vitro (אוטורדיוגרפיה). טכניקות רגישות אלה תרמו להבנת מנגנונים של מספר מחלות מוח, כגון אלצהיימר. ואכן, במונחים של דלקת עצבית, ישנם מחקרים רבים המעריכים 18 kDa Translocator Protein (TSPO), סמן נוירו-דלקתיות in vivo, עם עוקבים עם תווית רדיו כגון [11C]-(R)-PK11195 או [11C]PBR28 (לסקירה ראו10). בנוסף, שינויים של מערכות נוירוטרנסמיטר נחקרו באמצעות radiotracers 11,12,13.
עם זאת, טכניקות אלה אינן קובעות את המקור התאי של האות הרדיואקטיבי. זה עלול לעכב את הפרשנות של היסודות הביולוגיים של השינוי בכריכה של רדיוליגנד ב-PET/SPECT. לדוגמה, במקרה של מחקרי TSPO של דלקת עצבית, ההבנה אם העלייה או הירידה של TSPO נובעת משינויים אסטרוציטיים או מיקרוגליאליים היא בעלת חשיבות עליונה. טכניקת מיון התאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה לרקמות מטופלות של רדיוליגנד (FACS-RTT) פותחה כדי לעקוף את הבעיות הללו, ומאפשרת הערכה של קשירת רדיוליגנד בכל סוג תא בנפרד וכימות צפיפות חלבון המטרה לכל תא. טכניקה חדשנית זו היא אפוא משלימה ותואמת מאוד להדמיית PET ו-SPECT.
כאן, טכניקה זו יושמה לאורך שני צירים: חקר דלקת עצבית באמצעות רדיוליגנדים ספציפיים ל- TSPO והערכת המערכת הסרוטונרגית. בציר הראשון, המטרה הייתה להבין את המקור התאי של אות ה-TSPO בתגובה לתגובה דלקתית חריפה. לכן, FACS-RTT שימש על רקמות המוח של חולדות לאחר אינדוקציה של דלקת עצבית באמצעות הזרקת lipopolysaccharide (LPS) ובעקבות מחקר הדמיה in vivo [125I]CLINDE SPECT. יתר על כן, אותה הדמיה ופרוטוקול FACS-RTT יושמו על חולדות TgF344-AD בנות 12 ו-24 חודשים וחולדות תואמות מסוג בר (WT). הציר השני נועד לקבוע את מקורם של שינויים במערכת הסרוטונין במודל חולדה זה באמצעות הערכת צפיפות ex vivo 5-HT2AR לפי סוג התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הניסוייים נערכו בהסכמה עם ועדת האתיקה לניסויים בבני אדם ובבעלי חיים של קנטון ז'נבה, הוועדה הקנטונלית לאתיקה מחקרית (CCER), והכיוון הכללי של בריאות קנטון ז'נבה (שוויץ), בהתאמה. הנתונים מדווחים בעקבות הנחיות מחקר בבעלי חיים: דיווח על ניסויים In-vivo (ARRIVE).
1. הכנת וכיול מצלמת SPECT
- הפעל את המצלמה, טען את תוכנת ההפעלה (ראה טבלת חומרים). לחץ על כפתור הבמה של Home XYZ כדי לבצע ביות.
- הגדר את הניסוי המורכב מרכישת סריקה אחת של 10 דקות. הגדר את מצב הצעד ל-Fine ואת מצב הרכישה ל-Listmode (כדי לתעד את כל ספקטרום הפליטה).
- הגדירו את המיטה והבטיחו שמערכת החימום, חיישן הנשימה וההרדמה יהיו פונקציונליים ובטוחים (איור 1A-D). לאחר מכן, הניחו פנטום (כלומר, 2 מ"ל מתוך ריכוז ידוע של 125I בצינור מיקרו-פוגה של 2 מ"ל) שבו ראש החיה ימוקם (במרכז האזור, איור 1E).
- הגדר את אזור הסריקה על-ידי החלקת הסמנים עבור שלושת הממדים בעזרת שלוש התמונות בחלק התחתון של המסך. ודא שנפח הסריקה של הפנטום והחיה זהה.
- התחל את סריקת הפנטום לכיול הבא עם הפרמטרים שנקבעו בשלבים 1.2-1.4.
2. הגדרת סביבת עבודה להדמיית SPECT
- נקו את סביבת העבודה בעזרת חומר חיטוי והניחו ניירות רכים על כל המשטחים.
- ודא שיש מספיק איזופלורן וחמצן במיכלים המתאימים שלהם.
- הכינו קטטר 24 G על ידי חיתוך הסנפירים של צנתר הפרפר כדי לקבל מבט ברור יותר על וריד זנב החולדה.
- מצפים את הצנתר על ידי מילויו לחלוטין בתמיסת הפרין (25000 U/mL) לאחר הסרת המחט. לאחר מכן, הניחו את המחט בחזרה לתוכה כדי למנוע היווצרות קרישי דם לאחר החדרת הצנתר.
3. [125I]סינתזת רדיו-טראקר של CLINDE
אזהרה: רדיואקטיביות יכולה להיות בעלת אנרגיה מייננת מספקת כדי להשפיע על האטומים של התאים החיים ולפגוע בחומר הגנטי שלהם (DNA).
- הקפידו לעבוד בסביבה מתאימה, המאושרת לניסויים המערבים רדיואקטיביות.
הערה: יש ללבוש את ציוד המגן האישי (PPE) המתאים, לטיפול ברדיואקטיביות, כולל דוסידימטרים לאצבע ולגוף. נסו להישאר במרחק בטוח מכל מקור של רדיואקטיביות. - דגירה של 100 מיקרוגרם של מבשר טריבוטילין ב-100 מיקרול' של חומצה אצטית עם נתרן יודיד (Na125I) (ראו טבלת חומרים) ו-5 μL של 37% חומצה פראצטית ב-70 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בתרמוציפלקטר הממוקם בתא כפפות.
- דיללו את התגובה באמצעות 50% אצטוניטריל (ACN) במים כדי להגיע לנפח של 500 μL. הזריקו את ה-500 μL של התגובה המדוללת לעמודה בעלת פאזה הפוכה (ראו טבלת חומרים).
- בודד את ה-CLINDE [125I]עם HPLC הדרגתי ליניארי הפועל מ-5%-95% ACN ב-7 mM H3PO4 למשך 10 דקות. דיללו את הבידוד ב-H2O כדי להגיע לנפח סופי של 10 מ"ל, ולאחר מכן הזריקו את התגובה המדוללת לעמודת ריכוז (ראו טבלת חומרים).
- הורידו את ה-[125I]CLINDE מהטור עם 300 μL של אתנול מוחלט, ואז התאדו את האתנול על ידי דגירה שלו בצנטריפוגת ואקום ב-RT למשך 40 דקות.
- דיללו את השאריות המכילות את ה-[125I]CLINDE ב-300 מיקרול' של מלח סטרילי כדי ליצור תמיסת מלאי.
- לאחר מדידת הרדיואקטיביות שלה, דיללו את תמיסת המלאי במלח סטרילי כדי להשיג פתרון של 0.037 MBq ב-500 μL.
- טהר את העקיבה על-ידי HPLC (כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים). קבע את זמן האלוטציה באמצעות כיול סטנדרטי ב- 450 ננומטר, ובודד את השיא הרדיואקטיבי היחיד. בצע את עקומת הכיול הסטנדרטית באמצעות שבעה ריכוזים סטנדרטיים של CLINDE קר (לא רדיואקטיבי) (0.1 מיקרוגרם, 0.5 מיקרוגרם, 0.75 מיקרוגרם, 1 מיקרוגרם, 1.5 מיקרוגרם, 2 מיקרוגרם ו-5 מיקרוגרם ב-400 מיקרוגרם של תמיסה של 50% ACN). קבע את הטוהר הרדיוכימי על ידי מדידת שיא יחיד ברדיו TLC (כרומטוגרפיית שכבה דקה). ודא כי הטוהר של הרדיוכימי הוא מעל 60%.
- בדוק את הפעילות הספציפית של הרדיוליגנדה המודדת ספיגה אולטרה סגולה ב- 450 ננומטר ואת עקומות הכיול שנקבעו עם תרכובות ייחוס קרות. ודא שהפעילות הספציפית גדולה מ- 1000 GBq/μmol.
4. [125I]R91150 סינתזה רדיו-טראקרית
הערה: הקפד לעקוב אחר אותם כללי אבטחה שהוזכרו בסעיף הסינתזה של CLINDE.
- ערבבו 300 מיקרוגרם של מבשר R91150 בתמיסה של 3 μL של אתנול מוחלט, 3 μL של חומצה אצטית קרחונית, 15 μL של Na125I ללא נשא (ראה טבלת חומרים) (10 mCi) ב-0.05 M NaOH ו-3 μL של 30% H2O2. דגירה למשך 30 דקות בתא כפפות.
- הזריקו את התגובה כולה לעמודה בפאזה הפוכה (ראו טבלת חומרים).
- לבודד [125I]R91150 על ידי הפעלת HPLC איזוקרטית (ACN/מים 50/50, 10 mM מאגר חומצה אצטית) עם קצב זרימה של 3 מ"ל לדקה.
- דילול [125I]R91150 ב-H2O לנפח סופי של 10 מ"ל.
- הזריקו 10 מ"ל מהתגובה המדוללת לעמודת ריכוז (ראו טבלת חומרים).
- Elute [125I]R91150 מהטור עם 300 μL של אתנול מוחלט.
- אידוי האתנול על ידי דגירה שלו בצנטריפוגת ואקום ב- RT למשך 40 דקות.
- דיללו את השאריות המכילות [125I]R91150 ב-300 μL של מלח.
- טהר את המעקב על ידי HPLC. קבע את זמן האלוטציה באמצעות כיול סטנדרטי ב- 450 ננומטר ובודד את השיא הרדיואקטיבי היחיד. קבע את הטוהר הרדיוכימי על ידי מדידת שיא יחיד ברדיו TLC. ודא כי טוהר הרדיוכימי הוא מעל 98%.
5. הכנת בעלי חיים
- שוקלים ומרדימים את החולדה TgF344-AD (זכר או נקבה, מגיל 2-24 חודשים) בתא אינדוקציה עם 3% איזופלורן. לאחר ההרדמה העמוקה, הורידו את זרימת האיזופלורן ל-2% (0.4 ליטר לדקה, 100% O2) בתא.
- מקם את החיה על מיטה מחוממת מראש המצוידת בהרדמה. שמרו על איזופלורן ב-2% (0.4 ליטר לדקה, 100% O2).
- יש למרוח חומר סיכה ג'ל לעיניים בעיני החיה ולאשר את עומק ההרדמה באמצעות ניטור נשימתי; להתאים הרדמה במידת הצורך.
- בצעו את החדרת הצנתר 24 G בווריד הזנב.
6. רכישת SPECT
- העבירו את החיה למיטת המצלמה המצוידת במשטח חימום מבוקר טמפרטורה המותאם ל-38 מעלות צלזיוס (איור 1E).
- הצמידו את ראש החיה למוט הנשיכה וקבעו את תומכי הראש.
- הגדירו את הניסוי בסריקה של 60 דקות המהוות 60 פריימים של דקה אחת. השתמש שוב בכל שאר הפרמטרים שהוגדרו בשלב 1. לחץ על הלחצן עדכן תמונה כדי לעדכן את מיקום החיה.
- הגדר את אזור הסריקה על-ידי החלקת הסמנים בעזרת שלוש התמונות בחלק התחתון של המסך עבור שלושת הממדים.
- הזריקו 500 μL של הרדיו-טרצר הרדיואקטיבי ([125I]CLINDE או [125I]R91150), ולאחר מכן שטפו את הצינור ב-300 μL של NaCl סטרילי 0.9%. לחץ בו-זמנית על התחל רכישה כדי להתחיל את הסריקה.
- במהלך זמן הסריקה, הקפידו לשמור על החיה תחת הרדמה מתמדת עם ניטור קצב הנשימה. התאם את זרימת האיזופלורן במידת הצורך.
- לאחר שהסריקה מסתיימת, הרדים במהירות את החיה המורדמת על ידי עריפת ראשים.
7. שחזור סריקה
- פתח את תוכנת שחזור הסריקה (ראה טבלת חומרים), ולאחר מכן פתח את ערכת הנתונים, חפש את קובץ הפרמטרים [filename].parameters, שנוצר בתיקייה של הסריקה.
- בחר את האיזוטופ של העניין. שים לב שהפרמטר Listmode מאפשר בחירת איזוטופים מרובים בשלב זה.
- בחר את הפרמטרים הבאים: גודל Voxel של 0.4 מ"מ, 4 תת-קבוצות (POS-EM), 6 איטרציות (שווה ערך ל-24ME-EM), ללא מסנן פוסט-מסנן, ותיקון הדעיכה המתאים לאיזוטופים. בחר את תבנית הפלט ל- NIfTI ולאחר מכן בחר התחל שחזור SPECT .
8. מיצוי מוח של חולדה
- באותו אירוע הרדמה כמו הליך הסריקה ולאחר הבטחת מצב ההרדמה העמוקה של החיה על ידי ניטור קצב הנשימה שלה, להמשיך לערוף על ידי גיליוטינה ולהעביר במהירות את הראש לספסל הנתיחה.
- עם מספריים, בזהירות לחתוך את העור על גבי הראש מאחור לחזית עד אמצע העיניים.
- חתכו את השרירים העודפים סביב בסיס הגולגולת וחוליות צוואר הרחם.
- לאחר מכן, הניחו בזהירות להב אחד של המספריים בחור בחלק האחורי של הגולגולת, מגנום הפורמן, והסירו את החלק האחורי של הגולגולת עם צבתות כירורגיות.
- לאחר מכן, עם צבתות כירורגיות, בזהירות להסיר את החלק העליון של הגולגולת. הגולגולת של חולדות זכרים זקנים יכולה להיות עבה, להסיר כחתיכות קטנות כדי למנוע נזק למוח.
- חתכו בזהירות את קרום המוח במספריים. קרום המוח יכול לפגוע במוח במהלך תהליך המיצוי; להסיר אותו כאמצעי זהירות.
- לאחר הסרת החלק העליון של הגולגולת, סובבו את ראש החיה, ועם מרית שטוחה קטנה, משכו בזהירות את המוח החוצה על ידי חיתוך העצבים האופטיים והטריגמינליים.
- העבירו בזהירות את המוח על משטח זכוכית שטוח ונקי לצורך כריתה על קרח.
- השתמש במרית מתכת שטוחה ובסכין גילוח כדי לנתח את אזורי העניין של המוח. מניחים את הרקמות בצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל ושוקלים את הרקמה המתקבלת. השתמש בחלק המוחי ישירות לבידוד התאים או הקפיא אותו במהירות בחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר.
9. בידוד תאים
- הקפידו לעבוד בסביבה נקייה וסטרילית. מומלץ לעבוד תחת ארון בטיחות ביולוגית מסוג Class-II (BSC). ודא שהכפפות וכל פריט ציוד שהוכנס ל- BSC הם סטריליים.
- כדי להכין את התאים למיון תאים, עקוב אחר הפרוטוקול של Jaclyn M. Schwarz14.
הערה: בניסוי זה, ערכת דיסוציאציה עצבית זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) שימשה להכנת תאים.- שים את הדגימות לתוך צינור צנטריפוגה 2 מ"ל עם 1 מ"ל של HBSS (Ca- ו- Mg-free), ולאחר מכן צנטריפוגה (300 x g, 2 דקות, טמפרטורת החדר = RT) והסר את supernatant מבלי להפריע לכדור.
- הוסיפו 1900 μL של תערובת אנזימים-1 ודגירו אותו למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך כדי תסיסת הצינורות על ידי היפוך כל 5 דקות.
- מוסיפים 30 μL של תערובת אנזימים-2, מתסיסים בעדינות עם פיפטה 1 (ראו טבלת חומרים) הלוך ושוב 30 פעמים. לאחר מכן, דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך כדי תסיסת הצינורות על ידי היפוך כל 5 דקות.
- יש לערבב בעדינות הלוך ושוב עם פיפטה 2, ולאחר מכן פיפטה 3 לפני הדגירה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לנתק את הרקמות.
- סנן את התאים עם מסננת תאים של 80 מיקרומטר, הוסף 10 מ"ל של HBSS (ללא Ca ו- Mg). צנטריפוגה (300 x g, 10 דקות, RT) ולהסיר את supernatant מבלי להפריע לכדור.
- לצורך דלדול המיאלין, יש לבצע החייאה של הכדור עם 400 μL של מאגר להסרת מיאלין (ראה טבלת חומרים), ולאחר מכן להוסיף 100 μL של חרוזי הסרת מיאלין (ראה טבלת חומרים), לפני הדגירה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- הוסיפו 5 מ"ל של חיץ להסרת מיאלין, צנטריפוגה (300 x גרם, 10 דקות, RT), והסירו את ה-supernatant מבלי להפריע לכדור.
- הוסף 500 μL של חיץ להסרת מיאלין והנח את הצינור בעמודת השדה המגנטי. שטפו את העמודה עם 1 מ"ל של מאגר להסרת מיאלין ארבע פעמים.
- צנטריפוגה (300 x g, 2 דקות, RT) ולהסיר את supernatant מבלי להפריע לכדור. מערבולת לזמן קצר (2 שניות) כדי לנתק את התאים ולהוסיף 5 μL של בלוק Fc CD32. מערבולת שוב ודגירה במשך 5 דקות ב 4 °C (64 °F).
- הוסף 100 μL של תערובת של נוגדנים ראשוניים בעלי עניין; אינקובציה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- צנטריפוגה (350 x גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס) והסרת הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. כתם את הצינורות במהופך על נייר רך.
- לאחר מערבולת קצרה (2 שניות), מוסיפים 100 μL של תערובת הנוגדנים המשנית ודגירה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- הוסיפו 2 מ"ל של מאגר להסרת מיאלין, צנטריפוגה (350 x גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס) והסירו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. כתם את הצינורות במהופך על נייר רך. בצעו החייאה של התאים ב-250 μL של PBS סטרילי והמשיכו ישירות למיון תאים.
10. מיון תאים
- הכן את צינור המיקרופוגה עם 500 μL של PBS סטרילי לאיסוף התאים הממוינים.
- הוסף 10 μL של Hoechst לכל 1000 μL של תמיסת תאים כדי לצבוע את הגרעינים של התאים החיים ולהבדיל אותם מהתאים המתים.
- העבר את התאים בהקדם האפשרי למכונת מיון התאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- ראשית, מיין את התאים לפי פיזור קדימה וצד, ולאחר מכן מיין את התאים החיוביים של Hoechst. לאחר מכן, למיין את התאים על סמך הנוגדנים המעניינים. אסוף את התאים המוכתמים חיובית בנפרד. הקפידו להבחין בין התאים החיוביים לבין התאים האוטו-פלואורסצנטיים.
- ספרו את מספר התאים הממוינים עבור כל מאגר מעניין.
11. ספירת גמא
- כייל את מערכת הספירה γ עם 10 μL של אותה תמיסת פנטום המשמשת לכיול SPECT אך דילל אותה ב-1 מ"ל של מים.
הערה: פתרון הפנטום מדולל בגלל הדיוק המשופר של מערכת ספירת γ. - מקם את הצינור של תאים ממוינים במערכת הספירה γ והמשך עם ספירת γ על פי פרוטוקול היצרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חולדות WT חוו סריקת IN VIVO SPECT עם [125I]CLINDE radiotracer לאחר הזרקת LPS חד-צדדית (איור 2). סריקה זו (תוך שימוש בנתונים מסוכמים מתמונות של 45-60 דקות לאחר הזרקת רדיו-טראקר) הראתה קשירה גבוהה יותר של [125I]CLINDE באתר הזרקת ה-LPS (איור 2A) מאשר באזור הנוגד של המוח (איור 2B). דגימות ה-ex vivo שעברו FACS-RTT אישרו את התוצאות הללו וחשפו את נוכחותם של מספר גבוה יותר של אתרי קישור [125I]CLINDE רק במיקרוגליה, והראו שהמקור התאי של האות [125I]CLINDE בצד האיפסילטרלי של המוח היה מיקרוגליאלי (איור 3A)15.
באמצעות אותו [125I]CLINDE radiotracer, הפרוטוקול בוצע לאחר מכן על ההיפוקמפוס של חולדות TgF344-AD ישנות (בנות 12 ו-24 חודשים) והושווה ל-WT בן 24 חודשים. התוצאות הראו כי העלייה בקשירת TSPO לאחר 12 חודשים בחולדות TgF344-AD הוגבלה לאסטרוציטים. בחולדות בנות 24 חודשים, העלייה בקשירת TSPO נבעה הן משינויים אסטרוציטיים והן משינויים מיקרוגליאליים (איור 3B). התוצאות הראו כי ביטוי יתר של TSPO באסטרוציטים נצפה ככל הנראה לפני זה המיקרוגליאלי. באופן בלתי תלוי, באמצעות הרדיוטראקר [125I]R91150, נעשה שימוש בטכניקה זו בקנה מידה תאי כדי להראות שבחולדות TgF344-AD ישנות יותר, אסטרוציטים סטריאליים הציגו צפיפות 5HT2AR מופחתת בהשוואה ל-WT (איור 3C)16.
לבסוף, FACS-RTT בוצע על דגימות AD אנושיות לאחר המוות. לאחר הדיסוציאציה, התאים הודגרו עם [125I]CLINDE לפני ההכתמה והליך FACS. זה איפשר לגלות ביטוי יתר בקליפת המוח של TSPO הן באסטרוציטים והן במיקרוגליה של נבדקי AD בהשוואה לבקרות תואמות גיל (איור 3D).
איור 1: הגדרת מצלמת SPECT. (A) מצגת כוללת של מצלמת SPECT. (B) מצגת מיטה עם תנור חימום וניטור קצב הנשימה. (C) תקעי צינור הרדמה. (D) חימום המיטה ושקע הבדיקה הנשימתית. (E) תצוגת ניטור מיקום פנטום מהתוכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הדמיית מוח TSPO באמצעות SPECT עם [125I]CLINDE radiotracer. תמונות מייצגות (45-60 דקות לאחר ההזרקה של [125I]CLINDE) של ההיפוקמפוס לאחר (A) LPS או (B) הזרקת מלח בצד האיפסילטרלי (לבן) והקנטרלטרלי (אדום) של המוח. עקומות פעילות זמן in vivo הנמדדות בהיקף הריבית מיוצגות בלוח הימני. SPECT: טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון בודד; TSPO: חלבון טרנסלוקטור; LPS: ליפופוליסכריד. n = 7 בעלי חיים לכל תנאי. נתון זה שונה מ-Tournier et al.15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: כימות של TSPO ו-5HT2AR. (A) מקור תאי של ביטוי יתר של TSPO לאחר הזרקת מוח חד-צדדית של LPS. הרדיואקטיביות נמדדה (% מינון מוזרק/גרם של רקמה) בכל אוכלוסיית תאים בצד הקונטרה-צדדי (אפור, n = 7) ובצד האיפסילטרלי (ירוק, n = 7) של ההזרקה. מבחן סטטיסטי בשימוש: מבחן t זוגי. (B) TSPO בחולדה TgF344-AD ישנה. ריכוזי [125I]CLINDE (% מינון מוזרק/גרם של רקמה) נקבעו בחיות בר בנות 24 חודשים (אפור, n = 9) וב-12- (ירוק, n = 8) וחולדות TgF344- AD בנות 24 חודשים (סגולות, n = 7) בנות 24 חודשים. מבחן סטטיסטי בשימוש: ANOVA דו כיווני. (C) 5HT2AR יורד באסטרוציטים של הסטריאטום בחולדות TgF344-AD ישנות. הריכוז [125I]R91150 נקבע באסטרוציטים ובמיקרוגליה ברמה התאית (% מינון מוזרק/תא) בחולדות WT (אפורות, n = 7) ובחולדות TgF344-AD ישנות (ירוקות, n = 11). מבחן סטטיסטי בשימוש: ANOVA חד כיוונית. (D) מקור תאי של ביטוי יתר של TSPO בקליפת המוח המצחית במחלת אלצהיימר (AD). בכל אוכלוסיית תאים, הרדיואקטיביות נמדדת (% מינון מוזרק/גרם של רקמה) בנבדקי אלצהיימר (ירוק, n = 9) ובקרה (אפור, n = 9). מבחן סטטיסטי בשימוש: מבחן t לא מזווג. כל הנתונים מיוצגים כממוצע ± 95% CI עם הביאור הבא: * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למיטב ידיעתנו, טכניקה זו הייתה הראשונה שתיארה גישה המאפשרת הבנה טובה יותר של שינויים מחייבי in vivo של רדיוטראקר ברמה התאית. הפרוטוקול מתאר שיטה רב-ממדית לכימות קשירת רדיו-טראקר ברמה התאית באמצעות [125I]CLINDE (TSPO) או [125I]R91150 (5HT2AR) כדוגמאות.
טכניקה זו חזקה ורגישה מספיק כדי לזהות במדויק את המקור התאי של ספקטרום רחב של שינויים בתאי גליה, החל מתגובה דלקתית אינטנסיבית המושרה על ידי LPS וכלה בשינויים עדינים יותר בתאי גליה שנצפו במודל חולדות של אלצהיימר, ומביאים מידע משלים חשוב לדימות מוחי גרעיני in vivo , כמקור המיקרוגליאלי של האות המתקבל באמצעות SPECT שנקבע. המחקר הראה עוד כי FACS-RTT אפילו הצליח להבחין בשינויים בצפיפות הנוירורצפטורים בסולם התאי באמצעות הדוגמה של 5HT2AR (איור 3C). לבסוף, סופקו עדויות לשימוש בטכניקה ברקמות אנושיות שלאחר המוות, שהראו ריכוז TSPO מוגבר באסטרוציטים ובמיקרוגליה של נבדקי אלצהיימר.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ההשלמה שלה עם הדמיית PET ו- SPECT. ואכן, הדמיה גרעינית היא טכניקה רבת עוצמה שיכולה לחלץ מידע מאזור במוח או מרמת הווקסל. עם זאת, הגבול שלה שוכן בקנה מידה תאי; אי אפשר להבחין בתרומתו של כל סוג תא לאות. FACS-RTT מאפשר ללכת רחוק יותר על ידי חשיפת ריכוז רדיו-טראקר בכל סוג תא. מעניין, בתיאוריה, קבוצה בלתי מוגבלת של מטרות ניתן להעריך עם טכניקה זו, המגבלה היא הזמינות של radiotracer עבור היעד של עניין.
השלבים הקריטיים של הפרוטוקול כוללים שימוש ברדיואקטיביות שיש לבצע בסביבה מאובטחת עם כוח אדם מוסמך. יתר על כן, חשוב לקחת בחשבון דעיכה רדיואקטיבית. לצורך הכנת FACS, יש להבטיח ספציפיות נוגדנים, אורך גל, עוצמת אור המשתנים בהתאם לסוג התא וזקוקים לאופטימיזציה לצורך מיון יעיל של התא.
אחת המגבלות של טכניקה זו המודגשת במחקרים שהוצגו כאן טמונה בשימוש בבעלי חיים מזדקנים ובדגימות מוח לאחר המוות של בני אדם בגלל תאים אוטופלואורסצנטיים. ליפופוסין, כלומר שארית של עיכול ליזוזומי, הוא פלואורסצנטי ומצטבר בתאי עצב מזדקנים, מיקרוגליה ואסטרוציטים. FACS יכול, עם אופטימיזציה מוקדמת, להבחין בין תאים אוטופלואורסצנטיים לבין תאים המסומנים באופן חיובי, וזהו צעד חיוני אם נחקרים בעלי חיים מבוגרים יותר. מגבלה נוספת של הטכניקה היא חוסר האפשרות להשוות באופן ישיר את ריכוז הרדיוטראקר בין סוגי התאים הממוינים השונים על פני בעלי חיים שונים. זה יכול להתבצע אם הריכוז של רדיוטרצרים שאינם מטבוליזם, שאינם קשורים לחלבון בדם נחשב לנורמליזציה בין בעלי חיים.
מגבלה אחת אחרונה היא הצורך שכל הציוד המשמש, למשל, ציקלוטרון, מצלמת PET/SPECT, FACS ונגד γ, יהיו בקרבתם הפיזית זה לזה, במיוחד אם איזוטופים קצרים של זמן מחצית חיים משמשים להדמיית in vivo ול-FACS-RTT.
FACS-RTT יכול לשמש גם כגישה עצמאית, כלומר, לא בהכרח בעקבות מחקר הדמיה גרעינית in vivo 15. המורכבות של מחלות מוח דורשת חקר מנגנונים ברמה התאית או בקנה מידה של תא בודד. FACS-RTT יכול להיות כלי תרגום המגשר בין גישות הדמיה in vivo עם ספקטרום עצום של גישות ex vivo או in vitro תאית וביולוגיה מולקולרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית השוויצרית למדע (מענק מס '320030-184713). המחברים BBT ו-KC נתמכים על ידי קרן Velux (פרויקט מס' 1123). המחבר ST קיבל תמיכה מהקרן הלאומית השוויצרית למדע (מלגת ניידות פוסט-דוקטורט מוקדמת, לא. P2GEP3_191446), קרן פרופ' מקס קלוטה (מלגת רפואה קלינית פלוס), וקרן ז'אן ומדלן ואצ'ו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
References
- Nichols, E., et al. regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).
- Kinney, J. W., et al. Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 4, New York, N. Y. 575-590 (2018).
- D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice. Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).
- D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).
- Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).
- Morrone, C. D., et al. Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-β attenuation. Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).
- Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task. Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).
- Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease. Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).
- Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyzériat, K., Garibotto, V., Millet, P. In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Cells. 9 (9), (2020).
- Backes, H. [11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors. NeuroImage. 207, 116346 (2020).
- Millet, P., et al. Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images. NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).
- Tsartsalis, S., et al. A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images. Molecular Imaging. 13 (8), (2014).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
- Tournier, B. B., et al. Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).
